KR100316010B1 - 키틴 합성효소 2를 저해하는 신규 화합물 페린신 에이 및 이를함유하는 항진균제 조성물 - Google Patents
키틴 합성효소 2를 저해하는 신규 화합물 페린신 에이 및 이를함유하는 항진균제 조성물 Download PDFInfo
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Classifications
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Abstract
본 발명은 키틴 합성효소 II를 저해하는 하기 화학식 1의 신규 화합물 페린신 A(pellinsin A), 이를 생산하는 신균주 페리너스속 종(Pellinus sp.) PL3, 이 균주를 배양하여 페린신 A를 제조하는 방법, 이 균주의 배양액으로부터 페린신 A를 정제하는 방법 및 페린신 A를 함유하는 항진균제 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 신규 화합물 페린신 A는 키틴 합성효소 II에 대한 선택적 저해활성 및 병원성 진균류에 대한 항균활성이 우수하므로 이를 포함하는 약학 조성물은 항진균제로서 유용하다.
Description
본 발명은 키틴 합성효소 II를 저해하는 신규 화합물 페린신 A, 이를 생산하는 신균주 페리너스속 종(Pellinus sp.) PL3, 이 균주를 배양하여 페린신 A를 제조하는 방법, 이 균주의 배양액으로부터 페린신 A를 정제하는 방법 및 페린신 A를 함유하는 항진균제 조성물에 관한 것이다.
진균류의 세포벽과 세포막 합성효소 저해제에 대한 연구는 오래 전부터 시작되어 왔으나 항세균 항생물질에 비해 그 발전속도도 완만하고 진균류에 대한 전반적인 지식이 불충분하여 진균류에 대하여 약효가 우수한 효소저해제의 숫자도 매우 한정되어 있다. 더구나 발견된 효소저해제의 대부분도 독성이 높고 많은 부작용을 내포하고 있어서 새로운 효소저해제에 대한 필요성은 오래 전부터 대두되어 왔으며, 최근에는 AIDS나 장기이식시의 면역억제제 혹은 항암제 등의 장기간 사용에 따른 기회 감염에 의해 내장진균증이 더욱 더 증가하고 있는 추세이다(T. J. Walsh, et al.,Science, 264, 371-373, 1994).
따라서, 이러한 감염증에 대한 대책으로서 조기진단법의 확립과 선택독성이 뛰어난 화학요법제의 조속한 개발이 시급하며 이와 더불어 칸디다(Candida)와 아스퍼질러스(Aspergillus) 등과 같은 다양한 진균류에 대해 화학요법제의 개발이 절실히 요구되고 있다.
현재 임상에서 주로 이용되고 있는 항진균제는 폴리엔(polyene)과 아졸(azole) 유도체 및 알릴아민-티오카바메이트(allylamine-thiocarbamate)류로, 이들 화합물들은 모두 진균류 세포막 성분인 에르고스테롤(ergosterol)과 상호 작용하거나 에르고스테롤의 합성을 저해한다. 이 중에서 폴리엔은 세포막의 투과성을 증가시키고 세포내의 내용물의 유출을 일으켜 세포를 사멸시키며 많은 부작용이 있음에도 불구하고 암포테리신(amphotericin) B는 아직도 폴리엔 항생물질 중 유일하게 전신 진균감염증에 이용되고 있다. 아졸 화합물들은 합성품이 대부분이며 많은 새로운 화합물들이 이용되고 있고 에르고스테롤의 합성경로중 C-14 메틸제거효소(demethylase)를 저해하여 에르고스테롤 합성을 저해하지만 일부 이미다졸 화합물(clotrimazole, miconazole 등)들은 세포막과 직접 상호 작용하여 세포막에 손상을 가하기 때문에 독성이 강하여 국소적으로만 이용되고 있다(D. P. Hanger, et al.,Antimicrob. Agents Chemother., 32, 646, 1988). 최근에 개발된 아졸 화합물(케토코나졸, 이트라코나졸 등)들은 심각한 독성이 적은 반면 사이토크롬(cytochrome) P-450에 의존하는 효소를 저해하며 내분비계의 스테로이드 호르몬 합성을 저해하는 부작용이 보고되고 있다. 그리고 알릴아민 화합물인 나프티핀(naftifine)과 테르비나핀(terbinafine), 티오카바메이트(thiocarbamate) 화합물인 톨나프테이트(tolnaftate) 등의 진균제는 스쿠알렌 에폭시데이즈(squalene epoxidase)와 옥시도스쿠알렌 사이클레이즈(oxidosqualene cyclase)를 저해하여 에르고스테롤 합성을 억제한다고 알려져 있으나 이 화합물들은 시험관내(in vitro)에서 항진균 활성이 광범위하고 아졸 화합물보다 독성이 적은 반면 약물동력학적인 측면이 취약하여 피부질환증에만 주로 이용되고 있다.
