JPH07173191A

JPH07173191A - 新規酵素阻害剤ｓｆ２７７６物質及びその製造法

Info

Publication number: JPH07173191A
Application number: JP5317758A
Authority: JP
Inventors: Masahiro Hatsu; 正浩発; Shigetaka Ishii; 成貴石井; Naoko Miike; 直子三池; Shoichi Amano; 昭一天野; Akira Shimizu; 明清水; Satoshi Imai; 敏今井; Masayuki Shibahara; 聖至柴原
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1993-12-17
Filing date: 1993-12-17
Publication date: 1995-07-11

Abstract

(57)【要約】【目的】放線菌の培養法により新規酵素阻害剤SF2776物
質を提供する。【構成】ストレプトマイセス・エスピー・SF2776 株を
通常の微生物が利用し得る栄養物を含有する培地で培養
し、得られた培養物中からカラムクロマト法、ゲル濾過
法等を用いて目的物であるSF2776物質を単離した。新規
酵素阻害剤SF2776物質の分子式はC₂₁H₃₁N₇O₅であり、構
造式は下記に示される。SF2776物質はセリンプロテアー
ゼに対し阻害活性を有する。【化３】

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規酵素阻害剤SF2776物
質及びその製造法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする問題点】本発
明はセリンプロテアーゼ阻害活性を有する新規化合物SF
2776物質及びその製造法に関する。セリンプロテアーゼ
は、血液凝固・線維素溶解系、カリクレイン・キニン
系、免疫補体系等を構成する重要な酵素であり、生体は
その活性調節、制御のためにプロテアーゼ阻害物を産出
して適当なバランスを保っている。生体組織に対し有害
な局所刺激が与えられると防御反応の結果としてプラス
ミン、カリクレイン等のセリンプロテアーゼ活性が上昇
し、それが炎症の進む一因となると考えられている。

【０００３】また、セリンプロテアーゼはメタロプロテ
アーゼ、システインプロテアーゼと共に、癌細胞が間質
組織や基底膜を破壊、浸潤して血管内に進入し、遠隔組
織に着床、浸潤して増殖する、いわゆる癌浸潤や転移等
の癌悪性化においても重要な役割をすることが知られて
おり、FOY-305等のセリンプロテアーゼ阻害剤に癌の増
殖、転移抑制効果のあることが報告されている（M. Ohk
oshi et. al., Gann,73, 108-110(1982)、佐々木勇太郎
他、現代医療、17, 1815-1821(1985)）。

【０００４】このようにセリンプロテアーゼ阻害剤は、
免疫、炎症等の生体機能や癌増殖、転移等のメカニズム
解明のための試薬として用いられるほか、抗炎症剤や癌
増殖抑制剤、癌転移抑制剤として適用することが可能で
ある。これまでにセリンプロテアーゼ阻害剤として、前
述のFOY-305のほか、微生物代謝産物としてロイペプチ
ン、キモスタチン、アンチパイン等（青柳高明、酵素阻
害物質、共立全書）が報告されているが、その構造や基
質選択性は様々であり、新しい種類の阻害剤探索が進め
られてきた。

【０００５】

【問題点を解決するための手段】本発明者らは広く微生
物代謝産物をスクリーニングし、ストレプトマイセス属
に属する特定の菌株を培養することにより、セリンプロ
テアーゼに対する阻害作用を有する物質が培養液中に生
産、蓄積されることを見いだし、その有効物質を採取す
ることに成功した。さらに本発明者らは、有効物質SF27
76物質を単離し、その理化学的性状および生物学的性状
を明かにすることにより本発明を完成した。したがっ
て、第１の本発明の要旨とするところは下記の理化学的
性状を有する新規酵素阻害剤 SF2776物質にある。

【０００６】SF2776物質の理化学的性状（１）色及び性状無色粉末（２）分子式 C₂₁H₃₁N₇O₅ （３）元素分析値実測値；Ｃ 45.71
％、Ｈ 7.10％、Ｎ 18.65％（４）融点 216-218℃ （５）比旋光度 [α]D²⁵ = −9.7゜
（c 1.O, 水）（６）マススペクトル SI-MS (m/z) 462 (M
+H)⁺ （７）紫外線吸収スペクトル特徴的吸収は示さ
ず。（８）赤外線吸収スペクトル KBr 錠で測定したス
ペクトルを

【図１】に示す。（９）核磁気共鳴スペクトル重水中での水素核磁
気共鳴スペクトルを

【図２】に示す。（10）溶解性水に易溶、メタノー
ル、酢酸エチル、クロロホルム、ヘキサンに難溶。（11）呈色反応モリブデン酸、ヨー
ド、グレッグ-リーバック試薬に陽性、ニンヒドリン試
薬に陰性。（12）シリカゲル薄層クロマトグラフィーのRf値ブタノール：酢酸：水(4:1:2) 0.55

