DE60007338T2 - Verfahren zur herstellung von mycophenolsäure und derivaten davon - Google Patents
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Description
- Diese Erfindung bezieht sich auf ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung einer Mycophenolsäure der Formel (I)(wobei R1 eine Methylgruppe bedeutet und R2 für eine Hydroxylgruppe steht) und Derivate davon [in der Formel (I) bedeutet R1 eine Methyl- oder Hydroxymethylgruppe und R2 ist eine Aminogruppe]. Die Mycophenolsäure der Formel (I) [(E)-6-(1,3-Dihydro-4-hydroxy-6-methoxy-7-methyl-3-oxo-5-isobenzofuranyl)-4-methyl-4-hexensäure] wird therapeutisch aufgrund ihrer immunsuppressiven Wirkung verwendet.
- Die Mycophenolsäure wurde zuerst 1896 in der Fermentationsnährlösung von Penicillium glaucum [E.L. Jones et al.: J. Invest. Dermatol. 65, 537 (1975)] berichtet und später wurde sie auch aus den Fermentationsnährlösungen anderer Spezies der Penicillium-Gattung isoliert, z.B. P. brevicompactum. P. stoloniferum, P. echinulatum, P. roqueforti und P. viridicatum. Die Struktur der Mycophenolsäure wurde 1952 von J.M. Birkinshaw et al. [Biochem. J. 50, 630 (1952)] bestimmt. Nach der Entdeckung der Mycophenolsäure wurde auch ihre antibakterielle Wirksamkeit beschrieben, aber pathogene Staphylococcus-Stämme wurden ihr gegenüber schnell resistent; deshalb wurde auf diesem Gebiet nicht weiter entwickelt [E.P. Abraham et al.: Biochem. J. 39, 398 (1945)]. Die antifungale Wirksamkeit der Verbindung gegen einige Epidermophyton- und Trichophyton-Stämme wurde auch gezeigt. Auf ähnliche Weise wurde ihre antivirale Wirkung auch inter alia gegen den Herpes simplex Virus bewiesen [R.H. Williams et al.: J. Antibiot. 21, 463 (1968)]. Ebenso wurde eine Antitumorwirksamkeit davon veröffentlicht, bei der in den letzten Jahren begonnen wurde, sie intensiv zu studieren [Y. Sidi et al.: Br. J. Cancer 58, 61 (1988)]. Sein Morpholinoethylesterderivat, das in der zweiten Hälfte der 80er Jahre beschrieben wurde, wurde für eine therapeutische Verwendung als ein immunsuppressives Mittel genehmigt.
- Die breite biologische Leistungsfähigkeit der Mycophenolsäure kann durch ihre inhibierende Wirkung gegen die Wirksamkeit der Inosin-5'-monophosphatdehydrogenase- und Guanin-5'-monophosphatsynthetaseenzyme erklärt werden, die zu einer Abnahme der Guaninsynthese führt. In einigen Zellen kann die Guaninsynthese auch auf einem anderen Weg durch das Hypoxanthinguaninphosphoribosyltransferaseenzym ausgeführt werden. Dieses Enzym fehlt jedoch bei den T- und B-Lymphocyten und deshalb wird ihr Wachstum selektiv durch Mycophenolsäure inhibiert.
- Zu Beginn der 70er Jahre wurde eine Anzahl von Mycophenolsäurederivaten hergestellt. Modifikationen wurden sowohl am Isobenzofuranylring wie auch an der 4-Methyl-4-hexensäureseitenkette mit mikrobiologischen wie auch chemischen Mitteln erzeugt [D.F. Jones et al.: J. Chem. Soc. 1725 (1970)].
- Jones und Mills [J. Med. Chem. 14(4): 305 (1971)] und Suzuki et al. [J. Antibiot. 29(3): 275 (1976)] beschreiben die Herstellung und die Antitumorwirksamkeit der Mycophenolsäure und Derivate der Mycophenolsäure.
- In beiden Berichten wird behauptet, dass die höchste beobachtete Antitumorwirksamkeit bei der Ursprungsverbindung, der Mycophenolsäure, blieb und dass keine der erhaltenen Substitutionen eine erhöhte tumorizide Wirksamkeit zeigte.
- Einige Mycophenolsäurederivate zeigten in Antitumortests eine Wirksamkeit, die sich an jene der Mycophenolsäure annäherte [M.J. Sweeney et al.: Cancer Research 32, 1795 (1972)]. Sie waren Mycophenolsäurederivate, die eine höhere inhibierende Wirkung auf Inosin-5'-monophosphatdehydrogenase ausübte als Mycophenolsäure [M.J. Sweeney et al.: Cancer Research 32, 1803 (1972)].
- In einem Aspekt zielte die Erfindung auf die Selektion und genetische Verbesserung eines Mikroorganismus ab, durch dessen Verwendung die Mycophenolsäure vorteilhafter im Vergleich zu den in der Literatur bekannten Verfahren erzeugt werden kann. Von einem anderen Aspekt aus zielte die Erfindung auf ein mikrobiologisches Verfahren zum Herstellen der Mycophenolsäure und neuer, potentiell therapeutisch wirksamer Mycophenolsäurederivate.
- Im Verlauf unserer Untersuchungen zur Suche neuer aktiver Mittel mikrobiologischen Ursprungs wurden Mikroorganismen untersucht, die aus Bodenproben isoliert waren, die an verschiedenen geographischen Stellen gesammelt wurden. Innerhalb des Rahmens des antifungalen Screening-Programms wurde ein Pilzstamm isoliert, dessen Fermentationsnährlösung Mycophenolsäure enthielt. Ein Mutantenstamm, der eine hohe Konzentration Mycophenolsäure erzeugte, wurde aus diesem Stamm unter Verwenden von Mutations-Selektions-Verfahren hergestellt. Eine ultraviolette Bestrahlung und N-Methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidin wurden als mutagene Mittel angewandt.
