JP3854866B2 - ミコフェノール酸およびその誘導体の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
本発明は、式（Ｉ）：
【０００２】
【化２】
【０００３】
［式中、Ｒ1 はメチル基を意味し、Ｒ2 はヒドロキシル基を表す］
のミコフェノール酸およびその誘導体［式（Ｉ）において、Ｒ1 はメチルまたはヒドロキシメチル基を意味し、Ｒ2 はアミノ基である］の微生物学的製造方法に関する。式（Ｉ）のミコフェノール酸［（Ｅ）−６−（１，３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル）−４−メチル−４−ヘキセン酸］は、その免疫抑制作用に起因して、治療用途に使用される。
【０００４】
ミコフェノール酸は１８９６年にペニシリウム・グラウクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）の発酵ブロス中で初めて報告され［Ｅ．Ｌ．Ｊｏｎｅｓら：Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．６５，５３７（１９７５）］、後に、例えばペニシリウム・ブレビコンパクツム（Ｐ．ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、ペニシリウム・ストロニフェルム（Ｐ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒｕｍ）、ペニシリウム・エキヌラツム（Ｐ．ｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）およびペニシリウム・ビリディカツム（Ｐ． ｖｉｒｉｄｉｃａｔｕｍ）などのペニシリウム属の他の種の発酵ブロスからも単離された。ミコフェノール酸の構造はＪ．Ｍ．Ｂｉｒｋｉｎｓｈａｗら［Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ５０，６３０（１９５２）］によって１９５２年に決定された。ミコフェノール酸の発見後にその抗細菌活性も記載されたが、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の病原性株がミコフェノール酸に対する耐性を速やかに獲得したため、この分野がさらに発達することはなかった［Ｅ．Ｐ．Ａｂｒａｈａｍら：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９，３９８（１９４５）］。エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）属およびトリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属のいくつかの株に対する本化合物の抗真菌活性も明らかにされている。同様に、その抗ウイルス作用も、とりわけ単純疱疹ウイルスに対して立証されている［Ｒ．Ｈ．Ｗｉｌｌｉａｍｓら：Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．２１，４６３（１９６８）］。また、その抗腫瘍活性も公表され、近年集中的に研究されるようになった［Ｙ． Ｓｉｄｉら：Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５８，６１（１９８８）］。８０年代後半に記載されたミコフェノール酸のモルホリノエチルエステル誘導体は免疫抑制剤としての治療的使用が認可されている。
ミコフェノール酸の広範な生物学的効力は、この化合物がイノシン−５’−モノリン酸デヒドロゲナーゼ酵素およびグアニン−５’−モノリン酸シンテターゼ酵素の活性に対して阻害作用を持ち、それがグアニン合成量の低下を引き起こすことによって説明することができる。このグアニン合成は、一部の細胞において、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素により、他の経路でも達成することができる。しかし、Ｔリンパ球およびＢリンパ球にはこの酵素がないので、これらリンパ球の成長はミコフェノール酸によって選択的に阻害される。
【０００５】
１９７０年代の初頭に、多くのミコフェノール酸誘導体が製造された。修飾は微生物学的手段および化学的手段により、イソベンゾフラニル環にも４−メチル−４−ヘキセン酸側鎖にも施された［Ｄ．Ｆ．Ｊｏｎｅｓら：Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１７２５（１９７０）］。一部のミコフェノール酸誘導体は抗腫瘍試験でミコフェノール酸に近い活性を示している［Ｍ．Ｊ．Ｓｗｅｅｎｅｙら：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，１７９５（１９７２）］。イノシン−５' −モノリン酸デヒドロゲナーゼに対してミコフェノール酸より高い阻害作用を発揮するミコフェノール酸誘導体もあった［Ｍ．Ｊ．Ｓｗｅｅｎｅｙら：ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ ３２，１８０３（１９７２）］。
【０００６】
一側面として、本発明は、その使用によってミコフェノール酸を文献公知の方法よりも有利に製造することができる微生物の選択および遺伝的改良を目指した。
もう一つの側面として、本発明は、ミコフェノール酸および治療的に有効である可能性を持つ新規ミコフェノール誘導体の微生物学的製造方法を目指した。
微生物由来の新規活性物質を探索する研究の過程で、本発明者らは、様々な地域で収集した土壌試料から分離された微生物を調べた。抗真菌剤スクリーニングプログラムの一環として、発酵ブロス中にミコフェノール酸を含有する真菌株を分離した。この株から、突然変異選抜法により、高濃度のミコフェノール酸を産生する突然変異株を作出した。突然変異原として紫外線照射とＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ' −ニトロソグアニジンを利用した。
【０００７】
ミコフェノール酸の生合成は、ペニシリウム・グラウクム、ペニシリウム・ストロニフェルム、ペニシリウム・ブレビコンパクツム、ペニシリウム・スカブルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｃａｂｒｕｍ）、ペニシリウム・ナゲミ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎａｇｅｍｉ）、ペニシリウム・パトリスメイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐａｔｒｉｓｍｅｉ）、ペニシリニウム・グリセオブルンネウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｒｉｓｅｏｂｒｕｎｎｅｕｍ）およびペニシリウム・ビリディカツムの株について記載されている。ミコフェノール酸の生合成の過程で、この分子のイソベンゾフラン部分は、それに結合している側鎖とは異なる方法で形成される。側鎖の生合成はファルネシルピロリン酸まではステロイド骨格の合成に従う。イソベンゾフラン部分は１分子のアセチルＣｏＡと３分子のマロニルＣｏＡ−ｓから形成される。芳香環上のメチル基はＳ−アデノシルメチオニンから当該分子内に組み込まれる。８員鎖を切り離すことでミコフェノール酸の側鎖を形成するファルネシルピロリン酸はイソベンゾフラン環のＣ−６に結合される。この生合成の最終工程は、Ｓ−アデノシルメチオニンからのメトキシル基の形成を含む［Ｗ．Ｌ． Ｍｕｔｈら：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ８，３２１（１９７５）］。
【０００８】
文献に記載されているミコフェノール酸産生株は全てペニシリウム属のアシンメトリカ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａ）節に属する。分類学的決定によれば、本発明者らが分離した株はペニシリウム属内のモノベルチシラータ（Ｍｏｎｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）亜属に属し、ミコフェノール産生能を持つことは文献には今まで報告されていない種ペニシリウム・ワクスマニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉ）に分類することができる。
分類学的決定を以下に述べる。
【０００９】
一般的な培養形態上の特徴：
本新規分離株は、分生子柄の形成ならびに分枝、メトレおよびそのフィアライドの配置に関して、ペニシリウム属に特有の典型を示す。その胞子形成性気中菌糸体は通常ビロード様で、よく発達している。成熟状態において、デンプン＋硫酸アンモニウム寒天培地では暗い茶灰色；サブロー（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ）ペプトン＋グルコース寒天培地では明るい茶灰色；サブローグルコース寒天培地では暗い灰色；アスパラギン＋グリセロール培地では明るい緑色；牛血を添加したツァペック（Ｃｚａｐｅｋ）（硝酸塩＋スクロース）寒天培地では茶黒色；単純なツァペック培地では暗い茶灰色；麦芽寒天培地では暗色化する緑色；麦芽エキス＋酵母エキス＋グルコース寒天培地では暗色化する茶灰色；オートフレーク寒天培地では暗い茶灰色である。最初は、多数の菌糸が培養培地上で緑色または青緑色であることが多いが、成熟した気中菌糸体は灰色または茶灰色である。一般に、本株の基底菌糸体は無色または淡黄褐色である。可溶性色素の産生はどの培地でも観察されなかった。コロニー表面のしわは少ない。気中菌糸体の平均厚は、１〜３ｍｍを越えない。メラニン様色素の産生（チロシナーゼ活性）は陰性である。
【００１０】
分生子柄の長さは極めて多様である。分生子柄は、多くの場合、基底菌糸体から直接成長するが、長い軸糸の側方分枝である場合もある（図１ａ〜ｆの分生子柄タイプを参照されたい；ａ、ｄ、ｅおよびｆはアスパラギン＋グリセロール寒天培地；ｂは麦芽寒天培地；ｃはデンプン＋硫酸アンモニウム寒天培地；ｇは分生子鎖）。圧倒的多数が一つのフィアライド輪からなるブラシを持つことから、本株は、モノベルチシラータ種に分類することができる。このモノベルチシラータ型のブラシは「ディバリカータ（ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）」形に配置される場合が極めて多い（図１参照）。ビベルチシリウム（Ｂｉｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）型の分生子柄もそれぞれ別途観察することができる（図１参照）。フィアライドによって形成される輪は２〜８（ほとんどの場合、３）構成である。分生子は丸く、ほとんどの場合、２〜２５μｍの大きさで、平滑な表面を持つ。分生子鎖中の分生子数は２０を超える場合もある。
【００１１】
生理学的性質：
エスクリン加水分解：陽性。硫化水素の産生：陰性。ＮａＣｌ耐性：最大３％まで。ｐＨ耐性：３．０〜９．０。アンモニアまたは気体の発生を伴う硝酸塩からの亜硝酸塩の生成は検出されなかった。カタラーゼ試験：陽性。オキシダーゼ試験：陽性。尿素分解：陽性。レシチナーゼおよびゼラチナーゼ活性：陽性。デンプン加水分解は弱い。ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０加水分解：陽性。しかしツウィーン４０およびツウィーン６０の加水分解は極めて弱い。有機酸のナトリウム塩からは、安息香酸塩、サリチル酸塩では有利に生育し、酢酸塩、酒石酸塩およびコハク酸塩では弱く生育する。マロン酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩およびクエン酸塩では全く生育しないか、痕跡程度にしか生育しない。グルコース、フルクトース、アラビノース、キシロース、ラムノース、スクロース、ラフィノース、マンニトールおよびイノシトールを非常によく資化する。グルコース、スクロース、ラムノース、デキストリン、メリビオース、マルトース、ラフィノース、フルクトース、イノシトール、イヌリン、グリセロール、キシロース、ズルシトールおよびマンニトールで強い酸産生が観察された（Ｒ．Ｅ． Ｇｏｒｄｏｎの培養培地でブロモクレゾールパープル指示薬を使用）。ガラクトース、アラビノースおよびサリシンでの酸産生は弱かった。
