JPH0680607A

JPH0680607A - マルブラニシン

Info

Publication number: JPH0680607A
Application number: JP23343292A
Authority: JP
Inventors: Mitsuru Nakayama; 充中山; Shohei Nakagawa; 昌平中川; Tomoyuki Fujita; 智之藤田; Terumi Kuma; 映美熊
Original assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Taiho Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-09-01
Filing date: 1992-09-01
Publication date: 1994-03-22

Abstract

(57)【要約】【構成】本発明は、式【化１】で表される新規なマルブラニシンに関する。【効果】抗細菌作用及び制癌作用を有しており、医薬
として有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なキノン系抗生物
質マルブラニシン（Malbranicin ）に関する。本発明の
マルブラニシンは、抗細菌作用及び制癌作用を有してお
り、医薬として有用である。

【０００２】

【従来の技術】本発明のマルブラニシンは、文献未記載
の新規化合物である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、抗生
物質等として有用な新規物質を提供することにある。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明は式：

【０００５】

【化２】

【０００６】で表わされるマルブラニシンに係る。

【０００７】本発明のマルブラニシンは、次の理化学的
性質を有する。

【０００８】（１）性状：黄色針状結晶物質。

【０００９】（２）実験式：Ｃ₁₁Ｈ₁₂Ｏ₄（高分解能電
子衝撃（ＨＲＥＩ）マススペクトル法及び元素分析法に
よる）。

【００１０】元素分析：分析値；Ｃ：６３．３６％，
Ｈ：５．７２％理論値；Ｃ：６３．４５％，Ｈ：５．８１％（３）分子量：２０８（高分解能電子衝撃（ＨＲＥＩ）
マススペクトル法による）。

【００１１】（４）融点：１１２〜１１４℃ （５）比旋光度：〔α〕_D ²⁵＝−１８°（Ｃ＝０．０
１、メタノール中）。

【００１２】（６）紫外吸収スペクトル：エタノール
中、λｍａｘ（ｎｍ）（ε）：２５８（１２４００）、
３６０（９７０）。チャートを図１に示す。

【００１３】（７）赤外吸収スペクトル：ＫＢｒ錠剤
法、νｍａｘ（ｃｍ^-1）：２９８０（ｗ）、２９５０
（ｗ）、１７００（ｓ）、１６８０（ｓ）、１６４５
（ｓ）、１４６０、１３６０、１３２０、１２４０
（ｓ）、１１８０、１１６０、１１００、１０５０、９
００、８４０。チャートを図２に示す。

【００１４】（８）核磁気共鳴スペクトル：重クロロホ
ルム中、２７０ＭＨｚで測定したチャートを図３に示
す。

【００１５】（９）溶解性：メタノール、エタノール、
クロロホルム、アセトン、酢酸エチル、ベンゼン、ジメ
チルスルホキシドに良く溶け、ヘキサンにわずかに溶
け、水、石油エーテルに不溶である。

【００１６】（１０）各種展開溶媒を用いてのシリカゲ
ル薄層クロマトグラフィー上で下記の移動度（Ｒｆ値）
を示す。

【００１７】ベンゼン／酢酸エチル（５：１）Ｒｆ値＝０．４０ヘキサン／酢酸エチル（１：１）Ｒｆ値＝０．５８クロロホルム／酢酸エチル（２：１）Ｒｆ値＝０．４８（１１）呈色反応：硫酸、バニリン−硫酸、２，４−ジ
ニトロフェニルヒドラジン反応に陽性。ヨード蒸気、ニ
ンヒドリン、ドラゲンドルフ反応に陰性。

【００１８】（１２）塩基性、酸性、中性の区別：中性マルブラニシンは新規な抗生物質群に属し、その化学名
は、６−（１−アセチルエチル）−２−メトキシ−２，
５−シクロヘキサジエン−１，４−ジオンである。