이외에도 에르고스테롤 합성 저해제로 많은 화합물들이 보고되고 있으나 독성이 낮고 약효가 우수한 에르고스테롤 합성 저해제는 매우 적기 때문에 새로운 에르고스테롤 합성저해제에 대한 필요성이 꾸준히 증가되어 왔다. 상기와 같은 필요성 때문에 새로운 목표물로 에르고스테롤 합성효소중 스쿠알렌 합성에 관여하는 스쿠알렌 합성효소(squalene synthase)에 대한 연구와 이의 활성을 억제하는 물질의 탐색이 활발히 진행되고 있다. 이 효소는 에르고스테롤 합성과 콜레스테롤 합성시 중간 대사물 형성에 중요한 역할을 하는 효소이며 이 효소저해제로 이미 스쿠알레스타틴(squalestatin)(M. J. Dawson,et al.,J. Antibiot., 45, 639-647, 1992)과자라고지산(zaragozic acid)(J. D. Bergstrom,et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 80-84, 1993) 화합물들이 발표되었는데 이 화합물들은 항진균 활성뿐만 아니라 콜레스테롤 저하 효과도 나타내어 새로운 효소저해제 탐색의 목표물이 되고 있다.
한편, 진균류는 포유류 세포와는 달리 세포벽이 존재하기 때문에 진균류의 세포벽은 선택적인 목표물로서 오래 전부터 많은 주목을 받아왔다. 진균류 세포벽의 주성분은 주로 다당류인 키틴과 글루칸으로 구성되어 있고(D. J. Frost,et al., J. Antibiot., 48, 306-310, 1995), 키틴은 N-아세틸-D-글루코사민이 β-1,4-결합으로 이루어진 동종중합체(homopolymer)로서 키틴 합성효소 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ에 의해 합성된다(W, J. Choi,et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90, 80-84, 1994). 이러한 키틴 효소들에 대한 각각의 특성과 기능이 알려지면서 선진국에서는 분자생물학 기법을 이용하여 각각의 효소만을 선택적으로 생산할 수 있는 균주를 개발하여 격막 형성에 관여하는 키틴 합성효소 Ⅱ와 키틴 고리 형성에 관여하는 키틴 합성효소 Ⅲ의 저해제 탐색을 행하고 있다. 키틴 합성 저해제로는 폴리옥신(polyoxin)(J. Nagatsu,et al., Agric. Biol. Chem., 29, 848-854, 1965)과 니코마이신(nikkomycin)(H. P. Fiedler,et al., J. Chem. Tech. Biotechnol., 32, 271-280, 1982)이 보고되었고, 글루칸 합성 저해제로는 아쿨레아신(aculeacin)(J. Mizoguchi,et al., J. Antibiotics, 30, 308-313, 1977)과 에키노칸딘(echinocandin)(F. Benz,et al., Helv. Chim. Acta, 57, 2459-2477, 1974) 등이 보고되었으나 여러 가지 문제점으로 인해 널리 이용되지 못하고 있는 실정이다.
