JP4057765B2

JP4057765B2 - 新生理活性物質

Info

Publication number: JP4057765B2
Application number: JP2000175023A
Authority: JP
Inventors: 桂畑; 彰文奥田; 聡司山本; 紀秋坂田; 和之土橋
Original assignee: Mercian Corp; Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Mercian Corp; Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2000-06-12
Filing date: 2000-06-12
Publication date: 2008-03-05
Anticipated expiration: 2020-06-12
Also published as: JP2001354693A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は真菌の付着を阻害し、真菌が病原性を発揮することを阻害する薬剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、高度な化学療法等による免疫機能の低下した患者や高齢者の増加により日和見感染に対する対策は益々重要性を増してきている。カンジダ、アスペルギルス、クリプトコッカス等による内臓真菌感染症はこうした日和見感染症の一部を占め、発症率は年々増加しており、しかも直接の死因となるにもかかわらず、有効な治療薬が少ない。
これまでの真菌感染症治療剤は既知の骨格に化学修飾し新規化合物を開発するストラテジーが中心であったが、耐性菌の問題もあり新規メカニズムに基づく新薬の開発が切望されている。
ひとつの有力なアプローチとして、病原体の宿主への付着を阻害することにより病原性を発揮させないという試みが注目されている。最近の研究においても、付着と感染の関係が複数報告されている（Janet F et al., Science, 283: 1535-1538 (1999)、Ed T. Buurman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 7670-7675 (1998)、Cheryl A. Gale et al., Science, 279: 1355-1358 (1998)）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は真菌の細胞への付着を阻害し、真菌の病原性発揮を阻害する新規物質を単離し、真菌感染症治療剤を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
上記現状に鑑み、本発明者らは微生物培養液を原料として、真菌の細胞への付着を阻害する物質の探索スクリーニングを行った。その結果、フミコーラ属に属する微生物の培養液中に真菌の細胞への付着を阻害する物質が産生されることを見出した。この活性物質を単離・構造決定したところ新規活性物質であることが判明した。
すなわち本発明は、
(1). 一般式（Ｉ）で表される化合物。
【化３】

（式中、R₁は水素原子あるいはアセチル基、R₂は水素原子あるいはβ-D-グルコース残基、R₃は水素原子あるいはメチル基を意味する。）
(2). 一般式（Ｉ）において、R₁が水素原子、R₂が水素原子、R₃が水素原子あるいはメチル基である、(1)に記載の化合物。
(3). 一般式（Ｉ）において、R₁が水素原子、R₂がβ-D-グルコース残基、R₃が水素原子である、(1)に記載の化合物。
(4). 一般式（Ｉ）において、R₁がアセチル基、R₂がβ-D-グルコース残基、R₃が水素原子あるいはメチル基である、(1)に記載の化合物。
(5). 一般式（Ｉ）において、R₁がアセチル基、R₂がβ-D-グルコース残基、R₃が水素原子である、(1)に記載の化合物。
(6). 式(II)で表される化合物。
【化４】

(7). (1)ないし(6)のいずれかに記載の化合物を含有して成る抗真菌剤。
(8). (5)又は(6)に記載の化合物を含有して成る抗真菌剤。
