JPH0764851B2

JPH0764851B2 - リベロマイシンｂ、ｃ、及びｄ、その製造法並びに抗腫瘍剤及び抗真菌剤

Info

Publication number: JPH0764851B2
Application number: JP4006669A
Authority: JP
Inventors: 清磯野; 裕之長田; 広雪越野; 英俊高橋; 進二清水; 誠吉浜
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1992-01-17
Filing date: 1992-01-17
Publication date: 1995-07-12
Anticipated expiration: 2010-07-12
Also published as: JPH05194525A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規抗生物質及びその
製造方法、並びに該抗生物質を有効成分として含む抗腫
瘍剤及び抗真菌剤に関する。

【０００２】

【従来の技術】癌細胞の異常な増殖は、細胞増殖因子伝
達系の異常に由来することが多い。例えば、多くの癌細
胞では自己増殖を促進する腫瘍増殖因子アルファー（Ｔ
ＧＦ−α）を分泌することが知られている。従ってＴＧ
Ｆ−αの作用を選択的に阻害する薬剤は制癌剤として有
用であることが期待される。従来、この様な薬剤として
エルブスタチン等が知られているが、いずれも作用が十
分ではなく、また血液中で活性を失うという点からも有
用性に問題があった。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題及び課題を解決するため
の手段】従って、本発明は癌細胞の増殖因子を阻害し、
癌細胞の増殖を制御する新規物質の提供を目的とする。
同時に、該物質を含む制癌剤を提供することを目的とす
る。本発明者らは、先にＴＧＦ−αと類似の細胞増殖因
子である上皮増殖因子（ＥＧＦ）を用いてその阻害剤を
検索し、新規物質リベロマイシンＡ（ReveromycinA)を
見出した。そして、該抗生物質が顕著なＥＧＦ阻害作用
を示し、種々の癌細胞に対する増殖阻害活性を有するこ
と、及び該物質を含む医薬用組成物が抗真菌剤として有
用であることを明らかにし、これらの発明について特許
出願を行った（特願平２−１５５８１６号）。本発明者
はさらに研究を続けた結果、新規抗生物質としてリベロ
マイシンＢ、リベロマイシンＣ、及びリベロマイシンＤ
を見出し、本発明を完成した。

【０００４】すなわち本発明は、該抗生物質リベロマイ
シンＡの類縁体であるリベロマイシンＢ、リベロマイシ
ンＣ、及びリベロマイシンＤを提供するものである。ま
た、ストレプトミセス（Streptomyces) 属に属しリベロ
マイシンＢ、リベロマイシンＣ、及びリベロマイシンＤ
からなる群から選ばれる抗生物質リベロマイシンを生産
する菌を培養し、その培養物から抗生物質リベロマイシ
ンＢ、リベロマイシンＣ、及び／又はリベロマイシンＤ
を分離採取することを特徴とする該抗生物質の製造法を
提供するものである。さらに、本発明の別の態様によれ
ば、該抗生物質を有効成分として含有する抗腫瘍剤、及
び該抗生物質を有効成分として含有する抗真菌剤が提供
される。

【０００５】本発明者が先に見出した抗生物質リベロマ
イシンＡは、下記の構造式で示される抗生物質であり、
以下の理化学的性質を有する。

【０００６】

【化４】

【０００７】(1) 性状：白色粉末 (2) 融点：９５℃ (3) 分子式：Ｃ₃₆Ｈ₅₂Ｏ₁₁ (4) 元素分析：Ｃ：６4.４５％、Ｈ：8.０６％、
（Ｃ₃₆Ｈ₅₂Ｏ₁₁・１／２Ｈ₂Ｏとして） (5) 比旋光度：〔α〕²⁰ _D＝−１１５°（ｃ＝0.１、
メタノール中） (6) 紫外線吸収スペクトル（メタノール中):λ^MEOH _max
nm（ε）２３８（２5,３００）、２６０（ｓｈ、１2,２００） (7) 赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）３４３０、２９３０、１６９０、１６４０、１６１０、
１３８０、１２５０、１１６０、９７０cm^-1 (8) 溶解性：ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、
メタノールに易溶、酸性水に不溶 (9) 高分解能ＦＡＢ−ＭＳ：６８3.３４９６（Ｍ＋Ｎ
ａ）⁺ (10)呈色反応：ヨウ素、アニスアルデヒド、ＢＣＧに陽
性、ニンヒドリン、ドラゲンドルフに陰性本発明のリベロマイシンＢは以下の構造式で示され、下
記の理化学的性質を有する。