【００１９】本発明のマルブラニシンは、微生物の培養
により得ることができる。即ち、本物質はマルブラニシ
ンの生産能力を有する菌株（以下、マルブラニシン生産
菌と称する）を適当な条件下で培養することによって培
養液から採取することができる。

【００２０】本物質の製造に用い得るマルブラニシン生
産菌には、マルブランチェア（Malbranchea ）属に属す
る菌株が包含される。その一例として、マルブランチェ
アシンナモメアＴＡＩＭ１３Ｔ５４（Malbranchea
cinnamomea TAIM 13T54 ）株を例示できる。この菌株
は、中華民国台北省淡水市の土壌から分離されたマルブ
ランチェア属に属する菌株であり、通商産業省工業技術
院微生物工業技術研究所に、微生物の表示「Ｓｔｒａｉ
ｎＴＡＩＭ１３Ｔ５４」、受託番号「微工研条寄第
３８３７号（ＦＥＲＭＢＰ−３８３７）」として寄託
されている。

【００２１】そのマルブラニシン生産菌の菌学的性質
は、次の通りである。

【００２２】(1) 各培地における生育状態バレイショ・ブドウ糖寒天培地及びブドウ糖・乾燥酵母
寒天培地での生育状態について肉眼的観察及び顕微鏡的
観察を行った。

【００２３】・バレイショ・ブドウ糖寒天培地生育はブドウ糖・乾燥酵母寒天培地での生育に比べ、ゆ
っくりであり、その集落は４０℃、１０日間培養のとき
直径４５ｍｍに達した。集落は白色、うすピンク色、う
す黄色又は暗い赤味がかったブラウンを呈する。

【００２４】顕微鏡下では透明な幅２〜８μｍの栄養菌
糸を形成し、その菌糸は隔壁近くの膨潤した所で直径５
〜９μｍを示す。

【００２５】分生子柄は分化しない。通常その先端部分
は小さなループ状又はラセンを形成し、分節型分生子は
連鎖又は単一に分断する。分生子は黄味がかった緑色を
呈し、３．２〜４．５×３．９〜７．７μｍの立方体、
長楕円形又は円筒状である。被子器、子のう果等の有性
生殖器官を形成せず、柄子殼、分生胞子層等を有さな
い。

【００２６】各温度での生育と分生子の形成状況を下記
表１に示す。

【００２７】

【表１】

【００２８】・ブドウ糖・乾燥酵母寒天培地バレイショ・ブドウ糖寒天培地での生育とほぼ同様の生
育状態を示した。

【００２９】(2) 各生理的生態的性質・最適生育条件温度３８−４２℃ ｐＨ４．５−８・生育の範囲温度３０−５０℃ ｐＨ３．５−９．５以上のような分類学的諸性質よりマルブラニシン生産菌
は中等度好熱性を示す不完全菌中に属するものと判定さ
れる。これらの菌学的性質について、文献マイコタクソ
ノミー（Mycotaxon.）２０，１２９−１３２（１９８
４）及びマイコロジア（Mycologia ），７９（１），１
４２−１４３（１９８７）を参照した結果、色調、胞子
の形成等から、不完全菌中のモニリア目（Moniliales）
に属し、マルブランチェアシンナモメア（Malbranche
a cinnamomea）に属すると認められる。マルブランチェ
アシンナモメアと、バレイショ・ブドウ糖寒天培地上
での生育状況及び色調が若干相違する菌株である。従っ
て、マルブランチェアシンナモメアＴＡＩＭ１３
Ｔ５４株と命名した。

【００３０】本発明のマルブラニシンは、例えば上記マ
ルブランチェアシンナモメアＴＡＩＭ１３Ｔ５４
株又はその変異株等のマルブランチェア属に属する各種
のマルブラニシン生産菌を適当な培地で培養することに
より製造できる。

【００３１】上記微生物の培養は、原則的に一般微生物
の培養に準じるものであり、通常液体培養による振盪培
養法、通気攪拌培養法等の好気的条件下で行なわれるの
が好適である。