따라서, 키틴 합성효소 II를 저해하여 효과적인 항진균 활성을 나타내면서도 독성이 낮은 새로운 항진균제가 요구되고 있다.
본 발명의 목적은 진균류의 세포벽 합성에 필수적인 키틴 합성효소 II를 저해하는 신규 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 신규 화합물을 생산하는 신규 미생물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 미생물을 배양하여 상기 신규 화합물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 미생물의 배양액으로부터 상기 신규 화합물을 정제하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 화합물을 함유하는 항진균제 조성물을 제공하는 것이다.
도 1은 페리너스속 종 PL3의 자실체 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 페린신 A의 수소핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3은 페린신 A의 탄소핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 4는 페린신 A의 수소-탄소 핵자기공명 스펙트럼을 나타낸 것이다.
상기 목적에 따라, 본 발명에서는 하기 화학식 1의 구조를 갖고, 키틴 합성효소 II에 대해 저해활성을 나타내는 신규 화합물 페린신 A가 제공된다.
화학식 1
상기 화합물 페린신 A는 노란색 분말로서 분자식 C18H14O8로 나타낼 수 있고 분자량은 358이며, 메탄올, 디메틸설폭사이드(DMSO) 및 물에는 용해되나, 아세톤, 에탄올, 아세토니트릴, 에틸 아세테이트, 헥산 및 클로로포름에는 용해되지 않는다. 페린신 A는 키틴 합성효소 II에 대한 저해활성의 IC50이 약 28 ㎍/㎖로서 우수하여 여러 가지 병원성 진균류에 대하여 우수한 항균활성을 나타낸다.
병원성 진균류를 효과적으로 억제하기 위하여, 유효성분으로서 페린신 A를 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 항진균제 조성물을 제조할 수 있다. 이 항진균제 조성물은 통상적으로 사용되는 부형제, 붕해제, 감미제, 활택제, 향미제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 의해 정제, 캅셀제, 산제, 과립, 현탁제, 유화제, 시럽제, 액제 또는 비경구 투여용 제제와 같은 단위 투여형 또는 수회 투여형 약제학적 제제로 제형화될 수 있다.
페린신 A를 유효성분으로 함유하는 본 발명의 항진균제 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구투여하거나 경구투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 1 내지 30 mg, 바람직하게는 10 내지 15 mg, 가장 바람직하게는 12 내지 13 mg의 활성성분이되도록 1일 1회 이상 투여할 수 있다. 그러나 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여 방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명에서는 또한 페린신 A를 생산하는 신균주 페리너스속 종(Pellinus sp.) PL3가 제공된다. 본 발명의 균주 페리너스속 종 PL3는 30℃에서 생장이 가장 왕성하고 42℃이상에서는 생장하지 못한다. 이 균주의 자실체 형태는 도 1에서 보는 바와 같다. 이 균주는 MEA 배지(2.5% 맥아 추출물, 1.5% 아가), PDA 배지(Difco. Co., 제품번호: 0013-17-6) 및 YMA 배지(0.3% 효모 추출물, 0.3% 맥아 추출물, 0.5% 트립톤, 1.5% 아가)에서는 생장 속도가 빠른 반면, Czapek 배지(0.2% NaNO3, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.05% KCl, 0.001% FeSO4·7H2O, 3.0% 슈크로즈, 1.5% 아가), CYA 배지(0.5% 효모 추출물, 0.3% NaNO3, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.05% KCl, 0.001% FeSO4·7H2O, 0.0005% CuSO4·5H2O, 0.001% ZnCl2·7H2O, 3.0% 슈크로즈, 1.5% 아가) 및 CYA 20S 배지(0.5% 효모 추출물, 0.3% NaNO3, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.05% KCl, 0.001% FeSO4·7H2O, 0.0005% CuSO4·5H2O, 0.001% ZnCl2·7H2O, 20.0% 슈크로즈, 1.5% 아가)에서는 생장이 매우 느리다. 또한, 6종류의 배지 모두에서 유사한 노란색 계열의 색깔을 나타내고, 배양시간이 경과함에 따라 균사체의 각질화가 나타난다. 페리너스속 종 PL3는 생명공학연구소 유전자은행(KCTC)에 1999년 5월 17일자로 기탁번호 제 KCTC 0613BP 호로 기탁되어 있다.