【０００８】

【化５】

【０００９】(1) 性状：白色粉末 (2) 融点：７８−７９℃ (3) 分子式：Ｃ₃₆Ｈ₅₂Ｏ₁₁ (4) 分子量：６６０ (5) 比旋光度：〔α〕²⁴ _D＝−６６°（ｃ＝0.１、メ
タノール中） (6) 紫外線吸収スペクトル（メタノール中、λ^MeOH _max
nm）：２３９（ε２８８００） (7) ＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ６８３（Ｍ＋Ｎａ）⁺ (8) 溶解性：ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、
メタノールに易溶、酸性水に不溶 (9) 呈色反応：ヨウ素、アニスアルデヒド、ＢＣＧに陽
性、ニンヒドリン、ドラゲンドルフに陰性本発明のリベロマイシンＣは以下の構造式で示され、下
記の理化学的性質を有する。

【００１０】

【化６】

【００１１】(1) 性状：白色粉末 (2) 融点：７８−７９℃ (3) 分子式：Ｃ₃₇Ｈ₅₄Ｏ₁₁ (4) 分子量：６７４ (5) 比旋光度：〔α〕²⁴ _D＝−９０°（ｃ＝0.１、メ
タノール中） (6) 紫外線吸収スペクトル（メタノール中、λ^MeOH _max
nm）：２３９（ε３０８００） (7) ＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ６９７（Ｍ＋Ｎａ）⁺ (8) ＦＡＢ−ＨＲ−ＭＳ：ｍ／ｚ６９7.３５７４（計
算値：６９7.３５６４） (9) 溶解性：ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、
メタノールに易溶、酸性水に不溶 (10)呈色反応：ヨウ素、アニスアルデヒド、ＢＣＧに陽
性、ニンヒドリン、ドラゲンドルフに陰性本発明のリベロマイシンＤは以下の構造式で示され、下
記の理化学的性質を有する。

【００１２】

【化７】

【００１３】(1) 性状：白色粉末 (2) 融点：７８−８０℃ (3) 分子式：Ｃ₃₇Ｈ₅₄Ｏ₁₁ (4) 分子量：６７４ (5) 比旋光度：〔α〕²⁴ _D＝−１１２°（ｃ＝0.１、
メタノール中） (6) 紫外線吸収スペクトル（メタノール中、λ^MeOH _max
nm）：２３８（ε３０４００） (7) ＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ６９７（Ｍ＋Ｎａ）⁺ (8) ＦＡＢ−ＨＲ−ＭＳ：ｍ／ｚ６９7.３５７５（計
算値：６９7.３５６４） (9) 溶解性：ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、
メタノールに易溶、酸性水に不溶 (10)呈色反応：ヨウ素、アニスアルデヒド、ＢＣＧに陽
性、ニンヒドリン、ドラゲンドルフに陰性上記のリベロマイシンＢ、リベロマイシンＣ、及びリベ
ロマイシンＤは、群馬県倉淵村より採取された土壌から
分離されたストレプトミセスsp. ＳＮ−５９３（Strept
omyces sp. SN-593)を培養して得た培養物から分離精製
された。該ストレプトミセスsp. ＳＮ−５９３は、平成
２年６月５日付で工業技術院微生物工業技術研究所に寄
託番号微工研菌第１１５０３号（ＦＥＲＭ−１１５０
３）として寄託されており、該寄託番号は、平成３年５
月２０日にブタペスト条約に基づく国際寄託番号３４０
６号に訂正されている。