(9). (1)ないし(6)のいずれかに記載の化合物を含有して成る真菌の付着を阻害する抗真菌剤。
(10). (5)又は(6)に記載の化合物を含有して成る真菌の付着を阻害する抗真菌剤。
(11). フミコーラ・エスピー・エムイーアール・エフ2300(Humicola sp. Mer-f2300, FERM P-17589)を栄養培地中で培養し、その培養液から、(1)ないし(5)のいずれかに記載の化合物を採取する事を特徴とする、(1)ないし(5)のいずれかに記載の化合物の製造方法、
に関する。
【０００５】
【発明の実施の形態】
本発明について、１．生産菌のスクリーニング法、２．分離された生産菌の性状、３．生産菌の培養法、４．活性物質の精製法、５．活性物質の抗真菌剤としての利用法の順に詳細に説明する。
【０００６】
１．生産菌のスクリーニング法
哺乳類細胞、好ましくは真菌が接着する細胞である腸管上皮細胞を培養し、適当な方法、例えばエタノールにより固定する。そこへ被検サンプルと、適当な時間インキュベートしたカンジダ・アルビカンスを接種し、一定時間培養後バッファーで洗浄して、寒天培地、例えばサブロー・デキストロース寒天培地（Difco）を重層する。30℃一晩培養後、CFUをカウントし、付着率を計算する。
【０００７】
２．分離された生産菌の性状
本発明化合物の精製原料として、フミコーラ属の菌種いずれも使用可能であると期待されるが、本発明の代表的な菌株として、沖縄県宮古島で採取された土壌より分離された糸状菌で、本発明者らがエムイーアール・エフ2300(Mer-f2300)菌株と番号を付した菌株が挙げられる。このエムイーアール・エフ2300菌株の菌学的性状は次の通りであった。
本菌株をオートミール寒天培地上20℃で10日間培養すると、直径約4 cmのコロニーとなった。当初明るいオリーブ色の菌糸が周縁に向かい伸長し、裏面は暗色を呈して輪紋状となった。綿毛状の気菌糸は輪紋状で明色を呈し、やがてオリーブ色を帯びた黒色となった。
暗褐色のアレウロ型分生子は12〜15μmの直径を有していた。
以上の形態的特性より本菌はフミコーラ属であると同定した。本発明者らは、本菌をフミコーラ・エスピー・エムイーアール・エフ2300(Humicola sp. Mer-f2300)として工業技術院生命工学工業技術研究所に FERM P-17589の番号で寄託している。
【０００８】
３．生産菌の培養法
上記微生物の培養方法は、通常は液体培養による振盪培養法、通気攪拌培養法などの好気的条件下で行なうのが好適である。
培養に用いられる培地としては、フミコーラ属に属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であればよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地などいずれも用いることができる。培地組成としては炭素源としてのグルコース、シュークロース、フルクトース、グリセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜、コーン・スティープ・リカー、有機酸などを単独または組み合わせて用い得る。窒素源としてはファーマメデイァ、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆粉、カゼイン、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源を単独または組み合わせて用い得る。
ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、燐酸塩、その他の重金属塩なども必要に応じて添加使用され得る。なお、培養中発泡の著しいときは公知の各種消泡剤を適宜培地中に添加することもできるが、その添加は目的物質の生産に悪影響をあたえないものとする必要がある。
培地のpHは微生物の至適pH範囲、通常中性付近とするのが望ましい。培養温度は、微生物が良好に生育する温度、通常20〜40℃、特に好ましくは25℃付近に保つのがよい。培養時間は液体培養の場合、1〜14日間程度とされる。
上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれぞれに応じて上記範囲から最適条件を選択、調節される。