본 발명에서는 또한 페리너스속 종 PL3를 배양하여 페린신 A를 생산하는 방법이 제공되는데, 이를 위해서는 적절한 종균배지, 예를 들어, 포도당 2%, 효모 추출물 0.2%, 폴리펩톤 0.5%, 인산칼슘 0.1% 및 황산마그네슘 7수화물 0.05%를 포함하고 pH 5.9로 조정 후 살균된 배지에 페리너스속 종 PL3를 접종하고 20 내지 42℃, 바람직하게는 25 내지 30℃에서 일정 기간동안, 예를 들어 5 내지 7일동안 진탕배양한 후, 배양된 종균을 적절한 생산배지, 예를 들어, PDA 배지에 접종하여 20 내지 42℃, 바람직하게는 25 내지 30℃에서 일정 기간동안, 예를 들어 4 내지 6일동안 진탕배양한다.
본 발명에서는 또한 페리너스속 종 PL3의 배양액으로부터 페린신 A를 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 구체적으로 다음의 단계들을 포함한다. 우선, 페리너스속 종 PL3의 발효액에 에틸 아세테이트를 가하여 추출한 후 감압농축하여 얻은 조추출물을 클로로포름-메탄올 혼합액을 용출액으로 사용하는 순상 실리카겔 칼럼 크로마토그라피로 2회 분리시키는데, 여기에서 용출액중 클로로포름과 메탄올의 혼합비는 90:10 내지 80:20의 범위로 할 수 있고, 1차로 80:20(v/v), 2차로 90:10(v/v)의 혼합비를 사용하는 것이 바람직하다. 저해활성을 나타내는 분획들을 감압농축하여 다시 메탄올과 물의 혼합액을 용출액으로 사용하는 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그라피로 분리시키는데, 여기에서 용출액중 메탄올과 물의 혼합비는 60:40 내지 50:50의 범위로 할 수 있고, 50:50(v/v)이 바람직하다. 여기에서 얻어진 활성 분획을 다시 프레퍼레이티브 TLC(preparative TLC)를 사용하여 분리정제함으로써 부분정제된 활성 물질을 얻는다. 이때, 전개 용매로서는 클로로포름, 메탄올 및 아세톤의 혼합용매를 사용할 수 있으며, 이들의 혼합비는 85∼90:7∼8:2∼3의 범위로 할 수 있고, 이들이 90:7.5:2.5(v/v/v)의 비율로 혼합된 용매가 바람직하다. 그 후, 부분 정제된 활성 물질을 메탄올과 물의 혼합용매를 용출액으로 사용하는 액체 크로마토그래피(HPLC)로 분리하는데, 이때 메탄올과 물의 혼합비는 30:70 내지 20:80의 범위로 할 수 있고 메탄올:물이 20:80(v/v)의 비율로 혼합된 것이 바람직하다. 이 방법으로 순도 90% 이상의 페린신 A를 분리할 수 있다. 최종적으로, 프레퍼레이티브 TLC를 실시하여 순수한 페린신 A를 분리하는데, 이때 전개용매로서 메탄올:물을 30:70 내지 20:80, 바람직하게는 20:80(v/v)의 혼합비로 사용한다. 본 발명의 방법에 의하면, 순수한 페린신 A를 페리너스속 종 PL3의 발효액 1ℓ당 600 ㎍의 수율로 얻을 수 있다.