【００１２】
分類学上の位置：
本発明者らが分離したミコフェノール酸産生性ペニシリウム株はペニシリウム・ワクスマニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉ）種に近い変種であると考えることができる。この同定は下記表１のデータによっても確認される。
表１：ペニシリウム・ワクスマニの標準的記載と本発明者らが分離したミコフェノール酸産生性ペニシリウム株の特徴的特性との比較
【００１３】
【表１】
【００１４】
一側面として本発明は、本発明者らが分離しナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチャラル・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ００１２６９として寄託されたミコフェノール酸産生性ペニシリウム・ワクスマニ株は、突然変異選抜法による発生の後に、適切な発酵条件下で高濃度のミコフェノール酸を産生するという認識に基づいている。
さらに本発明は、本発明者らが土壌試料から同様に分離したストレプトミセス・グリセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｒｕｂｅｒ）Ｎｏ．１／６株（ストレプトミセスｓｐ．Ｎｏ．１／６として寄託）およびストレプトミセス・レシストミシフィカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｓｉｓｔｏｍｙｃｉｆｉｃｕｓ）Ｎｏ．１／２８株の培養物がそれぞれ、ミコフェノール酸を、Ｒ1 がメチルまたはヒドロキシメチル基を意味しかつＲ2 がアミノ基を表す一般式（Ｉ）の化合物に変換する能力を持つという認識に基づいている。
【００１５】
ストレプトミセスＮｏ．１／６株の分類学的説明
培養形態上の特徴的性質：オートミール寒天培地では、典型的赤色のよく発達した気中菌糸体（赤色系列；「シンナモメウス（Ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｓ）」色系列）が基底菌糸体表面を覆う。基底菌糸体の色は黄色を帯びている。可溶性色素は認められない。赤い胞子塊が観察され、多くのレチナキュラム・アペルツム（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌｕｍ ａｐｅｒｔｕｍ）型担胞子体の存在を検出することができる。ツァペック寒天培地では、コロニーは強く発達した、赤みを帯びた気中菌糸体、赤黄色の基底菌糸体および薄く赤みを帯びた拡散性色素を特徴とする。ポテトスライスでは、褐色の基底菌糸体が赤みを帯びた気中胞子塊で覆われ、ポテトの色は暗い茶赤色になった。大豆ペプトン寒天培地では、よく発達した赤みを帯びた気中菌糸体の下の基底菌糸体及び培地そのものは暗褐色または黒色である。リンゴ酸寒天平板では、黄色を帯びた気中菌糸体のほとんどが不稔性のままで、褐色を帯びた基底菌糸体の下に、強い赤褐色の可溶性色素の拡散を見ることができる。酵母−鉄寒天培地では、Ｎｏ．１／６株は極めて明白なメラニン様色素産生を示す。また、チロシン寒天培地でも、強度は弱いものの、発色性であることがわかった。
【００１６】
生理学的性質：Ｎｏ．１／６株はセルロースを分解しない。培地中の唯一の資化源としてのグルコース、フルクトース、スクロース、ラムノースおよびｉ−イノシトールの資化は陽性であり、また、生育は比較的弱いもののキシロースとアラビノースの資化も陽性であることが観察された。ラフィノースでは極めて弱い生育（資化陰性）が検出された。
【００１７】
分類学上の位置：レチナキュラム・アペルツム（らせん）型担胞子体を特徴とする典型的赤色ストレプトミセス（赤色系列の胞子塊色、基底菌糸体の色：黄褐色＋赤色、赤みを帯びた可溶性色素）としてのＮｏ．１／６株は、Ｋａｍｐｆｅｒらの数値分類体系［Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３７，１８３１−１８９１（１９９１）］のクラスター１８（２３）に属するストレプトミセス・グリセオルバー・ヤマグチ・アンド・サブリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｒｕｂｅｒ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｓａｂｕｒｉ）（１９５５）種にかなり類似した培養形態を示す。しかし、その近縁関係を明確にするには、いくつかの生理学的相違点に関して、さらなる研究が必要だろう。
【００１８】
ストレプトミセスＮｏ．１／２８株の分類学的説明
培養形態上ならびに光学および電子顕微鏡形態上の特徴的性質：オートミール寒天平板では、気中菌糸体が弱く発達し、その色は最初は白色で、後に明るい灰色を帯び、インターナショナル・ストレプトミセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）の色系列カテゴリーに従って正確に特徴づけることはできない［（ＳｈｉｒｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｌｉｅｂ，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔ．，１６，３１３−３４０（１９６６）］。顕微鏡観察の結果、菌糸は不稔性であることが判明し、担胞子体および分生子への分化は観察されなかった。基底菌糸体の中等度の発達と、淡黄褐色可溶性色素の産生が検出された。酵母エキス−麦芽エキス寒天培地では、弱く発達した白色および不稔性の気中菌糸体、赤褐色基底菌糸体および明るい黄色を帯びた拡散性色素が観察された。無機塩類−デンプン寒天平板では、よく発達した暗い赤灰色基底菌糸体が、相対的にさらによく発達した気中菌糸体で覆われ、その色は白色から短い（レチナキュラム・アペルツム型）らせん状担胞子体および平滑な表面を持つ胞子の黄灰色の塊に変化した。可溶性色素の存在は検出されなかった。この株（１／２８）の培養物は、ペプトン−酵母−鉄寒天培地でもチロシン寒天培地でも、暗褐色または黒色のメラニン様色素を産生した。
【００１９】
生理学的性質：セルロースでは良好な生育が観察されたが、セルロース繊維の目に見える分解はなかった。硝酸塩ブロスでは良好な生育を示したが、亜硝酸塩アンモニアまたは気体の発生は検出されなかった。６％までのＮａＣｌ濃度と５〜１１のｐＨ値に耐えうることがわかった。エスクリン加水分解試験およびウレアーゼ試験は陽性だった。グルコース、フルクトース、アラビノース、キシロース、ラムノース、スクロース、マンニトール、ラフィノースおよびメソイノシトールを培地中の唯一の炭素源として良好な生育が観察された。クエン酸Ｎａ、マロン酸Ｎａ、ピルビン酸Ｎａ、乳酸Ｃａおよびコハク酸Ｃａでは弱い生育が観察された。酢酸Ｎａ、酒石酸Ｎａおよび安息香酸Ｎａでは痕跡程度にしか生育しなかった。
【００２０】
分類学上の位置：気中菌糸体の色の正しい同定は不可能だったが、最も重要な特徴的性質に基づいて、この株はストレプトミセス・レシストミシフィカス・リンデンバイン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｓｉｓｔｏｍｙｃｉｆｉｃｕｓ Ｌｉｎｄｅｎｂｅｉｎ）１９５２（Ｋａｍｐｆｅｒら（１９９１）によればストレプトミセス・ビオラセウス（Ｓｔｒ． ｖｉｏｌａｃｅｕｓ））の弱胞子形成性変種と呼ぶことができる。
したがって本発明は、一般式（Ｉ）：
【００２１】
【化３】
【００２２】
［式中、Ｒ1 はメチルまたはヒドロキシメチル基を意味し、Ｒ2 はヒドロキシルまたはアミノ基を表す］
の化合物の微生物学的製造方法であって、ミコフェノール酸生合成能を持つペニシリウム・ワクスマニ真菌株を、同化可能な炭素および窒素源ならびに無機塩類を含む培養培地で２２℃〜３０℃にて生育し、Ｒ1 がメチル基を意味しかつＲ2 がヒドロキシル基を表す一般式（Ｉ）の化合物を発酵ブロスから分離し、所望によりそれを精製し、所望によりそれを、同化可能な炭素および窒素源ならびに無機塩類を含む培養培地で、液中曝気条件下に、生物変換反応が完了するまで、
ａ）ナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチャラル・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニズムスにストレプトミセスｓｐ．Ｎｏ．１／６として受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７５の下に寄託されているストレプトミセス・グリセオルバーＮｏ．１／６放線菌株の培養物を使って発酵することにより、Ｒ1 がメチル基を意味しかつＲ2 がアミノ基を表す一般式（Ｉ）の化合物を製造するか、または、
ｂ）ナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチャラル・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニズムスに受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７６の下に寄託されているストレプトミセス・レシストミシフィカスＮｏ．１／２８放線菌株の培養物を使って発酵することにより、Ｒ1 がヒドロキシメチル基を意味しかつＲ2 がアミノ基を表す一般式（Ｉ）の化合物を製造した後、
生成した一般式（Ｉ）の化合物を培養物から分離し、所望によりそれを精製することからなる方法に関する。
【００２３】
本発明では、グルコース、マルトース、スクロース、グリセロール、麦芽エキスおよび水溶性デンプンを炭素源として有利に資化するペニシリウム・ワクスマニ株の培養物をミコフェノール酸の製造に使用する。酵母エキス、ペプトン、肉エキス、カゼイン、トリプカシン（ｔｒｙｐｃａｓｉｎ）、大豆粉、コーンスティープリカー、硝酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを窒素源として使用することができる。
ミコフェノール酸の製造に使用する培養培地には、上記炭素および窒素源の他に、無機塩類（例えば硫酸マグネシウム）、アミノ酸類、ビタミン類および消泡剤が存在してもよい。
【００２４】
本発明のミコフェノール酸製造方法の好ましい一態様では、ナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチャラル・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニズムスに受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ ００１２６９として寄託されているペニシリウム・ワクスマニ株またはミコフェノール酸生合成能を持つその突然変異株の傾斜寒天培養物から蒸留水で胞子懸濁液を調製する。この胞子懸濁液５ｍｌを種培養培地に接種した後、２４℃〜２８℃（好ましくは２５℃）で３日間生育した接種用培養物を生産培養培地に接種し、２２℃〜２８℃（好ましくは２５℃）で７日間生育する。培養を好気培養条件で行ったところ、その間にｐＨ値は３．５と７．５の間で変化した。発酵の主要期間中は吸気量を毎時１２０リットルとし、撹拌速度を毎分４００回転とした。
