JPS6323996B2

JPS6323996B2 -

Info

Publication number: JPS6323996B2
Application number: JP10805980A
Authority: JP
Inventors: Masashi Ooshima; Noboru Ishizaki; Tadashi Horiuchi; Yasumasa Marumoto; Noribumi Sugyama
Original assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Daiichi Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1980-08-06
Filing date: 1980-08-06
Publication date: 1988-05-18
Also published as: JPS5732286A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は新規抗生物質DK―7814―Ａ，DK―
7814―ＢおよびDK―7814―Ｃならびにそれらの
製造法に関する。本発明者らは新規抗生物質を発明すべく自然界
より種々の微生物を分離し、その産生する抗生物
質を探索した結果、ダクチロスポランギウム属に
属する一微生物がその培養物中に新規抗生物質を
蓄積することを知見し、更に詳細に研究した結
果、本発明を完成するに至つた。抗生物質DK―7814―Ａ，―Ｂおよび―Ｃは
DK―7814―Ａ，―Ｂまたは―Ｃを生産する能力
を有する微生物を適当な培地中で一定の抗菌活性
が得られるまで培養し、培養物からこれらの抗生
物質を採取することによつて製造される。 DK―7814―Ａ，ＢまたはＣを有利に生産する
微生物としては、たとえば山形県で採取した土壌
試料から分離した生産菌No.R1―１株ならびにそ
の変異株があげられる。No.R1―１株に菌学的性
質は次の通りである。形態的特徴本生産菌は波状ないし曲状に伸長した基生産
糸に１個のあるいは数個が房状となつた指状の
胞子嚢を培地表面上に着生する。胞子嚢の大き
さは0.8〜1.4μm×4.0〜6.0μmであり、その中に
２〜４個の胞子が直列に入つている。胞子嚢胞
子は卵形ないし円筒形で表面は平滑であり、大
きさは0.7〜1.2μm×1.2〜1.8μmである。また、
この胞子は運動性を有する。空中菌子は一般に着生せず、車軸分枝および
菌核は認められない。各種培地における生育状態各種培地上で28℃，21日間培養したものにつ
いての生育状態は第１表の通りである。【表】【表】なお、グルコース・アスパラギン、スター
チ、イースト・麦芽およびオートミールの各種
寒天培地上で、基生菌糸は0.1N塩酸で橙色、
0.1N水酸化ナトリウムで紫色に色調が変化す
る。生理的性質常法に従がい試験した結果を第２表に示し
た。【表】炭素源の利用（プリドハム・ゴトリーブ寒天
培地）利用する：Ｌ―アラビノース、Ｄ―キシロー
ス、Ｄ―グルコース、Ｄ―フラクトース、シユ
クロース、Ｌ―ラムノース、ラフイノース、Ｄ
―マンニツト利用しない：イノシトール細胞壁成分メソ型のジアミノピメリン酸を含
む。上記のごとく、本生産菌は１）細胞壁成分とし
てメソ型のジアミノピメリン酸を含む２）基生菌
糸に指状の胞子嚢を寒天培地上に着生する３）胞
子嚢は２〜４個の運動性を有する胞子を含む、こ
とからダクチロスポランギウム属に属せしめるの
が最も妥当である。現在までに知られているダクチロスポランギウ
ム属の菌種にはダクチロスポランギウムオーラ
ンテイアクム、ダクチロスポランギウムタイラ
