JPH0449296A

JPH0449296A - リベロマイシンａ、その製造法並びに抗腫瘍剤及び抗真菌剤

Info

Publication number: JPH0449296A
Application number: JP2155816A
Authority: JP
Inventors: Kiyoshi Isono; 磯野　清; Hiroyuki Osada; 裕之長田; Hidetoshi Takahashi; 英俊高橋; Norio Kawanishi; 川西　悟生
Original assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: Snow Brand Milk Products Co Ltd; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 1990-06-14
Filing date: 1990-06-14
Publication date: 1992-02-18
Anticipated expiration: 2009-05-02
Also published as: US5322854A; EP0491956A1; CA2059632A1; EP0491956B1; EP0491956A4; JPH0633271B2; DE69114252T2; CA2059632C; WO1991019718A1; DE69114252D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、新規抗生物質、その製造法並びに該抗生物質
を有効成分として含む抗腫瘍剤及び抗真菌剤に関する。

（従来の技術）癌細胞の異常な増殖は、細胞増殖因子伝達系の異常に由
来することが多い。例えば、多くの癌細胞では自己増殖
を促進する腫瘍増殖因子アルファー　（ＴＧＦ−α）を
分泌することが知られている。

従って、ＴＧＦ−αの作用を選択的に阻害する薬剤は制
癌剤として有用であることが期待される。

従来、この様な薬剤としてエルプスタチン等が知られて
いるが、いずれも作用が十分ではなく、また血液中で活
性を失うという点からも有用性に問題があった。

（発明が解決すべき課題）従って、本発明は癌細胞の増殖因子を阻害し、癌細胞の
増殖を抑制する新規物質の提供を目的とする。同時に、
該物質を含む制癌剤を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、ＴＧＦ−αと類似の細胞増殖因子である
上皮増殖因子（ＥＧＦ）を用いてその阻害剤を検索し、
新規物質リベロマイシンＡ（ＲｅｖｅｒｏＩＩｌｙｃｉ
ｎ　Ａ）が顕著なＥＧＦ阻害作用を示し、種々の癌細胞
に対する増殖阻害活性を有することを明らかにし、本発
明を完成するに至った。

また、本発明者は上記物質リベロマイシンＡが、真菌類
に対しても抗菌活性を示すことを明らかにし、本物質を
含む医薬用組成物が抗真菌剤として有用であることを見
出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）新規抗生物質リベロマイシンＡ、（２）ストレプ
トミセス（Ｓ　ｔｒｅｐ　Ｌｏｒｎｙｃｅｓ　）属に属
する抗生物質リベロマイシンＡ生産菌を培養し、その培
養物から抗生物質リベロマイシンＡを男離採取すること
を特徴とする該抗生物質の製造法、（３）抗生物質リベロマイシンＡを有効成分として含有
することを特徴とする抗腫瘍剤、及び（４）抗生物質リ
ベロマイシンＡを有効成分として含有することを特徴と
する抗真菌剤、を提供するものである。

抗生物質リベロマイシンＡは、以下の理化学的性質を有
する新規抗生物質である。

抗生物質リベロマイシンＡの理化学的性質（１）性　状
　：白色粉末（２）融点＝９５℃ （３）分子式　：　ＣａＨｓｚＯ＋　Ｉ（４）元素分析
：Ｃ：６４．４５％、Ｈ：　８．０６％、（Ｃ８ｂＨｓ
ｚ０，１・１／２）１．０として）（５）比旋光度：　
〔α：ｌ　　−−１１５°　（ｃ　＝　０．１、メタノ
ール中）（６）紫外部吸収スペクトル（中）； λ、、、　　ｎｍ（ε）　＝２３８　（２５，３００）
　。

２６０　（ｓｈ、１２，２００）（７）赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）　；３４３０．
２９３０．１６９０、工６４０．１６１０．１３８０．
１２５０．１１６０．９７０ｃｍ−’ （８）溶解性　ニジメチルスルホキシド、酢酸エチル、
メタノールに易溶水に不溶（９）高分解能ＦＡＢ−ＭＳ　：　６８３．３４９６（
Ｍ十Ｎａ）” ０ω　呈色反応：ヨウ素、アニスアルデヒド、ＢＣＧに
陽性、ニンヒドリン、ドラゲンドルフに陰性本杭生物質リベロマイシンＡは、群馬県倉淵村より採取
された土壌から分離されたストレプトミセスｓｐ、　Ｓ
　Ｎ　　５９３　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｓｐ．
ＳＮ−５９３）を培養して得た培養物から単離された。