이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 실시예를 들어 설명하지만 본 발명의 범위가 하기 실시예에만 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 생산균주의 선발
대한민국 강원도 설악산에서 담황색 계통의 자실체를 가진 버섯을 채취하고 이를 동정하기 위해, 버섯의 균사체를 Czapek 배지(0.2% NaNO3, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.05% KCl, 0.001% FeSO4·7H2O, 3.0% 슈크로즈, 1.5% 아가), MEA 배지(2.5% 맥아 추출물, 1.5% 아가), CYA 배지(0.5% 효모 추출물, 0.3% NaNO3, 0.1%K2HPO4, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.05% KCl, 0.001% FeSO4·7H2O, 0.0005% CuSO4·5H2O, 0.001% ZnCl2·7H2O, 3.0% 슈크로즈, 1.5% 아가), CYA 20S 배지(0.5% 효모 추출물, 0.3% NaNO3, 0.1% K2HPO4, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.05% KCl, 0.001% FeSO4·7H2O, 0.0005% CuSO4·5H2O, 0.001% ZnCl2·7H2O, 20.0% 슈크로즈, 1.5% 아가), PDA 배지(Difco Co., 제품번호: 0013-17-6) 및 YMA 배지에 접종하여 25∼42℃에서 각각 14일간 배양하면서 관찰하였다.
실험 결과, 이 균주는 30℃에서 생장이 가장 왕성하였고 42℃이상에서는 생장하지 못하였다. 또한, MEA, PDA 및 YMA 배지에서는 생장 속도가 빠른 반면, Czapek, CYA 및 CYA20S 배지에서는 생장이 매우 느렸다. 6종류의 배지 모두에서 유사한 노란색 계열의 색깔을 나타냈고, 배양시간이 경과함에 따라 균사체의 각질화가 나타났다. 이러한 결과들을 종합하여 상기 버섯은 페리너스속 종(Pellinus sp.)으로 판명되었다.
페리너스속 종 PL3는 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 5월 17일자로 기탁번호 제 KCTC 0613BP 호로 기탁하였다.
실시예 2: 페리너스속 종 PL3가 생산하는 키틴 합성효소 II 활성저해물질의 분리 및 정제
(단계 1) 균주의 배양
냉동보관된 페리너스속 종 PL3 균주(10 % 글리세롤, -80℃)를 배플(baffle)이 있는 500 ㎖ 삼각 프라스크에 50 ㎖ 종균배지(포도당 2 %, 효모 추출물 0.2 %, 폴리펩톤 0.5 %, 인산칼륨 0.1 %, 황산 마그네슘 7수화물 0.05 %, pH 5.9로 조정후 살균)에 접종하여 26℃에서 6일동안 배양하였다. 이 배양액을 PDA 배지(Difco Co., 제품번호: 0013-17-6) 1ℓ에 2 %(v/v) 농도가 되게 접종한 후 26℃에서 130 rpm으로 5일동안 진탕배양하였다.
(단계 2) 키틴 합성효소 II 활성 저해 물질의 분리 및 정제
(단계 1)에서 얻은 페리너스속 종 PL3의 배양액 10 ℓ에 동량의 에틸 아세테이트를 첨가하여 2회 추출한 후 감압 농축하고 에틸 아세테이트 추출물을 순상 크로마토그라피 컬럼(Merck, Kieselgel 60, 230-400 mesh)에 흡착시킨 후 클로로포름과 메탄올의 혼합액(80:20(v/v))으로 용출하여 활성 분획을 얻고 이 활성 분획을 농축하여 다시 역상 컬럼(Merck, Lichroprep RP-18, 40-63 ㎛)에 흡착시켰다. 역상 컬럼에 흡착된 활성 성분을 메탄올과 물의 혼합액(50:50(v/v))으로 용출하여 활성 분획을 얻었으며, 이 활성 분획을 전개 용매로서 클로로포름, 메탄올 및 아세톤의 혼합액(90:7.5:2.5(v/v/v))을 사용한 프레퍼레이티브 TLC(preparative TLC)로 정제하였다. 부분 정제된 활성 분획을 용출액으로 메탄올과 물의 혼합액(20:80(v/v))을 사용한 HPLC(컬럼: YMC-Pack, ODS, SH-343-5, No.204788)로 정제하여 순도 90%이상의 활성물질을 얻었다. 최종적으로, 메탄올과 물의 혼합액(20:80(v/v))을 전개 용매로 이용하여 프레퍼레이티브 TLC(preparative TLC)를 실시함으로써 키틴 합성효소 II의 활성을 저해하는 순수한 화합물을 분리하고, 이를 페린신 A로 명명하였다. 이때, 최종적으로 얻어진 순수한 페린신 A의 수율은배양액 1 ℓ당 600 ㎍이었다.