【００１４】ストレプトミセスsp. SN-593の菌学的性質
は以下の通りである。 1. 菌体を、６Ｎ塩酸を用いて１１０℃で１８時間加水
分解した場合に、薄膜クロマトグラフィー上で、Ｌ，Ｌ
−ジアミノピメリン酸を検出したが、メソ−ジアミノピ
メリン酸は検出されなかった。寒天平板上に発育させた
場合、電子顕微鏡観察では、気菌糸は不完全な螺旋状を
呈し、胞子表面は平滑で円筒型であった。 2. 各種培地上における生育状態（２７℃、２０日間培
養、色調はカラーハーモニーマニュアル第４版（Contai
ner 社) による）は、以下の通りであった。

【００１５】１）スターチ・イースト寒天培地発育：豊富気菌糸：豊富気菌糸色調：灰（２ｉｈ）裏面色調：ビーバー（３ｌｉ）可溶性色素：無２）イーストエキス・モルトエキス寒天培地発育：豊富気菌糸：豊富気菌糸色調：灰（３ｉｈ）裏面色調：チョコレート（５ｐｏ）可溶性色素：無３）オートミール寒天培地発育：豊富気菌糸：豊富気菌糸色調：２ｍｌ裏面色調：カラシ色（２ｎｅ）可溶性色素：無４）スターチ・無機塩寒天培地発育：豊富気菌糸：豊富気菌糸色調：灰（３ｉｈ）裏面色調：くり茶（４ｎｉ）可溶性色素：無５）Ｖ８ジュース寒天培地発育：普通気菌糸：少ない気菌糸色調：灰（３ｉｈ）裏面色調：黒（２ｐｏ）可溶性色素：無６）蔗糖硝酸塩寒天培地発育：普通気菌糸：良好気菌糸色調：黄褐色（２ｇｅ）裏面色調：無色可溶性色素：無７）グルコース・アスパラギン寒天培地発育：良好気菌糸：良好気菌糸色調：灰（２ｆｅ）裏面色調：カラシ色（２ｎｅ）可溶性色素：無８）グリセロール・アスパラギン寒天培地発育：普通気菌糸：普通気菌糸色調：ナチュラル（２ｄｃ）裏面色調：黄色（３ｎｇ）可溶性色素：無９）ポテト−にんじん寒天培地発育：良好気菌糸：良好気菌糸色調：灰（５ｆｅ）裏面色調：無色可溶性色素：無以上の菌学的性質からＳＮ−５９３株をストレプトミセ
ス属に属する菌であると同定した。

【００１６】本発明のリベロマイシンＢ、リベロマイシ
ンＣ、及びリベロマイシンＤは、上記菌株を栄養源含有
培地に接種し、好気的に培養することにより製造され
る。抗生物質の生産菌としては、上記菌株に限らず、ス
トレプトミセス属に属し該抗生物質を生産する能力を有
するものであれば、すべて本発明に使用できる。上記微
生物の培養方法は、原則的には一般微生物の培養法に準
ずるが、通常は液体培養による振盪培養法、通気攪拌培
養法などの好気的条件下で行なうのが好適である。

【００１７】培養に用いられる培地としては、ストレプ
トミセス属に属する微生物が利用できる栄養源を含有す
る培地であればよく、各種合成培地、半合成培地、寒天
培地等のいずれの培地を使用してもよい。培地組成とし
ては、炭素源として、グルコース、シュークロース、フ
ルクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜、
コーン・スティープ・リカー、有機酸、またはこれらの
任意の混合物を用いることができる。窒素源としては、
ファーマメディア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、
大豆粉、カゼイン、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、
硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源を
単独で、または組み合せて用い得る。ナトリウム塩、カ
リウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、その他の重金属
塩などを、必要に応じて添加使用してもよい。なお、培
養中発泡の著しいときは、アデカノール（登録商標）、
シリコーンオイル等の公知の各種消泡剤を、適宜培地中
に添加することもできるが、その添加量は、目的物質の
生産に悪影響を与えない添加量である必要がある。例え
ば0.５重量％以下で添加使用することが好ましい。