【００２５】
発酵中に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）後のデンシトメトリーを用いて、発酵ブロスの活性物質含量を決定した。培養物が最高濃度のミコフェノール酸を含有する時に発酵を停止した。遠心分離した発酵ブロス試料の上清をメタノールで４倍希釈したものを高速液体クロマトグラフィーによる分析にかけた［装置：ＬＫＢ無勾配システム；カラム：ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）Ｃ18 ５μｍ（ＢＳＴ）；中間カラム：４０×４ｍｍ；分析カラム；２５０×４．６ｍｍ；２５℃にサーモスタット制御；２３８ｎｍで測定；溶離液：アセトニトリル−リン酸でｐＨ２に調節した蒸留水（６０：４０）；流量：１．０ｍｌ／分；注入量：１０μｌ］。このシステムでのミコフェノール酸の保持時間は１５．８分である。
【００２６】
Ｒ1 がメチル基を意味しかつＲ2 がアミノ基を表す一般式（Ｉ）の化合物を製造する本発明方法の好ましい一態様では、ストレプトミセス・グリセオルバーＮｏ．１／６株の傾斜寒天培養物から蒸留水で胞子懸濁液を調製する。この胞子懸濁液を種培養培地に接種し、次に２５℃〜３７℃（好ましくは２８℃）で３日間生育した接種用培養物を生産培養培地に接種し、次いでそれを２５℃〜３２℃（好ましくは２８℃）で３日間培養した。培養物にミコフェノール酸を加えた後、培養をさらに７日間続けた。
【００２７】
Ｒ1 がヒドロキシメチル基を意味しかつＲ2 がアミノ基を表す一般式（Ｉ）の化合物を製造する本発明方法のもう一つの好ましい態様では、ストレプトミセス・レシストミシフィカスＮｏ．１／２８株の傾斜寒天培養物から蒸留水で胞子懸濁液を調製する。この胞子懸濁液を種培養培地に接種し、次に２５℃〜３７℃（好ましくは２８℃）で３日間生育した接種用培養物を生産培養培地に接種して３日間培養した。培養物にミコフェノール酸を加えた後、培養をさらに７日間続けた。
本発明の方法を以下の実施例によって例示する。
【００２８】
実施例１
高濃度のミコフェノール酸を生合成するペニシリウム・ワクスマニ突然変異株［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ ００１２６９］を、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ' −ニトロソグアニジンを使って行う突然変異選抜実験で作製した。土壌試料から分離したミコフェノール酸生合成性ペニシリウム・ワクスマニ株をＭＳ寒天傾斜培地で２５℃にて１０日間生育した。
培養培地ＭＳの組成（蒸留水１０００ｍｌ中）：
グルコース ４ｇ
麦芽エキス １０ｇ
酵母エキス ４ｇ
寒天 ２０ｇ
【００２９】
寒天傾斜培地から５ｍｌの滅菌０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で胞子を洗い落とした。その胞子懸濁液にＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ' −ニトロソグアニジンを１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。その懸濁液を２８℃、１５０ｒｐｍで３５分間振とうした。次に、５０００ｒｐｍの速度で遠心分離することによって胞子を沈降させた後、滅菌蒸留水に再懸濁した。その懸濁液をＭＳ寒天平板に塗布した。平板を２５℃で１０日間培養した後、生育したコロニーをＭＳ培養培地に接種した。生育した寒天傾斜培養物のミコフェノール酸産生能を、実施例２に記載する方法により、振とうフラスコ実験でスクリーニングした。
【００３０】
実施例２
麦芽エキスおよび酵母エキスを含む傾斜寒天培地で７〜１０日間生育したＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ００１２６９ペニシリウム・ワクスマニ株の培養物から、５ｍｌの滅菌水を使って胞子を洗い落とし、その胞子懸濁液を、５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中で滅菌した１００ｍｌのＭＩ接種用培養培地に接種した。ＭＩ培養培地の組成は次の通りである（水道水１０００ｍｌ中）。
グルコース ４０ｇ
カゼイン加水分解物 ５ｇ
硝酸ナトリウム ３ｇ
リン酸二水素カリウム ２ｇ
塩化カリウム ０．５ｇ
硫酸マグネシウム ０．５ｇ
硫酸鉄 ０．０１ｇ
【００３１】
滅菌前に培養培地のｐＨ値を６．０に調節し、滅菌を１２１℃で２５分間行った。培養物を振とう装置（２５０ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）で３日間振とうした後、容量各５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ５０本にて１２１℃で２５分間滅菌した１００ｍｌの培養培地Ａ２に接種した。
培養培地Ａ２の組成は、水道水１０００ｍｌ中、
グルコース ８０ｇ
トリプカシン １０ｇ
である。
【００３２】
滅菌は１２１℃で２５分間行った。フラスコを振とう装置（２５０ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）で２５℃にて振とうした。発酵ブロスの活性物質含量をＨＰＬＣ法で決定した。発酵を１６８時間続け、発酵ブロスからミコフェノール酸を単離した。３１００ｍｇ／リットルのミコフェノール酸を含む５Ｌの発酵ブロスから、以下のように生成物を単離した。
【００３３】
発酵が完了した後、２０重量％の硫酸を添加することによって発酵ブロスのｐＨ値を３．２±０．２に調節し、その酸性発酵ブロスを２５００ｍｌの塩化メチレンと共に１時間撹拌した。次に、相を分離した後、水相を１２５０ｍｌ×３の塩化メチレンで上記のように抽出した。ミコフェノール酸を含有する合わせた塩化メチレン抽出物を５００ｍｌ×１および２５０ｍｌ×２の５重量％炭酸水素ナトリウム溶液で抽出した。ミコフェノール酸ナトリウム塩を含む合わせたアルカリ性水溶液を２０℃未満に冷却し、溶液のｐＨ値を２０重量％硫酸溶液で３．２±０．２に調節した。その酸性溶液を２８０ｍｌ×３の塩化メチレンで抽出した後、合わせた塩化メチレン抽出物を減圧下にエバポレートした。蒸発残渣を８０℃のイソプロピルアルコール８８ｍｌに溶解し、１．１ｇの活性炭を使って３０分間清澄化した。活性炭を濾過した後、濾紙表面を熱イソプロピルアルコールで２回洗浄した。合わせたイソプロピルアルコールろ液を減圧下でエバポレートした後、粗生成物を８０℃のイソプロピルアルコール８８ｍｌに溶解した。次に、得られた溶液を室温に冷却し、０〜５℃で終夜静置した。結晶を濾過し、冷イソプロピルアルコールで１回、ｎ−ヘキサンで２回洗浄した。得られた生成物を減圧下に５０〜６０℃で乾燥した。次に、その乾燥生成物を６０℃の外温でエタノール５５ｍｌに溶解し、得られた溶液を撹拌しながら脱イオン水２２ｍｌを滴下した。その溶液を室温に冷却し、０〜５℃で終夜静置した。濾過した後、結晶をエタノールと水の４：１０混合液で１回、ｎ−ヘキサンで２回洗浄し、最後に減圧下に５０〜６０℃で乾燥したところ、９．０ｇの純粋なミコフェノール酸を得た。
融点：１４１℃
生成物の分光データは以下の通りである：
紫外スペクトル（９６％エタノール中、濃度２０μｇ／ｍｌ、層厚１ｃｍ）
【００３４】
【表２】
【００３５】
ＩＲ：３４１５；１７４５；１７１０；１６２５ｃｍ-1；
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，δTMS ＝０ｐｐｍ）：１．８０（ｓ，３Ｈ，４−ＣＨ3 ）；２．１３（ｓ，３Ｈ，７’−ＣＨ3 ）；２．３０（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ2 −３）；２．４２（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ2 −２）；３．３７（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ2 −６）；３．７６（ｓ，３Ｈ，６’−ＯＣＨ3 ）；５．１６（ｓ，２Ｈ，Ｈ2 −１’）；５．２５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，δTMS ＝０ｐｐｍ）：１１．５，ｑ（７’−ＣＨ3 ）；１６．０，ｑ（４−ＣＨ3 ）；２２．５，ｔ（Ｃ−６）；３２．７，ｔ（Ｃ−２）；３４．１，ｔ（Ｃ−３）；６０．９，ｑ（６’−ＯＣＨ3 ）；７０．０，ｔ（Ｃ−１’）；１０６．３，ｓ（Ｃ−３ａ’）；１１６．７，ｓ（Ｃ−７’）；１２２．０，ｓ（Ｃ−５’）；１２２．９，ｄ（Ｃ−５）；１３３．８，ｓ（Ｃ−４）；１４４．０，ｓ（Ｃ−７ａ’）；１５３．６，ｓ（Ｃ−４’）；１６３．６，ｓ（Ｃ−６’）；１７２．９，ｓ（Ｃ−３’）；１７９．４，ｓ（Ｃ−１）
質量分析
電子衝撃イオン化（ＥＩ）質量分析
特徴的スペクトルデータ：
ＥＩ（７０ｅＶ）；ｍ／ｚ ３２０（［Ｍ］+ ・）；ｍ／ｚ ３０２（［Ｍ−Ｈ2 Ｏ］+ ・）；ｍ／ｚ ２４７（［Ｍ− ・ＣＨ2 ＣＨ2 −ＣＯＯＨ］+ ）；ｍ／ｚ ２２９（［２４７−Ｈ2 Ｏ］+ ）； ｍ／ｚ ２０７（［Ｃ11Ｈ11Ｏ4 ］+ ）；ｍ／ｚ １５９（［Ｃ10Ｈ7 Ｏ2 ］+ ）
化学イオン化（ＣＩ）質量分析
特徴的スペクトルデータ：
ＣＩ（ｉ−ブタン）：ｍ／ｚ ３２１（［Ｍ＋Ｈ］+ ）；ｍ／ｚ ３２０（［Ｍ］+ ・）；ｍ／ｚ ３０３（［Ｍ＋Ｈ−Ｈ2 Ｏ］+ ）。
【００３６】
実施例３
作業容量５Ｌの研究用発酵槽にて１２１℃で４５分間滅菌した５Ｌの生産培養培地Ａ２に、実施例２で述べたように調製した振とう培養接種物２５０ｍｌを接種した。接種後、１２０Ｌ／時の滅菌空気を吹き込み、撹拌機の速度を４００ｒｐｍとして、発酵槽を２５℃で運転した。発酵を１６８時間続けた後、ミコフェノール酸を発酵ブロスから単離した。得られた４．９Ｌの発酵ブロスは発酵の終了時点で２０００ｍｇ／ｌのミコフェノール酸を含有した。実施例２で述べたように発酵ブロスからミコフェノール酸を単離した。
【００３７】
実施例４
研究用発酵槽にて１２１℃で３５分間滅菌した５Ｌの生産培地Ａ３に、実施例２に記載したように調製した種培養物２５０ｍｌを接種した。
培地Ａ３の組成（水道水１０００ｍｌ中）：
グルコース ８０ｇ
ＮＺアミンＹＴＴ（Ｑｕｅｓｔ社） １０ｇ
上記発酵槽を曝気量１２０Ｌ／時および撹拌速度４００ｒｐｍにて２７℃で運転した。発酵を１６８時間続けた。得られた５Ｌの発酵ブロスは２５５０ｍｇ／ｌのミコフェノール酸を含有した。ミコフェノール酸を実施例２に従って発酵ブロスから単離した。
【００３８】
実施例５
ストレプトミセスｓｐ．Ｎｏ．１／６として寄託したストレプトミセス・グリセオルバーＮｏ．１／６株［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７５］をＣＭ寒天傾斜培地で生育した培養物から、細胞懸濁液を調製した。
寒天培養培地ＣＭの組成（蒸留水１０００ｍｌ中）：
グルコース ２５ｇ
ペプトン ２ｇ
酵母エキス １ｇ
硫酸マグネシウム−水（１：７） ０．５ｇ
リン酸二水素カリウム ５ｇ
寒天 ２０ｇ
【００３９】
容量５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入っている１００ｍｌの滅菌接種用培養培地ＭＢに上記懸濁液５ｍｌを接種した。
培養培地ＭＢの組成（水道水１０００ｍｌ中）：
グルコース ２０ｇ
麦芽エキス ３０ｇ
酵母エキス １０ｇ
硫酸マグネシウム−水（１：７） １ｇ
【００４０】