【０００９】
４．活性物質の精製法
菌の培養液からの本発明化合物の精製は以下のようにして精製することができる。フミコーラ属の微生物を通常の適切な培養条件にて培養後、培養上清と菌体に分離する。菌体に、例えば80%アセトン水溶液を加えて攪拌後、減圧下でアセトンを留去し、培養上清と混合する。
培養液と菌体抽出液の混合物を、ブタノールまたはメチルイソブチルケトンなどの有機溶媒を加え抽出し、有機溶媒層を減圧下濃縮する。次いでシリカゲルなどを用いる吸着クロマトグラフィー、セファデックスLH 20 ゲルクロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、ペーパークロマトグラフィー、分取用HPLCなどを適宜利用して分画し、活性スクリーニングにより活性画分を確認する。上記手法を適宜組み合わせることにより活性物質を単離することができる。吸着クロマトグラフィーに使用する溶媒としては、クロロホルム、メタノール、アセトン、ヘキサン、トルエンなど通常使用される有機溶媒を用い、適宜濃度を選択、組み合わせて使用することができる。
単離した化合物の構造解析は、元素分析、GC-MS、 NMR、融点など常法の手法によって行うことができる。
【００１０】
５．活性物質の抗真菌剤としての利用法
単離した化合物は真菌の付着阻害活性を有していた。従って該化合物は、１．真菌感染症のリスクファクターの高い患者さんへの予防投与、２．難治性真菌感染症に対して既存の抗真菌剤との併用使用が想定される。
該化合物を各種疾患治療・予防剤として投与する場合、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、シロップ剤などとして経口的に投与してもよいし、また噴霧剤、坐剤、注射剤、外用剤、点滴剤として非経口的に投与してもよい。投与量は症状の程度、年齢、肝疾患の種類などにより著しく異なるが、通常成人１日当たり約 1mg〜100mg を１日１〜数回にわけて投与する。
製剤化の際は通常の製剤担体を用い、常法により製造する。すなわち、経口用固形製剤を調製する場合は、主薬に賦形剤、更に必要に応じて結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤などを加えた後、常法により錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などとする。これらの錠剤、顆粒剤には糖衣、ゼラチン衣、その他必要により適宜コーティングすることは勿論差し支えない。
注射剤を調製する場合には、主薬に必要によりpH調整剤、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤などを添加し、常法により皮下、筋肉内、静脈内用注射剤とする。
【００１１】
【発明の効果】
本発明により、真菌の付着を抑制し病原性を減弱させることが可能となった。
【００１２】
【実施例】
以下の実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１３】
［実施例１］精製方法
フミコーラ・エスピー・エムイーアール・エフ2300(Humicola sp. Mer-f2300)株の斜面培地（ポテト・デキストロース寒天培地）から１白金耳を20mlの種培地（馬鈴薯デンプン2％、グルコース1％、大豆粉2％、リン酸第一カリウム0.1％、硫酸マグネシウム７水和物0.05％、pH 無調整）を入れた250ml容の三角フラスコに接種し、25℃で３日間回転攪拌機上で培養して種培養液を得た。この種培養液1mlを生産培地（グリセリン5％、ポテトエキス液25％、麦芽エキス0.5％、酵母エキス0.5％、pH 6.5）60mlを含む500ml容の三角フラスコに接種して、25℃で96時間回転攪拌機上で培養を行なった。
