JPH0338274B2

JPH0338274B2 -

Info

Publication number: JPH0338274B2
Application number: JP1178185A
Authority: JP
Inventors: Nozomi Ootake; Haruo Seto; Akira Shimazu; Hiroshi Nakayama; Mitsuo Ogura; Mitsuru Hisamatsu; Tetsuo Ishikawa
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd
Priority date: 1985-01-26
Filing date: 1985-01-26
Publication date: 1991-06-10
Also published as: JPS61172881A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規な抗生物質であるキユーロマイシ
ン（curromycin）Ａ又はＢとその製造法に関す
るものである。さらに詳しく述べると、本発明はストレプトマ
イセス属に属するキユーロマイシン生産菌を培地
に培養して得られた培養物から採取した新抗生物
質キユーロマイシンＡ又はＢと、その製造法に関
するものである。本発明者らは、ストレプトマイセス属に属する
キヤリオマイシン生産株の一変異株の培養物中よ
りグラム陽性菌及びマウス白血病細胞（Ｐ−388）
の生育を阻害する物質が生産されていることを見
出した。その有効物質を培養物質から純粋に単離
することに成功し、その性状を調べた結果、既知
の物質とは異なる新規な構造を有する２種類の物
質であることを確かめ、この２種類の有効物質を
それぞれキユーロマイシンＡ及びキユーロマイシ
ンＢと命名して本発明を完成した。したがつて第一の本発明は、下記の構造：〔式中、Meはそれぞれメチル基を表わし、キユ
ーロマイシンＡの場合にはＲはメトキシメチル基
（−CH₂OCH₃）であり、キユーロマイシンＢの
場合にはＲはメチル基である〕を有する新抗生物
質キユーロマイシンＡ又はＢを提供するものであ
る。本発明のキユーロマイシンＡ及びＢの理化学的
性状はつぎのとおりである。キユーロマイシンＡ１外観：微黄色粉末２融点：103〜105℃ ３比旋光度：〔α〕²¹ _D＋39.0（ｃ＝0.1，メタノー
ル）４質量分析（FAB−MS）： 714（Ｍ＋Ｎ） 752（Ｍ＋Ｋ）５元素分析：実測値Ｃ，63.65 ；Ｈ，7.41；Ｎ，5.25％計算値Ｃ，63.955；Ｈ，7.73；Ｎ，5.89％６分子式： C₃₈H₅₅N₃O₁₀ ７紫外部吸収スペクトル（メタノール中）： 228nm（ε19800），267nm（ε16300）， 275nm（ε19800），285nm（ε15100）８赤外吸収スペクトル：添付図面第１図に示
す。９薄層クロマトグラフイーのRf値：展開溶媒：クロロホルム：メタノール（24：１）：Rf 0.2 酢酸エチル：Rf 0.2 10 溶解性：水、ヘキサンに不溶メタノール、ク
ロロホルム、アセトンに可溶 11 呈色反応：I₂、硫酸に対する反応：陽性ニン
ヒドリン、塩化鉄に対する反応：陰性 12 酸性、中性、塩基性の別：中性キユーロマイシンＢ１外観：微黄色粉末２融点：106〜110℃ ３比旋光度：〔α〕²¹ _D＋35.0（ｃ＝0.1，メタノー
ル）４質量分析（FAB−MS）： 684（Ｍ＋Ｎ） 722（Ｍ＋Ｋ）５元素分析：実測値Ｃ，64.59；Ｈ，7.61；Ｎ，5.76％計算値Ｃ，65.01；Ｈ，7.76；Ｎ，6.15％６分子式： C₃₇H₅₃N₃O₉ ７紫外部吸収スペクトル（メタノール中）： 228nm（ε19800），267nm（ε16300）， 275nm（ε19800），285nm（ε15100）８赤外吸収スペクトル：添付図面第２図に示す９薄層クロマトグラフイーのRf値：展開溶媒：クロロホルム：メタノール（24：１）：Rf 0.2 酢酸エチル：Rf 0.2 10 溶解性：水、ヘキサンに不溶メタノール、ア
セトン、クロロホルムに可溶 11 呈色反応：I₂、硫酸に対する反応：陽性ニン
ヒドリン、塩化鉄に対する反応：陰性 12 酸性、中性、塩基性の別：中性上記の物理化学的性質及び炭素核磁気共鳴スペ
クトル等よりキユーロマイシンＡ及びＢの化学構
造はつぎのとおり決定された。ただし、キユーロマイシンＡ：Ｒ CH₃OCH₂
− キユーロマイシンＢ：Ｒ CH₃− 本発明によるキユーロマイシンＡ及びＢのマウ
ス白血病細胞（Ｐ−388）に対する50％阻害濃度
は、Ａ及びＢともに、120μｇ／mlであつた。また本発明によるキユーロマイシンＡ及びＢの
１％ペプトン寒天平板上でのバシラス・ズブチリ
ス IAM 1026に対するペーパーデイスク法によ
る生育阻止円径は下の表１のごとくである。