滅菌前に培養培地のｐＨ値を７．０に調節し、滅菌を１２１℃で２５分間行った。培養物を振とう装置（２５０ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）で２８℃にて３日間生育した後、得られた種培養各５ｍｌを、容量各５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ５０本に入っている１００−１００ｍｌの滅菌生物変換反応培養培地ＭＢＴに接種した。培地ＭＢＴはそれぞれ以下の組成を有する。（水道水１０００ｍｌ中）：
グルコース ２０ｇ
麦芽エキス １０ｇ
大豆粉 ５ｇ
ペプトン １０ｇ
硫酸マグネシウム−水（１：７） １ｇ
リン酸二水素カリウム １ｇ
【００４１】
滅菌前に培養培地のｐＨ値を７．０に調節した。滅菌は１２１℃で２５分間行った。接種時に、別途滅菌したグルコースを少しずつ培養培地に加えた。フラスコは振とう装置（２５０ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）を用いて３日間２８℃で振とうした。７２時間培養物に、エタノールに溶解したミコフェノール酸を最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるように添加した。この添加の後、発酵をさらに７日間続けた。生物変換反応の最後に、２．０Ｌのアセトンと４．０Ｌの酢酸エチルを４．０Ｌの発酵ブロスに加えた。次に、その混合物を１時間撹拌した。次に、相を分離し、水相を４．０Ｌのクロロホルムで再び抽出した。抽出の過程で得られた乳化した有機相を遠心分離した。次に、分離した有機相をエバポレートし、得られた粗生成物（２．０ｇ）を、１００ｇのキーゼルゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ）６０（粒径０．０６３〜０．２ｍｍ；Ｒｅａｎａｌ社（ブダペスト））吸着剤で調製したカラムによるクロマトグラフィーにかけた。粗生成物をクロロホルム、メタノールおよび９９．５％酢酸（８．５：１．５：０．０１）の混合液と共にカラムにのせ、クロマトグラフィー中は、上記の混合液を展開溶媒として使用した。このカラムクロマトグラフィーでは、各１０ｍｌの画分を集め、それらの画分をキーゼルゲル６０Ｆ254 ＤＣアルフォイル（ａｌｕｆｏｉｌ）（Ｍｅｒｃｋ社）でのＴＬＣにより、上記の展開混合液を用いて分析した（１％ＦｅＣｌ3 ／エタノール試薬を使って室温で検出）。主にミコフェノール酸アミドを含む画分を合わせ、得られた１２０ｍｌの溶液に４０ｍｌの脱イオン水を加えた。その混合物のｐＨ値を、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の添加によって４．０〜４．５に調節した。相を分離した後、水相を４０ｍｌのクロロホルムで抽出した。合わせた抽出物を減圧下でエバポレートし、得られた生成物（０．３ｇ）を再び、３０ｇのキーゼルゲル６０（粒径０．０６３〜０．０２ｍｍ；Ｒｅａｎａｌ社（ブダペスト））吸着剤で調製したカラムによるクロマトグラフィーにかけた。このクロマトグラフィーカラムは塩化メチレンと酢酸エチルの混合液（酢酸エチル含量１０％）を使って調製した。溶出には、以降の各溶出毎に、この混合液の酢酸エチル含量を１０％ずつ増加させた。クロマトグラフィーの過程で１５〜２０ｍｌの画分を収集し、上記の条件下でＴＬＣで調べた。（検査の際には、ベンゼンと酢酸エチルからなる混合液（１：２）を展開溶媒系として使用した）。生成物は、塩化メチレンと酢酸エチルの混合液（酢酸エチル含量４０％）を使ってカラムから溶離させた。生成物を含む画分を減圧下にエバポレートして、クロマトグラフィー的に純粋なミコフェノール酸アミド０．２ｇを得た。
【００４２】
ＩＲ：３４３３；１７３７；１６６５；１６２２ｃｍ-1；
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，δTMS ＝０ｐｐｍ）：１．８０（ｓ，３Ｈ，４−ＣＨ3 ）；２．１４（ｓ，３Ｈ，７’−ＣＨ3 ）；２．３１（ｓ，４Ｈ，Ｈ2 −２およびＨ2 −３）；３．３９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ2 −６）；３．７６（ｓ，３Ｈ，６’−ＯＣＨ3 ）；５．１９（ｓ，２Ｈ，Ｈ2 −１’）；５．２１（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，δTMS ＝０ｐｐｍ）：１１．４，ｑ（７’−ＣＨ3 ）；１６．０，ｑ（４−ＣＨ3 ）；２２．５，ｔ（Ｃ−６）；３４．２，ｔ（Ｃ−２）；３４．９，ｔ（Ｃ−３）；６１．０，ｑ（６’−ＯＣＨ3 ）；７０．０，ｔ（Ｃ−１’）；１０６．３，ｓ（Ｃ−３ａ’）；１１６．７，ｓ（Ｃ−７’）；１２２．０，ｓ（Ｃ−５’）；１２３．０，ｄ（Ｃ−５）；１３４．２，ｓ（Ｃ−４）；１４４．１，ｓ（Ｃ−７ａ’）；１５３．５，ｓ（Ｃ−４’）；１６３．５，ｓ（Ｃ−６’）；１７２．８，ｓ（Ｃ−３’）；１７６．４，ｓ（Ｃ−１）
質量分析
電子衝撃イオン化（ＥＩ）質量分析
特徴的スペクトルデータ
ＥＩ（７０ｅＶ）：（［Ｍ］+ ・）３１９，Ｃ17Ｈ21ＮＯ5 ；ｍ／ｚ ３０２，Ｃ17Ｈ18Ｏ5 （［Ｍ−ＮＨ3 ］+ ・）；ｍ／ｚ ３０１，Ｃ17Ｈ19ＮＯ4 ，（［Ｍ−Ｈ2 Ｏ］+ ・）；ｍ／ｚ ２６１，Ｃ15Ｈ17Ｏ4 ，（［Ｍ− ・ＣＨ2 ＣＯＮＨ2 ］+ ）；ｍ／ｚ ２０７，Ｃ11Ｈ11Ｏ4 ，（Ｍ− ・Ｃ5 Ｈ8 ＣＯＮＨ2 ］+ ）
化学イオン化（ＣＩ）質量分析
特徴的スペクトルデータ：
ＣＩ（ｉ−ブタン）：（［Ｍ＋Ｈ］+ ）３２０；（［Ｍ］+ ・）３１９；ｍ／ｚ ３０３（［Ｍ＋Ｈ−ＮＨ3 ］+ ）；ｍ／ｚ ２０７（［Ｍ− ・Ｃ5 Ｈ8 ＣＯＮＨ2 ］+ ）
【００４３】
実施例６
実施例５で述べたように、ＣＭ寒天傾斜培地で生育したストレプトミセス・レシストミシフィカスＮｏ．１／２８株［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７６］の培養物から調製した細胞懸濁液を使って、接種用培養物の調製と生物変換反応を行った。
【００４４】
生物変換反応の最後に体積４．５Ｌの発酵ブロスを実施例４に述べたように抽出した。抽出物を減圧下でエバポレートすることにより３．８ｇの粗生成物を得て、１１４ｇのキーゼルゲル６０吸着剤（粒径０．０６３〜０．２ｍｍ；Ｒｅａｎａｌ社）で調製したクロマトグラフィーカラムで粗生成物を精製した。クロマトグラフィーによる精製では、クロロホルム、メタノールおよび９９．５％酢酸の混合液（８．５：１．５：０．０１）を展開溶媒系として使用した。クロマトグラフィー中は各１５〜２０ｍｌの画分を収集し、実施例５で述べたようにＴＬＣによって分析した。クロロホルム、メタノールおよび９９．５％酢酸からなる混合液（８．５：１．５：０．１）を展開溶媒系として使用した。主にヒドロキシメチルミコフェノール酸アミドを含む画分を合わせ、その溶液を実施例５で述べたように処理してからエバポレートした。生成物（０．４ｇ）をさらに、４０ｇのキーゼルゲル６０（粒径０．０６３〜０．２ｍｍ；Ｒｅａｎａｌ社）吸着剤で調製したカラムによるクロマトグラフィーにかけた。このクロマトグラフィーカラムはクロロホルム中に調製し、溶出中はクロロホルムとメタノールを含む混合液（メタノール含量は各溶出毎に１％ずつ増加させた）を使用した。クロマトグラフィー中は各１０ｍｌの画分を収集し、上記の条件下にＴＬＣで分析した。生成物は５％のメタノールを含むクロロホルムを使ってカラムから溶離させた。生成物を含む画分をエバポレートし、得られた生成物（０．３ｇ）を、３００ｍｌのセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（スウェーデン））を含むカラムで、メタノールを溶媒として、さらに精製した。このゲル濾過クロマトグラフィーでは、各１０ｍｌの画分を収集し、上記の条件下にＴＬＣで分析した。純粋な生成物を含む画分を合わせ、減圧下にエバポレートしたところ、クロマトグラフィー的に均一なヒドロキシメチルミコフェノール酸アミド０．２２ｇを得た。
【００４５】
得られた生成物の分光データは以下の通りである。
ＩＲ：３３３９；１７３５；１６５７；１６１５ｃｍ-1；
1Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ4 ，δTMS ＝０ｐｐｍ）：１．８０（ｓ，３Ｈ，４−ＣＨ3 ）；２．２５（ｓ，４Ｈ，Ｈ2 −２およびＨ2 −３）；３．３８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ2 −６）；３．７８（ｓ，３Ｈ，６’−ＯＣＨ3 ）；４．６６（ｓ，２Ｈ，７’−ＣＨ2 −ＯＨ）；５．２５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．４０（ｓ，２Ｈ，Ｈ2 −１’）；
13Ｃ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ4 ，δTMS ＝０ｐｐｍ）：１６．２，ｑ（４−ＣＨ3 ）；２３．４，ｔ（Ｃ−６）；３５．３，ｔおよび３６．５，ｔ（Ｃ−２およびＣ−３）；５７．８，ｔ（７’−ＣＨ2 −ＯＨ）；６２．９，ｑ（６’−ＯＣＨ3 ）；７１．５，ｔ（Ｃ−１’）；１０８．２，ｓ（Ｃ−３ａ’）；１２２．０，ｓおよび１２３．６，ｓ（Ｃ−５’およびＣ−７’）；１２４．２，ｄ（Ｃ−５）；１３５．３，ｓ（Ｃ−４）；１４６．８，ｓ（Ｃ−７ａ’）；１５６．１，ｓ（Ｃ−４’）；１６４．１，ｓ（Ｃ−６’）；１７３．７，ｓ（Ｃ−３’）；１７８．７，ｓ（Ｃ−１）
質量分析
ポジティブ（＋）およびネガティブ（−）ＦＡＢスペクトル
特徴的スペクトルデータ：
＋および−ＦＡＢ（キセノン，９ｋＶ）：［Ｍ＋Ｈ］+ ３３６，ｍ／ｚ ３１８［Ｍ＋Ｈ−Ｈ2 Ｏ］+ ；［Ｍ−Ｈ］- ３３４
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明者らが分離した新規ミコフェノール酸産生株の分生子柄の形状を示す図。ａ、ｄ、ｅおよびｆはアスパラギン＋グリセロール寒天培地、ｂは麦芽寒天培地、ｃはデンプン＋硫酸アンモニウム寒天培地、ｇは分生子鎖。
本発明は、式（Ｉ）：
【０００２】
【化２】
［式中、Ｒ1 はメチル基を意味し、Ｒ2 はヒドロキシル基を表す］
のミコフェノール酸およびその誘導体［式（Ｉ）において、Ｒ1 はメチルまたはヒドロキシメチル基を意味し、Ｒ2 はアミノ基である］の微生物学的製造方法に関する。式（Ｉ）のミコフェノール酸［（Ｅ）−６−（１，３−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−６−メトキシ−７−メチル−３−オキソ−５−イソベンゾフラニル）−４−メチル−４−ヘキセン酸］は、その免疫抑制作用に起因して、治療用途に使用される。
【０００４】