【００３２】培養に用いられる培地としては、マルブラ
ニシン生産菌が利用できる栄養源を含有する培地であれ
ばよく、各種の合成培地、半合成培地、天然培地等をい
ずれも用いることができる。培地組成としては炭素源と
してのグルコース、シュークロース、フラクトース、グ
リセリン、デキストリン、澱粉、糖蜜、コーン・スティ
ーブ・リカー、有機酸等を単独又は組合せて用い得る。
窒素源としてはファーマメディア、ペプトン、肉エキ
ス、酵母エキス、麦芽エキス、大豆粉、カゼイン、アミ
ノ酸、尿素等の有機窒素源、リン酸カリウム、塩化ナト
リウム、硫酸マグネシウム、硝酸ナトリウム、硫酸アン
モニウム等の無機窒素源を単独又は組合せて用い得る。
また培地には、ナトリウム塩、カリウム塩、マグネシウ
ム塩、リン酸塩、その他の重金属塩等も必要に応じて適
宜添加選択され得る。

【００３３】尚、培養中発泡の著しい時は、例えば大豆
油、亜麻仁油等の植物油、オクタデカノール、テトラデ
カノール、ヘプタデカノール等の高級アルコール類、各
種シリコン化合物等の消泡剤を適宜培地中に添加するこ
ともできる。

【００３４】培地のｐＨは、やや酸性ないし中性付近と
するのが好ましい。培養温度は、マルブラニシン生産菌
が良好に生育する温度、通常約３０〜５０℃、特に好ま
しくは約３８〜４２℃付近に保つのがよい。培養時間
は、液体振盪培養及び通気攪拌培養のいずれの場合も、
一般に２〜５日間程度とされる。上記培養によって目的
とするマルブラニシンが生成蓄積される。勿論上述した
各種の培養条件は、使用微生物の種類や特性、外部条件
等に応じて適宜変更でき、またそれぞれに応じて上記範
囲から最適条件を選択、調節できる。

【００３５】この培養により生産された抗生物質等とし
て有用なマルブラニシンを単離するには発酵生産物を採
取する一般的な方法に準じて行なうことができる。例え
ば溶媒抽出、液体交換、あるいは結晶化等の各種手段を
単独または任意の順序に組合せて用いることができる。

【００３６】より詳しくは、上記培養により生産される
マルブラニシンは常法に従いまず瀘過、遠心分離等を行
なって、培養瀘液と菌体固形分とを分離し、得られたマ
ルブラニシンを含む培養瀘液については、水と混合しな
い酢酸エチル、クロロホルム、ブタノール等の溶媒を用
いてマルブラニシンを有機溶媒層に転溶させ、得られた
溶媒層に芒硝を加え、脱水後、溶媒を減圧下で留去すれ
ばマルブラニシンを含む粗抽出物を得ることができる。
更に、菌体固形分についてはアセトン、メタノール等の
溶媒で数回抽出し、溶媒を減圧下で留去後、酢酸エチ
ル、クロロホルム、ブタノール等の溶媒を用いて上記記
載と同様の方法にてマルブラニシンを含む粗抽出物を得
ることができる。必要があれば、塩酸、硫酸又は水酸化
ナトリウムにてｐＨを調節したり、又工業用食塩等を加
えることにより抽出効率を高くしたり、エマルジョン防
止などの方法を講じることができる。また、適当な溶媒
を用いた向流分配法も抽出の範疇に入れる。

