JP2803182B2

JP2803182B2 - 抗腫瘍性物質ｂｅ―１２２３３

Info

Publication number: JP2803182B2
Application number: JP1168036A
Authority: JP
Inventors: 勝久小尻; 寛之須田; 彬大倉; 健二河村; 昌則岡西
Original assignee: Banyu Phamaceutical Co Ltd
Current assignee: MSD KK
Priority date: 1989-06-29
Filing date: 1989-06-29
Publication date: 1998-09-24
Anticipated expiration: 2013-09-24
Also published as: JPH0330688A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は医薬の分野で有用であり、さらに詳細には腫
瘍細胞の増殖を阻害し、制癌効果を発揮する新規化合
物、その製法及びその用途並びに該新規物質を産生する
新規なストレプトミセス（Streptomyces）続に属する微
生物に関するものである。

従来の技術癌化学療法の分野においては、ブレオマイシン（Bleo
mycin）及びアドリアマイシン（Adriamycin）等の多く
の微生物代謝産物を臨床的に応用することが試みられ、
またこれらは実際に臨床において使用されている。しか
しながら、様々な種類の腫瘍に対してその効果は必ずし
も充分ではなく、また臨床上これらの薬剤に対する腫瘍
細胞の耐性現象が明らかにされるにつれ、その臨床的応
用性は複雑化している〔第47回日本癌学会総会記事、12
頁〜15頁（1988年）参照〕。

発明が解決しようとする課題このような状況においては、常に新規制癌物質の開発
が臨床上求められている。即ち、既存の制癌物質に対す
る耐性を克服する目的であり、また既存の制癌物質が充
分に効果を発揮できない種類の癌に対して有効である物
質が求められている。

課題を解決するための手段本発明者らは、該課題を解決することを目的として抗
腫瘍性物質について微生物代謝産物を広くスクリーニン
グした結果、後記の物質が優れた抗腫瘍作用を示すこと
を見い出して本発明を完成した。

即ち、本発明は式で表される新規な抗腫瘍性物質BE−12233、その製造法
及びその用途並びに該新規物質を産生する新規なストレ
プトミセス属に属する微生物に関するものである。

以下に、本発明に係わる新規な抗腫瘍性物質BE−1223
3について物理化学的な性状を示す。

BE−12233の理化学的性状性状：淡黄色アモルファス状固体若しくは結晶分子式:C₁₆H₁₆N₂O₃ 元素分析値：理論値炭素67.59％、水素5.67％実測値炭素67.45％、水素5.71％融点:300℃まで明瞭な融点を示さない。

マススペクトル:FABマススペクトルを第１図に示す。
〔（Ｍ＋Ｈ）⁺:285.1247〕 UVスペクトル：メタノール中（10μg/ml）で測定したUV
スペクトルを第２図に示す。

IRスペクトル:KBr錠剤法によるIRスペクトルを第３図に
示す。¹ H−NMRスペクトル:d₆−ジメチルスルホキシド中で測定
した¹H−NMRスペクトル（300MHz）を第４図に示す。¹³ C−NMRスペクトル:d₆−ジメチルスルホキシド中で測
定した¹³C−NMRスペクトル（75MHz）を第５図に示す。