【表】また各種細菌に対する最小阻止濃度は下の表２
のごとくである。

【表】本発明はさらに、ストレプトマイセス属に属す
るキユーロマイシン生産菌を培養し、その培養物
からキユーロマイシンＡ及びＢ、あるいはキユー
ロマイシンＡ及びＢの両者を採取することを特徴
とする新抗生物質キユーロマイシンＡ又はキユー
ロマイシンＢ又はそれら両者の製造法を要旨とす
る。本発明に使用されるキユーロマイシン生産菌と
しては、その培養物中に採取するに十分な量のキ
ユーロマイシンＡ及び／又はＢを生産する能力を
有する菌であればいかなるものであつてもよい
が、このようなキユーロマイシン生産菌株の一例
としては、本発明者等により母株358−AV₂株を
変異処理して得られたEtBr32株がある。以下に
変異株EtBr32株と母株358−AV₂の諸性状を述べ
る。本変異株EtBr32はストレプトミセス属の一種
358−AV₂をエチジウム・ブロマイド処理するこ
とにより得られた。母株358−AV₂は富山県小矢
部市の草地で採取された土壌資料より分離され、
抗生物質キヤリオマイシを生産する。本菌株と母
株の特徴づけは国際ストレプトミセス・プロジエ
クト（ISP）及びワツクスマン氏の方法に準じ、
27℃で10日と20日間培養したものを基準に記載し
た。形態的性状：母株358−AV₂は、空中菌糸上に
多数のコイル状螺旋胞子鎖（通常径３〜4μｍ、
３〜４回転、20〜30胞子）を房状に単軸分枝す
る。胞子はほゞ球形、0.6〜0.7×0.6〜0.8μｍ、粗
面状表面を呈する。基生菌糸上に単独又は２連の
胞子をわずかに形成する。栄養寒天培地上で、基
生菌糸体の表面に菌核（径30〜40μｍ）や菌糸束
を形成し、短かい空中菌糸の先端に小さな球状体
を形成する。変異株EtBr32株の空中菌糸は用い
たすべての培地において肉眼的に観察されない。
しかし、光学顕微鏡的には少数の培地上で直状、
曲状、ループ状（１〜２回転）の短かい空中菌糸
が、ごくまれに観察される。基生菌糸上には単独
又は２連の胞子を形成し、培地によつては胞子の
集団的着生がみられる。基生菌糸に直接又は短枝
を分岐し、到卵形、2.5〜2.0×3.0〜4.0μｍの球状
体を形成する。液体培地で長期静置培養すると、
栄養菌糸の分節と分断がみられる。培養性状と生理的性状：母株358−AV₂と変異
株EtBr32の培養性状は表３に示す。母株は灰色
系列で黒湿斑点を散在する菌叢色と、淡黄色から
淡黄味茶色を経て灰味黄茶色又は明茶色の裏面色
及びPH指示性のない黄色拡散性色素をもつ。変異
株は空中菌糸を形成せず、淡黄色から淡黄味茶色
又は明茶色で、酸性でやゝ桃色味を帯びる裏面色
と、同様なPH指示性を示す淡黄味茶色の拡散性色
素をもつ。両株の生理的性状は表４に示すよう
に、ほとんど差異は認められない。両株ともに中
温性で、メラニン様色素を産生せず、試験に使用
した炭素源のすべてを同化する。母株の同定：母株358−AV₂の諸性状を
Streptomycsの概知種と比較すると、S.chib−
aensisとS.hygroscopicusに近似する。本菌株358
−AV₂は菌叢中に黒湿斑点を散在させる点と胞
子表面が粗面状を呈する点で、S.chibaensisより
S.hygroscopicusに近縁である。本菌株は黄色拡
散性色素をもつ点と全炭素源を同化する点でS.
hygroscopicus及びその５亜種と異なるが、概に
同種と同定されているキヤリオマイシン生産菌
IFO 13609、ガデゴマイシン生産菌IM7912Tと
はよく一致する。よつて母株358−AV₂はS.
hygroscopicusと同定し、ストレプトミセス・ハ
イグロスコピカス358−AV₂と命名された。変異株EtBr32は母株とつぎの５点で区別され
る。(1)空中菌糸の形成が悪く、肉眼的には観察さ
れない。(2)基生菌糸上の胞子着生が良好である。
(3)基生菌糸上に球状体を形成する。(4)液体培地で
栄養菌糸の分断がみられる。(5)拡散性色素が弱
く、PH指示性を示す。