ンデンス〔アーカイブスミクロバイオロジイ
58 42〜52（1967）〕、ダクチロスポランギウム
バリエスポリウム〔公開特許公報昭52−134095〕、
ダクチロスポランギウムサルモネウム〔公開特
許公報昭53−50101〕およびダクチロスポランギ
ウムマツザキエンス〔日本抗生物質学術協議会
第214回研究会、昭和54年９月21日〕の５種があ
る。しかし、これらの菌種はいずれも基生菌糸叢
の色が淡橙色、明るい橙色、橙色、黄橙色、赤橙
色、桃色、淡褐色あるいは赤褐色を基調としてお
り、赤紫色ないし暗赤紫色を特徴とする本生産菌
No.R1―１株とは明らかに異なつている。以上のことより本生産菌No.R1―１株は新菌種
と認めるのが妥当であり、ダクチロスポランギウ
ムプルプレウムsp.nov.（Dactylosporangium
purpureum sp.nov.）と命名した。本生産菌は工
業技術院微生物工業技術研究所に微生物受託番号
FERM Ｐ―5658号として寄託されている。本生産菌ダクチロスポランギウムプルプレウ
ムは他の放線菌例えばストレプレマイセスなどの
場合にみられるようにその性状が変化しやすく、
例えば紫外線、エツクス線、高周波放射線、薬品
等を用いる人工的変異手段で変異しうるものであ
り、いずれの変異株であつてもDK―7814―Ａ，
―Ｂおよび（または）―Ｃ物質の生産能を有する
ダクチロスポランギウム属の放線菌は本発明の方
法に使用することができる。次に本発明にかかわる新規抗生物質DK―7814
―Ａ，―Ｂおよび―Ｃの製造方法を示す。本生産
菌株は各種の栄養源を含む培地で好気的条件下に
培養される。培地成分としては放線菌の培養に繁
用される各種の培地源が使用出来る。例えば炭素
源としてはグリセリン、グルコース、シユクロー
ス、澱粉などが単独または混合物として用いられ
る。また窒素源としては大豆粉、脱脂大豆粉、肉
エキス、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、コー
ンステイープリカー、硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウムなどの天然物や無機物が単独または混
合物として用いられる。無機塩としては食塩、リ
ン酸塩、炭酸カルシウム、硫酸マグネシウムな
ど、その他微量の重金属塩が必要に応じて用いら
れる。培養に際しては一般に抗生物質生産の培養に用
いられている液体培養法、特に深部通気撹拌培養
法が最も適している。培地のPHは約6.0〜8.0が好
ましく、培養温度は約20〜35℃、好ましくは30℃
付近に調節するのがよい。抗生物質DK―7814―
Ａ，―ＢまたはＣの蓄積の確認は被検菌としてバ
チルス・ズブチリスATCC6633を用いるペーパー
デイスク法で行なわれる。培養時間は通常50〜
170時間である。培養液から抗生物質DK―7814―Ａ，―Ｂまた
は（および）―Ｃを採取するにはその性質を利用
して一般の抗生物質の採取の方法に準じて行なえ
ばよい。抗生物質DK―7814―Ａ，―Ｂおよび―
Ｃ（以下DK―7814と記述した場合には抗生物質
DK―7814―Ａ，―Ｂおよび―Ｃの混合物を示
す。）は主として培養液中に生産される。培養終
了後、菌体その他の固形物をけいそう土等のロ過
助剤を用いるロ過操作あるいは遠心分離によつて
除去することにより、DK―7814を含む培養ロ液
が得られる。培養ロ液中に存在するDK―7814は
後記するその理化学的性状を利用することにより
抽出、精製することが出来る。例えばDK―7814
は上記培養ロ液を中性ないし弱酸性にし、クロロ
ホルム、ベンゼン、酢酸エチル、ブタノール等の
混和しない有機溶媒で抽出することが出来る。あ