ミコフェノール酸は１８９６年にペニシリウム・グラウクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｌａｕｃｕｍ）の発酵ブロス中で初めて報告され［Ｅ．Ｌ．Ｊｏｎｅｓら：Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．６５，５３７（１９７５）］、後に、例えばペニシリウム・ブレビコンパクツム（Ｐ．ｂｒｅｖｉｃｏｍｐａｃｔｕｍ）、ペニシリウム・ストロニフェルム（Ｐ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒｕｍ）、ペニシリウム・エキヌラツム（Ｐ．ｅｃｈｉｎｕｌａｔｕｍ）、ペニシリウム・ロックフォルティ（Ｐ．ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）およびペニシリウム・ビリディカツム（Ｐ． ｖｉｒｉｄｉｃａｔｕｍ）などのペニシリウム属の他の種の発酵ブロスからも単離された。ミコフェノール酸の構造はＪ．Ｍ．Ｂｉｒｋｉｎｓｈａｗら［Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｊ． ５０，６３０（１９５２）］によって１９５２年に決定された。ミコフェノール酸の発見後にその抗細菌活性も記載されたが、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属の病原性株がミコフェノール酸に対する耐性を速やかに獲得したため、この分野がさらに発達することはなかった［Ｅ．Ｐ．Ａｂｒａｈａｍら：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３９，３９８（１９４５）］。エピデルモフィトン（Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎ）属およびトリコフィトン（Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ）属のいくつかの株に対する本化合物の抗真菌活性も明らかにされている。同様に、その抗ウイルス作用も、とりわけ単純疱疹ウイルスに対して立証されている［Ｒ．Ｈ．Ｗｉｌｌｉａｍｓら：Ｊ．Ａｎｔｉｂｉｏｔ．２１，４６３（１９６８）］。また、その抗腫瘍活性も公表され、近年集中的に研究されるようになった［Ｙ． Ｓｉｄｉら：Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５８，６１（１９８８）］。８０年代後半に記載されたミコフェノール酸のモルホリノエチルエステル誘導体は免疫抑制剤としての治療的使用が認可されている。
ミコフェノール酸の広範な生物学的効力は、この化合物がイノシン−５’−モノリン酸デヒドロゲナーゼ酵素およびグアニン−５’−モノリン酸シンテターゼ酵素の活性に対して阻害作用を持ち、それがグアニン合成量の低下を引き起こすことによって説明することができる。このグアニン合成は、一部の細胞において、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ酵素により、他の経路でも達成することができる。しかし、Ｔリンパ球およびＢリンパ球にはこの酵素がないので、これらリンパ球の成長はミコフェノール酸によって選択的に阻害される。
【０００５】
１９７０年代の初頭に、多くのミコフェノール酸誘導体が製造された。修飾は微生物学的手段および化学的手段により、イソベンゾフラニル環にも４−メチル−４−ヘキセン酸側鎖にも施された［Ｄ．Ｆ．Ｊｏｎｅｓら：Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１７２５（１９７０）］。一部のミコフェノール酸誘導体は抗腫瘍試験でミコフェノール酸に近い活性を示している［Ｍ．Ｊ．Ｓｗｅｅｎｅｙら：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３２，１７９５（１９７２）］。イノシン−５' −モノリン酸デヒドロゲナーゼに対してミコフェノール酸より高い阻害作用を発揮するミコフェノール酸誘導体もあった［Ｍ．Ｊ．Ｓｗｅｅｎｅｙら：ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ ３２，１８０３（１９７２）］。
【０００６】
一側面として、本発明は、その使用によってミコフェノール酸を文献公知の方法よりも有利に製造することができる微生物の選択および遺伝的改良を目指した。
もう一つの側面として、本発明は、ミコフェノール酸および治療的に有効である可能性を持つ新規ミコフェノール誘導体の微生物学的製造方法を目指した。
微生物由来の新規活性物質を探索する研究の過程で、本発明者らは、様々な地域で収集した土壌試料から分離された微生物を調べた。抗真菌剤スクリーニングプログラムの一環として、発酵ブロス中にミコフェノール酸を含有する真菌株を分離した。この株から、突然変異選抜法により、高濃度のミコフェノール酸を産生する突然変異株を作出した。突然変異原として紫外線照射とＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ' −ニトロソグアニジンを利用した。
【０００７】
ミコフェノール酸の生合成は、ペニシリウム・グラウクム、ペニシリウム・ストロニフェルム、ペニシリウム・ブレビコンパクツム、ペニシリウム・スカブルム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｃａｂｒｕｍ）、ペニシリウム・ナゲミ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｎａｇｅｍｉ）、ペニシリウム・パトリスメイ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｐａｔｒｉｓｍｅｉ）、ペニシリニウム・グリセオブルンネウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｇｒｉｓｅｏｂｒｕｎｎｅｕｍ）およびペニシリウム・ビリディカツムの株について記載されている。ミコフェノール酸の生合成の過程で、この分子のイソベンゾフラン部分は、それに結合している側鎖とは異なる方法で形成される。側鎖の生合成はファルネシルピロリン酸まではステロイド骨格の合成に従う。イソベンゾフラン部分は１分子のアセチルＣｏＡと３分子のマロニルＣｏＡ−ｓから形成される。芳香環上のメチル基はＳ−アデノシルメチオニンから当該分子内に組み込まれる。８員鎖を切り離すことでミコフェノール酸の側鎖を形成するファルネシルピロリン酸はイソベンゾフラン環のＣ−６に結合される。この生合成の最終工程は、Ｓ−アデノシルメチオニンからのメトキシル基の形成を含む［Ｗ．Ｌ． Ｍｕｔｈら：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ８，３２１（１９７５）］。
【０００８】
文献に記載されているミコフェノール酸産生株は全てペニシリウム属のアシンメトリカ（Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃａ）節に属する。分類学的決定によれば、本発明者らが分離した株はペニシリウム属内のモノベルチシラータ（Ｍｏｎｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌａｔａ）亜属に属し、ミコフェノール産生能を持つことは文献には今まで報告されていない種ペニシリウム・ワクスマニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉ）に分類することができる。
分類学的決定を以下に述べる。
【０００９】
一般的な培養形態上の特徴：
本新規分離株は、分生子柄の形成ならびに分枝、メトレおよびそのフィアライドの配置に関して、ペニシリウム属に特有の典型を示す。その胞子形成性気中菌糸体は通常ビロード様で、よく発達している。成熟状態において、デンプン＋硫酸アンモニウム寒天培地では暗い茶灰色；サブロー（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ）ペプトン＋グルコース寒天培地では明るい茶灰色；サブローグルコース寒天培地では暗い灰色；アスパラギン＋グリセロール培地では明るい緑色；牛血を添加したツァペック（Ｃｚａｐｅｋ）（硝酸塩＋スクロース）寒天培地では茶黒色；単純なツァペック培地では暗い茶灰色；麦芽寒天培地では暗色化する緑色；麦芽エキス＋酵母エキス＋グルコース寒天培地では暗色化する茶灰色；オートフレーク寒天培地では暗い茶灰色である。最初は、多数の菌糸が培養培地上で緑色または青緑色であることが多いが、成熟した気中菌糸体は灰色または茶灰色である。一般に、本株の基底菌糸体は無色または淡黄褐色である。可溶性色素の産生はどの培地でも観察されなかった。コロニー表面のしわは少ない。気中菌糸体の平均厚は、１〜３ｍｍを越えない。メラニン様色素の産生（チロシナーゼ活性）は陰性である。
【００１０】
分生子柄の長さは極めて多様である。分生子柄は、多くの場合、基底菌糸体から直接成長するが、長い軸糸の側方分枝である場合もある（図１ａ〜ｆの分生子柄タイプを参照されたい；ａ、ｄ、ｅおよびｆはアスパラギン＋グリセロール寒天培地；ｂは麦芽寒天培地；ｃはデンプン＋硫酸アンモニウム寒天培地；ｇは分生子鎖）。圧倒的多数が一つのフィアライド輪からなるブラシを持つことから、本株は、モノベルチシラータ種に分類することができる。このモノベルチシラータ型のブラシは「ディバリカータ（ｄｉｖａｒｉｃａｔａ）」形に配置される場合が極めて多い（図１参照）。ビベルチシリウム（Ｂｉｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）型の分生子柄もそれぞれ別途観察することができる（図１参照）。フィアライドによって形成される輪は２〜８（ほとんどの場合、３）構成である。分生子は丸く、ほとんどの場合、２〜２５μｍの大きさで、平滑な表面を持つ。分生子鎖中の分生子数は２０を超える場合もある。
【００１１】
生理学的性質：
エスクリン加水分解：陽性。硫化水素の産生：陰性。ＮａＣｌ耐性：最大３％まで。ｐＨ耐性：３．０〜９．０。アンモニアまたは気体の発生を伴う硝酸塩からの亜硝酸塩の生成は検出されなかった。カタラーゼ試験：陽性。オキシダーゼ試験：陽性。尿素分解：陽性。レシチナーゼおよびゼラチナーゼ活性：陽性。デンプン加水分解は弱い。ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０加水分解：陽性。しかしツウィーン４０およびツウィーン６０の加水分解は極めて弱い。有機酸のナトリウム塩からは、安息香酸塩、サリチル酸塩では有利に生育し、酢酸塩、酒石酸塩およびコハク酸塩では弱く生育する。マロン酸塩、ピルビン酸塩、乳酸塩およびクエン酸塩では全く生育しないか、痕跡程度にしか生育しない。グルコース、フルクトース、アラビノース、キシロース、ラムノース、スクロース、ラフィノース、マンニトールおよびイノシトールを非常によく資化する。グルコース、スクロース、ラムノース、デキストリン、メリビオース、マルトース、ラフィノース、フルクトース、イノシトール、イヌリン、グリセロール、キシロース、ズルシトールおよびマンニトールで強い酸産生が観察された（Ｒ．Ｅ． Ｇｏｒｄｏｎの培養培地でブロモクレゾールパープル指示薬を使用）。ガラクトース、アラビノースおよびサリシンでの酸産生は弱かった。
【００１２】
分類学上の位置：
本発明者らが分離したミコフェノール酸産生性ペニシリウム株はペニシリウム・ワクスマニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉ）種に近い変種であると考えることができる。この同定は下記表１のデータによっても確認される。
表１：ペニシリウム・ワクスマニの標準的記載と本発明者らが分離したミコフェノール酸産生性ペニシリウム株の特徴的特性との比較
【００１３】
【表１】
一側面として本発明は、本発明者らが分離しナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチャラル・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ００１２６９として寄託されたミコフェノール酸産生性ペニシリウム・ワクスマニ株は、突然変異選抜法による発生の後に、適切な発酵条件下で高濃度のミコフェノール酸を産生するという認識に基づいている。
さらに本発明は、本発明者らが土壌試料から同様に分離したストレプトミセス・グリセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｒｕｂｅｒ）Ｎｏ．１／６株（ストレプトミセスｓｐ．Ｎｏ．１／６として寄託）およびストレプトミセス・レシストミシフィカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｓｉｓｔｏｍｙｃｉｆｉｃｕｓ）Ｎｏ．１／２８株の培養物がそれぞれ、ミコフェノール酸を、Ｒ1 がメチルまたはヒドロキシメチル基を意味しかつＲ2 がアミノ基を表す一般式（Ｉ）の化合物に変換する能力を持つという認識に基づいている。