【００１８】培地のpHは微生物の至適pH範囲、通常中性
付近とするのが望ましい。培地温度は、微生物が良好に
生育する温度であればよく、通常2.０〜４０℃、特に好
ましくは２７℃付近に保つのがよい。培養時間は、液体
培養の場合、一般に１〜５日間程度、好ましくは約７２
時間である。上記培養によって目的とする抗生物質リベ
ロマイシンが生成蓄積される。上述した各種の培養条件
は、使用する微生物の種類や特性、外部条件などに応じ
て適宜変更してもよく、当業者によれば、容易に最適条
件が選択、調節される。

【００１９】上記培養により生産される抗生物質の単離
は、リベロマイシンＢ、リベロマイシンＣ、及びリベロ
マイシンＤの蓄積が最大になる時に、発酵生産物を採取
する一般的方法に準じて行えばよい。例えば、抗生物質
リベロマイシンと不純物との溶解度差を利用する手段、
吸着親和力の差を利用する手段、分子量の差を利用する
手段のいずれによっても実施でき、それぞれの方法は単
独、または適宜組合せて、あるいは反復して使用され
る。

【００２０】具体的には、リベロマイシンＢ、リベロマ
イシンＣ、及びリベロマイシンＤは、培養濾液にその大
部分が存在するので、その培養濾液を、各種のゲル濾過
クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、液体ク
ロマトグラフィー等を組合せて精製すると、リベロマイ
シンＢ、リベロマイシンＣ、及びリベロマイシンＤと、
その他の活性成分を含む画分が得られる。この画分を凍
結乾燥して得られた粉末を、更に高速液体クロマトグラ
フィー（例えばカプセルパックカラム）を用い、例えば
１８％メタノール：0.０１％アンモニアの系で展開によ
り精製すれば、リベロマイシンＢ、リベロマイシンＣ、
及びリベロマイシンＤを含むそれぞれの精製白色粉末を
得ることができる。

【００２１】以下に本発明の抗生物質リベロマイシン
Ｂ、リベロマイシンＣ、及びリベロマイシンＤの製造方
法の一例を示すが、本発明の製造方法はこれらの実施例
に限定されない。

【００２２】例１グルコース２％、可溶性デンプン１％、肉エキス0.１
％、乾燥酵母0.４％、大豆粉2.５％、食塩0.２％の組成
からなる２リットルの培地に、ストレプトミセスＳＮ−
５９３株を接種し、前培養液とした。この前培養液1.５
リットルを同組成の培地１２０リットルを含む２００リ
ットル容タンクに接種し、２７℃で１１７時間にわたり
通気攪拌培養した。この全培養液の濾液約１００リット
ルを、１8.５リットル容量のダイヤイオンＨＰ２０に吸
着させ、約３６リットルの３０％メタノールで不純物を
溶出させた後、３６リットルの１００％メタノールで活
性成分を溶出させた。活性成分を含むフラクションを減
圧濃縮した後、２リットルの酸性水（１Ｎ塩酸でpH５に
調整）を加え、等量の酢酸エチルで２回抽出した。酢酸
エチル層を減圧濃縮して得られた残渣を少量のクロロホ
ルム：メタノール混合液（２：１）に溶解し、2.２リッ
トル容量のシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付し
た。4.５リットルのクロロホルム：メタノール混合液
（２：１）で洗浄した後、4.５リットルの１００％メタ
ノールで溶出して活性画分を得た。さらに活性画分を減
圧濃縮した後、残渣を少量の２０％メタノールに溶解し
て１リットル容量のセファデックスＬＨ−２０カラムに
付し、1.５リットルの２０％メタノールで展開して活性
画分を回収した。活性画分を減圧濃縮した後に凍結乾燥
し、リベロマイシンＡ、リベロマイシンＢ、リベロマイ
シンＣ、及びリベロマイシンＤを含む粗精製物約８ｇを
得た。