【００３７】更に精製するためには通常の脂溶性低分子
物質の精製手段を運用できる。すなわち活性炭、シリカ
ゲル、アルミナ、マクロポーラス非イオン系吸着樹脂等
の吸着剤による種々の吸着クロマトグラフィーおよびＯ
ＤＳ−結合型シリカゲル等を用いる逆相クロマトグラフ
ィーが使用できる。これらのうち、溶出溶媒にクロロホ
ルム／メタノール、酢酸エチル／クロロホルム、酢酸エ
チル／ベンゼン，ベンゼン／アセトン等の混合溶媒系を
用いるシリカゲルクロマトグラフィー、分取シリカゲル
薄層クロマトグラフィー（メルク社製「シリカゲル６
０」２０×２０ｃｍ）およびアセトニトリル／水、メタ
ノール／水等の混合溶媒系を溶出に用いる逆相シリカゲ
ルクロマトグラフィーが最も有効に利用できる。

【００３８】また、更に精製を必要とする場合には、上
記クロマトグラフィーをくり返し行なうか又は溶出溶媒
にメタノールを用いたセファデックスＬＨ−２０（ファ
ルマシア社製）によるゲル瀘過クロマトグラフィーなど
を適宜組み合わせて行なうことにより、高純度のマルブ
ラニシンを単離、精製することができる。

【００３９】本発明のマルブラニシンは、バチルス（Ba
cillus）属等のグラム陽性細菌類等及びフザリウム（Fu
sarium）属の真菌類等に抗菌活性を有する。

【００４０】また、マルブラニシンは、ヒト鼻咽喉癌由
来の株化培養ＫＢ細胞及びマウス白血病Ｐ３８８細胞に
対する殺細胞作用をも有する。

【００４１】なお、精製工程中の有効物質の確認は、マ
ルブラニシンにより増殖抑制作用のみられる微生物、例
えば実施例に記載のバチルスズブチルスＡＴＣＣ
６６３３（Bacillus subtilis ATCC 6633 ）を用いるバ
イオアッセイ法と、薄層クロマトグラフィーまたはペー
パークロマトグラフィーで展開させた後、上記検定菌に
よるバイオオートグラフィーで検出する方法、ＵＶ２５
４ｎｍによる蛍光発色、２，４−ジニトロフェニルヒド
ラジンで検出する方法を併用するのが良い。

【００４２】又、マウス白血病Ｐ３８８細胞に対する殺
細胞効果を調べることにより、有効画分を確認すること
ができる。

【００４３】

【実施例】次に実施例を挙げて更に詳細に説明する。

【００４４】実施例１マルブラニシンの製造及びその
作用可溶性デンプン１．５％、ペプトン０．４％、酵母エキ
ス０．４％、リン酸カリウム０．１％、硫酸マグネシウ
ム０．０５％よりなる培地（ｐＨ７．０）１２０ｍｌを
５００ｍｌの坂口振盪フラスコに分注し、滅菌後、マル
ブランチェアシンナモメアＴＡＩＭ１３Ｔ５４株
（識別のための表示ＳｔｒａｉｎＴＡＩＭ１３Ｔ
５４、微工研条寄第３８３７号）を一白金耳量接種し、
４０℃で４０時間往復振盪培養した（毎分１１０回、振
幅７ｃｍ）。次に、可溶性テンプン１．５％、酵母エキ
ス０．４％、硫酸マグネシウム０．０５％、リン酸カリ
ウム０．１％よりなる培地（ｐＨ７．０）を５００ｍｌ
の坂口振盪フラスコに１５０ｍｌずつ分注し、滅菌後、
上記の種菌を１％の割合で加え、４０℃、３日間往復振
盪培養した（毎分１１０回、振幅７ｃｍ）。

【００４５】培養終了後、培養液（１０Ｌ、ｐＨ５．
８）を採取し、遠心、瀘過後、希水酸化ナトリウム溶液
でｐＨ７．０に調整し、酢酸エチル（２Ｌ）で２回攪拌
抽出した。また、菌体固形分はアセトン（３Ｌ）で２回
抽出し、溶媒留去後、残渣を酢酸エチル（１Ｌ）で２回
攪拌抽出した。

【００４６】先の培養瀘液側の酢酸エチル抽出液と合わ
せて、この酢酸エチル抽出画分を水で洗浄し、無水硫酸
ナトリウムで乾燥後、減圧濃縮して黄褐色の油状物質
（１．３２ｇ）を得た。