溶解性：水に溶けにくく、ジメチルスルホキシドなどの
有機溶媒に易溶。

酸性、中性、塩基性物質の区別：中性物質 Rf値:0.5（メルク社製、キーゼルゲル60F₂₅₄使用，展開
溶媒；クロロホルム／メタノール＝10/1）呈色反応：過マンガン酸カリウム反応陽性BE−12233
の生物学的活性抗腫瘍性物質BE−12233のマウス実験腫瘍細胞に対す
る増殖阻止作用を決定するため、in vitroで試験を行っ
た。P388腫瘍細胞に対するin vitroの抗腫瘍作用試験
は、試験化合物をまずジメチルスルホキシドに溶解した
のち、20％にジメチルスルホキシドを含む細胞培養用培
地（20％DMSO−RPMI−1640培地）で逐次希釈し、３×10
⁴個の腫瘍細胞を含む細胞培養用培地（仔牛血清10％含
有RPMI−1640培地）200μに対し２μを加えた。37
℃で72時間、５％CO₂下で培養したのち、コールターカ
ウンターにて生存する細胞数をカウントし、対照群と比
較した。その結果、BE−12233はP388腫瘍細胞に対し、
強い増殖阻止作用を示し、BE−12233の腫瘍細胞の増殖
を50％阻止する濃度（IC₅₀）はP388/S細胞に対しては1.
3μＭであり、P388/V細胞に対しては1.5μＭであった。

ここにおいてP388/Sは通常のマウス白血病細胞の一種
であり、P388/V細胞は制癌物質ビンクリスチンに対して
耐性を獲得したP388白血病細胞である。

本発明化合物を抗腫瘍剤として使用する場合、有効量
の本発明化合物単独又は有効量の本発明化合物及び不活
性且つ薬学的に許容しうる担体から成る医薬組成物とし
て使用される。

この医薬組成物は、本発明化合物と不活性な薬学的担
体とを組み合わせて公知の方法で製造され、各種の処方
で経口的、非経口的若しくは局所的に投与される。適切
な組成物の例としては、錠剤、カプセル、丸剤、粉末若
しくは顆粒等の経口投与用の固形組成物又は溶液、サス
ペンジョン若しくはエマルジョンのような経口投与用の
液体組成物が挙げられる。また、使用直前に滅菌水、生
理的食塩水若しくは他の注射用滅菌溶剤に溶解しうる滅
菌組成物の形で製造することもできる。

本発明の化合物の実際に好ましい投与量は、使用され
る化合物の種類、配合された組成物の種類、適用頻度及
び治療すべき特定部位、宿主及び腫瘍によって変化する
ことに注意すべきである。一日当りの成人一人当りの投
与量は、経口投与の場合10ないし1000mgであり、非経口
投与の場合10ないし500mgである。非経口投与法として
は静脈内注射が好ましい。なお、投与回数は投与方法及
び症状により異なるが、１回ないし数回である。

本発明の抗腫瘍性物質BE−12233の製造法について説
明する。

本発明の抗腫瘍性物質BE−12233の製造に使用する微
生物又はその変異株は、抗腫瘍性物質BE−12233を産生
するものならばいずれでも良いが、例えば以下の菌学的
性状を有する微生物を挙げることができる。

1.形態 BA−12233株は、顕微鏡下で、よく発達した気菌糸の
先端より50ヶ以上の分節胞子の長い連鎖を付け、直線状
及び屈曲状に伸びている。輪生状のものは認められな
い。この胞子は大きさが0.7×１〜２μｍ位の円筒状
で、胞子のう、鞭毛胞子、菌核等の特殊な器官及び菌糸
の分断は観察されない。さらにこの胞子の平面は平滑で
ある。

2.各種寒天平板培地における培養性状各種寒天平板培地において28℃、14日間培養した結果
を第１表に示す。

3.生育温度（イースト・麦芽エキス寒天培地、14日間培
養） 12℃：生育及び気菌糸形成は良好 20℃：生育及び気菌糸形成は良好 28℃：生育及び気菌糸形成は良好 37℃：生育は良好で気菌糸形成は不良 45℃：生育せず 4.生理学的諸性質（１）ゼラチンの液化陰性（グルコース・ペプトン・ゼラチン培地）（２）スターチの加水分解陽性（スターチ・無機塩寒天培地）（３）脱脂粉乳の凝固及びペプトン化陰性（スキムミルク培地）（４）メラニン様色素の生成陽性（ペプトン・イースト・鉄寒天培地）（５）食塩耐性食塩含有量７％以下で生育（イースト・麦芽寒天培地） 5.炭素源の利用能プリドハム・ゴドリーブ寒天を基礎培地として、下記
各種糖を添加し、28℃、14日間培養した。その結果を第
２表に示す。