【００２３】この粗精製物を高速液体クロマトグラフィ
ー（カラム:CAPCELL PAK C₁₈, 100mmφ×500 mm、検出:
UV 240 nm) に付し、メタノール：水：１％アンモニア
水（１８：８１：１）の混合溶媒を用いて、流速２２０
ml／分で展開してリベロマイシンＡ、リベロマイシン
Ｂ、リベロマイシンＣ、及びリベロマイシンＤをそれぞ
れ単一の成分として含むフラクションを回収した。各フ
ラクションを減圧濃縮し、残った水溶液を１Ｎ塩酸でpH
５に調整した後、等量の酢酸エチルで２回抽出した。酢
酸エチル層を減圧濃縮して得られた残渣を凍結乾燥し、
約３ｇのリベロマイシンＡ、約１２mgのリベロマイシン
Ｂ、約８０mgのリベロマイシンＣ、及び約１４mgのリベ
ロマイシンＤを得た。

【００２４】例２上記のリベロマイシンＢ、リベロマイシンＣ、及びリベ
ロマイシンＤと、特願平2-155816号の明細書に記載され
た抗生物質リベロマイシンＡについて、サブローデキス
トロース寒天培地を用いた寒天希釈法により、ＭＩＣ
（最小発育阻止濃度）を測定した。その結果、キャンデ
ィダアルビカンス (Candida albicans)IF01594に対する
ＭＩＣは、それぞれ、リベロマイシンＡ：２５０μg/m
l；リベロマイシンＢ：＞２５０μg/ml；リベロマイシ
ンＣ：２５０μg/ml；及びリベロマイシンＤ：２５０μ
g/mlであった。

【００２５】例３（癌細胞増殖阻害試験）２×１０⁴個／mlのヒト口腔癌細胞ＫＢ及びヒト白血病
細胞Ｋ５６２を、それぞれＤＭＥＭ（５％牛胎仔血清含
有）及びＲＰＭＩ１６４０培地（１０％牛胎仔血清含
有）で２４時間培養した。この培養物に、一連の希釈系
列のリベロマイシンＢ、リベロマイシンＣ、リベロマイ
シンＤ、及びリベロマイシンＡをそれぞれ加えて７２時
間培養し、ＭＴＴ試薬を加えて細胞の生育を計測した。
各濃度における増殖阻害率を算出し、グラフからＩＣ₅₀
値を求めた。結果を表１に示す。

【００２６】

【表１】抗生物質リベロマイシンの細胞増殖抑制効果５０％阻害濃度（μg/ml）化合物ヒト口腔癌細胞ＫＢヒト白血病細胞Ｋ５６２リベロマイシンＡ 1.９ 1.６リベロマイシンＢ＞５０＞５０リベロマイシンＣ 2.０ 2.０リベロマイシンＤ 1.６ 1.３

【００２７】例４（上皮増殖因子（ＥＧＦ）に反応して
生じるマウス上皮細胞のＤＮＡ合成阻害試験）静止期のマウス上皮細胞にＥＧＦ（５ng/ml)を加え、さ
らにリベロマイシンＢ、リベロマイシンＣ、リベロマイ
シンＤ、及びリベロマイシンＡを添加した後、１７時間
目に³Ｈラベルのチミジン（１μCi/ml)を培地に加え
た。５時間ラベルした細胞の酸不溶性画分の放射活性
を、液体シンチレーションカウンターで計数してＤＮＡ
合成量を測定した。尚、阻害率は次の方法により算出し
た。結果を表２に示す。

【００２８】

【００２９】

【表２】化合物５０％阻害濃度（μg/ml）リベロマイシンＡ 2.０リベロマイシンＢ 7.０リベロマイシンＣ 0.８リベロマイシンＤ 1.２

【００３０】例５（温度感受性ガン遺伝子（ｓｒｃ^ts）
でトランスフォームしたラット細胞（ＮＲＫ）に対する
効果）ｓｒｃ^ts−ＮＲＫ細胞を３２℃で培養すると、トランス
フォームして球状の細胞が増えるが、３９℃で培養する
と、球状の細胞は消失して平らに接着した細胞だけにな
る。薬剤を３２℃で培養した細胞に加え、２４時間後に
顕微鏡観察して球状細胞を計数した。薬効の判定は以下
の様に算出した。結果を表３に示す。