培養液（６リットル）を培養上清と菌体に分離し、その菌体に80％アセトン水溶液（３リットル）を加え、室温で3時間攪拌した。得られた80％アセトン抽出液を減圧下で留去した後、培養上清と混合し、さらに１-ブタノール（6リットル）で抽出した。１-ブタノール層を減圧下で濃縮し、得られた残渣（160g）をセファデックスLH-20（ファルマシア社製、1200ml）上に添加し、テトラヒドロフラン−メタノール（1:1）の溶媒で溶出した。3750mlから3950mlまでに溶出した画分を減圧下で濃縮乾固し、残渣（5.4g）を得た。さらにこの残渣をHPLC分取（ODSカラム：YMC-Pack ODS-A, φ50mm×500mm（ワイエムシー社製）、流速60ml/min）し、40%アセトニトリル水溶液（３リットル）、その後70％アセトニトリル水溶液（３リットル）で溶出した。保持時間90分から95分までに溶出される画分を集め、減圧下濃縮乾固した。
得られた残渣を再度HPLC分取（ODSカラム：YMC-Pack ODS-A, φ50mm×500mm（ワイエムシー社製）、流速60ml/min）し、70％アセトニトリル水溶液（3.6リットル）で溶出した。保持時間43分から45分までに溶出される画分を集め、減圧下濃縮乾固し、無色の粉末（EM-f2300A 73.6mg）を得た。また、保持時間48分から53分までに溶出される画分を集め、減圧下濃縮乾固し、無色の粉末（EM-f2300B 9.3mg）を得た。
以下に記載した構造解析の結果、EM-f2300Aは一般式（Ｉ）においてR₁がアセチル基・R₂がβ-D-グルコース残基・R₃が水素原子である化合物、EM-f2300Bは式(II)の化合物であることが明らかとなった。
【００１４】
［実施例２］EM-f2300Aの構造解析
EM-f2300Aの構造解析データ
１．色および性状：無色粉末
２．分子量：678, FAB-MS m/z 701(M+Na)⁺
３．分子式：C₃₈H₆₂O₁₀
４．紫外吸収スペクトル：末端吸収
５．TLC：メルク社製キーゼルゲル60F254を使用し、クロロホルム：メタノール：水（８０：２０：１）で、Rf=0.34
６．溶解性：ジメチルスルホキシド・ピリジンに可溶、水・メタノールに難溶
７．融点：294℃
８．呈色反応：ヨード、硫酸、ボーンズ試薬に陽性
９．赤外吸収スペクトル：
KBr粉末中で測定した。主な吸収を示す。（波数、cm^-1）
3300, 2960, 1730, 1710, 1460, 1440, 1380, 1360, 1260
１０．比施光度：[α]²³ _D -70.0(C=0.02, メタノール)
１１．¹H-NMRスペクトル
5.64(1H), 5.03(1H), 4.61(1H), 4.41(1H), 4.26(1H), 4.18(1H), 4.04(1H), 4.01(1H), 3.66(1H), 3.15(1H), 2.55(1H), 2.46(3H), 2.20(1H), 2.18(1H), 2.07(1H), 1.97(3H), 1.82(1H), 1.77(1H), 1.76(1H), 1.74(1H), 1.63(1H), 1.57(3H), 1.52(3H), 1.44(3H), 1.42(1H), 1.39(1H), 1.36(1H), 1.33(1H), 1.29(1H), 1.17(3H), 1.16(3H), 1.10(3H), 1.05(3H), 0.95(3H), 0.93(3H)
１２．¹³C-NMRスペクトル
177.1(s), 171.0(s), 134.5(s), 134.3(s), 106.3(d), 88.7(d), 78.8(d), 78.2(d), 75.9(d), 72.1(d),70.5(d), 63.2(t), 53.8(d), 50.3(d), 48.8(d), 41.9(t), 41.2(s), 41.0(s), 40.8(s), 38.6(s), 38.1(s), 31.7(t), 30.0(t), 28.4(q), 27.3(t), 26.9(d), 26.2(t), 25.2(q), 22.2(q), 21.8(q), 21.4(q), 21.2(q), 19.9(t), 19.0(t), 18.6(q), 18.0(q), 17.4(q), 8.6(q)
【００１５】
［実施例３］EM-f2300Bの構造解析
EM-f2300Bの構造解析データ
１．色および性状：無色粉末
２．分子量：660, FAB-MS m/z 659(M-H)^-
３．分子式：C₃₈H₆₀O₉
４．紫外吸収スペクトル：末端吸収
５．TLC：メルク社製キーゼルゲル60F254を使用し、クロロホルム：メタノール：水（８０：２０：１）で、Rf=0.37