6.細胞壁のアミノ酸 LL−ジアミノピメリン酸及びグリシンが検出された。

以上の菌学的性状により、BA−12233株は放線菌スト
レプトミセス属に属することが判明した。

従って、本発明者らは、BA−12233株をストレプトミ
セス・エスピーBA−12233（Streptomyces sp.BA−1223
3）と称することにした。

なお、本菌株は通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されており、その微工研受託番号は微工研
菌寄第10492号（FERM P−10492）である。

本発明で使用する抗腫瘍性物質BE−12233を産生する
微生物の変異株は、例えばＸ線若しくは紫外線等の照射
処理、例えばナイトロジェン・マスタード、アザセリ
ン、亜硝酸、２−アミノプリン若しくはＮ−メチル−
Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（NTG）等の変
異誘起剤による処理、ファージ接触、形質転換、形質導
入又は接合等の通常用いられる菌種変換処理方法により
抗腫瘍性物質BE−12233産生菌を変異させた微生物であ
る。

本発明のBE−12233を製造するにあたり、BE−12233の
生産菌株BA−12233株を栄養源含有培地に接種して好気
的に発育させることにより、BE−12233を含む培養物が
得られる。栄養源としては、放線菌の栄養源として公知
のものが使用できる。例えば、炭素源としては、市販さ
れているブドウ糖、グリセリン、麦芽糖、デンプン、庶
糖、糖蜜又はデキストリンなどが単独又は混合物として
用いられる。窒素源としては、市販されている大豆粉、
コーンスティープリカー、肉エキス、酵母エキス、綿実
粉、ペプトン、小麦胚芽、魚粉、無機アンモニウム塩又
は硝酸ナトリウムなどが単独又は混合物として用いられ
る。無機塩としては、市販されている炭酸カルシウム、
塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム又は
各種リン酸塩などを使用することができる。その他必要
に応じて、鉄、マンガン又は亜鉛などの重金属塩を微量
添加することもできる。また、発泡の著しい時には、消
泡剤として、例えば大豆油又は亜麻仁油等の植物油、オ
クタデカノール等の高級アルコール類、各種シリコン化
合物等を適宜添加しても良い。これらのもの以外でも、
該生産菌が利用し、BE−12233の生産に役立つものであ
れば、いずれも使用することができる。

培養方法としては、一般の微生物代謝産物の生産方法
と同様に行えばよく、固体培養でも液体培養でもよい。
液体培養の場合は、静置培養、撹拌培養、振盪培養又は
通気培養などのいずれを実施してもよいが、特に振盪培
養又は深部通気撹拌培養が好ましい。培養温度は20℃〜
37℃が適当であるが、25℃〜30℃が好ましい。好ましい
培地のpHは４〜８の範囲で、培養時間は24時間〜192時
間、好ましくは48時間〜120時間である。

培養物から目的とするBE−12233を採取するには、微
生物の生産する代謝物の培養物から採取するのに通常使
用される分離手段が適宜利用される。BE−12233は培養
濾液中及び菌体中に存在するので、培養濾液又は菌体よ
り通常の分離手段、例えば溶媒抽出法、イオン交換樹脂
法又は吸着若しくは分配クロマトグラフィー法及びゲル
濾過法等を単独又は組合せて行うことにより精製でき
る。また高速液体クロマトグラフィーや薄層クロマトグ
ラフィーなども抽出精製に利用可能である。

好ましい分離−精製の例としては次の方法が挙げられ
る。まず培養液を遠心分離し、菌体を得る。得られた菌
体をメタノール又はアセトン等の有機溶媒を用いて抽出
する。抽出物を減圧下に濃縮し、濃縮液を酢酸エチルな
どの有機溶媒で抽出する。この抽出液を濃縮することに
より、BE−12233を含む粗物質が得られる。次に、シリ
カゲルのカラムクロマトグラフィーを行って精製すれ
ば、BE−12233を淡黄色の結晶状物質として得ることが
できる。