【００１５】
ストレプトミセスＮｏ．１／６株の分類学的説明
培養形態上の特徴的性質：オートミール寒天培地では、典型的赤色のよく発達した気中菌糸体（赤色系列；「シンナモメウス（Ｃｉｎｎａｍｏｍｅｕｓ）」色系列）が基底菌糸体表面を覆う。基底菌糸体の色は黄色を帯びている。可溶性色素は認められない。赤い胞子塊が観察され、多くのレチナキュラム・アペルツム（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌｕｍ ａｐｅｒｔｕｍ）型担胞子体の存在を検出することができる。ツァペック寒天培地では、コロニーは強く発達した、赤みを帯びた気中菌糸体、赤黄色の基底菌糸体および薄く赤みを帯びた拡散性色素を特徴とする。ポテトスライスでは、褐色の基底菌糸体が赤みを帯びた気中胞子塊で覆われ、ポテトの色は暗い茶赤色になった。大豆ペプトン寒天培地では、よく発達した赤みを帯びた気中菌糸体の下の基底菌糸体及び培地そのものは暗褐色または黒色である。リンゴ酸寒天平板では、黄色を帯びた気中菌糸体のほとんどが不稔性のままで、褐色を帯びた基底菌糸体の下に、強い赤褐色の可溶性色素の拡散を見ることができる。酵母−鉄寒天培地では、Ｎｏ．１／６株は極めて明白なメラニン様色素産生を示す。また、チロシン寒天培地でも、強度は弱いものの、発色性であることがわかった。
【００１６】
生理学的性質：Ｎｏ．１／６株はセルロースを分解しない。培地中の唯一の資化源としてのグルコース、フルクトース、スクロース、ラムノースおよびｉ−イノシトールの資化は陽性であり、また、生育は比較的弱いもののキシロースとアラビノースの資化も陽性であることが観察された。ラフィノースでは極めて弱い生育（資化陰性）が検出された。
【００１７】
分類学上の位置：レチナキュラム・アペルツム（らせん）型担胞子体を特徴とする典型的赤色ストレプトミセス（赤色系列の胞子塊色、基底菌糸体の色：黄褐色＋赤色、赤みを帯びた可溶性色素）としてのＮｏ．１／６株は、Ｋａｍｐｆｅｒらの数値分類体系［Ｊ． Ｇｅｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． １３７，１８３１−１８９１（１９９１）］のクラスター１８（２３）に属するストレプトミセス・グリセオルバー・ヤマグチ・アンド・サブリ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｒｕｂｅｒ Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ａｎｄ Ｓａｂｕｒｉ）（１９５５）種にかなり類似した培養形態を示す。しかし、その近縁関係を明確にするには、いくつかの生理学的相違点に関して、さらなる研究が必要だろう。
【００１８】
ストレプトミセスＮｏ．１／２８株の分類学的説明
培養形態上ならびに光学および電子顕微鏡形態上の特徴的性質：オートミール寒天平板では、気中菌糸体が弱く発達し、その色は最初は白色で、後に明るい灰色を帯び、インターナショナル・ストレプトミセス・プロジェクト（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ）の色系列カテゴリーに従って正確に特徴づけることはできない［（ＳｈｉｒｌｉｎｇおよびＧｏｔｔｌｉｅｂ，Ｉｎｔ． Ｊ． Ｓｙｓｔ． Ｂａｃｔ．，１６，３１３−３４０（１９６６）］。顕微鏡観察の結果、菌糸は不稔性であることが判明し、担胞子体および分生子への分化は観察されなかった。基底菌糸体の中等度の発達と、淡黄褐色可溶性色素の産生が検出された。酵母エキス−麦芽エキス寒天培地では、弱く発達した白色および不稔性の気中菌糸体、赤褐色基底菌糸体および明るい黄色を帯びた拡散性色素が観察された。無機塩類−デンプン寒天平板では、よく発達した暗い赤灰色基底菌糸体が、相対的にさらによく発達した気中菌糸体で覆われ、その色は白色から短い（レチナキュラム・アペルツム型）らせん状担胞子体および平滑な表面を持つ胞子の黄灰色の塊に変化した。可溶性色素の存在は検出されなかった。この株（１／２８）の培養物は、ペプトン−酵母−鉄寒天培地でもチロシン寒天培地でも、暗褐色または黒色のメラニン様色素を産生した。
【００１９】
生理学的性質：セルロースでは良好な生育が観察されたが、セルロース繊維の目に見える分解はなかった。硝酸塩ブロスでは良好な生育を示したが、亜硝酸塩アンモニアまたは気体の発生は検出されなかった。６％までのＮａＣｌ濃度と５〜１１のｐＨ値に耐えうることがわかった。エスクリン加水分解試験およびウレアーゼ試験は陽性だった。グルコース、フルクトース、アラビノース、キシロース、ラムノース、スクロース、マンニトール、ラフィノースおよびメソイノシトールを培地中の唯一の炭素源として良好な生育が観察された。クエン酸Ｎａ、マロン酸Ｎａ、ピルビン酸Ｎａ、乳酸Ｃａおよびコハク酸Ｃａでは弱い生育が観察された。酢酸Ｎａ、酒石酸Ｎａおよび安息香酸Ｎａでは痕跡程度にしか生育しなかった。
【００２０】
分類学上の位置：気中菌糸体の色の正しい同定は不可能だったが、最も重要な特徴的性質に基づいて、この株はストレプトミセス・レシストミシフィカス・リンデンバイン（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｓｉｓｔｏｍｙｃｉｆｉｃｕｓ Ｌｉｎｄｅｎｂｅｉｎ）１９５２（Ｋａｍｐｆｅｒら（１９９１）によればストレプトミセス・ビオラセウス（Ｓｔｒ． ｖｉｏｌａｃｅｕｓ））の弱胞子形成性変種と呼ぶことができる。
したがって本発明は、一般式（Ｉ）：
【００２１】
【化３】
［式中、Ｒ1 はメチルまたはヒドロキシメチル基を意味し、Ｒ2 はヒドロキシルまたはアミノ基を表す］
の化合物の微生物学的製造方法であって、ミコフェノール酸生合成能を持つペニシリウム・ワクスマニ真菌株を、同化可能な炭素および窒素源ならびに無機塩類を含む培養培地で２２℃〜３０℃にて生育し、Ｒ1 がメチル基を意味しかつＲ2 がヒドロキシル基を表す一般式（Ｉ）の化合物を発酵ブロスから分離し、所望によりそれを精製し、所望によりそれを、同化可能な炭素および窒素源ならびに無機塩類を含む培養培地で、液中曝気条件下に、生物変換反応が完了するまで、
ａ）ナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチャラル・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニズムスにストレプトミセスｓｐ．Ｎｏ．１／６として受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７５の下に寄託されているストレプトミセス・グリセオルバーＮｏ．１／６放線菌株の培養物を使って発酵することにより、Ｒ1 がメチル基を意味しかつＲ2 がアミノ基を表す一般式（Ｉ）の化合物を製造するか、または、
ｂ）ナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチャラル・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニズムスに受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７６の下に寄託されているストレプトミセス・レシストミシフィカスＮｏ．１／２８放線菌株の培養物を使って発酵することにより、Ｒ1 がヒドロキシメチル基を意味しかつＲ2 がアミノ基を表す一般式（Ｉ）の化合物を製造した後、
生成した一般式（Ｉ）の化合物を培養物から分離し、所望によりそれを精製することからなる方法に関する。
【００２３】
本発明では、グルコース、マルトース、スクロース、グリセロール、麦芽エキスおよび水溶性デンプンを炭素源として有利に資化するペニシリウム・ワクスマニ株の培養物をミコフェノール酸の製造に使用する。酵母エキス、ペプトン、肉エキス、カゼイン、トリプカシン（ｔｒｙｐｃａｓｉｎ）、大豆粉、コーンスティープリカー、硝酸ナトリウムまたは硫酸アンモニウムを窒素源として使用することができる。
ミコフェノール酸の製造に使用する培養培地には、上記炭素および窒素源の他に、無機塩類（例えば硫酸マグネシウム）、アミノ酸類、ビタミン類および消泡剤が存在してもよい。
【００２４】
本発明のミコフェノール酸製造方法の好ましい一態様では、ナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチャラル・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニズムスに受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ ００１２６９として寄託されているペニシリウム・ワクスマニ株またはミコフェノール酸生合成能を持つその突然変異株の傾斜寒天培養物から蒸留水で胞子懸濁液を調製する。この胞子懸濁液５ｍｌを種培養培地に接種した後、２４℃〜２８℃（好ましくは２５℃）で３日間生育した接種用培養物を生産培養培地に接種し、２２℃〜２８℃（好ましくは２５℃）で７日間生育する。培養を好気培養条件で行ったところ、その間にｐＨ値は３．５と７．５の間で変化した。発酵の主要期間中は吸気量を毎時１２０リットルとし、撹拌速度を毎分４００回転とした。
【００２５】
発酵中に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）後のデンシトメトリーを用いて、発酵ブロスの活性物質含量を決定した。培養物が最高濃度のミコフェノール酸を含有する時に発酵を停止した。遠心分離した発酵ブロス試料の上清をメタノールで４倍希釈したものを高速液体クロマトグラフィーによる分析にかけた［装置：ＬＫＢ無勾配システム；カラム：ヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）Ｃ18 ５μｍ（ＢＳＴ）；中間カラム：４０×４ｍｍ；分析カラム；２５０×４．６ｍｍ；２５℃にサーモスタット制御；２３８ｎｍで測定；溶離液：アセトニトリル−リン酸でｐＨ２に調節した蒸留水（６０：４０）；流量：１．０ｍｌ／分；注入量：１０μｌ］。このシステムでのミコフェノール酸の保持時間は１５．８分である。
【００２６】
Ｒ1 がメチル基を意味しかつＲ2 がアミノ基を表す一般式（Ｉ）の化合物を製造する本発明方法の好ましい一態様では、ストレプトミセス・グリセオルバーＮｏ．１／６株の傾斜寒天培養物から蒸留水で胞子懸濁液を調製する。この胞子懸濁液を種培養培地に接種し、次に２５℃〜３７℃（好ましくは２８℃）で３日間生育した接種用培養物を生産培養培地に接種し、次いでそれを２５℃〜３２℃（好ましくは２８℃）で３日間培養した。培養物にミコフェノール酸を加えた後、培養をさらに７日間続けた。
【００２７】
Ｒ1 がヒドロキシメチル基を意味しかつＲ2 がアミノ基を表す一般式（Ｉ）の化合物を製造する本発明方法のもう一つの好ましい態様では、ストレプトミセス・レシストミシフィカスＮｏ．１／２８株の傾斜寒天培養物から蒸留水で胞子懸濁液を調製する。この胞子懸濁液を種培養培地に接種し、次に２５℃〜３７℃（好ましくは２８℃）で３日間生育した接種用培養物を生産培養培地に接種して３日間培養した。培養物にミコフェノール酸を加えた後、培養をさらに７日間続けた。
本発明の方法を以下の実施例によって例示する。
【００２８】
実施例１
高濃度のミコフェノール酸を生合成するペニシリウム・ワクスマニ突然変異株［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ ００１２６９］を、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ' −ニトロソグアニジンを使って行う突然変異選抜実験で作製した。土壌試料から分離したミコフェノール酸生合成性ペニシリウム・ワクスマニ株をＭＳ寒天傾斜培地で２５℃にて１０日間生育した。