【表】

【表】 (注) 裏：集落の裏面色、叢：集落の菌叢色、拡：培
地中への拡散性色素

【表】なお本菌株はストレプトマイセス・ハイグロス
コピカスEtBr32（Streptomyces hygroscopicus
EtBr32）株として工業技術院微生物工業技術研
究所に昭和59年12月３日以来寄託されており、受
託番号は微工研菌寄第7977号（FERM Ｐ−
7797）である。本菌株、すなわちEtBr−32株は他の放線菌の
場合にみられるようにその性状が変化しやすく、
たとえば紫外線、エツクス線、放射線、薬品等を
用いる人工的変異手段で変異しうるものであり、
このような変異株であつてもキユーロマイシンＡ
及び／又はＢの生産能を有するストレプトマイセ
ス属の菌はすべて本発明の方法に使用することが
できる。本発明の方法では、ストレプトマイセス属に属
するキユーロマイシン生産菌、たとえばEtBr−
32株を通常、微生物が利用しうる栄養物を含有す
る培地で培養する。たとえば、炭素源としてグル
コール、シユクロース、デキストリン、澱粉、水
あめ、糖みつ、植物油、動物油等を使用しうる。
また、窒素源として大豆粉、小麦胚芽、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、コーンステイープリ
カー、硝酸ソーダ、硫酸アンモニウム等を使用し
うる。その他、必要に応じて炭酸カルシウム、塩
化カリウム、燐酸塩等の無機塩類を添加するほ
か、菌の発育を助け、キユーロマイシンＡ及び／
又はＢの生産を促進するごとき有機物および無機
物を適当に添加することができる。培養法としては、一般の抗生物質生産の方法と
同じく好気的条件下での培養法であれば、いかな
る方法を適用してもよいが、深部培養が最も適し
ている。培養に適した温度は20〜35℃であるが、多くの
場合26〜32℃の付近で培養を行なうのが好まし
い。キユーロマイシンＡ及び／又はＢの生産は振
とう培養、タンク培養共に２〜７日で蓄積が最高
に達する。本発明のキユーロマイシンＡ及びＢの検定に当
つては、検定菌としてバシラス・ズブチリス
IAM1026を用いる。１％ペプトン寒天平板上で
の生育阻止円径は7μｇ／ml〜225μｇ／mlにおい
て濃度の対数と直線関係を示し、キユーロマイシ
ンＡ及びＢはともに12〜22mmの阻止円径を与え
る。本発明によつて得られるキユーロマイシンＡ及
びＢは中性の脂溶生物質であり、前述のような理
化学性状を有しているので、培養物からキユーロ
マイシンＡ及び／又はＢの採取にあたつては、そ
の性状を利用して抽出、精製することができる。
すなわち、培養液中に蓄積されたキユーロマイシ
ンＡ及び／又はＢは合成吸着剤であるダイヤイオ
ンHP−20等に吸着される。また水と混らない有
機溶剤、たとえば酢酸エチルで抽出すればキユー
ロマイシンＡ及びＢは有機溶剤層に抽出される。
また培養菌体中からはアセトン−水またはメタノ
ール−水で抽出される。キユーロマイシンＡ及びＢをさらに精製するに
は、シリカゲル、アルミナ等の吸着剤やセフアデ
ツクスLH−20（フアルマシア製）などを用いる
クロマトグラフイーや逆層系のカラム（SSC−
ODS−764、センシユー科学社製）等を用いる高
速液体クロマトグラフイーを行なうとよい。以上のような方法により、あるいはこれらを適