るいは活性炭、アンバーライトXAD―２（ロー
ム・アンド・ハース社製）、ダイヤイオンHP20
（三菱化成社製）、アンバーライトIRA―400（ロー
ム・アンド・ハース社製）、ダウエツクス１×４
（ダウ・ケミカル社製）などの吸着剤に吸着させ
たのち適当な溶媒で溶出することも出来る。この
ようにして得られた抽出液中のDK―7814はアル
カリ性の水溶液たとえばPH８〜10の緩衝液で抽出
し水層に移行させ、この水溶液を分別後酸を加え
て弱酸性とし、新たに加えた非水溶性有機溶媒に
移行させても更に精製することが出来る。このようにして得られた抽出液を減圧濃縮する
ことによりDK―7814の赤色粗粉末を得ることが
出来る。さらにDK―7814を精製するためには吸
着クロマトグラフイー、ゲルロ過、高速液体クロ
マトグラフイーなどの方法が単独に、あるいは組
み合わせて用いられる。吸着剤としてはシリカゲ
ル、アルミナ、活性炭、アンバーライトXAD―
２、ダイヤオンHP20等が、ゲルロ過剤としては
セフアデツクスLH20（フオルマシア社製）、バイ
オ―ビーズＳ（バイオラツト社製）等が、また高
速液体クロマトグラフイーの担体としては逆相系
の担体であるマイクロボンダパツクC₁₈（ウオータ
ズリミテツド社製）、LS―410（東洋曹達工業製）
等が用いられる。分離に用いる溶剤はたとえばシ
リカゲルの場合クロロホルム、酢酸エチル、ベン
ゼンなどの極性の低い溶媒とメタノール、アセト
ンなどの極性溶媒との混合溶媒が好ましい。高速
液体クロマトグラフイーの場合はメタノール、ア
セトンおよびアセトニトリルと水の混合溶媒が効
果的である。DK―7814は性質が類似している
DK―7814―Ａ，―Ｂおよび―Ｃの混合物である
がDK―7814―Ａ，―Ｂおよび―Ｃの分離には吸
着クロマトグラフイーまたは高速液体クロマトグ
ラフイーを行なうのが有効である。たとえばアセ
トニトリルと水を用いた逆相液体クロマトグラフ
イーでＡ，Ｂ，Ｃの３成分に分離することが出来
る。このようにして得られたDK―7814―Ａ，―Ｂ
および―Ｃは以下の理化学的性状および生物学的
性状を有する。 (1) 外観各物質共赤色粉末 (2) 融点 DK―7814―Ａ 223〜225℃（分解） DK―7814―Ｂ 248〜250℃（分解） DK―7814―Ｃ 250〜252℃（分解） (3) 分子式および構造式 DK―7814―Ａ C₂₆H₁₈O₁₅（R₁＝R₂＝OH） DK―7814―Ｂ
C₂₆H₁₈O₁₄（R₁＝OH，R₂＝Ｈ） DK―7814―Ｃ C₂₆H₁₆O₁₄
【式】 (4) 元素分析値（いずれも一水和物として） DK―7814―Ａ計算値Ｃ 53.06 Ｈ 3.40 Ｏ 43.54 実測値Ｃ 53.26 Ｈ 3.35 Ｏ 43.39 DK―7814―Ｂ計算値Ｃ 54.55 Ｈ 3.50 Ｏ 41.96 実測値Ｃ 54.18 Ｈ 3.55 Ｏ 42.27 DK―7814―Ｃ計算値Ｃ 54.74 Ｈ 3.16 Ｏ 42.11 実測値Ｃ 55.21 Ｈ 3.09 Ｏ 41.70 (5) 分子量（質量分析法） DK―7814―Ａ 570 DK―7814―Ｂ 554 DK―7814―Ｃ 552 (6) 紫外線吸収スペクトルクロロホルム溶液中での紫外線吸収スペクト
ルを第１，２および３図に示す。その極大吸収
値は次の通りである。 DK―7814―Ａ（第１図） λmax(nm) 545 505 480 366 352 312 log ε 3.64 3.87 3.86 4.01 4.06 4.32 DK―7814―Ｂ（第２図） λmax(nm) 550 510 480 365 348 314 log ε 3.49 3.74 3.72 3.91 3.96 4.23 DK―7814―Ｃ（第３図） λmax(nm) 547 508 475 370 354 311 log ε 3.65 3.87 3.85 4.01 4.04 4.29 (7) 赤外吸収スペクトル KBr錠での赤外吸収スペクトルを第４図