培養培地ＭＳの組成（蒸留水１０００ｍｌ中）：
グルコース ４ｇ
麦芽エキス １０ｇ
酵母エキス ４ｇ
寒天 ２０ｇ
【００２９】
寒天傾斜培地から５ｍｌの滅菌０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）で胞子を洗い落とした。その胞子懸濁液にＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ' −ニトロソグアニジンを１ｍｇ／ｍｌの最終濃度で加えた。その懸濁液を２８℃、１５０ｒｐｍで３５分間振とうした。次に、５０００ｒｐｍの速度で遠心分離することによって胞子を沈降させた後、滅菌蒸留水に再懸濁した。その懸濁液をＭＳ寒天平板に塗布した。平板を２５℃で１０日間培養した後、生育したコロニーをＭＳ培養培地に接種した。生育した寒天傾斜培養物のミコフェノール酸産生能を、実施例２に記載する方法により、振とうフラスコ実験でスクリーニングした。
【００３０】
実施例２
麦芽エキスおよび酵母エキスを含む傾斜寒天培地で７〜１０日間生育したＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ００１２６９ペニシリウム・ワクスマニ株の培養物から、５ｍｌの滅菌水を使って胞子を洗い落とし、その胞子懸濁液を、５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中で滅菌した１００ｍｌのＭＩ接種用培養培地に接種した。ＭＩ培養培地の組成は次の通りである（水道水１０００ｍｌ中）。
グルコース ４０ｇ
カゼイン加水分解物 ５ｇ
硝酸ナトリウム ３ｇ
リン酸二水素カリウム ２ｇ
塩化カリウム ０．５ｇ
硫酸マグネシウム ０．５ｇ
硫酸鉄 ０．０１ｇ
【００３１】
滅菌前に培養培地のｐＨ値を６．０に調節し、滅菌を１２１℃で２５分間行った。培養物を振とう装置（２５０ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）で３日間振とうした後、容量各５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ５０本にて１２１℃で２５分間滅菌した１００ｍｌの培養培地Ａ２に接種した。
培養培地Ａ２の組成は、水道水１０００ｍｌ中、
グルコース ８０ｇ
トリプカシン １０ｇ
である。
【００３２】
滅菌は１２１℃で２５分間行った。フラスコを振とう装置（２５０ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）で２５℃にて振とうした。発酵ブロスの活性物質含量をＨＰＬＣ法で決定した。発酵を１６８時間続け、発酵ブロスからミコフェノール酸を単離した。３１００ｍｇ／リットルのミコフェノール酸を含む５Ｌの発酵ブロスから、以下のように生成物を単離した。
【００３３】
発酵が完了した後、２０重量％の硫酸を添加することによって発酵ブロスのｐＨ値を３．２±０．２に調節し、その酸性発酵ブロスを２５００ｍｌの塩化メチレンと共に１時間撹拌した。次に、相を分離した後、水相を１２５０ｍｌ×３の塩化メチレンで上記のように抽出した。ミコフェノール酸を含有する合わせた塩化メチレン抽出物を５００ｍｌ×１および２５０ｍｌ×２の５重量％炭酸水素ナトリウム溶液で抽出した。ミコフェノール酸ナトリウム塩を含む合わせたアルカリ性水溶液を２０℃未満に冷却し、溶液のｐＨ値を２０重量％硫酸溶液で３．２±０．２に調節した。その酸性溶液を２８０ｍｌ×３の塩化メチレンで抽出した後、合わせた塩化メチレン抽出物を減圧下にエバポレートした。蒸発残渣を８０℃のイソプロピルアルコール８８ｍｌに溶解し、１．１ｇの活性炭を使って３０分間清澄化した。活性炭を濾過した後、濾紙表面を熱イソプロピルアルコールで２回洗浄した。合わせたイソプロピルアルコールろ液を減圧下でエバポレートした後、粗生成物を８０℃のイソプロピルアルコール８８ｍｌに溶解した。次に、得られた溶液を室温に冷却し、０〜５℃で終夜静置した。結晶を濾過し、冷イソプロピルアルコールで１回、ｎ−ヘキサンで２回洗浄した。得られた生成物を減圧下に５０〜６０℃で乾燥した。次に、その乾燥生成物を６０℃の外温でエタノール５５ｍｌに溶解し、得られた溶液を撹拌しながら脱イオン水２２ｍｌを滴下した。その溶液を室温に冷却し、０〜５℃で終夜静置した。濾過した後、結晶をエタノールと水の４：１０混合液で１回、ｎ−ヘキサンで２回洗浄し、最後に減圧下に５０〜６０℃で乾燥したところ、９．０ｇの純粋なミコフェノール酸を得た。
融点：１４１℃
生成物の分光データは以下の通りである：
紫外スペクトル（９６％エタノール中、濃度２０μｇ／ｍｌ、層厚１ｃｍ）
【００３４】
【表２】
ＩＲ：３４１５；１７４５；１７１０；１６２５ｃｍ-1；
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，δTMS ＝０ｐｐｍ）：１．８０（ｓ，３Ｈ，４−ＣＨ3 ）；２．１３（ｓ，３Ｈ，７’−ＣＨ3 ）；２．３０（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ2 −３）；２．４２（ｔ，Ｊ＝８Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ2 −２）；３．３７（ｄ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ2 −６）；３．７６（ｓ，３Ｈ，６’−ＯＣＨ3 ）；５．１６（ｓ，２Ｈ，Ｈ2 −１’）；５．２５（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，δTMS ＝０ｐｐｍ）：１１．５，ｑ（７’−ＣＨ3 ）；１６．０，ｑ（４−ＣＨ3 ）；２２．５，ｔ（Ｃ−６）；３２．７，ｔ（Ｃ−２）；３４．１，ｔ（Ｃ−３）；６０．９，ｑ（６’−ＯＣＨ3 ）；７０．０，ｔ（Ｃ−１’）；１０６．３，ｓ（Ｃ−３ａ’）；１１６．７，ｓ（Ｃ−７’）；１２２．０，ｓ（Ｃ−５’）；１２２．９，ｄ（Ｃ−５）；１３３．８，ｓ（Ｃ−４）；１４４．０，ｓ（Ｃ−７ａ’）；１５３．６，ｓ（Ｃ−４’）；１６３．６，ｓ（Ｃ−６’）；１７２．９，ｓ（Ｃ−３’）；１７９．４，ｓ（Ｃ−１）
質量分析
電子衝撃イオン化（ＥＩ）質量分析
特徴的スペクトルデータ：
ＥＩ（７０ｅＶ）；ｍ／ｚ ３２０（［Ｍ］+ ・）；ｍ／ｚ ３０２（［Ｍ−Ｈ2 Ｏ］+ ・）；ｍ／ｚ ２４７（［Ｍ− ・ＣＨ2 ＣＨ2 −ＣＯＯＨ］+ ）；ｍ／ｚ ２２９（［２４７−Ｈ2 Ｏ］+ ）； ｍ／ｚ ２０７（［Ｃ11Ｈ11Ｏ4 ］+ ）；ｍ／ｚ １５９（［Ｃ10Ｈ7 Ｏ2 ］+ ）
化学イオン化（ＣＩ）質量分析
特徴的スペクトルデータ：
ＣＩ（ｉ−ブタン）：ｍ／ｚ ３２１（［Ｍ＋Ｈ］+ ）；ｍ／ｚ ３２０（［Ｍ］+ ・）；ｍ／ｚ ３０３（［Ｍ＋Ｈ−Ｈ2 Ｏ］+ ）。
【００３６】
実施例３
作業容量５Ｌの研究用発酵槽にて１２１℃で４５分間滅菌した５Ｌの生産培養培地Ａ２に、実施例２で述べたように調製した振とう培養接種物２５０ｍｌを接種した。接種後、１２０Ｌ／時の滅菌空気を吹き込み、撹拌機の速度を４００ｒｐｍとして、発酵槽を２５℃で運転した。発酵を１６８時間続けた後、ミコフェノール酸を発酵ブロスから単離した。得られた４．９Ｌの発酵ブロスは発酵の終了時点で２０００ｍｇ／ｌのミコフェノール酸を含有した。実施例２で述べたように発酵ブロスからミコフェノール酸を単離した。
【００３７】
実施例４
研究用発酵槽にて１２１℃で３５分間滅菌した５Ｌの生産培地Ａ３に、実施例２に記載したように調製した種培養物２５０ｍｌを接種した。
培地Ａ３の組成（水道水１０００ｍｌ中）：
グルコース ８０ｇ
ＮＺアミンＹＴＴ（Ｑｕｅｓｔ社） １０ｇ
上記発酵槽を曝気量１２０Ｌ／時および撹拌速度４００ｒｐｍにて２７℃で運転した。発酵を１６８時間続けた。得られた５Ｌの発酵ブロスは２５５０ｍｇ／ｌのミコフェノール酸を含有した。ミコフェノール酸を実施例２に従って発酵ブロスから単離した。
【００３８】
実施例５
ストレプトミセスｓｐ．Ｎｏ．１／６として寄託したストレプトミセス・グリセオルバーＮｏ．１／６株［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７５］をＣＭ寒天傾斜培地で生育した培養物から、細胞懸濁液を調製した。
寒天培養培地ＣＭの組成（蒸留水１０００ｍｌ中）：
グルコース ２５ｇ
ペプトン ２ｇ
酵母エキス １ｇ
硫酸マグネシウム−水（１：７） ０．５ｇ
リン酸二水素カリウム ５ｇ
寒天 ２０ｇ
【００３９】
容量５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコに入っている１００ｍｌの滅菌接種用培養培地ＭＢに上記懸濁液５ｍｌを接種した。
培養培地ＭＢの組成（水道水１０００ｍｌ中）：
グルコース ２０ｇ
麦芽エキス ３０ｇ
酵母エキス １０ｇ
硫酸マグネシウム−水（１：７） １ｇ
【００４０】
滅菌前に培養培地のｐＨ値を７．０に調節し、滅菌を１２１℃で２５分間行った。培養物を振とう装置（２５０ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）で２８℃にて３日間生育した後、得られた種培養各５ｍｌを、容量各５００ｍｌのエルレンマイヤーフラスコ５０本に入っている１００−１００ｍｌの滅菌生物変換反応培養培地ＭＢＴに接種した。培地ＭＢＴはそれぞれ以下の組成を有する。（水道水１０００ｍｌ中）：
グルコース ２０ｇ
麦芽エキス １０ｇ
大豆粉 ５ｇ
ペプトン １０ｇ
硫酸マグネシウム−水（１：７） １ｇ
リン酸二水素カリウム １ｇ
【００４１】
滅菌前に培養培地のｐＨ値を７．０に調節した。滅菌は１２１℃で２５分間行った。接種時に、別途滅菌したグルコースを少しずつ培養培地に加えた。フラスコは振とう装置（２５０ｒｐｍ、振幅２．５ｃｍ）を用いて３日間２８℃で振とうした。７２時間培養物に、エタノールに溶解したミコフェノール酸を最終濃度が０．１ｍｇ／ｍｌになるように添加した。この添加の後、発酵をさらに７日間続けた。生物変換反応の最後に、２．０Ｌのアセトンと４．０Ｌの酢酸エチルを４．０Ｌの発酵ブロスに加えた。次に、その混合物を１時間撹拌した。次に、相を分離し、水相を４．０Ｌのクロロホルムで再び抽出した。抽出の過程で得られた乳化した有機相を遠心分離した。次に、分離した有機相をエバポレートし、得られた粗生成物（２．０ｇ）を、１００ｇのキーゼルゲル（Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ）６０（粒径０．０６３〜０．２ｍｍ；Ｒｅａｎａｌ社（ブダペスト））吸着剤で調製したカラムによるクロマトグラフィーにかけた。粗生成物をクロロホルム、メタノールおよび９９．５％酢酸（８．５：１．５：０．０１）の混合液と共にカラムにのせ、クロマトグラフィー中は、上記の混合液を展開溶媒として使用した。このカラムクロマトグラフィーでは、各１０ｍｌの画分を集め、それらの画分をキーゼルゲル６０Ｆ254 ＤＣアルフォイル（ａｌｕｆｏｉｌ）（Ｍｅｒｃｋ社）でのＴＬＣにより、上記の展開混合液を用いて分析した（１％ＦｅＣｌ3 ／エタノール試薬を使って室温で検出）。主にミコフェノール酸アミドを含む画分を合わせ、得られた１２０ｍｌの溶液に４０ｍｌの脱イオン水を加えた。その混合物のｐＨ値を、１Ｎ水酸化ナトリウム溶液の添加によって４．０〜４．５に調節した。相を分離した後、水相を４０ｍｌのクロロホルムで抽出した。合わせた抽出物を減圧下でエバポレートし、得られた生成物（０．３ｇ）を再び、３０ｇのキーゼルゲル６０（粒径０．０６３〜０．０２ｍｍ；Ｒｅａｎａｌ社（ブダペスト））吸着剤で調製したカラムによるクロマトグラフィーにかけた。このクロマトグラフィーカラムは塩化メチレンと酢酸エチルの混合液（酢酸エチル含量１０％）を使って調製した。溶出には、以降の各溶出毎に、この混合液の酢酸エチル含量を１０％ずつ増加させた。クロマトグラフィーの過程で１５〜２０ｍｌの画分を収集し、上記の条件下でＴＬＣで調べた。（検査の際には、ベンゼンと酢酸エチルからなる混合液（１：２）を展開溶媒系として使用した）。生成物は、塩化メチレンと酢酸エチルの混合液（酢酸エチル含量４０％）を使ってカラムから溶離させた。生成物を含む画分を減圧下にエバポレートして、クロマトグラフィー的に純粋なミコフェノール酸アミド０．２ｇを得た。