６．溶解性：ジメチルスルホキシド・ピリジンに可溶、水・メタノールに難溶
７．融点：238℃
８．呈色反応：ヨード、硫酸、ボーンズ試薬に陽性
９．赤外吸収スペクトル：
KBr粉末中で測定した。主な吸収を示す。（波数、cm^-1）
3320, 2950, 1720, 1460, 1440, 1380, 1360, 1260
１０．比施光度：[α]²³ _D +16.4(C=0.1, メタノール)
１１．¹H-NMRスペクトル
5.81(1H), 5.67(1H), 5.04(1H), 4.75(1H), 4.64(1H), 4.42(1H), 4.27(1H), 4.19(1H),4.05(2H), 3.68(1H), 2.45(3H), 2.41(1H), 2.24(1H), 2.14(1H), 2.08(1H), 1.99(1H), 1.97(1H), 1.87(1H), 1.83(1H), 1.81(1H), 1.72(1H), 1.63(1H), 1.61(1H), 1.57(3H), 1.46(1H), 1.43(1H), 1.41(3H), 1.38(1H), 1.36(1H), 1.32(3H), 1.29(1H), 1.27(3H), 1.17(3H), 1.13(3H), 1.10(3H), 0.93(3H)
１２．¹³C-NMRスペクトル
171.5(s), 163.6(s), 134.4(s), 134.2(s), 124.9(d), 106.8(d), 89.1(d), 79.2(d), 78.7(d), 76.4(d), 74.6(d), 72.6(d), 70.9(d), 67.1(d), 63.7(t), 50.7(d), 46.9(s), 42.3(t), 41.7(s), 41.0(s), 39.6(s), 39.2(s), 37.9(t), 29.7(t), 28.8(q), 28.4(t), 27.1(t), 26.3(q), 26.0(d), 24.7(q), 23.0(q), 22.7(q), 22.3(q), 21.8(q), 21.5(q), 20.9(t), 19.5(t), 18.5(q)
【００１６】
［実施例４］EM-f2300A2の構造解析
EM-f2300A（1.1mg）を10％塩酸−メタノール溶液（1ml）に溶かし、50分間還流した。その後反応液を留去し、得られた残渣を50mlの酢酸エチルと50mlの水とで分配した。酢酸エチル層を50mlの飽和食塩水で洗浄し、更に、硫酸ナトリウムで脱水し、減圧下留去した。得られた残渣をシリカゲル（関東化学製、9ml）上に添加し、ノルマルヘキサン−酢酸エチル（1:1, 100ml）の溶媒で溶出し、一般式（Ｉ）においてR₁が水素原子、R₂が水素原子、R₃が水素原子であるEM-f2300A2
(0.5mg)を得た。
EM-f2300A2の構造解析データ
１．色および性状：無色粉末
２．分子量：474, FAB-MS m/z 473(M-H)^-
３．分子式：C₃₀H₅₀O₄
４．紫外吸収スペクトル：末端吸収
５．TLC：メルク社製キーゼルゲル60F254を使用し、クロロホルム：メタノール：水（８０：２０：１）で、Rf=0.43
６．溶解性：ジメチルスルホキシド・ピリジンに可溶、水・メタノールに難溶
７．呈色反応：ヨード、硫酸、ボーンズ試薬に陽性
８．¹H-NMRスペクトル
4.16(1H), 3.44(1H), 3.15(1H), 2.53(1H), 2.41(1H), 2.25(1H), 2.23(1H), 2.04(1H), 2.01(1H), 1.97(1H), 1.83(1H), 1.81(1H), 1.79(1H), 1.71(1H), 1.60(1H), 1.56(1H), 1.54(3H), 1.52(1H), 1.49(1H), 1.47(3H), 1.42(1H), 1.34(1H), 1.32(3H), 1.19(3H), 1.15(3H), 1.12(3H), 1.04(3H), 0.95(3H), 0.91(3H)
１２．¹³C-NMRスペクトル