【０００７】上記のSF2776物質の理化学的性状及び各種
のスペクトルデータからSF2776物質はC₂₁H₃₁N₇O₅の分子
式を有し、下記の構造式に示すペプチド構造を有すると
推定される。これまでに見いだされているペプチド構造
を有する酵素阻害剤とは構造が異なることからSF2776物
質は新規物質と判定した。

【０００８】

【化２】

【０００９】第２の本発明の要旨とするところは、スト
レプトマイセス属に属するSF2776物質生産菌を培養し、
その培養物からSF2776物質を採取することを特徴とする
酵素阻害剤SF2776物質の製造法にある。

【００１０】本発明に使用される酵素阻害剤ＳＦ２７７
６生産菌の一例としては、岐阜県高山市の土壌から分離
されたＳＦ２７７６株がある。ＳＦ２７７６株の菌学的
性状は下記の通りである。

【００１１】Ｉ．形態基生菌糸は長く伸長し、よく分岐し、通常の条件下では
分断しない。気菌糸はスターチ寒天、グリセロール・ア
スパラギン寒天、イースト・麦芽寒天等で豊富に着生し
胞子形成も良好である。気菌糸はよく分岐し、車軸分岐
は見られない。気菌糸先端の胞子連鎖は直線状ないしカ
ール状である。電子顕微鏡による観察では、胞子は楕円
型〜円筒型で、0.7〜0.9 x 0.8〜1.4 μｍの大きさを有
し、表面は平滑で通常30〜50個位連鎖する。胞子のう、
運動性胞子、菌核などは観察されていない。

【００１２】II．各種培地上の生育状態ＳＦ２７７６株の各種培地上の生育状態は次表に示す通
りである。色の記載について（）内に示す標準はコン
テイナー・コーポレーション・オブ・アメリカ（Contai
ner Corporation of America）社製の「カラー・ハーモ
ニィ・マニアル（Color Harmony Manual）」に記載のも
のを用いた。観察は２８℃で１４〜２１日培養後に行
った。

【００１３】培地発育(色は裏面) 気菌糸可溶性色素シュクロース・硝酸塩寒天微弱、なしなしなしグルコース・アスパラギン寒天普通、なし豊富、灰色(2fe-3fe) なしグリセロール・アスパラギン寒天良好、なし豊富、灰色(e-d) なしスターチ寒天良好、なし豊富、灰色(3fe) なしオートミール寒天良好、なし豊富、灰色(2fe-3fe) なしイースト・麦芽寒天良好、なし豊富、灰色(5fe) なしチロシン寒天良好、淡黄色豊富、灰色(g-e なし栄養寒天微弱、なしなしなしリンゴ酸・カルシウム寒天微弱、なしなしなしベネット寒天良好、なし豊富、灰色(5fe) なし

【００１４】III．生理的性質（１）生育温度範囲：イースト・スターチ寒天において
１５〜３７℃の温度範囲で生育し、２５〜３０℃付近で
良好に生育する。（２）ゼラチンの液化：陽性（３）スターチの加水分解：陽性（４）硝酸塩の還元；陰性（５）脱脂乳のペプトン化：陰性脱脂乳の凝固：陽性（６）耐塩性：耐塩性は低く、１．５％ＮａＣｌ含有培
地でも生育阻害を受ける。（７）メラニン様色素の生成：陰性

【００１５】IV．炭素源の利用性（ＩＳＰー９培地使
用）（１）利用する：Ｄ−グルコース、Ｄ−フラクトース、
Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、ラフィノース（２）利用しない：シュクロース、（３）利用が疑わしい：Ｄ−マンニトール、myo−イノ
シトール、Ｌ−ラムノース

【００１６】Ｖ．菌体分析ベッカー（Becker）らの方法（Appl. Microbiol. 13: 2
36,1965）により分析した結果、全菌体加水分解物中の
ジアミノピメリン酸はＬＬ型であつた。以上の性状よ
り、ＳＦ２７７６株は放線菌の中でストレプトマイセス
属に属し、気菌糸色調はグレイ・シリーズ、気菌糸先端
は直線状〜カール状で、胞子表面は平滑状、裏面色調は
無色〜淡黄色で、顕著な可溶性色素を生産しない菌株と
要約される。

【００１７】本発明者らはＳＦ２７７６株をストレプト
マイセス・エスピー・ＳＦ２７７６（Streptomyces s
p. SF2776）と命名した。なお、本菌株は工業技術院微
生物工業技術研究所に、ＦＥＲＭＰ−１３８８５とし
て寄託されている。ＳＦ２７７６株は他の放線菌に見ら
れるように、その性状が変化しやすい。例えば、ＳＦ２
７７６株の、またはこの株に由来する突然変異株（自然
発生または誘発性）、形質接合体または遺伝子組換え体
であっても、酵素阻害剤ＳＦ２７７６を生産するものは
全て本発明に使用できる。