- Die Biosynthese der Mycophenolsäure wurde in den Fällen der Stämme von Penicillium glaucum, Penicillium stoloniferum, Penicillium brevicompactum, Penicillium scabrum, Penicillium nagemi, Penicillium patrismei, Penicillium griseobrunneum und Penicillium viridicatum beschrieben. Im Verlauf der Biosynthese der Mycophenolsäure wird der Isobenzofuranteil des Moleküls auf eine Weise erzeugt, die von der daran gebundenen Seitenkette verschieden ist. Die Biosynthese der Seitenkette folgt der Synthese des Steroidskeletts bis zum Farnesylpyrophosphat. Der Isobenzofuranteil wird aus einer Acetyl-CoA und drei Malonyl-CoAs gebildet. Die Methylgruppe am aromatischen Ring wird vom S-Adenosyhnethionin in das Molekül eingebaut. Farnesylpyrophosphat, dessen Seitenkette der Mycophenolsäure nach dem Abspalten einer achtgliedrigen Kette gebildet wird, wird an das C-6 des Isobenzofuranringes gebunden. Der letzte Schritt der Biosynthese umfasst die Bildung einer Methoxylgruppe aus S-Adenosyhnethionin [W.L. Muth et al.: Antimicrobial Agents and Chemotherapy 8, 321 (1975)].
- Alle Mycophenolsäure-herstellenden Stämme, die in der Literatur beschrieben sind, gehören zu der Assymmetrica-Sektion innerhalb der Penicillium-Gattung. Basierend auf der taxonomischen Bestimmung gehört der von uns isolierte Stamm zur Monoverticillata-Sektion innerhalb der Penicillium-Gattung und kann als die Penicillium waksmani-Art klassifiziert werden, deren Mycophenolsäure-erzeugende Fähigkeit in der Literatur noch nicht veröffentlicht wurde.
- Die taxonomische Bestimmung wird im Folgenden gegeben.
- Allgemeine Kultur-morphologische Eigenschaften
- Das neue Stammisolat ist ein charakteristischer Repräsentant der Penicillium-Gattung in dem Aspekt des Aufbauens seiner Konidienträger und der Anordnung von Verzweigungen, Metulae wie auch der zugehörigen Fialiden. Sein sporenbildendes Luftmyzel ist typischerweise samtartig und gut entwickelt. In einem reifen Zustand ist es dunkelbräunlich-grau in einem Stärke + Ammoniumsulfat-Agar; leicht bräunlich-grau auf einem Sabouraud's Pep ton + Glucose-Agar; dunkelgrau auf einem Sabouraud's Glucose-Agar; leicht grün auf Asparagin + Glycerol; bräunlich-schwarz auf Czapek's (Nitrat + Sucrose) Agar mit Rinderblut; dunkelbräunlich-grau auf dem einfachen Czapek's Agar; dunkler werdend grün auf dem Malz-Agar; dunkler werdend bräunlich-grau auf dem Malzextrakt + Hefeextrakt + Glucose-Agar; dunkelbräunlich-grau auf einem Haferflocken-Agar. Am Beginn ist eine große Anzahl von Hyphen häufig grün oder bläulich-grün auf Kulturmedium, wobei das reife Luftmyzel grau oder bräunlich-grau ist. Im Allgemeinen ist das Substratmyzel des Stammes farblos oder blassgelblich-braun. Die Herstellung eines löslichen Pigments konnte nicht auf irgendeinem der Medien beobachtet werden. Die Oberfläche der Kolonien ist weniger runzelig. Die durchschnittliche Dicke des Luftmyzels übersteigt nicht 1 bis 3 mm. Die Herstellung eines Melanoidpigments (Tyrosinaseaktivität) ist negativ.
- Die Länge der Konidienträger ist extrem vielfältig: Sie wachsen häufig direkt aus dem Substratmyzel, ein anderes Mal sind sie Seitenverzweigungen eines längeren axialen Filaments (siehe
1 : Konidienträgertypen a bis f; a, d, e und f auf Asparagin + Glycerol-Agar; b auf Malz-Agar; während c auf Stärke + Ammoniumsulfat-Agar; g ist eine Konidienkette). Der Stamm kann in die Gruppe von Monoverticillata-Arten klassifiziert werden, unter Berücksichtigung, dass er in einer überwältigenden Mehrheit Pinsel trägt, die aus einer einzelnen Fialidenwindung besteht. Pinsel dieses Monoverticillata-Typs werden häufig in einer "Divaricata"-Art (siehe1 ) angeordnet. Konidienträger des Biverticillium-Typs können auch in jedem Fall getrennt beobachtet werden (siehe1 ). Die Windungen, die als Fialiden ausgelegt sind, können 2- bis 8-gliedrig (in den meisten Fällen 3-gliedrig) sein. Die Konidien sind rund, in den meisten Fällen besitzen sie eine glatte Oberfläche mit einer Größe von 2 bis 25 μm. Die Anzahl von individuellen Konidien in den Konidiumketten kann 20 übersteigen. - Physiologische Eigenschaften:
- Aesculinhydrolyse: positiv. Die Erzeugung von Hydrogensulfid: negativ. NaCl-Toleranz: bis zu 3% als ein Maximum. pH-Toleranz: 3,0 bis 9,0. Die Bildung von Nitrit aus Nitrat, die Entwicklung von Ammoniak oder Gas konnte nicht erfasst werden. Katalasetest: positiv. Oxidasetest: positiv. Harnstoffzersetzung: positiv. Lecithinase- und Gelatinaseaktivität: positiv. Stärkehydrolyse ist schwach. Tween-20-Hydrolyse: positiv, aber die Hydrolyse von Tween-40 und Tween-60 ist sehr schwach. Von den Natriumsalzen organischer Säure wächst es vorteilhafterweise auf Benzoat, Salicylat, schwach auf Acetat, Tartrat und Succinat. Es wächst überhaupt nicht oder nur in Spuren auf Malonat, Pyruvat, Lactat und Citrat. Es nutzt ausgezeichnet Glucose, Fructose, Arabinose, Xylose, Rhamnose, Sucrose, Raffinose, Mannitol und Inositol. Eine starke Säureproduktion wurde beobachtet (durch Verwenden von Bromocresolpurpur-Indikator auf dem Kulturmedium von R.E. Gordon): auf Glucose, Sucrose, Rhamnose, Dextrin, Melibiose, Maltose, Raffinose, Fructose, Inositol, Inulin, Glycerol, Xylose, Dulcitol und Mannitol. Die Säureproduktion war schwach auf Galactose, Arabinose und Salicin.
- Taxonomische Stellung
- Der Mycophenolsäure-erzeugende Penicillium-Stamm, der von uns isoliert wurde, kann als eine nahe Variante der Penicillium waksmani-Art betrachtet werden. Diese Identifizierung ist auch durch die Daten der unten angegebenen Tabelle 1 verifiziert.