【００４７】この油状物質をクロロホルム約５ｍｌに溶
解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（メルク社
製「キーゼルゲル」、１．８×４０ｃｍ）に吸着させ、
クロロホルム／酢酸エチル（２：１）で溶出した。

【００４８】溶出フラクションをペーパーディスクにし
みこませ乾燥後、バチルスズブチルスＡＴＣＣ６
６３３を検定菌とする寒天平板上にのせて行うバイオア
ッセイ法により、生育阻止が認められたマルブラニシン
を含む活性画分を集め、溶媒を留去後乾固して、淡黄色
油状物質４５０ｍｇを得た。

【００４９】ｉ）得られた油状物質をクロロホルム／酢
酸エチル（１０：１）約２ｍｌに溶解し、シリカゲルカ
ラムクロマトグラフィー（１．４×２５ｃｍ）にもう一
回吸着させ、クロロホルム／酢酸エチル（１０：１）で
溶出し、マルブラニシンを含む画分を得た。その画分の
一部を、シリカゲル薄層プレート上にスポットし、展開
溶媒クロロホルム／酢酸エチル（２：１）を用いて展
開、風乾後、ＵＶ２５４ｎｍで蛍光発色を示すマルブラ
ニシンを含む活性画分を集めた。溶媒留去後乾固し、そ
の後クロロホルム／メタノール混合液で再結晶し、目的
物質を３２０ｍｇ得た。続いてメタノールで再結晶して
針状結晶を得た。

【００５０】ii）また、得られた油状物質をメタノール
に溶解し、その一部（１ｍｇ）をＯＤＳ結合型シリカゲ
ルカラム（ウォーターズ社製「ＮＯＶＡＰＡＫ
Ｃ₁₈」、５．０×２５０ｍｍ）に吸着させ、溶出溶媒と
してメタノール／水（３：２）を用い、流速１．０ｍｌ
／分で溶出した。溶出フラクションをバイオアッセイ法
により検出し、マルブラニシンを含む活性画分を集め、
有機溶媒を減圧留去した後、水溶液を凍結乾燥した。こ
の操作を３回繰り返し行ない、淡黄色物質２ｍｇの目的
物質を得た。この高速液体クロマトグラフ装置にて本発
明のマルブラニシンをＵＶ２１０ｎｍで検出した場合は
保持時間約３．６９分のピークとして検出される。

【００５１】得られたマルブラニシンの系列寒天平板希
釈法によるミュラーヒントン（Mueller-Hinton）寒天培
地上、３７℃、１８時間培養後の細菌類（細胞数１０⁶
個／ｍｌ）及びサブロー（Sabouraud ）寒天培地上、２
７℃、７２時間培養後の真菌類（細胞数１０⁶個／ｍ
ｌ）に対する最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は表２の通り
である。この判定の結果、マルブラニシンは、グラム陽
性細菌の一部及び真菌類の一部に活性を示した。

【００５２】また、マルブラニシンのヒト鼻咽喉癌由来
の株化培養ＫＢ細胞（細胞数１×１０³個）及びマウス
白血病Ｐ３８８細胞（細胞数１×１０³個）を５％ＣＯ
₂インキュベーターで２４時間培養後、適当な濃度のマ
ルブラニシンを添加し、３日間培養する。クリスタルバ
イオレットで染色し、無処理群との比より、５０％細胞
増殖を阻害する濃度（ＩＣ₅₀）を求めた。ＫＢ細胞及び
Ｐ３８８細胞に対するＩＣ₅₀は、それぞれ２．８μｇ／
ｍｌ及び０．７μｇ／ｍｌであっった。

【００５３】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明物質の紫外吸収スペクトルである。

【図２】本発明物質の赤外吸収スペクトルである。

【図３】本発明物質の核磁気共鳴スペクトルである。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】式：【化１】で表わされるマルブラニシン。