（DK―7814―Ａ），第５図（DK―7814―Ｂ）
および第６図（DK―7814―Ｃ）に示す。その
特徴的特性吸収波数は次の通りである（cm^-1）。 DK―7814―Ａ 3450 1730 1695 1610 1450 1310 1240 980
940 DK―7814―Ｂ 3450 1730 1695 1610 1450 1300 1230 980
940 DK―7814―Ｃ 3450 1740 1700 1610 1460 1310 1240 980
950 (8) プロトン核磁気共鳴スペクトル（200MHz） CDCl₃およびDMSO―d₆中でテトラメチルシ
ランを内部標準物質として測定したスペクトル
データーを次に示す。（ppm） DK―7814―Ａ CDCl₃ 13.30（ｓ）1H 12.00（ｓ）1H 11.12（ｓ）1H
7.52（ｓ）1H 7.34（ｓ）1H 6.21（ｓ）1H
5.92（ｓ）1H 4.75（ｍ）1H 4.72（ｓ）1H
3.98（ｓ）3H 3.94（ｓ）3H 3.85（ｍ）1H
3.35（ｍ）1H 3.25（ｍ）1H DMSO―d₆ 13.32（ｓ）1H 11.78（ｓ）1H 10.70（ｓ）1H
7.78（ｓ）1H 7.54（ｓ）1H 6.43（ｍ）2H
5.90（ｍ）2H 5.30（ｍ）1H 4.60（ｍ）1H
4.44（ｍ）1H 3.93（ｍ）3H 3.92（ｓ）3H DK―7814―Ｂ CDCl₃ 13.16（ｓ）1H 12.18（ｓ）1H 11.07（ｓ）1H
7.46（ｓ）1H 6.98（ｓ）1H 6.22（ｓ）1H
5.91（ｓ）1H 4.68（ｍ）1H 3.98（ｓ）3H
3.94（ｓ）3H 3.58（ｍ）1H 3.48（ｍ）1H
3.26（ｍ）1H 3.17（ｍ）1H DK―7814―Ｃ CDCl₃ 13.16（ｓ）1H 12.15（ｓ）1H 10.98（ｓ）1H
7.52（ｓ）1H 7.28（ｓ）1H 6.22（ｓ）1H
5.82（ｓ）1H 4.36(d)1H 4.23(d)1H 3.99（ｓ）
3H 3.95（ｓ）3H 3.20（ｓ）1H DMSO―d₆ 13.29（ｓ）1H 11.74（ｓ）1H 10.68（ｓ）1H
7.76（ｓ）1H 7.73（ｓ）1H 7.03(d)1H 6.45
（ｓ）1H 5.37（ｓ）1H 4.60(d)1H 4.40(d)1H
3.91（ｓ）3H 3.89（ｓ）3H （ｓ＝一重線，ｄ＝二重線，ｍ＝多重線を示
し、またその吸収ピークのもとになる水素原子
の数を記した。） (9) ¹³C―核磁気共鳴スペクトル DMSO―d₆中でテトラメチルシランを内部
標準にして測定したDK―7814―Ｃのプロトン
ノイズデカツプリングのスペクトルデーターを
次に示す。括弧内はオフレゾナンスの場合の多
重度を示す。（ppm）（ｓ＝一重線，ｄ＝二重
線，ｑ＝四重線） 186.1（ｓ） 180.4（ｓ） 176.0（ｓ） 163.0
（ｓ） 161.5（ｓ） 160.2（ｓ） 156.4（ｓ）
154.0（ｓ） 148.9（ｓ） 146.0（ｓ）
138.5（ｓ） 129.8（ｓ） 129.3（ｓ） 123.7
（ｓ） 119.2(d) 114.5（ｓ） 112.9(d)
112.6（ｓ） 110.2（ｓ） 108.2（ｓ） 94.8
(d) 74.8(d) 57.0（ｑ） 54.8（ｑ） 52.8(d)
48.4(d) (10) 溶解度 DK―7814―Ａ，―Ｂ，―Ｃ共にジメチルホ