페린신 A의 이화학적 성질은 표 1과 같다.
| 구분 | 이화학적 성질 |
| 외형(appearance) | 노란색 분말 |
| 분자식 | C18H14O8 |
| 분자량 | 358 |
| 가용성 | MeOH, DMSO, 물 |
| 불용성 | 아세톤, EtOH, CH3CN, EtOAc, 헥산, 클로로포름 |
실시예 3: 기기분석 및 구조결정
페린신 A의 구조를 결정하기 위하여, 다음과 같은 여러 가지 기기분석을 행하였다.
(1) 자외선-가시광선 흡광도 분석
페린신 A를 100 % 메탄올에 녹여 자외선-가시광선 분광기(Shimazu사, UV-265)를 이용하여 흡수 파장을 분석한 결과 UV 205, 336 nm에서 최대 흡수치를 나타내었다.
(2) 적외선(IR) 흡광도 분석
분말상의 페린신 A 1 ㎎을 KBr을 이용하여 디스크(disk) 형태로 제조하여 적외선 분광기(Bruker EQUINOX 55)로 분석하였다. 분광결과 3,400 cm-1에서 하이드록실기의 존재와 2,922와 2,852 cm-1에서 C-H 연장 진동(stretching vibration), 1,737과 1,718 cm-1에서 카보닐 탄소에 기인하는 흡수 피크가 관찰되었다.
(3) 분자량 분석
질량분석기(Hewlett packard 5989A)를 이용하여 질량분석을 행한 결과, 분리 정제된 페린신 A의 분자량은 358이고 분자식은 C18H14O8로 추정되었으며, 화학식 1과 같은 구조식을 가진 것으로 판명되었다.
(4) 핵자기공명(NMR) 분석
페린신 A 10 ㎎을 CD3OD에 녹여 5 ㎜ NMR 튜브에 넣고 Brucker AMX 500기종으로 NMR 분석을 행하였으며,1H-NMR은 500 MHz로,13C-NMR은 125 MHz로 측정하였다(도 2 및 도 3). 그리고 수소-탄소 연결 핵자기공명 스펙트럼(HMBC)을 측정하여 구조를 결정하였으며 그 결과는 도 4에 나타낸 바와 같다.
실시예 4: 키틴 합성효소 II의 저해활성 검정
페린신 A의 키틴 합성효소 II에 대한 저해 활성은 UDP-[14C]GlcNAc (N-acetyl-D-glucosamine) (400,000 cpm/μmol)을 기질로 하여 최 원자 등의 방법(Won-Ja Choi, et al.,Anal. Biochem., 219, 368-372, 1994)을 사용하여 측정하였다. 시험군으로서 32 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1.6 mM 코발트 아세테이트, 1.1 mM UDP-[14C]GlcNAc, 20 ㎕의 키틴 합성효소 II의 조효소액, 14 ㎕의 페린신 A, 2 ㎕의 트립신(2 ㎎/㎖)을 가하여 30℃에서 15분 동안 예비반응을 시켰다.
이 반응액에 2 ㎕의 트립신 저해제(4 ㎎/㎖)를 첨가하여 얼음에서 10분 동안방치하고, 32 mM N-아세틸글루코사민을 첨가하여 전체 용적이 50 ㎕가 되게 한 후, 30℃에서 90분 동안 반응시켰다. 이 반응액에 1 ㎖의 10 % 트리클로로아세트산을 첨가하여 반응을 정지시킨 후 GF/C 여과지(Whatman Co.)를 이용하여 여과하였다. 이 여과지를 건조시킨 후 3 ㎖의 칵테일(LUMAC LSC B.V.)을 첨가하여 액체 섬광계수기를 이용하여 방사능을 측정하였다.