【００１８】本発明の方法では、前記の菌を通常の微生
物が利用しうる栄養物を含有する培地で培養する。栄養
源としては、従来放線菌の培養に利用されている公知の
ものが使用できる。例えば、炭素源として、グルコー
ス、水あめ、デキストリン、澱粉、糖みつ、動・植物油
等を使用しうる。また窒素源として、大豆粕、小麦胚
芽、コーンスティープリカー、綿実粕、肉エキス、ペプ
トン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、硝酸ソーダ、尿
素等を使用しうる。その他、必要に応じ、ナトリウム、
カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、塩
素、燐酸、硫酸、およびその他のイオンを生成すること
ができる無機塩類を添加することは有効である。また菌
の発育を助け、酵素阻害剤ＳＦ２７７６の生産を促進す
るような有機および無機物を適当に添加することができ
る。

【００１９】培養法としては、好気的条件での培養法、
特に深部培養法が最も適している。培養に適当な温度は
２５〜３０℃であるが、多くの場合、２８℃付近で培養
する。新酵素阻害剤ＳＦ２７７６の生産は培地や培養条
件により異なるが、振とう培養、タンク培養のいずれに
おいても通常２〜７日の間でその蓄積が最高に達する。
培養中の新酵素阻害剤ＳＦ２７７６の蓄積量が最高にな
った時に培養を停止し、培養液から目的物質を単離精製
する。

【００２０】SF2776物質の精製法かく生産されるSF2776物質は前記する理化学的性状を有
するので、その性状に従って培養液から精製することが
可能であるが、特に以下の方法により効率的に精製でき
る。すなわち、有効成分を含む培養物から固形物を濾別
し濾液と固形物に分ける。濾液は活性炭で処理して活性
物質を樹脂に吸着する。ついでアセトン等の適当な溶媒
にて溶出し、溶出液を減圧濃縮することにより溶媒を留
去し、水溶液とする。この水溶液をセパビーズSP207
（三菱化成社製）で処理して活性物質を樹脂に吸着す
る。

【００２１】ついでメタノール等の適当な溶媒にて溶出
し、溶出液を減圧濃縮することにより溶媒を留去し、水
溶液とする。この水溶液をＣＭ-セファデックス（ファ
ルマシア社製）で処理して活性物質を吸着する。ついで
NaCl等の適当な溶液により溶出し、脱塩後、減圧濃縮す
ることにより活性粗粉末を得る。この粗粉末をトヨパー
ルHW-40F（東ソー社製）を用いてゲル濾過を行い、得ら
れた活性溶液を脱塩後、濃縮した後、凍結乾燥すること
により、SF2776物質を単離する。SF2776物質の検定に当
たっては、トリプシンに対する阻害活性を測定すること
による生物学的検定法及びシリカゲル薄層クロマトグラ
フィーによる化学的検定法を用いることができる。

【００２２】以下に本発明の実施例を示すが、これは単
なる一例であって本発明を限定するものではない。ここ
に例示しなかった多くの変法あるいは修飾手段を用いう
ることは勿論のことである。

【００２３】

【実施例】種培地として、スターチ 2.0％、グルコース
1.0％、ポリペプトン 0.5％、小麦胚芽 0.6％、酵母エ
キス 0.3％、大豆粕 0.2％および炭酸カルシウム0.2
％、（殺菌前 pH7.0）の組成からなる培地を用いた。ま
た、生産培地として、グルコース（別殺）1.0％、グリ
セリン1.5％、大豆粕1.5％、酵母エキス1.0％、燐酸二
カリウム0.1％、硫酸マグネシウム0.1％、炭酸カルシウ
ム0.2％、塩化コバルト0.0001％、（殺菌前pH7.0）の組
成からなる培地を用いた。

【００２４】前記の種培地20mlを分注した100ml容三角
フラスコを121℃で20分間殺菌し、これにストレプトマ
イセス・エスピー・ＳＦ２７７６株（ＦＥＲＭＰ−１
３８８５）の斜面寒天培養の２〜３白金耳を接種し、２
８℃で２４時間振盪培養し、第１種培養とした。次
いで、種培地８０ｍｌを分注した５００ｍｌ容三角フラ
スコを１２１℃で３０分間殺菌し、前記第１種培養４
ｍｌを接種し、２８℃で２４時間振盪培養し、これを第
２種培養とした。更に、種培地７００ｍｌを分注した３
Ｌ容三角フラスコを１２１℃で３０分間殺菌し、第２種
培養３５ｍｌを接種し、２８℃で２４時間振盪培養し、
これを第３種培養とした。予め、１２１℃で３０分間殺
菌した３５Ｌの生産培地を含む５０Ｌ容ジャーファーメ
ンターに、前記の第３種培養を７００ｍｌ接種し、２８
℃で２日間通気（１７、５Ｌ／分）、攪拌２００ｒｐｍ
で培養した。培養終了後、濾過助剤として珪藻土を加え
て濾過した。