- Ein Vergleich der Standardbeschreibung von Penicillium waksmani mit den diagnostischen Eigenschaften des Mycophenolsäure-erzeugenden Penicillium-Stammes, der von uns isoliert wurde Tabelle 1
- In einem Aspekt basiert die Erfindung auf der Erkenntnis, dass der Mycophenolsäure-herstellende Penicillium waksmani-Stamm, der von uns isoliert wurde und der unter der Nr. NCAIM (P)F 001269 in der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganismus hinterlegt wurde, hohe Konzentrationen von Mycophenolsäure unter geeigneten Fermentationsbedingungen erzeugt, nachdem es durch Mutations-Selektions-Methoden entwickelt wurde.
- Weiter basiert die Erfindung auf der Erkenntnis, dass die Kulturen von Stämmen des Streptomyces griseoruber Nr. 1/6 (hinterlegt als Streptomyces sp. Nr. 1/6) bzw. Streptomyces resistomycificus Nr. 1/28, die auf ähnliche Weise von uns aus Bodenproben isoliert wurden, auch fähig sind, die Mycophenolsäure zu transformieren, gebildet zu einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei R1 Methyl- oder Hydroxymethylgruppe bedeutet und R2 für eine Aminogruppe steht.
- Taxonomische Beschreibung des Streptomyces-Stammes Nr. 1/6 Kultur-morphologische Diagnoseeigenschaften: Auf einem Haferschrot-Agar bedeckt ein gut entwickeltes Luftmyzel einer typischen roten Verfärbung (Rot-Farbenreihe; "Cinnamomeus"-Farbreihe) die Substratmyzeloberfläche. Die Farbe des letzteren ist gelblich. Lösliche Pigmente sind nicht sichtbar. Beim Beobachten der roten Sporenmasse kann das Auftreten vieler Retinaculum apertum-Typ-Sporenträger nachgewiesen werden. Auf einem Czpek-Agar: Die Kolonien sind durch ein stark entwickeltes rötliches Luftmyzel, rötlich-gelbes Substratmyzel und mattrötliche diffuse Pigmente gekennzeichnet. Auf Kartoffelstücken ist das braune Substratmyzel von einer rötlichen Luftsporen-Masse bedeckt, während die Farbe der Kartoffel dunkelbräunlich rot wurde. Auf einem Sojapepton-Agar unter dem gut entwickelten rötlichen Luftmyzel ist das Substratmyzel wie auch das Medium selbst stark braun oder schwarz. Auf Malat-Agar-Platten blieb das gelbliche Luftmyzel meist steril und unter dem bräunlichen Substratmyzel kann die Diffusion eines intensiven rötlich-braunen löslichen Pigments beobachtet werden. Auf Hefe-Eisen-Agar zeigt der Stamm Nr. 1/6 eine extrem positive Melanoidpigmentproduktion. Auf ähnliche Weise bewies er auch auf einem Tyrosin-Agar chromogen zu sein, aber mit einer geringeren Intensität.
- Physiologische Eigenschaften: Der Stamm Nr. 1/6 zersetzt nicht Cellulose. Die positive Nutzung von Glucose, Fructose, Sucrose, Rhamnose und i-Inositol, außerdem das relativ schwache Wachstum, aber die noch positive Nutzung mit Xylose und Arabinose als einzige Quellen in dem Medium wurden beobachtet. Ein sehr schwaches Wachstum (negative Nutzung) mit Raffinose wurde erfasst.
- Taxonomische Stellung: Der Stamm Nr. 1/6 als typischer roter Streptomyces (Sporenmassefarbe in der Rot-Reihe, Farbe des Substratmyzels: gelb-braun + rot, rötliches lösliches Pigment), das mit Retinaculum apertum (spiral)-Sporenträger gekennzeichnet ist, zeigt eine beträchtliche Kultur-morphologische Ähnlichkeit mit der Art Streptromyces griseoruber, Yamaguchi und Saburi (1955), die zu dem Cluster 18 (23) des numerischen Klassifikationssystem von Kampfer et al. [J. Gen. Microbiol. 137, 1831–1891 (1991)] gehört. Einige physiologische Unterschiede betrachtend werden jedoch weitere Studien nötig sein, um seine näheren Verwandtschaften klarzustellen.
- Die taxonomiscbe Beschreibung des Streptomyces-Stammes Nr. 1/28 Kultur- wie auch licht- und elektronenmikroskopische-morphologische Diagnoseeigenschaften: Auf Haferschrot-Agar-Platten ist das Luftmyzel schwach entwickelt, seine Farbe ist zuerst weiß, später leicht grau, und kann nicht genau gemäß der Farb-Serien-Kategorien des International Streptomyces Project [(Shirling und Gottlieb, Int. J. Syst. Bact. 16, 313–340 (1966)] charakterisiert werden. Gemäß der Ergebnisse der mikroskopischen Beobachtungen wurde bewiesen, dass die Hyphen steril sind, ihre Differenzierung in Sporenträger und Konidien wurde nicht beobachtet. Die Mediumentwicklung des Substratmyzels und die Erzeugung von leichten gelblich-braunen löslichen Pigmenten wurde nachgewiesen. Auf Hefeextrakt-/Malzextrakt-Agar wurde schwach entwickeltes weißes und steriles Luftmyzel, rötlich-braunes Substratmyzel und leicht gelbliche diffundierbare Pigmente beobachtet. Auf anorganischen Salz-Stärke-Agar-Platten war das gut entwickelte dunkelrötlich-graue Substratmyzel mit verhältnismäßig mehr entwickeltem Luftmyzel bedeckt, dessen Farbe sich von weiß in eine gelblich-graue Masse kurzer (Retinaculum apertum-Typ) spiraler Sporenträger und Sporen glatter Oberflächen änderte. Das Vorhandensein löslicher Pigmente wurde nicht nachgewiesen. Die Kulturen dieses Stammes (1/28) erzeugten sowohl auf Pepton-Hefe-Eisen-Agar als auch auf Tyrosin-Agar dunkelbraune oder schwarze Melanoidpigmente.