【００３１】

【表３】化合物５０％阻害濃度（μg/ml）リベロマイシンＡ 2.０リベロマイシンＢ５０リベロマイシンＣ 1.０リベロマイシンＤ 1.０上記のリベロマイシンＢ、リベロマイシンＣ、及びリベ
ロマイシンＤを含む医薬用組成物は、常法により錠剤、
散剤、カプセル剤、注射剤、吸入剤または外用剤等の製
剤とすることができ、経口または非経口投与により抗腫
瘍剤若しくは抗真菌剤として臨床に供される。投与量は
治療すべき症状及び投与方法により左右されるが、抗腫
瘍剤として投与する場合には成人１日あたり１mg〜1,０
００mgであり、抗真菌剤として投与する場合には成人１
日あたり１０mg〜1,０００mgである。尚、リベロマイシ
ンＢ、リベロマイシンＣ、及びリベロマイシンＤのマウ
ス急性毒性値は、それぞれ２００、１００mg／kg以上
（静注）である。

【００３２】

【発明の効果】以上の様に、本発明の新規抗生物質リベ
ロマイシンＢ、リベロマイシンＣ、及びリベロマイシン
Ｄは、抗腫瘍作用及び抗真菌作用を有するので抗腫瘍剤
及び抗真菌剤として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の抗生物質リベロマイシンＢの紫外線
吸収スペクトル（１００％メタノール中）を示す図であ
る。

【図２】本発明の抗生物質リベロマイシンＣの紫外線
吸収スペクトル（１００％メタノール中）を示す図であ
る。

【図３】本発明の抗生物質リベロマイシンＤの紫外線
吸収スペクトル（１００％メタノール中）を示す図であ
る。

【図４】本発明の抗生物質リベロマイシンＢの赤外線
吸収スペクトル（ＫＢｒ）を示す図である。

【図５】本発明の抗生物質リベロマイシンＣの赤外線
吸収スペクトル（ＫＢｒ）を示す図である。

【図６】本発明の抗生物質リベロマイシンＤの赤外線
吸収スペクトル（ＫＢｒ）を示す図である。

【図７】本発明の抗生物質リベロマイシンＢの５００
ＭＨｚ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ₃ＯＤ中）を示す
図である。

【図８】本発明の抗生物質リベロマイシンＣの５００
ＭＨｚ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ₃ＯＤ中）を示す
図である。

【図９】本発明の抗生物質リベロマイシンＤの５００
ＭＨｚ¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ₃ＯＤ中）を示す
図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者高橋英俊栃木県河内郡南河内町薬師寺諏訪山3304− １ (72)発明者清水進二栃木県宇都宮市宮の内４−213−９ (72)発明者吉浜誠栃木県宇都宮市江曽島町1400−８

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の式で示される抗生物質リベロマイ
シンＢ。【化１】
【請求項２】下記の式で示される抗生物質リベロマイ
シンＣ。【化２】
【請求項３】下記の式で示される抗生物質リベロマイ
シンＤ。【化３】
【請求項４】ストレプトミセス属に属しリベロマイシ
ンＢ、リベロマイシンＣ、及びリベロマイシンＤからな
る群から選ばれる抗生物質リベロマイシンを生産する菌
を培養し、その培養物から該抗生物質を分離採取するこ
とを特徴とする、抗生物質リベロマイシンの製造方法。
【請求項５】抗生物質リベロマイシン生産菌が、スト
レプトミセスsp. ＳＮ−５９３である請求項４記載の製
造方法。
【請求項６】リベロマイシンＢ、リベロマイシンＣ、
及び／又はリベロマイシンＤを有効成分として含有する
ことを特徴とする抗腫瘍剤。
【請求項７】リベロマイシンＢ、リベロマイシンＣ、
及び／又はリベロマイシンＤを有効成分として含有する
ことを特徴とする抗真菌剤。