【００２５】こうして得られた濾液 50Ｌを活性炭 5 Ｌ
の塔にかけ有効成分を吸着させた後、水 30 Ｌで洗浄
後、50％アセトン水 15Ｌにより有効成分を溶出した。
さらに、溶出液から減圧濃縮によりアセトンを留去した
水層 10 ＬをセパビーズSP207（三菱化成社製）500 ml
の塔にかけ有効成分を吸着させた後、水 2.5 Ｌ及び30
％メタノール水 1.5 Ｌで洗浄後、60％メタノール水 3
Ｌにより有効成分を溶出した。さらに、溶出液から減圧
濃縮によりメタノールを留去した水層 2 ＬをＣＭ−セ
ファデックス（Ｈ⁺、ファルマシア社製）700 mlの塔に
かけ有効成分を吸着させた後、水 2.5 Ｌ洗浄後、NaCl
溶液の濃度勾配法（0〜1.0 M）により有効成分を溶出し
た。溶出液画分中のSF2776物質はブタノール-酢酸-水
（4:1:2）混液を展開溶媒とするシリカゲル薄層（Art57
15 メルク社製）クロマトグラフィー（Rf 0.55）で検出
した。

【００２６】得られた活性画分を合わせて、セパビーズ
SP207（三菱化成社製）200 mlの塔にかけ有効成分を吸
着させた後、水 2 Ｌで洗浄した。50％アセトン水 1 Ｌ
により有効成分を溶出し、脱塩を行った。減圧下にて濃
縮後、凍結乾燥し、1.2ｇの活性粗粉末を得た。この粉
末を少量の水に溶解し、水にて充填したトヨパールHW-4
0F（東ソー社製）700mlの塔にかけ、水で洗浄した後、
1.0 MのNaCl溶液で展開し活性画分を溶出した。得られ
た活性画分を合わせて、セパビーズSP207（三菱化成社
製）200 mlの塔にかけ有効成分を吸着させた。水 2 Ｌ
で洗浄後、50％アセトン水 800 mlにより有効成分を溶
出し、脱塩を行った。減圧下にて濃縮後、凍結乾燥し、
352mg のSF2776物質の無色粉末を得た。

【００２７】

【発明の効果】本発明によるSF2776物質はセリンプロテ
アーゼ阻害作用を有することから、抗炎症剤あるいは癌
の転移抑制剤としての有用性が期待される。以下に試験
例を示す。

【００２８】

【試験例】下記の方法により、セリンプロテアーゼの一
種であるトリプシンに対する阻害活性を測定した。トリプシン阻害活性測定法 40 mM トリス緩衝液（ｐＨ 8.0）、5 mM ジチオスレイ
トール、2 mM エチレンジアミン４酢酸２ナトリウム、5
00 U トリプシン（シグマ社製）および種々の濃度の被
験薬を含む反応液 0.5 mlにカゼイン溶液を0.5 ml添加
し、37℃で10分間反応した後、5.0％トリクロロ酢酸 1.
5 mlを加えて反応を停止させた。4℃で１時間放置した
後、3500 rpmで10分間遠心分離し、上清の280 nmにおけ
る吸光度を測定した。被験薬無添加で同様に処理し測定
したコントロール値、被験薬および酵素無添加で同様に
処理し測定したブランク値より以下の式にて阻害率を計
算し、IC₅₀値を算出した。

【００２９】

【数１】その結果、SF2776物質のトリプシンに対する阻害活性IC
₅₀値は3.6 μg/mlであった。

【図面の簡単な説明】

【図１】：SF2776物質のKBr錠での赤外線吸収スペクト
ルを示す。

【図２】：SF2776物質の重水中で測定した水素核磁気共
鳴スペクトルを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者天野昭一神奈川県横浜市港北区師岡町760番地明治製菓株式会社薬品総合研究所内 (72)発明者清水明神奈川県横浜市港北区師岡町760番地明治製菓株式会社薬品総合研究所内 (72)発明者今井敏神奈川県横浜市港北区師岡町760番地明治製菓株式会社薬品総合研究所内 (72)発明者柴原聖至神奈川県横浜市港北区師岡町760番地明治製菓株式会社薬品総合研究所内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の構造式で示されるペプチド化合物ま
たはその塩。【化１】
【請求項２】ストレプトマイセス属に属するSF2776物質
生産菌を培養し、その培養物からSF2776物質を採取する
ことを特徴とする請求項１記載の酵素阻害剤SF2776物質
の製造法。