- Physiologische Eigenschaften: Ein gutes Wachstum wurde auf Cellulose beobachtet, aber ohne die sichtbare Verschlechterung der Cellulosefasern. In Nitratnährlösung zeigte er gutes Wachstum, aber das Vorhandensein von Nitriten, Ammoniak oder die Entwicklung von Gas wurde nicht nachgewiesen. Es wurde bewiesen, dass er fähig ist, NaCl-Konzentrationen bis 6% und pH-Werte von 5 und 11 zu tolerieren. Positive Aesculin-Hydrolyse- und Urease-Tests wurden nachgewiesen. Ein gutes Wachstum wurde mit Glucose, Fructose, Arabinose, Xylose, Rhamnose Sucrose, Mannitol, Raffinose und Mesoinositol als einzige Quellen von Kohlenstoff in dem Medium beobachtet. Ein schwaches Wachstum wurde mit Na-Citrat, Na-Malonat, Na-Pyruvat, Ca-Lactat und Ca-Succinat beobachtet. Das Wachstum erfolgte nur in Spuren mit Na-Acetat, Na-Tartrat und Na-Benzoat.
- Taxonomische Stellung: Obwohl die korrekte Identifizierung der Farbe des Luftmyzels nicht möglich war, können wir auf der Basis der wichtigsten diagnostischen Eigenschaften diesen Stamm als eine schwach sporenbildende Variante der Art Streptomyces resistomycificus Lindenbein, 1952 (Str. violaceus gemäß Kampfer et al., 1991) bestimmen.
- Daher bezieht sich die Erfindung auf ein mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)wobei R1 eine Methyl- oder Hydroxymethylgruppe bedeutet und R2 für eine Hydroxyl- oder Aminogruppe steht,
wobei das Verfahren umfasst
Aufziehen eines Pilzstammes von Penicillium waksmani, der fähig ist, Mycophenolsäure zu biosynthetisieren, auf einem Kulturmedium, das Quellen assimilierbaren Kohlenstoffs und Stickstoffs wie auch Mineralsalze enthält, bei 22 bis 30°C, Trennen der Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei R1 eine Methylgruppe bedeutet und R2 für eine Hydroxylgruppe steht, von der Fermentationsnährlösung und, falls erwünscht, Reinigen dieser, und falls erwünscht, Fermentieren dieser - a) durch Verwenden der Kulturen eines Actinomycete-Stammes von Streptomyces griseoruber Nr. 1/6, der bei der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms als Streptomyces sp. Nr. 1/6 unter Nr. NCAIM (P)B 001275 hinterlegt ist, um eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) herzustellen, wobei R1 eine Methylgruppe bedeutet und R2 für eine Aminogruppe steht, oder
- b) durch Verwenden der Kulturen eines Actinomycete-Stammes von Streptomyces resistomycificus Nr. 1/28, der bei der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms unter Nr. NCAIM (P)B 001276 hinterlegt ist, um eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) herzustellen, wobei R1 eine Hydroxymethylgruppe bedeutet und R2 für eine Aminogruppe steht,
- Gemäß der Erfindung werden die Kulturen des Penicillium waksmani-Stammes, der vorteilhafterweise Glucose, Maltose, Sucrose, Glycerol, Malzextrakt und wasserlösliche Stärke als Kohlenstoffquellen nutzt, für die Herstellung der Mycophenolsäure verwendet. Hefeextrakt, Pepton, Fleischextrakt, Casein, Trypcasin, Sojabohnenmehl, Maisquellenwasser, Natriumnitrat oder Ammoniumsulfat können als Stickstoffquellen verwendet werden.
- Zusätzlich zu den oben genannten Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können auch Mineralsalze, z.B. Magnesiumsulfat, Aminosäuren, Vitamine und Antischaummittel in den Kulturmedien vorhanden sein, die zum Herstellen der Mycophenolsäure verwendet werden.
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung zur Herstellung der Mycophenolsäure wird eine Sporensuspension mit destilliertem Wasser von den Schrägagarkulturen des Penicillium waks mani-Stammes, der bei der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms unter Nr. NACAIM (P)F 001269 hinterlegt ist, oder einem Mutantenstamm davon hergestellt, der fähig ist, Mycophenolsäure zu biosynthetisieren. Nach dem Animpfen von 5 ml dieser Sporensuspension in ein Impfkulturmedium wird ein produktives Kulturmedium mit der 3 Tage alten angeimpften Kultur, die bei 24°C bis 28°C, bevorzugt bei 25°C, aufgezogen wurde, angeimpft, dann bei 22°C bis 28°C, bevorzugt bei 25°C, 7 Tage lang inkubiert. Die Kultivierung wurde unter aeroben Bedingungen ausgeführt, während der pH-Wert zwischen 3,5 und 7,5 schwankte. In der Hauptzeitspanne der Fermentation betrug der Lufteinlass 120 l/h, die Rate des Rührens betrug 400 Upm.
- Während der Fermentation wurde der Gehalt der aktiven Substanz der Fermentationsnährlösung unter Verwenden einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) oder einer Densitometrie nach einer Dünnschichtchromatographie (TLC) bestimmt. Wenn die Kultur die höchste Konzentration von Mycophenolsäure enthielt, wurde die Fermentation beendet. Für die Analysen durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie wurden die zentrifugierten Überstände der Fermentationsnährlösungsproben, die auf das vierfache mit Methanol verdünnt waren, angewendet [Ausrüstung: LKB isokratisches System; Säule: Nucleosil C18 5 μm (BST); mittlere Säule: 40×4 mm; analytische Säule: 250×4,6 mm; thermostatiert bei 25°C; Messung bei 238 nm; Eluent: Acetonitril – destilliertes Wasser eingestellt auf pH 2 mit Phosphorsäure (60:40); Flussrate: 1,0 ml/min; Injektionsvolumen: 10 μl]. Die Retentionszeit der Mycophenolsäure beträgt 15,8 min in diesem System Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei R1 eine Methylgruppe bedeutet und R2 für eine Aminogruppe steht, wird eine Sporensuspension mit destilliertem Wasser aus einer Schrägagarkultur des Streptomyces griseoruber-Stammes Nr. 1/6 hergestellt. Ein Impfkultumnedium wurde mit dieser Sporensuspension angeimpft, dann wurde ein produktives Kulturmedium mit der 3 Tage alten angeimpften Kultur, die bei 25°C bis 37°C, bevorzugt bei 28°C, aufgezogen war, angeimpft, welche dann bei 25°C bis 32°C, bevorzugt bei 28°C, 3 Tage lang inkubiert wurde. Nach dem Zugeben der Mycophenolsäure zu der Kultur wurde die Kultivierung zusätzliche 7 Tage lang fortgesetzt.
- Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens der Erfindung zur Herstellung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei R1 eine Hydroxymethylgruppe bedeutet und R2 für eine Aminogruppe steht, wird eine Sporensuspension mit destilliertem Wasser von der Schrägagarkultur des Streptomyces resistomycificus-Stammes Nr. 1/28 hergestellt. Ein Impfkulturmedium wurde mit dieser Sporensuspension angeimpft, dann wurde ein produktives Kulturmedium mit der 3 Tage alten angeimpften Kultur, die bei 25°C bis 37°C, bevorzugt bei 28°C, aufgezogen war, 3 Tage lang angeimpft. Nach der Zugabe der Mycophenolsäure zu der Kultur wurde die Kultivierung zusätzliche 7 Tage lang fortgesetzt.
- Die Verfahren der Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht. Beispiel 1 Der Mutantenstamm Penicillium waksmani [NCAIM (P)F 001269], der Mycophenolsäure in einer hohen Konzentration biosynthetisiert, wurde in einem Mutationsselektionsexperiment hergestellt, das mittels N-Methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidin ausgeführt wurde. Der die Mycophenolsäure biosynthetisierende Stamm Penicillium waksmani, der aus einer Bodenprobe isoliert war, wurde auf einer MS-Agar-Schrägkultur bei 25°C 10 Tage lang aufgezogen.
- Zusammensetzung des Kulturmediums MS:
Glucose 4 g Malzextrakt 10 g Hefeextrakt 4 g Agar 20 g in 1000 ml destilliertem Wasser. - Die Sporen wurden von der Agar-Schrägkultur mit 5 ml sterilem 0,1 m Phosphatpuffer (pH 8,0) abgewaschen. Zu der Sporensuspension wurde N-Methyl-N-nitro-N'-nitrosoguanidin in einer Endkonzentration von 1 mg/ml gegeben. Die Suspension wurde bei 28°C bei 150 Upm 35 min lang geschüttelt. Nachfolgend wurden die Sporen durch Zentrifugieren bei einer Rate von 5000 Upm sedimentiert und dann in sterilem destillierten Wasser resuspendiert. Die Suspension wurde auf MS-Agar-Platten verteilt. Nach dem Inkubieren der Platten bei 25°C 10 Tage lang wurden die gewachsenen Kolonien auf MS-Kulturmedium angeimpft. Die Mycophenolsäure-erzeugende Fähigkeit der gewachsenen Agar-Schrägkulturen wurde in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise in Experimenten mit geschüttelten Kolben gescreent.
- Beispiel 2
- Die Sporen einer 7 bis 10 Tage alten Kultur des NCAIM (P)F 001269 Penicillium waksmani-Stammes, der auf Schräg-Agar gewachsen war, welcher Malzextrakt und Hefeextrakt enthielt, wurden mit 5 ml sterilem destilliertem Wasser abgewaschen, dann wurden 100 ml MI-Animpfkulturmedium, das in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben sterilisiert worden war, mit der Sporensuspension angeimpft. Die Zusammensetzung des MI-Kulturmediums war wie folgt.
Glucose 40 g Caseinhydrolysat 5 g Natriumnitrat 3 g Kaliumdihydrogenphosphat 2 g Kaliumchlorid 0,5 g Magnesiumsulfat 0,5 g Eisensulfat 0,01 g in 1000 ml Leitungswasser. - Vor der Sterilisation wurde der pH-Wert des Kulturmediums auf 6,0 eingestellt und die Sterilisation wurde bei 121°C 25 min lang ausgeführt. Die Kultur wurde auf einem Schüttelapparat (250 Upm, 2,5 cm Amplitude) 3 Tage lang geschüttelt, dann wurden 100 ml eines Kulturmediums A2, das in 50 Erlenmeyer-Kolben eines jeweiligen Volumens von 500 ml bei 121°C 25 min lang sterilisiert worden war, angeimpft.
- Zusammensetzung des Kulturmediums A2:
Glucose 80 g Trypcasin 10 g in 1000 ml Leitungswasser. - Die Sterilisation wurde bei 121°C 25 min lang ausgeführt. Der Kolben wurde auf einem Schüttelapparat (250 Upm, 2,5 cm Amplitude) bei 25°C geschüttelt. Der Gehalt der aktiven Substanz der Fermentationsnährlösung wurde unter Verwenden des HPLC-Verfahrens bestimmt. Die Fermentation wurde 168 h lang fortgesetzt und die Mycophenolsäure wurde aus der Fermentationsnährlösung isoliert. Aus 5 l der Fermentationsnährlösung, die 3100 mg/l Mycophenolsäure enthielt, wurde das Produkt wie folgt isoliert.
- Nach dem Abschluss der Fermentation wurde der pH-Wert der Fermentationsnährlösung auf 3,2 + 0,2 durch Zugeben einer Schwefelsäure von 20 Gew.-% eingestellt, dann wurde die saure Fermentationsnährlösung mit 2500 ml Methylenchlorid 1 h lang gerührt. Nachfolgend wurde nach dem Trennen der Phasen die wässrige Phase mit 3×1250 ml Methylenchlorid wie oben beschrieben extrahiert. Der kombinierte Methylenchloridextrakt, der Mycophenolsäure enthielt, wurde mit 1×500 ml und 2×250 ml einer 5 gew.%igen Natriumhydrogencarbonatlösung extrahiert. Die kombinierte wässrige alkalische Lösung, die Mycophenolsäurenatriumsalz enthielt, wurde unter 20°C gekühlt und der pH-Wert der Lösung wurde auf 3,2 + 0,2 unter Verwenden einer 20 gew.%igen Schwefelsäurelösung eingestellt. Die saure Lösung wurde mit 3×280 ml Methylenchlorid extrahiert, dann wurde der kombinierte Methylenchloridextrakt unter reduziertem Druck verdampft. Der Verdampfungsrückstand wurde in 88 ml Isopropylalkohol bei 80°C aufgelöst und mit 1,1 g Aktivkohle 30 min lang gereinigt. Nach dem Filtern der Aktivkohle wurde die Filteroberfläche zweimal mit heißem Isopropylalkohol gewaschen. Das kombinierte Isopropylalkoholfiltrat wurde unter reduziertem Druck verdampft, dann wurde das Rohprodukt in 88 ml Isopropylalkohol bei 80°C aufgelöst. Nachfolgend wurde die erhaltene Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und man ließ sie bei 0 bis 5°C über Nacht stehen. Die Kristalle wurden gefiltert und einmal mit gekühltem Isopropylalkohol und zweimal mit n-Hexan gewaschen. Das erhaltene Produkt wurde bei 50 bis 60°C unter reduziertem Druck getrocknet. Nachfolgend wurde das getrocknete Produkt in 55 ml Ethanol bei einer äußeren Temperatur von 60°C aufgelöst, dann wurden 22 ml entionisiertes Wasser tropfenweise unter Rühren zu der erhaltenen Lösung gegeben. Die Lösung wurde auf Raumtemperatur gekühlt und man ließ sie bei 0 bis 5°C über Nacht stehen. Nach der Filtration wurden die Kristalle einmal mit einer 4:10-Mischung aus Ethanol und Wasser und zweimal mit n-Hexan gewaschen und schließlich unter reduziertem Druck bei 50 bis 60°C getrocknet, um 9,0 g reine Mycophenolsäure zu ergeben.