次に実施例を挙げ、本発明を具体的に説明する。しか
しながら、本発明は実施例に限定されるものではなく、
実施例の修飾手段はもちろん、本発明によって明らかに
されたBE−12233の性状に基づいて、公知の手段を用い
てBE−12233を生産、濃縮、抽出、精製する方法すべて
を包括する。

実施例斜面寒天培地に培養した放線菌BA−12233株をグルコ
ース0.1％、デキストリン2.0％、コーングルテンミール
1.0％、魚粉0.5％、酵母エキス0.1％、塩化ナトリウム
0.1％、硫酸マグネシウム0.05％、塩化カルシウム0.05
％、硫酸第一鉄0.0002％、塩化第一銅0.00004％、塩化
マンガン0.00004％、塩化コバルト0.00004％、硫酸亜鉛
0.00008％、ホウ酸ナトリウム0.00008％、モリブデン酸
アンモニウム0.00024％、及び３−（Ｎ−モルホリノ）
プロパンスルホン酸0.5％からなる培地（pH6.7）110ml
を含む500ml容の三角フラスコ４本に接種し、28℃で72
時間、回転振盪機（毎分180回転）上で培養した。この
培養液を2mlずつ、上記の培地を110ml含む500ml容の三
角フラスコ50本に接種し、28℃で120時間、回転振盪機
（毎分180回転）上で培養した。

培養液を濾過し、得られた菌体をメタノール３を用
いて抽出し、メタノール抽出液2.5を減圧下に200mlに
まで濃縮した後、濃縮液を2N塩酸でpH3に修正した。こ
の溶液を酢酸エチル800mlで抽出し、酢酸エチル層を減
圧下に濃縮し、粗物質0.3gを得た。得られた粗物質につ
いてシリカゲルクロマトグラフィーを行い（2.5×30c
m）、展開溶媒クロロホルム−メタノール（50:1）で溶
出して得られる活性画分を濃縮乾固し、メタノールで溶
解して濃縮していくことにより生じるBE−12233の淡黄
色結晶を濾取し、14.6mgを得た。

発明の効果本発明に記載するBE−12233は、既存の制癌剤に耐性
を有する腫瘍細胞に対しても該制癌剤に耐性を獲得して
いない細胞と同程度の増殖阻止効果を有することから、
医薬の分野で癌の治療剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図は、BE−12233のFABマススペクトルの図である。
第２図は、メタノール中におけるBE−12233の紫外部及
び可視部の吸収スペクトルの図である。第３図は、BE−
12233のKBr錠剤法による赤外吸収スペクトルの図であ
る。第４図は、BE−12233のd₆−ジメチルスルホキシド
中における300MHz ¹H−NMRスペクトルの図である。第５
図は、BE−12233のd₆−ジメチルスルホキシド中におけ
る75MHz ¹³C−NMRスペクトルの図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 17/18 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者岡西昌則東京都目黒区下目黒２丁目９番３号萬有製薬株式会社探索研究所内審査官斉藤真由美 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 17/00 - 17/18 A61K 31/47 C12N 1/20 C07D 471/04 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】式で表される抗腫瘍性物質BE−12233。
【請求項２】式で表される抗腫瘍性物質BE−12233を有効成分とする抗
腫瘍剤。
【請求項３】式で表される抗腫瘍性物質BE−12233の製造に際し、抗腫
瘍性物質BE−12233を産生する微生物又はその変異株を
培養して抗腫瘍性物質BE−12233を蓄積させ、採取する
ことを特徴とする製法。
【請求項４】ストレプトミセス・エスピーBA−12233（S
treptomyces sp.BA−12233）株又はその変異株を培養す
ることを特徴とする第３請求項記載の製法。
【請求項５】式で表される抗腫瘍性物質BE−12233を生産する能力を有
するストレプトミセス・エスピー（Streptomyces sp.）
BA−12233株又はその変異株。