該ストレプトミセスｓｐ．ＳＮ−５９３は平成２年６月
５日付で工業技術院微生物工業技術研究所に寄託され、
その寄託番号は微工研菌寄第１１５０３号（ＦＥＲＭ　
Ｐ１１５０３）である。

ストレプトミセスｓｐ、ＳＮ　　５９３の菌学的性質は
以下の通りである。

１、菌体を６Ｎ塩酸、１１０℃，１８時間加水分解した
ものの薄膜クロマトグラフィーでは、Ｌ。

Ｌ−ジアミノピメリン酸を検出したが、メソ−ジアミノ
ピメリン酸は検出されなかった。寒天平板上に発育した
ものの電子顕微鏡観察では、気菌糸は不完全な螺旋状を
呈し、胞子表面は平滑で円筒型である。

２、各種培地上における生育状態（２７℃ｌ２Ｏ日間培
養、色調はカラーハーモニーマニュアル第４版（Ｃｏｎ
ｔａｉｎｅｒ社）によった。

１）　スターチ・イースト寒天培地発育　：豊富気菌糸　　：　豊　富気菌糸色調：　灰（２ｉｈ）裏面色調　：　ビーバー（３乏ｉ）可溶性色素：　無２）　イーストエキス・モルトエキス寒天培地発育　：
豊富気菌糸　　：　豊　冨気菌糸色調：　灰（３ｉｈ）裏面色調　：　チョコレート（５ｐｏ）可溶性色素：　
無３）　オートミール寒天培地発育　：豊富気菌糸　　：　豊　富気菌糸色調：　２ｄ裏面色調　：　カラシ色（２ｎｅ）可溶性色素：　無４）スターチ・無機塩寒天培地発育　：豊富気菌糸　　：　豊　富気菌糸色調：　灰（３ｉｈ）裏面色調　：　くり茶（４ｎｉ）可溶性色素：　無５）　■８ジュース寒天培地発　育　　：　普通気菌糸　　：　少ない気菌糸色調：　灰（３ｉｈ）裏面色調　：　黒（２ｐｏ）可溶性色素：　無６）蔗糖硝酸塩寒天培地発育　：普通気菌糸　　：　良　好気菌糸色調：　黄褐色（２ｇｅ）裏面色調　：　無色可溶性色素：　無７）　グルコース・アスパラギン寒天培地発育　：良好気菌糸　　：　良　好気菌糸色調：　灰（２ｆｅ）裏面色調　：　カラシ色（２ｎｅ）可溶性色素：　無８）　グリセロール・アスパラギン寒天培地発育　：普
通気菌糸　　：　普　通気菌糸色調：　ナチュラル（２ｄｃ）裏面色調　：　黄　色（３ｎｇ）可溶性色素：　無９）ポテト−にんじん寒天培地発育　：良好気菌糸　　：　良　好気菌糸色調：　灰（５ｆｅ）裏面色調　：　無　色可溶性色素：　無以上の菌学的性質から５Ｎ−５９３株をストレプトミセ
ス属に属する菌であると同定した。

本発明の抗生物質リベロマイシンＡは、上記菌株を栄養
源含有培地に接種し、好気的に培養することにより製造
される。抗生物質リベロマイシンＡの生産菌としては上
記菌株に限らず、ストレプトミセス属に属し抗生物質リ
ベロマイシンＡを生産する能力を有するものであれば、
すべて本発明に使用できる。

上記微生物の培養方法は、原則的には一般微生物の培養
法に準するが、通常は液体培養による振盪培養法、通気
撹拌培養法などの好気的条件下で行なうのが好適である
。

培養に用いられる培地としては、ストレプトミセス属に
属する微生物が利用できる栄養源を含有する培地であれ
ばよく、各種の合成培地、半合成培地天然培地などいず
れも用いることができる。

培地組成としては炭素源としてのグルコース、シューク
ロース、フルクトース、グリセリン、デキストリン、澱
粉、糖蜜、コーン・ステイープ・リカー、有機酸、など
を単独または組み合せて用い得る。窒素源としてはファ
ーマメディア、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、大豆
粉、カゼイン、アミノ酸、尿素などの有機窒素源、硝酸
ナトリウム、硫酸アンモニウムなどの無機窒素源を単独
または組み合せて用い得る。

ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩
、その他の重金属塩なども必要に応じて添加使用され得
る。なお、培養中発泡の著しいときは、アデカノール［
Ｆ］、シリコーンオイル等の公知の各種消泡剤を適宜培
地中に添加することもできるが、その添加は目的物質の
生産に悪影響を与えないものとする必要がある。例えば
０．５％以下で使用することが好ましい。

培地のｐＨは微生物の至適ｐｉ（範囲、通常中性付近と
するのが望ましい。培地温度は、微生物が良好に生育す
る温度、通常２．０〜４０℃１とくに好ましくは２７℃
付近に保つのがよい。培養時間は液体培養の場合、一般
に１〜５日間程度、好ましくは約７２時間である。上記
培養によって目的とする抗生物質リベロマイシンＡが生
成蓄積される。

もちろん上述した各種の培養条件は、使用微生物の種類
や特性、外部条件などに応じて適宜変更でき、またそれ
ぞれに応じて上記範囲から最適条件を選択、調節される
。

上記培養により生産される抗生物質リベロマイシンＡの
単離は、該抗生物質の蓄積が最大になる時に、発酵生産
物を採取する一般的方法に準じて、リベロマイシンＡと
不純物との溶解度差を利用する手段、吸着親和力の差を
利用する手段、分子量の差を利用する手段のいずれによ
っても実施でき、それぞれの方法は単独、または適宜組
合せて、あるいは反復して使用される。

具体的には、リベロマイシンＡは、培養濾液にその大部
分が存在するので、その培養濾液を各種のゲル濾過クロ
マトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、液体クロマ
トグラフィー等を組合せて精製すると、リベロマイシン
Ａ及びその他の活性成分を含む両分かえられる。この両
分を凍結乾燥して得られた粉末を更に高速液体クロマト
グラフィー（例えばカプセルバンクカラム）を用い、例
えば１８％メタノール：０．０１％アンモニアの系で展
開により精製すれば、リベロマイシンＡの精製白色粉末
を得ることができる。

以下に製造例により本発明の抗生物質リベロマイシンへ
の製造方法の一例を示すが、本発明の抗生ｈｔリヘロマ
イシンへの製造法はこれらの製造例に限定されない。

（製造例）グルコース２％、可溶性デンプン１％、肉エキス０．１
％、乾燥酵母０．４％、大豆粉２．５％、食塩０．２％
の組成からなる１８！の培地に、ストレプトミセス５Ｎ
−５９３株を接種し、２７℃で７２時間の通気撹拌培養
した。この全培養液の濾液をｐＨ１ｏに調整し、等量の
酢酸エチルで抽出した。

その水層をｐＨ５に調整し、再び等量の酢酸エチルで抽
出し、酢酸エチル層を減圧濃縮して粗油性物質を得た。

粗油性物質をシリカゲルクロマトグラフィーに付し、ク
ロロホルム：メタノール−１０：１及び２：１で洗浄後
、１００％メタノールで溶出して活性画分を得た。活性
画分をさらにＭＣＩゲルに付し、７０％メタノールで溶
出した。次に、セファデックスＬＨ−２０に付し、２０
％メタノールで展開して活性画分を回収し、再び同条件
でセファデックスＬＨ−２０にて展開することによりリ
ベロマイシンＡを主成分とする活性画分を得た。最終的
には高速液体クロマトグラフィー（カラム：　ＣＡＰＣ
ＥＬＬ　ＰＡＫ　ｃｕｅ　２０　ｍｍφ×２５０閣）で
１８％メタノール：０．０１％ＮＨ，０）１の溶媒系で
繰り返し分取し、リヘロマイシンＡを単一物質として含
むフラクションを得た。リベロマイシンＡを含むフラク
ションを減圧濃縮し、残った水溶液をｐ）１５に調整し
た後、等量の酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル層を減
圧濃縮して得られた残香を凍結乾燥し、最終的に白色粉
末としてリベロマイシンＡ約１００■が得られた上記の様にして得られる抗生物質リベロマイシンＡの各
種微生物に対する最少発育阻止濃度は以下の表１に示す
通りである。