176.4(s), 134.6(s), 133.5(s), 83.1(d), 68.7(d), 53.1(d), 50.4(d), 48.3(d), 44.2(t), 40.5(s), 40.3(s), 39.2(s), 38.4(s), 37.7(s), 31.3(t), 29.5(t), 28.7(q), 26.9(t), 26.4(d), 25.7(t), 24.7(q), 21.8(q), 21.0(q), 20.8(q), 19.5(t), 19.0(t), 18.1(q), 17.1(q), 16.8(q), 8.1(q)
【００１７】
［実施例５］EM-f2300A3の構造解析
EM-f2300A（4.4mg）を1N水酸化ナトリウム水溶液（2ml）に溶かし、3時間還流した。反応液に1N塩酸（2ml）を加え、更に過剰の水を加えた後、ダイヤイオンHP-20 3ml（三菱化学製）を加えて濃縮した。HP-20を約100mlの水で洗ったあと100mlの80％アセトン水および100mlのメタノールで溶出させた。得られた溶出液を留去することにより、一般式（Ｉ）においてR₁が水素原子、R₂がβ-D-グルコース残基、R₃が水素原子であるEM-f2300A3(3.0mg)を得た。
EM-f2300A3の構造解析データ
１．色および性状：無色粉末
２．分子量：636, FAB-MS m/z 659(M+Na)⁺ , 637(M+H)⁺, 635(M-H)^-
３．分子式：C₃₆H₆₀O₉
４．紫外吸収スペクトル：末端吸収
５．TLC：メルク社製キーゼルゲル60F254を使用し、クロロホルム：メタノール：水（８０：２０：１）で、Rf=0.33
６．溶解性：ジメチルスルホキシド・ピリジンに可溶、水・メタノールに難溶
７．呈色反応：ヨード、硫酸、ボーンズ試薬に陽性
８．¹H-NMRスペクトル
5.00(1H), 4.62(1H), 4.38(1H), 4.29(1H), 4.26(1H), 4.13(2H), 4.08(1H), 3.37(1H), 3.14(1H), 2.53(1H), 2.40(1H), 2.25(1H), 2.20(1H), 2.01(1H), 1.97(1H), 1.95(1H), 1.83(1H), 1.81(1H), 1.74(1H), 1.70(1H), 1.61(1H), 1.55(3H), 1.49(3H), 1.48(3H), 1.45(1H), 1.43(1H), 1.34(1H), 1.32(1H), 1.31(1H), 1.17(3H), 1.13(3H), 1.05(3H), 1.04(3H), 0.95(3H), 0.92(3H)
１２．¹³C-NMRスペクトル
177.4(s), 135.4(s), 134.6(s), 107.1(d), 95.9(d), 79.2(d), 79.0(d), 76.1(d), 72.1(d), 67.9(d), 63.1(t), 54.2(d), 51.3(d), 49.2(d), 44.6(t), 41.4(s), 41.3(s), 41.0(s), 38.8(s), 38.7(s), 32.3(t), 30.5(t), 28.9(q), 27.8(t), 27.3(d), 26.7(t), 25.7(q), 22.7(q), 21.9(q), 21.8(q), 20.4(t), 19.7(t), 19.1(q), 18.6(q), 17.8(q), 9.1(q)
【００１８】
［実施例６］EM-f2300A4の構造解析
EM-f2300A（6mg）をメタノール溶液（3ml）に溶かし、TMS-ジアゾメタン（2.0Mヘキサン溶液）0.15mlを加えた。その後反応液を留去し、得られた残渣を0.3mlのメタノールと0.2mlのジメチルスルホキシドに溶解させた。さらにこの溶液をHPLC分取（ODSカラム：YMC J’sphere M80 , φ20mm×250mm（ワイエムシー社製）、流速5 ml/min）を行い、90％アセトニトリル水溶液で溶出した。保持時間37分から42分までに溶出される画分を集め、減圧下濃縮乾固し、無色の粉末（一般式（Ｉ）においてR₁がアセチル基、R₂がβ-D-グルコース残基、R₃がメチル基であるEM-f-2300A4 5.7mg）を得た。
EM-f2300A4の構造解析データ
１．色および性状：無色粉末
２．分子量：692, FAB-MS m/z 715(M+Na)⁺ , 693(M+H)⁺