ルムアミド、アルカリ水に易溶、酢酸エチル、
クロロホルム、メタノールに可溶、水、ｎ―ヘ
キサン、石油エーテルには不溶である。 (11) 薄層クロマトグラフイー【表】 (12) 呈色反応クロロホルム溶液および酸性溶液では橙赤色
であるが、アルカリ性溶液では紫色に変化す
る。酢酸マグネシウム反応は陽性、ニンヒドリ
ン反応は陰性である。 (13) 抗菌スペクトル普通寒天培地“栄研”（栄研化学社製）を用
いて抗生物質DK―7814―Ａ，―Ｂおよび―Ｃ
の抗菌スペクトルをペーパーデイス法で測定し
た結果を第３表に示す。【表】上記の結果から明らかな様に新規抗生物質DK
―7814―Ａ，―Ｂおよび―Ｃは医薬用その他の抗
菌剤として有用な物質であると考えられる。また
その構造および類似物質の生物活性より抗腫瘍剤
としての有用性も考えられる。次に抗生物質DK―7814―Ａ，―Ｂおよび―Ｃ
を新規抗生物質と認めた根拠を記述する。ダクチロスポランギウム属に属する菌株の産生
する抗生物質としてはカプレオマイシン〔公開特
許公報52−134095〕，CP―44161〔公開特許公報53
−50101〕およびSF―2052〔ジヤーナル・オブ・
アンチビオチツクス32（12）1354〜1356（1979）〕
が知られている。この内カプレオマイシンおよび
SF―2052は水溶性物質であり、CP―44161はポ
リエーテル系抗生物質である。このことより、抗
生物質DK―7814―Ａ，―Ｂおよび―Ｃとは明ら
かに異なることが認められる。また、抗生物質
DK―7814―Ａ，―Ｂおよび―Ｃの構造は前記の
如くであるが、構造類似物質としてはアクチノプ
ラネスイアンチノゲネスＡ／1668が産生するパ
ープロマイシン〔ジヤーナル・オブ・アンチビオ
チツクス27(3)161〜168（1974）〕、ストレプトマイ
セスカリホルニカスTA2640およびATCC3312
が産生するグリセオロジンＡおよびＣ〔ジヤーナ
ル・オブ・アンチビオチツクス31(10)970〜978
（1978）〕、ストレプトマイセスグリセウス
FCRC―57が産生するグリセオロジンＧ〔ジヤー
ナル・オブ・アンチビオチツクス32(3)197〜204
（1979）〕およびストレプトマイセスコリナスが
産生するコリノマイシン（＝α―ルブロマイシ
ン）、β―ルブロマイシン〔アーカイブス・ミク
ロバイオロジイ17361〜383（1952）〕が知られてい
る。これらの物質の構造は明らかに本発明の抗生
物質とは異なる。さらにグリセオロジン群抗生物
質には前記のグリセオロジンＡ，ＣおよびＧ以外
にA₂，Ｂ，C₂，ＫおよびＬ（すべて構造は不明）
〔アンチバイオテイキ10603〜612（1965）〕が知ら
れているが、いずれの物質も抗生物質DK―7814
―Ａ，―Ｂおよび―Ｃとは紫外線吸収スペクトル
が明らかに異なる。以上のことから本抗生物質
DK―7814―Ａ，―Ｂおよび―Ｃは新規抗生物質
と同定された。次に本発明の目的化合物DK―7814―Ａ，―Ｂ
および―Ｃの製造例を示すが、この実施例はなん
ら本発明を限定するものではない。実施例１グルコース２％，ポリペプトン0.5％，肉エキ
ス0.3％，乾燥酵母0.3％，NaCl0.5％，CaCO₃0.3
％（PH7.0）からなる種菌用培地100mlを500ml溶
坂口フラスコに分注し滅菌後、ダクチロスポラン
ギウムプルプレウムをその斜面培養から１白金
耳接種し、28℃，144時間振盪培養した。この種
培養300mlを可溶性澱粉２％，グルコース0.1％，
大豆粉0.5％，乾燥酵母0.5％，NaCl0.3％，
CaCO₃0.3％，アデカノールEX885（消泡剤，旭電
化社製）0.0005％（PH7.0）からなる主醗酵培地