表　１　抗生物質リベロマイシンＡの各種微生物に対す
る最小生育阻止濃度上記抗生物質リベロマイシンＡは細胞増殖抑制効果なら
びに抗真菌作用を示すので、リベロマイシンＡを含有す
る組成物は制癌剤及び抗真菌剤として有用である。

試験例１（抗生物質リベロマイシンＡの癌細胞増殖阻害試験）ヒト白血病細胞に−５６２及びＨＬ−６０をＲＰＭＩ　
　１６４０培地（１０％の牛脂仔血清を含む）で培養し
た。これに一連の希釈系列のりベロマイシンＡを加え、
１７時間培養したのち、ＭＴＴ試薬を加えて生育を計測
した。その結果を表２に示す。

表　２　抗生物質リベロマイシンＡの細胞増殖抑制効果
（最小生育阻止濃度）試験例２（上皮増殖因子（ＥＣ，Ｆ）に反応して生じるマウス上
皮細胞のＤＮＡ合成阻害試験）静止期のマウス上皮細胞にＥ　Ｇ　Ｆ　（５ｎｇ／ｄ）
とりベロマイシンＡを添加して１７時間後に３Ｈラベル
のチミジンを培地に加えた（１μＣｉ　／　ｄ　）。

５時間ラベルした細胞の酸不溶性画分の放射活性を液体
シンチレーションカウンターで計数するとＤＮＡ合成量
が測定された。阻害率は次の方法により算出した。

阻害率（％）＝試験例３（温度感受性ガン遺伝子（ｓｒｃ”）でトランスフオー
ムしたラット細胞（ＮＨＫ）に対する効果）ｓｒｃ”　
−Ｎ　ＲＫ細胞を３２℃で培養すると、トランスフオー
ムして球状の細胞が増えるが、３９℃で培養すると、球
状の細胞は消失し、平らに接着した細胞だけになる。薬
剤を３２℃で培養した細胞に加え、２４時間後に顕微鏡
観察し球状細胞を計数した。

薬効の判定は以下の様に算出した。

抑制率（％）− この結果を以下に示す。

表３供試化合物　濃度（μｇ／１ｒｄｌ＞阻害率（χ）細胞
毒性この結果を以下に示す。

表４供試化合物　濃度（μｇ　／　ｒｔｄｌ　）阻害率（χ
）細胞毒性Ｒ０，５なし０．５なし上記抗生物質リベロマイシンＡは、常法により錠剤、散
剤、カプセル剤、注射剤、吸入剤または外用剤等の製剤
とすることができ、経口または非経口投与により制癌剤
若しくは抗真菌剤として臨床に供される。投与量は治療
すべき症状及び投与方法により左右されるが、制癌剤と
して投与する場合には成人１日あたり１■〜１，０００
１１ｇであり、抗真菌剤として投与する場合には成人１
日あたり１０■〜１　、０００■である。尚、抗生物質
リベロマイシンＡのマウス急性毒性値は１００■／ｋｇ
以下（静注）である。