Schmelzpunkt: 141°C. - Die spektroskopischen Daten des Produkts sind wie folgt: Ultraviolettspektrum (in einer Konzentration von 20 μg/ml in 96% Ethanol mit einer Schichtdicke von 1 cm):
-
- IR: 3415; 1745; 1710; 1625 cm–1;
- 1H-NMR (CDCl3, δTMS = 0 ppm): 1,80 (s, 3H, 4-CH3); 2,13 (s, 3H, 7'-CH3); 2,30 (t, J=8 Hz, 2H, H2-3); 2,42, (t, J=8 Hz, 2H, H2-2); 3,37 (d, J=6,6 Hz, 2H, H2-6); 3,76 (s, 3H, 6'-OCH3); 5,16 (s, 2H, H2-1'); 5,25 (t, J=6,6 Hz, 1H, H-5);
- 13C-NMR (CDCl3, δTMS = 0 ppm): 11,5, q (7'-CH3); 16,0, q (4-CH3); 22,5, t (C-6); 32,7, t (C-2); 34,1, t (C-3); 60,9, q (6'-OCH3); 70,0, t (C-1'); 106,3, s (C-3a'); 116,7, s (C-7'); 122,0, s (C-5'); 122,9, d (C-5); 133,8, s (C-4); 144,0, s (C-7a'); 153,6, s (C-4'); 163,6, s (C-6'); 172,9, s (C-3'); 179,4, s (C-1).
- Massenspektren
- Elektronenionisations-(EI)-Massenspektrum
- Charakteristische Spektraldaten:
- EI (70 eV): m/z 320 ([M]+·); m/z 302 ([M-H2O]+·); m/z 247 ([M-·CH2CH2-COOH]+); m/z 229 ([247-H2O]+); m/z 207 ([C11H11O4]+); m/z 159 ([C10H7O2]+).
- Chemisches Ionisation-(CI)-Massenspektrum
- Charakteristische Spektraldaten: CI (i-Butan): m/z 321 ([M+H]+); m/z 320 ([M]+·); m/z 303 ([M+H-H2O]+).
- Beispiel 3
- 5 ldes produktiven Kulturmediums A2, das bei 121 °C 45 min lang in einem Laborfermenter eines 5 l Arbeitsvolumens sterilisiert worden war, wurden mit 250 ml der geschüttelten Kulturanimpfung, die wie im Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden war, angeimpft. Nach dem Animpfen wurde der Fermenter bei 25°C durch in Blasen Durchleiten von 120 l/h steriler Luft und dem Rührer bei einer Rate von 400 Upm betrieben. Die Fermentation wurde 168 h lang fortgesetzt, dann wurde die Mycophenolsäure aus der Fermentationsnährlösung isoliert. Die erhaltene Fermentationsnährlösung von 4,9 l enthielt 2000 mg/l Mycophenolsäure am Ende der Fermentation. Die Mycophenolsäure wurde aus der Fermentationsnährlösung wie im Beispiel 2 beschrieben isoliert.
- Beispiel 4
- 5 l des Produktionsmediums A3, das in einem Laborfermenter bei 121°C 35 min lang sterilisiert worden war, wurde mit 250 ml Impfkultur, die wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt worden war, angeimpft.
- Zusammensetzung des Mediums A3:
Glucose 80 g NZ-Amin YTT (Quest) 10 g in 1000 ml Leitungswasser. - Der Fermenter wurde bei 27°C mit einer 120 l/h-Belüftung und 400 Upm Rühren betrieben. Die Fermentation wurde 168 h lang fortgesetzt. Die erhaltenen 5 l Fermentationsnährlösung enthielt 2550 mg/l Mycophenolsäure. Die Mycophenolsäure wurde aus der Fermentationsnährlösung gemäß Beispiel 2 isoliert.
- Beispiel 5
- Eine Zellsuspension wurde aus einer Kultur des Stammes Streptomyces griseoruber Nr. 1/6, der als Streptomyces sp. Nr. 1/6 [NCAIM (P)B 001275] hinterlegt ist, der auf CM-Schräg-Agar aufgezogen war, hergestellt. Zusammensetzung des Agar-Kulturmediums CM:
Glucose 25 g Pepton 2 g Hefeextrakt 1 g Magnesiumsulfat-Wasser (1:7) 0,5 g Kaliumdihydrogenphosphat 5 g Agar 20 g in 1000 ml destilliertem Wasser. - 5 ml der Suspension wurden zu 100 ml sterilisiertem Animpfkulturmedium MB in einem Erlenmeyer-Kolben eines Volumens von 500 ml angeimpft.