宜組合わせることにより、高純度のキユーロマイ
シンＡ及び／又はキユーロマイシンＢが微黄色粉
末として得られる。本発明は下記の実施例について具体的に説明す
るが、これに限定されるものではなく、ここに例
示しない多くの変形あるいは修飾手段を採用しう
ることはいうまでもない。実施例キユーロマイシンＡ及びＢの製造法ストレプトマイセス、ハイグロスコピカス
EtBr32株（微工研菌寄第7977号）の菌体をスタ
ーチ１％、大豆粉３％（PH７）の液体培地１
（500ml容三角フラスコ、10本使用）に接種し、28
℃で43時間振盪培養したものを種母とする。グリ
セリン２％、カゼイン0.5％、糖みつ１％、ポリ
ペプトン0.1％、炭酸カルシウム0.4％（PH7.4）の
組成からなる液体培地30に前記の種母を接種
し、28℃で72時間通気撹拌培養した（50ジヤー
フアーメンター）。ジヤーフアーメンター２基分の培養物をシヤー
プレス遠心機により遠心分離を行なつた。得られ
た液50を酢酸エチル15で２回抽出した後、
酢酸エチル層を減圧下に２に濃縮した。また菌
体をアセトン８で抽出し、別後得られた液
のアセトンを留去して２の濃縮液を得た。この
濃縮液を酢酸エチル１で２回抽出し、さきに培
養液より得られた酢酸エチル層と合わせて、
0.1規定塩酸、0.1規定水酸化ナトリウム、純水各
２ずつで洗浄後、無水硫酸ナトリウムで脱水
し、濃縮乾固した。得られた粗抽出物をクロロホ
ルムで充填したシリカゲル（ワコーゲルＣ−
2001.5）の塔の上に乗せ、クロロホルム−メタ
ノール混液（24：１）にて展開するクロマトグラ
フイーを行なつた。まずキヤリオマイシンが溶出
され、ついでカラム容量の3.5倍程度にキユーロ
マイシンＡ及びＢ混合物が溶出された。溶出液を
濃縮乾固し、再度同様のシリカゲルのクロマトグ
ラフイーを行ない、2.6ｇのキユーロマイシンＡ
及びＢ混合物を得た。キユーロマイシンＡ及びＢ
の分離には逆層系のカラム（センシユー科学社製
SSC−ODS−764）を用いる高速液体クロマトグ
ラフイーを行なつた。展開溶媒としてテトラヒド
ロフランと水（40：60）の混合溶媒を用い、流速
9.0ml／分で展開すると保持時間21分でキユーロ
マイシンＡが、22分でキユーロマイシンＢが溶出
された。このクロマトグラフイーをくり返してキ
ユーロマイシンＡの900mgとキユーロマイシンＢ
の300mgを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のキユーロマイシンＡの赤外吸
収スペクトル図（KBr錠として）、第２図は本発
明のキユーロマイシンＢの赤外吸収スペクトル図
（KBr錠として）である。

Claims

【特許請求の範囲】１下記の構造：〔式中、Meはそれぞれメチル基を表わし、キユ
ーロマイシンＡの場合にはＲはメトキシメチル基
（−CH₂OCH₃）であり、キユーロマイシンＢの
場合にはＲはメチル基である〕を有する新抗生物
質キユーロマイシンＡ又はＢ。２ストレプトマイセス属に属するキユーロマイ
シン生産菌を培養し、その培養物からキユーロマ
イシンＡ又はＢ又は両者を採取することを特徴と
する新抗生物質キユーロマイシンＡ又はキユーロ
マイシンＢ又は両者の製造法。