이 때 대조군은 반응액에 페린신 A를 첨가하지 않았고, 공시험군(Blank)은 페린신 A와 키틴 합성효소 II를 첨가하지 않고 동일한 실험을 반복하여 방사능을 측정하였다. 페린신 A의 키틴 합성효소 II에 대한 저해 활성은 수학식 1에 따라 계산하였다.
그 결과, 페린신 A의 키틴 합성효소 II의 저해활성은 IC50이 28 ㎍/㎖로 확인되어 기존의 키틴 합성효소 II의 저해제로 알려진 폴리옥신(Polyoxine) D (IC50= 70 ㎍/㎖, E. Cabib,Antimicrob. Agents Chemother.,35, 170-173, 1991) 보다 활성이 매우 높음을 확인하였다.
실시예 5: 병원성 균주를 이용한 활성 검색
병원성 균주들 중 효모류는 사부로 브로쓰(Sabouraud's broth)를 이용하여하룻밤 액체 배양한 후 균액을 107CFU/㎖이 되게 조절하여 접종 균액으로 사용하였으며 진균류는 감자 덱스트로즈 아가 배지(potato dextrose agar)나 사부로 아가(Sabouraud's agar) 배지에서 25℃로 7-14일 동안 충분히 배양하여 접종원으로 사용하였다. 페린신 A는 멸균된 증류수를 이용하여 2배 희석 계열을 만든 후, 멸균하여 50℃로 유지시킨 PDA 배지나 사부로 아가 배지와 9:1의 비율로 혼합하여 최종 농도가 1,000-1.95 ㎍/㎖이 되도록 5 ㎝ 크기의 평판에 분주하였다. 배지가 고형화되면 위에서 제조한 피검균들의 접종 균액을 각 평판마다 일정량씩 접종하여 25-30℃에서 1-5일 동안 배양한 후 육안으로 관찰하여 균의 생육이 억제된 농도를 최소생육저지농도(MIC)로 정하였다.
페린신 A의 동식물 유래의 병원성 진균류에 대한 항균 활성도 측정 결과, 인체 병원균인 트리코파이톤 멘타그로파이테스(Trichophyton mentagrophytes) 및 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)에 대한 MIC는 50 ㎍/㎖, 콕시디오이데즈 이미티스(Coccidioides imitis) 및 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans)에 대한 MIC는 100 ㎍/㎖이었다. 또한 식물 병원균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cinerea), 피티움 울티멈(Pythium ultimum), 파이토프토라 캡시시(Phytophthora capsici) 및 알터나리아 키쿠치아나(Alternaria kikuchiana)에 대한 MIC값은 100 ㎍/㎖이었으며, 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 피리큘라리아 오리자에(Pyricularia oryzae)에 대한 MIC값은 50 ㎍/㎖로 기존의 키틴 합성효소 II 저해제인 폴리옥신 D와 대등한우수한 항균 활성을 나타내었다. 특히, 콜레토트리쿰 라게나리움(Colletotrichum lagenarium)에 대한 MIC값은 12.5 ㎍/㎖로 매우 높은 항균 활성을 확인하였다.