- Zusammensetzung des Kulturmediums MB:
Glucose 20 g Malzextrakt 30 g Hefeextrakt 10 g Magnesiumsulfat – Wasser (1:7) 1 g in 1000 ml Leitungswasser. - Vor der Sterilisation wurde der pH-Wert des Kulturmediums auf 7,0 eingestellt und die Sterilisation wurde bei 121°C 25 min lang ausgeführt. Die Kulturen wurden auf einem Schüttelapparat (250 Upm, 2,5 cm Amplitude) bei 28°C 3 Tage lang aufgezogen, dann wurden jeweils 5 ml der erhaltenen Impflösung in 50 Erlenmeyer-Kolben eines Volumens von 500 ml jeweils in 100–100 ml sterilisiertem Biokonversionskulturmedium MBT angeimpft, das jeweils die folgende Zusammensetzung hatte:
Glucose 20 g Malzextrakt 10 g Sojabohnenmehl 5 g Pepton 10 g Magnesiumsulfat – Wasser (1:7) 1 g Kaliumdihydrogenphosphat 1 g in 1000 ml Leitungswasser. - Vor der Sterilisation wurde der pH-Wert des Kulturmediums auf 7,0 eingestellt. Die Sterilisation wurde bei 121°C 25 min lang ausgeführt. Eine getrennt sterilisierte Glucose wurde portionsweise zu dem Kulturmedium bei dem Animpfen zugegeben. Die Kolben wurden bei 28°C unter Verwenden eines Schüttelapparates (250 Upm, 2,5 cm Amplitude) 3 Tage lang geschüttelt. Zu den 72 h alten Kulturen wurde Mycophenolsäure aufgelöst in Ethanol bis zu einer Endkonzentration von 0,1 mg/ml gegeben. Die Fermentation wurde weitere 7 Tage nach der Zugabe fortgesetzt. Am Ende der Biokonversion wurden 2,0 l Aceton und 4,0 l Ethylacetat zu der Fermentationsnährlösung von 4,0 l gegeben. Dann wurde die Mischung 1 h lang gerührt. Nachfolgend wurden die Phasen getrennt und die wässrige Phase wurde wieder mit 4,0 l Chloroform extrahiert. Die emulgierten organischen Phasen, die im Verlauf der Extraktion erhalten wurden, wurden zentrifugiert. Dann wurde die getrennte organische Phase verdampft und dann das erhaltene Rohprodukt (2,0 g) auf einer Säule chromatographiert, die aus 100 g Kieselgel 60- Adsorbenz (Teilchengröße 0,063 bis 0,2 mm; Reanal, Budapest) hergestellt war. Das Rohprodukt wurde auf die Säule mit einer Mischung aus Chloroform, Methanol und 99,5% Essigsäure (8,5 : 1,5 : 0,01) angewendet und im Lauf der Chromatographie wurde die oben genannte Mischung als Entwicklungslösemittel verwendet. Bei der Säulenchromatographie wurden Fraktionen von jeweils 10 ml gesammelt und die Fraktionen wurden durch TLC auf einer Kieselgel 60 F254 DC-Alufolie (Merck) analysiert, unter Verwenden der oben beschriebenen Entwicklungsmischung (Nachweis bei Raumtemperatur mit 1% FeCl3 in Ethanolreagenz). Die Fraktionen, die hauptsächlich Mycophenolsäureamid enthielten, wurden kombiniert, dann wurden 40 ml entionisiertes Wasser zu den erhaltenen 120 ml Lösung gegeben. Der pH-Wert der Mischung wurde auf 4,0 bis 4,5 durch Zugeben von 1N Natriumhydroxidlösung eingestellt. Nach der Trennung der Phasen wurde die wässrige Phase mit 40 ml Chloroform extrahiert. Die kombinierten Extrakte wurden unter reduziertem Druck verdampft und das erhaltene Produkt (0,3 g) wurde wieder einer Chromatographie auf einer Säule unterzogen, die aus 30 g Kieselgel 60-Adsorbenz (Teilchengröße: 0,063 bis 0,02 mm; Reanal, Budapest) hergestellt war. Die chromatographische Säule wurde unter Verwenden einer Mischung aus Methylenchlorid und Ethylacetat, die 10% Ethylacetat enthielt, vorbereitet. Für die Elution wurde der Ethylacetatgehalt dieser Mischung um 10% in jeder nachfolgenden Elution vergrößert. Im Verlauf der Chromatographie wurden Fraktionen von 15 bis 20 ml genommen und mit TLC unter den oben beschriebenen Bedingungen untersucht.
- (Im Verlauf der Untersuchung wurde eine Mischung, die aus Benzol und Ethylacetat bestand (1:2) als Entwicklungssystem angewandt.) Das Produkt wurde aus der Säule unter Verwenden einer Mischung aus Methylenchlorid und Ethylacetat, die 40% Ethylacetat enthielt, gelöst. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden unter reduziertem Druck verdampft, um 0,2 g eines chromatographisch reinen Mycophenolsäureamids zu erhalten.
-
- IR: 3433; 1737; 1665; 1622 cm–1;
- 1H-NMR (CDCl3, δTMS = 0 ppm): 1,80 (s, 3H, 4-CH3); 2,14 (s, 3H, 7'-CH3); 2,31 (s, 4H, H1-2 und H2-3); 3,39 (d, J=6,3 Hz, 2H, H2-6); 3,76, (s, 3H, 6'-OCH3); 5,19 (s, 2H, H2-1'); 5,21 (t, J=6,3 Hz, 1H, H-5);
- 13C-NMR (CDCl3, δTMS = 0 ppm): 11,4, q (7'-CH3); 16,0, q (4-CH3); 22,5, t (C-6); 34,2, t (C-2); 34,9, t (C-3); 61,0, q (6'-OCH3); 70,0, t (C-1'); 106,3, s (C-3a'); 116,7, s (C-7'); 122,0, s (C-5'); 123,0, d (C-5); 134,2, s (C-4); 144,1, s (C-7a'); 153,5, s (C-4'); 163,6, s (C-6'); 172,8, s (C-3'); 176,4, s (C-1).
- Massenspektren
- Elektronenionisations-(EI)-Massenspektrum
- Charakteristische Spektraldaten:
- EI (70 eV): ([M]+·) 319; C17H21NO5; m/z 302, C17H18O5 ([M-NH3]+·); m/z 301, C17H19NO4, ([M-H2O]+·); m/z 261, C15H17O4, ([M-·CH2CONH2]+); m/z 207, C11H11O4, ([M-·C5H8CONH2]+).
- Chemisches Ionisations-(CI)-Massenspektrum
- Charakteristische Spektraldaten:
- CI (i-Butan): ([M+H]+) 320; ([M]+·) 319; m/z 303 ([M+H-NH3]+) m/z 207 ([M-·C5H8CONH2]+).
- Beispiel 6
- Die Herstellung der Animpfkultur und die Biokonversion wurden mit der Zellsuspension ausgeführt, die aus der Kultur des Stammes von Streptomyces resistomycificus Nr. 1/28 [NCAIM (P)B 001276] hergestellt, der auf einer CM-Schräg-Agar wie in Beispiel s beschrieben aufgezogen war.