【図面の簡単な説明】

第１図は抗生物質リベロマイシンＡの紫外線吸収スペク
トルであり、第２図は赤外線吸収スペクトル（Ｋａｒ）
であり、第３図は５００’ＡＨｚ　’Ｈ−ＮＭＲスペク
トル（ＣＤ、ＯＤ中）であり、第４図は５００ＭＨｚ’
　”Ｃ−ＮＭＲスペクトル（ＣＤ！ＯＤ中）である。第１図中、□は１００％メタノール中；は１００％メタ
ノール１０．０１Ｎ塩酸中；−−−−は１００％メタノ
ール／　０．　ＯＩ　Ｎ　ＮａＯＨ中で測定した結果を
示す。第１図手続補正平成書年２．７．３０月　　　　日１、特許請求の範囲を別紙の通り訂正する。２、　明細書の記載を以下の通り訂正する。１、事件の表示平成２年特許願第１５５８１６号３、補正をする者事件との関係名称同出願人（６７９）理化学研究所（６６！ｉ）雪印乳業株式会社４、代理人５、補正命令の日付自発特許請求の範囲（１〕　　下記の理化学的性質を有する抗生物質リベロ
マイシンＡ０性　　状二白色粉末融　　　点：　９５℃ 分子式：　Ｃ３６）１５２０□ ％式％メタノール中）紫外線吸収スペクトル（メタノール中）；２６０　　（
ｓｈ、　　１２，２００）赤外線吸収スペクトル（ＫＢ
ｒ）　　；３４３０．２９３０．１６９０．１６４０．
１６１０．１３８０．１２５０．１１６０．９７０ｃｍ
−’ 溶解性ニジメチルスルホキシド、酢酸エチル、メタノー
ルに易溶水に不溶高分解能ＦＡＢ−ＭＳ　：　６８３．３４９６　（Ｍ＋
Ｎａじ呈色反応：ヨウ素、アニスアルデヒド、ＢＣＧに
陽性、ニンヒドリン、ドラゲンドルフに陰性（２）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
属に属する抗生物質リベロマイシンＡ生産菌を培養し、
その培養物から抗生物質リベロマイシンＡを分離採取す
ることを特徴とする抗生物質リベロマイシンＡの製造方
法。（３）抗生物質リベロマイシンＡ生産菌が、ストレプト
ミセス５ｉ１１．　Ｓ　Ｎ　−５９３（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　５ｐＳＮ−５９３）である請求項（２）に
記載の製造法。（４）抗生物質リベロマイシンＡを有効成分として含有
することを特徴とする抗腫瘍剤。（５）抗生物質リベロマイシンＡを有効成分として含有
することを特徴とする抗真菌剤。１、事件の表示平成２年特許願第１６号１、　特許請求の範囲を別紙の通り訂正する。２、　明細書第５頁６行の“リベロマイシンＡは、を以
下の通り訂正する。ｒリベロマイシンＡは以下の構造式で示され、４、代同理人（６６９）雪印乳業株式会社」５、補正命令の日付自発７、補正の内容特許請求の範囲（１）以下の構造式で示される抗生物質リベロマイシン
Ａ。（５）抗生物質リベロマイシンＡを有効成分として含有
することを特徴とする抗真菌剤。（２）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
属に属する抗生物質リベロマイシンＡ生産菌を培養し、
その培養物から抗生物質リベロマイシンＡを分離採取す
ることを特徴とする抗生物質リベロマイシンＡの製造方
法。（３）抗生物質リベロマイシンＡ生産菌が、ストレプト
ミセスｓｐ、　　Ｓ　Ｎ　−５９３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ　ｓｐ。５Ｎ−５９３）である請求項（２）に記載の製造法。（４）抗生物質リベロマイシンＡを有効成分として含有
することを特徴とする抗腫瘍剤。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記の理化学的性質を有する抗生物質リベロマイ
シンＡ。性状：白色粉末融点：９５℃ 分子式：Ｃ＿３＿６Ｈ＿５＿２Ｏ＿１＿１元素分析：Ｃ：６４．４５％、Ｈ：８．０６％、（Ｃ＿
３＿６Ｈ＿５＿２Ｏ＿１＿１・１／２Ｈ＿２Ｏとして）
比旋光度：〔α〕＝−１１５゜（ｃ＝０．１、メタノー
ル中）紫外部吸収スペクトル（中）； ▲数式、化学式、表等があります▼ 赤外線吸収スペクトル（ＫＢｒ）；３４３０、２９３０、１６９０、１６４０、１６１０、
１３８０、１２５０、１１６０、９７０ｃｍ＾−＾１溶解性：ジメチルスルホキシド、酢酸エチル、メタノー
ルに易溶水に不溶高分解能ＦＡＢ−ＭＳ：６８３、３４９６（Ｍ＋Ｎａ）
＾＋呈色反応：ヨウ素、アニスアルデヒド、ＢＣＧに陽
性、ニンヒドリン、ドラゲンドルフに陰性
（２）ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）
属に属する抗生物質リベロマイシンＡ生産菌を培養し、
その培養物から抗生物質リベロマイシンＡを分離採取す
ることを特徴とする抗生物質リベロマイシンＡの製造方
法。
（３）抗生物質リベロマイシンＡ生産菌が、ストレプト
ミセスｓｐ．ＳＮ−５９３（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｓｐ．ＳＮ−５９３）である請求項（２）に記載の製造
法。
（４）抗生物質リベロマイシンＡを有効成分として含有
することを特徴とする抗腫瘍剤。（５）抗生物質リベロ
マイシンＡを有効成分として含有することを特徴とする
抗真菌剤。