실시예 6: 활성저해물질의 급성독성시험
페린신 A에 대해서 체중 25 g정도의 5주령 ddy 마우스(대한실험동물협회)를 대상으로 급성독성 시험을 수행하였다. 먼저 시험물질(페린신 A)을 멸균증류수로 혼합하여 투여직전에 조제하였다. 그리고 대조군은 멸균 증류수를 사용하였으며, 약 3시간 절식시킨 시험계에 대하여 경구 투여용 존데를 이용하여 시험물질을 강제 투여하였다. 투여 당일은 투여 후 1시간에서 6시간까지 매시간, 투여익일부터 14일까지는 매일 1회씩 일반 상태의 변화, 중독 증상 및 사망 동물의 유무를 관찰하였다. 관찰기간 종료후 CO2마취하에 방열치사시켜 내부 장기의 육안적 이상 유무를 상세히 관찰하였다. 그 결과 이 화합물을 1회 100 ㎎까지 투여하고 14일 동안 지속적으로 관찰하여도 커다란 독성이 없음을 확인하였다.
제제예
다음의 제제예는 본 발명에 따른 페린신 A가 유효성분으로 함유된 항진균제의 제제화를 위한 일례이다. 본 발명에 따른 항진균제가 다음의 제제예에 의해 한정되는 것은 아니다.
제제예 1: 경구투여용 정제의 제조
페린신 A를 유효약물로 하여 다음과 같은 조성물을 만든 후 통상의 방법으로 경구투여용 정제를 제조하였다.
성 분
함 량
페린신 A 100 ㎎
경질무수규산 10 ㎎
미세결정 셀룰로오스 190 ㎎
스테아린산마그네슘 5 ㎎
전분글리콘산나트륨 60 ㎎
무수일산일수소칼슘 135 ㎎
제제예 2: 주사제의 제조
페린신 A를 유효약물로 하여 다음과 같은 조성물을 만든 후 통상의 방법으로 주사제를 제조하였다.
성 분
함 량
페린신 A 100 ㎎
만니톨 180 ㎎
Na2HPO4ㆍ12H2O 26 ㎎
증류수 2,974 ㎎
본 발명의 신규 화합물 페린신 A는 키틴 합성효소 II에 대한 선택적 저해활성이 우수하고, 이로 인해 병원성 진균류에 대한 항균활성이 우수하므로 이를 포함하는 약학 조성물은 항진균제로서 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (5)
- 키틴 합성 효소 II를 저해하는 하기 화학식 1의 페린신 A:화학식 1
- 페린신 A를 생산하는 페리너스속 종(Pellinus sp.) PL3 균주(KCTC 0613BP).
- 페리너스속 종(Pellinus sp.) PL3 균주(KCTC 0613BP)를 적절한 배지에서 배양한 후 배양액으로부터 페린신 A를 분리하는 것을 포함하는 페린신 A의 제조 방법.
- (a) 페리너스속 종(Pellinus sp.) PL3 균주의 배양액에 에틸 아세테이트를 가하고 추출하여 조추출물을 얻는 단계;(b) 상기 조추출물을 클로로포름과 메탄올의 혼합액을 용출액으로 사용하는 순상 실리카겔 컬럼 크로마토그라피로 분리하여 활성분획을 얻는 단계:(c) 단계 (b)에서 얻은 활성분획을 메탄올과 물의 혼합액을 용출액으로 사용하는역상 실리카겔 컬럼 크로마토그라피로 분리하여 활성분획을 얻는 단계;(d) 단계 (c)에서 얻은 활성 분획을 클로로포름, 메탄올 및 아세톤의 혼합액을 전개용매로 사용하는 프레퍼레이티브 TLC(preparative TLC)로 정제하여 부분정제된 활성물질을 얻는 단계;(e) 단계 (d)에서 얻은 부분정제된 활성물질을 메탄올과 물의 혼합액을 용출액으로 사용하는 고압 액체 크로마토그라피(HPLC)로 분리하여 활성물질을 얻는 단계; 및(f) 단계 (e)에서 얻은 활성물질을 메탄올 및 물의 혼합액을 사용하는 프레퍼레이티브 TLC로 분리정제함으로써 순수한 페린신 A를 분리하는 단계를 포함하는,페리너스속 종 PL3의 배양액으로부터 페린신 A를 정제하는 방법.
- 활성성분으로서 하기 화학식 1의 페린신 A 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유하는 항진균제 조성물:화학식 1
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