20を注入滅菌した30ジヤーフアーメンターに
接種し、30℃において通気量10／mm，撹拌数
250rpmで120時間通気撹拌培養を行なつた。この
ようにして得られた培養液を集めて60とし、こ
れをラジオライト＃900（昭和化学工業社製）を加
えて濾過し培養ロ液60を得た。実施例２実施例１のようにして得られた培養ロ液60の
PHを4.0に塩酸で調製し、30の酢酸エチルで２
回抽出した。この抽出液を水洗後、無水芒硝で乾
燥して減圧濃縮した。この濃縮液にｎ―ヘキサン
を加えてDK―7814の赤色粗粉末を1.13ｇ得た。
この赤色粗粉末をクロロホルム10mlに溶解し、シ
リカゲル（CC―４・マリンクロツト社製）100ｇ
を充填したカラムに加えて初めクロロホルムで展
開した後クロロホルム―メタノール（100：５）
で溶出した。溶出液は20mlずつ分画した。各フラ
クシヨンの抗菌活性およびシリカゲル薄層クロマ
トグラフイーによつて各成分を検知した。フラク
シヨンNo.15〜20の画分には主にDK―7814―Ｂお
よび―Ｃが含まれており、フラクシヨンNo.21〜30
の画分には主にDK―7814―Ａが含まれていた。
各フラクシヨンを減圧濃縮して主にDK―7814―
ＢおよびＣが含まれている画分より230mgの粉末
を得た。また主にDK―7814―Ａが含まれている
画分より76mgの粉末を得た。実施例３実施例２で得られた主にDK―7814―Ｂおよび
Ｃが含まれている画分の粉末200mgを20mlのアセ
トニトリルに溶解し、その２mlをLS―410（2.54
×30cm、東洋曹達工業(株)製）の高速液体クロマト
用カラムにチヤージし、20Kg／cm²の加圧下に50％
のアセトニトリルで13.8ml／mmの流速で展開した
所、リテンシヨンタイム11.5分にDK―7814―Ｂ
のピークを、リテンシヨンタイム18.5分にDK―
7814―Ｃのピークをそれぞれ認めた。上記の操作
を10回行ないリテンシヨンタイム11.5分のピーク
の所を分取し、減圧濃縮するとDK―7814―B2mg
が粉末として得られた。またリテンシヨンタイム
18.5分のピークの所を分取し、減圧濃縮すると
DK―7814―C40mgが粉末として得られた。さら
に実施例２で得た主にDK―7814―Ａが含まれて
いる画分の粉末50mgを５mlのアセトニトリルに溶
解し、上記と同じ条件でLS―410を用いた高速液
体クロマトグラフイーを行なうとリテンシヨンタ
イム10.5分にDK―7814―Ａのピークを認めた。
このピークの所を分取し濃縮するとDK―7814―
A5mgが粉末として得られた。これらの抗生物質
DK―7814の物理化学的性状は本文中に詳述する
通りである。

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図および第３図は紫外線吸収スペ
クトルを、第４図、第５図および第６図は赤外吸
収スペクトルを示す。

Claims

【特許請求の範囲】１式で表わされる抗生物質DK―7814―Ａ，DK―
7814―ＢまたはDK―7814―Ｃ。ただし、式中R₁
はOHをR₂はＨまたはOHを意味するか、または
R₁とR₂で【式】を意味する。２ダクチロスポランギウム属に属するDK―
7814―Ａ，DK―7814―ＢまたはDK―7814―Ｃ
生産菌を培養し、培養物からDK―7814―Ａ，
DK―7814―ＢまたはDK―7814―Ｃを採取する
ことを特徴とする抗生物質DK―7814―Ａ，DK
―7814―ＢまたはDK―7814―Ｃの製法。３ダクチロスポランギウム属に属する菌株がダ
クチロスポランギウムプルプレウムに属する菌株
である特許請求の範囲第２項記載の方法。