３．分子式：C₃₉H₆₄O₁₀
４．紫外吸収スペクトル：末端吸収
５．TLC：メルク社製キーゼルゲル60F254を使用し、クロロホルム：メタノール：水（８０：２０：１）で、Rf=0.4
６．溶解性：ジメチルスルホキシド・ピリジンに可溶、水・メタノールに難溶
７．呈色反応：ヨード、硫酸、ボーンズ試薬に陽性
８．¹H-NMRスペクトル
5.64(1H), 5.03(1H), 4.61(1H), 4.41(1H), 4.26(1H), 4.18(1H), 4.02(2H), 3.70(3H), 3.67(1H), 2.93(1H), 2.47(3H), 2.27(1H), 2.21(1H), 2.13(1H), 2.02(1H), 1.88(1H), 1.76(1H), 1.75(1H), 1.72(1H), 1.68(1H), 1.67(1H), 1.44(3H), 1.41(3H), 1.40(1H), 1.39(1H), 1.38(1H), 1.37(3H), 1.30(1H), 1.29(1H), 1.24(1H), 1.23(1H), 1.16(3H), 1.09(3H), 1.07(3H), 0.92(3H), 0.88(3H), 0.79(3H)
１２．¹³C-NMRスペクトル
175.3(s), 171.5(s), 134.79(s), 134.75(s), 106.8(d), 89.1(d), 79.2(d), 78.7(d), 76.3(d), 72.6(d), 71.0(d), 63.7(t), 54.1(d), 50.9(q), 50.7(d), 49.5(d), 42.3(t), 41.7(s), 41.4(s), 41.3(s), 39.1(s), 38.9(s), 31.9(t), 30.5(t), 28.8(q), 27.7(t), 27.2(d), 26.4(t), 25.5(q), 22.5(q), 22.2(q), 21.6(q), 21.5(q), 20.2(t), 19.4(t), 19.0(q), 18.5(q), 17.7(q), 8.9(q)
【００１９】
［実施例７］EM-f2300A5 の構造解析
EM-f2300A2（3.9mg）をメタノール溶液（2ml）に溶かし、TMS-ジアゾメタン（2.0Mヘキサン溶液）0.05mlを加えた。その後反応液を留去し、得られた残渣をシリカゲル（関東化学製、9ml）上に添加し、ノルマルヘキサン−酢酸エチル（1:1, 100 ml）の溶媒で溶出し、一般式（Ｉ）においてR₁が水素原子、R₂が水素原子、R₃がメチル基であるEM-f2300A5 (3.3mg)を得た。
EM-f2300A5 の構造解析データ
１．色および性状：無色粉末
２．分子量：488, FAB-MS m/z 511(M+Na)⁺ , 489 (M+H)⁺
３．分子式：C₃₁H₅₂O₄
４．紫外吸収スペクトル：末端吸収
５．TLC：メルク社製キーゼルゲル60F254を使用し、クロロホルム：メタノール：水（８０：２０：１）で、Rf=0.45
６．溶解性：ジメチルスルホキシド・ピリジンに可溶、水・メタノールに難溶
７．呈色反応：ヨード、硫酸、ボーンズ試薬に陽性
８．¹H-NMRスペクトル
4.17(1H), 3.69(3H), 3.44(1H), 2.93(1H), 2.41(1H), 2.27(1H), 2.22(1H), 2.18(1H), 2.01(1H), 1.96(1H), 1.81(1H), 1.74(1H), 1.72(2H), 1.54(1H), 1.48(1H), 1.44(1H), 1.39(4H), 1.32(6H), 1.28(1H), 1.22(1H), 1.21(1H), 1.14(3H), 1.12(3H), 1.10(3H), 0.92(3H), 0.87(3H), 0.78(3H)
１２．¹³C-NMRスペクトル
175.2(s), 135.5(s), 134.3(s), 84.1(d), 69.7(d), 54.1(d), 51.3(d), 50.9(q), 49.5(d), 45.1(t), 41.4(s), 41.3(s), 40.1(s), 39.4(s), 39.0(s), 32.0(t), 30.5(t), 29.7(q), 27.8(t), 27.2(d), 26.5(t), 25.5(q), 22.6(q), 22.0(q), 21.4(q), 20.3(t), 19.9(t), 19.0(q), 18.0(q), 17.6(q), 8.9(q)