- Am Ende der Biokonversion wurde die Fermentationsnährlösung eines Volumens von 4,5 l wie in Beispiel 4 beschrieben extrahiert. Durch Verdampfen der Extrakte unter reduziertem Druck wurden 3,8 g Rohprodukt erhalten; welches auf einer Chromatographiesäule gereinigt wurde, die aus 114 g Kieselgel 60-Adsorbenz (Teilchengröße 0,063 bis 0,2 mm; Reanal) hergestellt war. Im Verlauf der Reinigung durch Chromatographie wurde eine Mischung aus Chloroform, Methanol und 99,5% Essigsäure (8,5:1,5:0,01) als das Entwicklungssystem verwendet. Während der Chromatographie wurden jeweils Fraktionen von 15 bis 20 ml genommen und durch TLC wie in Beispiel 5 beschrieben analysiert. Eine Mischung, die Chloroform, Methanol und 99,5% Essigsäure (8,5:1,5:0,1) umfasste, wurde als das Entwicklungssystem verwendet. Die Fraktionen, die hauptsächlich Hydroxymethylmycophenolsäureamid enthielten, wurden kombiniert, und die Lösung wurde vor dem Verdampfen wie in Beispiel 5 beschrieben verarbeitet. Das Produkt (0,4 g), das nach dem Verdampfen der Lösung erhalten wurde, wurde einer weiteren Chromatographie auf einer Säule unterzogen, die aus 40 g Kieselgel 60-Adsorbenz (Teilchengröße 0,063 bis 02, mm; Reanal) hergestellt war. Die Chromatographiesäule wurde in Chloroform hergestellt und während der Elution wurden Mischungen verwendet, die Chloroform und Methanol enthielten, deren Methanolgehalt um 1% in jeder Elution vergrößert wurde. Während der Chromatographie wurden Fraktionen von jeweils 10 ml genommen und durch TLC unter den oben beschriebenen Bedingungen analysiert. Das Produkt wurde aus der Säule unter Verwen den von Chloroform, das 5% Methanol enthielt, gelöst. Die Fraktionen, die das Produkt enthielten, wurden verdampft und das erhaltene Produkt (0,3 g) wurde weiter gereinigt unter Verwenden von Methanol als Lösemittel auf einer Säule, die 300 ml Sephadex LH-20-Gel (Pharmacia, Schweden) enthielt. Im Verlauf der Gelfiltrationschromatographie wurden Fraktionen von jeweils 10 ml genommen und durch TLC unter den oben beschriebenen Bedingungen analysiert. Die Fraktionen, die das Rohprodukt enthielten, wurden kombiniert und unter reduziertem Druck verdampft, um 0,22 g eines chromatographisch homogenen Hydroxymethylmycophenolsäureamids zu erhalten.
- Spektroskopische Daten des erhaltenen Produktes:
-
- IR: 3339; 1735; 1657; 1615 cm–1;
- 1H-NMR (MeOH-d4, δTMS = 0 ppm): 1,80 (s, 3H, 4-CH3); 2,25 (s, 4H, H2-2 und H2-3); 3.38 (d, 7=6,5 Hz, 2H, H2-6); 3,78 (s, 3H, 6'-OCH3); 4,66 (s, 2H, 7'-CH2-OH); 5,25 (t, J=6,5 Hz, 1H, H-5); 5,40 (s, 2H, H2-1');
- 13C-NMR (MeOH-d4, δTMS = 0 ppm): 16,2, q (4-CH3); 23,4, t (C6); 35,3, t und 36,5, t (C-2 und C-3); 57,8, t (7'CH2-OH); 62,9, q (6'-OCH3); 71,5, t (C-1'); 108,2, s (C-3a'); 122,0, s und 123,6, s (C-5' und C-7'); 124,2, d (C-5); 135,3, s (C-4); 146,8, s (C-7a'); 156,1, s (C-4'); 164,1, s (C-6'); 173,7, s (C-3'); 178,7, s (C-1).
- Massenspektren
- Positive (+) und negative (–) FAB-Spektren
- Charakteristische Spektraldaten:
- + und – FAB (Xenon, 9 kV): [M+H]+ 336, m/z 318 [M+H-H2O]+; [M-H]- 334.
Claims (2)
- Mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel (I)wobei R1 eine Methyl- oder Hydroxymethylgruppe bedeutet und R2 für eine Hydroxyl- oder Aminogruppe steht, wobei das Verfahren umfasst Aufziehen eines Pilzstammes von Penicillium waksmani, der fähig ist, Mycophenolsäure zu biosynthetisieren, auf einem Kulturmedium, das Quellen assimilierbaren Kohlenstoffs und Stickstoffs wie auch Mineralsalze enthält, bei 22 bis 30°C, Trennen der Verbindung der allgemeinen Formel (I), wobei R1 eine Methylgruppe bedeutet und R2 für eine Hydroxylgruppe steht, von der Fermentationsnährlösung und, falls erwünscht, Reinigen dieser, und falls erwünscht, Biokonvertieren dieser a) durch Verwenden der Kulturen eines Actinomycete-Stammes von Streptomyces griseoruber Nr. 1/6, der bei der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms als Streptomyces sp. Nr. 1/6 unter Nr. NCAIM (P)B 001275 hinterlegt ist, um eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) herzustellen, wobei R1 eine Methylgruppe bedeutet und R2 für eine Aminogruppe steht, oder b) durch Verwenden der Kulturen eines Actinomycete-Stammes von Streptomyces resistomycificus Nr. 1/28, der bei der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms unter Nr. NCAIM (P)B 001276 hinterlegt ist, um eine Verbindung der allgemeinen Formel (I) herzustellen, wobei R1 eine Hydroxymethylgruppe bedeutet und R2 für eine Aminogruppe steht, auf einem Kulturmediumn, das Quellen assimilierbaren Kohlenstoffs und Stickstoffs wie auch Mineralsalze enthält, unter submersen, belüfteten Bedingungen bis zum Abschluss der Biokonversion, dann Trennen der Verbindung der allgemeinen Formel (I), die von der Kultur gebildet wurde und, falls erwünscht, Reinigen dieser.
- Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Stamm Penicillium waksmani, der bei der National Collection of Agricultural and Industrial Microorganisms unter Nr. NCAIM (P)F 001269 hinterlegt ist, oder ein zugehöriger Mutantenstamm, der fähig ist, Mycophenolsäure zu biosynthetisieren, kultiviert wird.
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