【００４２】
ＩＲ：３４３３；１７３７；１６６５；１６２２ｃｍ-1；
1Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，δTMS ＝０ｐｐｍ）：１．８０（ｓ，３Ｈ，４−ＣＨ3 ）；２．１４（ｓ，３Ｈ，７’−ＣＨ3 ）；２．３１（ｓ，４Ｈ，Ｈ2 −２およびＨ2 −３）；３．３９（ｄ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ2 −６）；３．７６（ｓ，３Ｈ，６’−ＯＣＨ3 ）；５．１９（ｓ，２Ｈ，Ｈ2 −１’）；５．２１（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；
13Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3 ，δTMS ＝０ｐｐｍ）：１１．４，ｑ（７’−ＣＨ3 ）；１６．０，ｑ（４−ＣＨ3 ）；２２．５，ｔ（Ｃ−６）；３４．２，ｔ（Ｃ−２）；３４．９，ｔ（Ｃ−３）；６１．０，ｑ（６’−ＯＣＨ3 ）；７０．０，ｔ（Ｃ−１’）；１０６．３，ｓ（Ｃ−３ａ’）；１１６．７，ｓ（Ｃ−７’）；１２２．０，ｓ（Ｃ−５’）；１２３．０，ｄ（Ｃ−５）；１３４．２，ｓ（Ｃ−４）；１４４．１，ｓ（Ｃ−７ａ’）；１５３．５，ｓ（Ｃ−４’）；１６３．５，ｓ（Ｃ−６’）；１７２．８，ｓ（Ｃ−３’）；１７６．４，ｓ（Ｃ−１）
質量分析
電子衝撃イオン化（ＥＩ）質量分析
特徴的スペクトルデータ
ＥＩ（７０ｅＶ）：（［Ｍ］+ ・）３１９，Ｃ17Ｈ21ＮＯ5 ；ｍ／ｚ ３０２，Ｃ17Ｈ18Ｏ5 （［Ｍ−ＮＨ3 ］+ ・）；ｍ／ｚ ３０１，Ｃ17Ｈ19ＮＯ4 ，（［Ｍ−Ｈ2 Ｏ］+ ・）；ｍ／ｚ ２６１，Ｃ15Ｈ17Ｏ4 ，（［Ｍ− ・ＣＨ2 ＣＯＮＨ2 ］+ ）；ｍ／ｚ ２０７，Ｃ11Ｈ11Ｏ4 ，（Ｍ− ・Ｃ5 Ｈ8 ＣＯＮＨ2 ］+ ）
化学イオン化（ＣＩ）質量分析
特徴的スペクトルデータ：
ＣＩ（ｉ−ブタン）：（［Ｍ＋Ｈ］+ ）３２０；（［Ｍ］+ ・）３１９；ｍ／ｚ ３０３（［Ｍ＋Ｈ−ＮＨ3 ］+ ）；ｍ／ｚ ２０７（［Ｍ− ・Ｃ5 Ｈ8 ＣＯＮＨ2 ］+ ）
【００４３】
実施例６
実施例５で述べたように、ＣＭ寒天傾斜培地で生育したストレプトミセス・レシストミシフィカスＮｏ．１／２８株［ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７６］の培養物から調製した細胞懸濁液を使って、接種用培養物の調製と生物変換反応を行った。
【００４４】
生物変換反応の最後に体積４．５Ｌの発酵ブロスを実施例４に述べたように抽出した。抽出物を減圧下でエバポレートすることにより３．８ｇの粗生成物を得て、１１４ｇのキーゼルゲル６０吸着剤（粒径０．０６３〜０．２ｍｍ；Ｒｅａｎａｌ社）で調製したクロマトグラフィーカラムで粗生成物を精製した。クロマトグラフィーによる精製では、クロロホルム、メタノールおよび９９．５％酢酸の混合液（８．５：１．５：０．０１）を展開溶媒系として使用した。クロマトグラフィー中は各１５〜２０ｍｌの画分を収集し、実施例５で述べたようにＴＬＣによって分析した。クロロホルム、メタノールおよび９９．５％酢酸からなる混合液（８．５：１．５：０．１）を展開溶媒系として使用した。主にヒドロキシメチルミコフェノール酸アミドを含む画分を合わせ、その溶液を実施例５で述べたように処理してからエバポレートした。生成物（０．４ｇ）をさらに、４０ｇのキーゼルゲル６０（粒径０．０６３〜０．２ｍｍ；Ｒｅａｎａｌ社）吸着剤で調製したカラムによるクロマトグラフィーにかけた。このクロマトグラフィーカラムはクロロホルム中に調製し、溶出中はクロロホルムとメタノールを含む混合液（メタノール含量は各溶出毎に１％ずつ増加させた）を使用した。クロマトグラフィー中は各１０ｍｌの画分を収集し、上記の条件下にＴＬＣで分析した。生成物は５％のメタノールを含むクロロホルムを使ってカラムから溶離させた。生成物を含む画分をエバポレートし、得られた生成物（０．３ｇ）を、３００ｍｌのセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）ＬＨ−２０ゲル（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社（スウェーデン））を含むカラムで、メタノールを溶媒として、さらに精製した。このゲル濾過クロマトグラフィーでは、各１０ｍｌの画分を収集し、上記の条件下にＴＬＣで分析した。純粋な生成物を含む画分を合わせ、減圧下にエバポレートしたところ、クロマトグラフィー的に均一なヒドロキシメチルミコフェノール酸アミド０．２２ｇを得た。
【００４５】
得られた生成物の分光データは以下の通りである。
ＩＲ：３３３９；１７３５；１６５７；１６１５ｃｍ-1；
1Ｈ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ4 ，δTMS ＝０ｐｐｍ）：１．８０（ｓ，３Ｈ，４−ＣＨ3 ）；２．２５（ｓ，４Ｈ，Ｈ2 −２およびＨ2 −３）；３．３８（ｄ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ2 −６）；３．７８（ｓ，３Ｈ，６’−ＯＣＨ3 ）；４．６６（ｓ，２Ｈ，７’−ＣＨ2 −ＯＨ）；５．２５（ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ−５）；５．４０（ｓ，２Ｈ，Ｈ2 −１’）；
13Ｃ−ＮＭＲ（ＭｅＯＨ−ｄ4 ，δTMS ＝０ｐｐｍ）：１６．２，ｑ（４−ＣＨ3 ）；２３．４，ｔ（Ｃ−６）；３５．３，ｔおよび３６．５，ｔ（Ｃ−２およびＣ−３）；５７．８，ｔ（７’−ＣＨ2 −ＯＨ）；６２．９，ｑ（６’−ＯＣＨ3 ）；７１．５，ｔ（Ｃ−１’）；１０８．２，ｓ（Ｃ−３ａ’）；１２２．０，ｓおよび１２３．６，ｓ（Ｃ−５’およびＣ−７’）；１２４．２，ｄ（Ｃ−５）；１３５．３，ｓ（Ｃ−４）；１４６．８，ｓ（Ｃ−７ａ’）；１５６．１，ｓ（Ｃ−４’）；１６４．１，ｓ（Ｃ−６’）；１７３．７，ｓ（Ｃ−３’）；１７８．７，ｓ（Ｃ−１）
質量分析
ポジティブ（＋）およびネガティブ（−）ＦＡＢスペクトル
特徴的スペクトルデータ：
＋および−ＦＡＢ（キセノン，９ｋＶ）：［Ｍ＋Ｈ］+ ３３６，ｍ／ｚ ３１８［Ｍ＋Ｈ−Ｈ2 Ｏ］+ ；［Ｍ−Ｈ］- ３３４
【図面の簡単な説明】
【図１】 本発明者らが分離した新規ミコフェノール酸産生株の分生子柄の形状を示す図。ａ、ｄ、ｅおよびｆはアスパラギン＋グリセロール寒天培地、ｂは麦芽寒天培地、ｃはデンプン＋硫酸アンモニウム寒天培地、ｇは分生子鎖。
Claims (5)
- 一般式（Ｉ）：
の化合物の微生物学的製造方法であって、ミコフェノール酸生合成能を持つ、ナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチャラル・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニズムスに受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ ００１２６９として寄託されているペニシリウム・ワクスマニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉ）真菌株または、その突然変異株を、同化可能な炭素および窒素源ならびに無機塩類を含む培養培地で２２℃〜３０℃にて生育し、Ｒ１がメチル基を意味しかつＲ２がヒドロキシル基を表す前記一般式（Ｉ）の化合物を発酵ブロスから分離することを特徴とする、前記一般式（Ｉ）の化合物の微生物学的製造方法。 - 一般式（Ｉ）：
の化合物の微生物学的製造方法であって、ミコフェノール酸生合成能を持つペニシリウム・ワクスマニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉ）真菌株を、同化可能な炭素および窒素源ならびに無機塩類を含む培養培地で２２℃〜３０℃にて生育し、Ｒ１がメチル基を意味しかつＲ２がヒドロキシル基を表す前記一般式（Ｉ）の化合物を発酵ブロスから分離し、精製し、同化可能な炭素および窒素源ならびに無機塩類を含む培養培地で、液中曝気条件下で生物変換反応が完了するまで、ナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチャラル・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）にストレプトミセスｓｐ．Ｎｏ．１／６として受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７５の下に寄託されているストレプトミセス・グリセオルバー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｒｕｂｅｒ）Ｎｏ．１／６放線菌株の培養物を使って生物変換することにより、Ｒ１がメチル基を意味しかつＲ２がアミノ基を表す一般式（Ｉ）の化合物を製造し、その後、生成した前記一般式（Ｉ）の化合物を培養物から分離することを特徴とする、前記一般式（Ｉ）の化合物の微生物学的製造方法。 - 一般式（Ｉ）：
の化合物の微生物学的製造方法であって、ミコフェノール酸生合成能を持つペニシリウム・ワクスマニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｗａｋｓｍａｎｉ）真菌株を、同化可能な炭素および窒素源ならびに無機塩類を含む培養培地で２２℃〜３０℃にて生育し、Ｒ１がメチル基を意味しかつＲ２がヒドロキシル基を表す前記一般式（Ｉ）の化合物を発酵ブロスから分離し、精製し、同化可能な炭素および窒素源ならびに無機塩類を含む培養培地で、液中曝気条件下で生物変換反応が完了するまで、ナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチャラル・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニズムスに受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｂ ００１２７６の下に寄託されているストレプトミセス・レシストミシフィカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｅｓｉｓｔｏｍｙｃｉｆｉｃｕｓ）Ｎｏ．１／２８放線菌株の培養物を使って生物変換することにより、Ｒ１がヒドロキシメチル基を意味しかつＲ２がアミノ基を表す一般式（Ｉ）の化合物を製造し、その後、生成した前記一般式（Ｉ）の化合物を培養物から分離することを特徴とする、前記一般式（Ｉ）の化合物の微生物学的製造方法。 - 前記の分離された化合物を精製する工程を更に含むことを特徴とする、請求項１、２及び３のいずれか１項に記載の微生物学的製造方法。
- 前記ペニシリウム・ワクスマニ真菌株が、ナショナル・コレクション・オブ・アグリカルチャラル・アンド・インダストリアル・マイクロオーガニズムスに受託番号ＮＣＡＩＭ（Ｐ）Ｆ ００１２６９として寄託されているペニシリウム・ワクスマニ真菌株であることを特徴とする、請求項２及び３のいずれか１項に記載の微生物学的製造方法。
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