【００２０】
［実施例８］EM-f2300Aの真菌付着阻害活性
6穴マルチウェルプレートの各穴に10％牛胎児血清および2mMグルタミンを含むD-MEM培地（日水製薬）で1×10⁵個/mlに調整したIEC-18細胞を3mlずつ分注した。該プレートを炭酸ガスインキュベータ内で37℃、3日間培養後、培養上清を除去し、エタノール固定した。各濃度のEM-f2300A含有サブロー・デキストロース液体培地で30℃、48時間培養したカンジダ・アルビカンスを4×10²個/mlに調整し、該プレートの各穴に1ml接種した。30℃、1時間培養後、培養上清を除去し、PBSで洗浄後、サブロー・デキストロース寒天培地（Difco）を2ml重層した。30℃、一夜培養後、CFUをカウントし、付着率を算出した。その結果を図１に示す。
EM-f2300Aは、カンジダ・アルビカンスのIEC-18細胞への付着を阻害する活性を示した。
【００２１】
［実施例９］EM-f2300Aの抗微生物活性
EM-f2300Aのパン酵母(S. cerevisiae G2-10)、カンジダ(C. albicans E81022)、アスペルギルス(A. fumigatus Tsukuba)および黄色ブドウ球菌(S. aureus ATCC29213)に対する最小発育阻止濃度（MIC, μg/ml）を、96穴V底マイクロプレートを用いた微量液体希釈法により測定した。
各種真菌に対してはサブローデキストロースブロス培地（Difco社製）を用い、接種菌量は血球計算盤にて分生子数を数え、2×10³cells/mlとなるように調整した。30℃、48時間培養後、菌の発育が肉眼的に認められない最小濃度をMIC値とした。黄色ブドウ球菌に対してはミューラーヒントンブロス培地（Becton Dickinson社製）を用い、接種菌量は血球計算盤にて菌数を数え、2×10⁵cells/mlとなるように調整した。35℃、24時間培養後、MIC値を求めた。その結果を表１に示す。
また、EM-f2300BはS. cerevisiaeに対し7.8μg/ml以上の濃度で、C. albicansに対し15.6μg/ml以上の濃度で形態変化を起こさせ、f2300A2, A3, A4, A5にも同様の活性が認められて、弱いながらも抗真菌作用を持つことが示唆された。
【００２２】
【表１】

【図面の簡単な説明】
【図１】 EM-f2300Aの濃度とカンジダ付着率との関係を示す図である。

Claims

一般式（Ｉ）で表される化合物。

（式中、R₁は水素原子あるいはアセチル基、R₂は水素原子あるいはβ-D-グルコース残基、R₃は水素原子あるいはメチル基を意味する。）
一般式（Ｉ）において、R₁が水素原子、R₂が水素原子、R₃が水素原子あるいはメチル基である請求項１に記載の化合物。
一般式（Ｉ）において、R₁が水素原子、R₂がβ-D-グルコース残基、R₃が水素原子である請求項１に記載の化合物。
一般式（Ｉ）において、R₁がアセチル基、R₂がβ-D-グルコース残基、R₃が水素原子あるいはメチル基である請求項１に記載の化合物。
一般式（Ｉ）において、R₁がアセチル基、R₂がβ-D-グルコース残基、R₃が水素原子である請求項１に記載の化合物。
式(II)で表される化合物。
請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の化合物を含有して成る抗真菌剤。
請求項５又は請求項６に記載の化合物を含有して成る抗真菌剤。
請求項１ないし請求項６のいずれかに記載の化合物を含有して成る真菌の付着を阻害する抗真菌剤。
請求項５又は請求項６に記載の化合物を含有して成る真菌の付着を阻害する抗真菌剤。
フミコーラ・エスピー・エムイーアール・エフ2300(Humicola sp. Mer-f2300, FERM P-17589)を栄養培地中で培養し、その培養液から請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の化合物を採取する事を特徴とする、請求項１ないし請求項５のいずれかに記載の化合物の製造方法。