CN115215902A - 一种具有抗炎活性的水溶性红色食用真菌色素及其制备方法和用途 - Google Patents

一种具有抗炎活性的水溶性红色食用真菌色素及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有抗炎活性的水溶性红色食用真菌色素及其制备方法和用途，涉及天然食用色素技术领域。该色素为式I所示的化合物、或其盐、或其酯、或其溶剂合物，其中，R1、R2、R3、R4分别独立选自氢、C1～C6烷基；R5选自氢、C1～C6烷基、卤素。本发明制备的化合物无细胞毒性，且具有显著抗炎活性；此外，该化合物可作为一种可溶性红色食用色素。即本发明制备得到的是一种安全性好、水溶性好、色泽鲜艳、性能稳定、色价高又具抗炎活性的天然保健红色素。本发明化合物由真菌经发酵产生，可通过对发酵产物进行甲醇提取后，再用硅胶柱层析和高效液相色谱分离纯化，易于操作和实施，易于工业化大规模生产，具备广阔的应用前景。
Figure DDA0003032005980000011

Description

一种具有抗炎活性的水溶性红色食用真菌色素及其制备方法 和用途
技术领域
本发明涉及天然食用色素技术领域，具体涉及一种具有抗炎活性的水溶性红色食用真菌色素及其制备方法和用途。
背景技术
色素在食品中的应用可以追溯到公元前1500年。食品色素分为天然色素和合成色素，其可以弥补食品在研磨、高温等加工过程中损失的颜色，提高食品的感官性质，从而被广泛应用。合成色素虽然具有着色力强、色泽鲜艳等优点，但是近年来不断被报道对人体健康存在潜在威胁。随着消费者健康饮食文化理念的不断深入，天然色素作为一种更为安全、健康的添加剂，其市场份额在不断增大。
真菌来源的天然色素具有性质稳定、周期短等优势而受到青睐。其中，azaphilone色素是一类典型的真菌聚酮色素，含有一个高度氧化的并环结构，在曲霉属、青霉属、毛壳霉属等多种真菌的次级代谢产物中都被报道过。在东亚地区，azaphilone类红曲色素被应用于食品领域已经有很长的历史，其不仅可以呈现出红色、橙色、绿色等多种颜色，还具有抑菌、抗病毒、抗癌、细胞毒性和抗炎等多种活性。
但是，天然色素大多溶解性较差，限制了其在工业上的应用。水溶性色素的优势日益凸显，所以对水溶性azaphilone色素的研究开发具有重大理论意义和经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗炎活性的水溶性红色食用真菌色素及其制备方法和用途。
本发明提供了式I所示的化合物、或其盐、或其酯、或其溶剂合物：
Figure BDA0003032005960000011
其中，
R1、R2、R3、R4分别独立选自氢、C1～C6烷基；
R5选自氢、C1～C6烷基、卤素。
进一步地，所述化合物如式II所示：
Figure BDA0003032005960000021
其中，
R1、R2、R3、R4分别独立选自氢、C1～C6烷基；
R5选自氢、C1～C6烷基、卤素。
进一步地，所述化合物的结构如下：
Figure BDA0003032005960000022
本发明还提供了前述的化合物的制备方法，所述化合物由菌株Penicilliumsp.CIB411经发酵产生；所述菌株Penicillium sp.CIB411保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14993。
进一步地，前述的制备方法包括如下步骤：
A.将菌株Penicillium sp.CIB411接种于固体发酵培养基中，培养得到发酵产物；
B.将甲醇加入到步骤A得到的发酵产物中，混合后浸提，过滤得到浸提液，将浸提液减压浓缩，得到浸膏；
C.将步骤B得到的浸膏提纯，即得；
所述固体发酵培养基的制备方法为：取大米，加水浸泡24～48h后滤干水分，加入蛋白胨，混合均匀，即得；所述大米和蛋白胨的质量比为100:0.3；
或者，它包括如下步骤：
a.将菌株Penicillium sp.CIB411接种于液体发酵培养基中，培养得到发酵产物；
b.将步骤a得到的发酵产物抽滤，滤液用正丁醇进行萃取，得萃取液；滤饼加入甲醇提取，得提取液；
c.分别将步骤b得到的萃取液和提取液减压浓缩得浸膏，将各部分浸膏合并，得总浸膏；
d.将步骤c得到的浸膏提纯，即得；
所述液体发酵培养基的溶剂为土豆汁，溶质为葡萄糖、蛋白胨和KH2PO4；
所述土豆汁的制备方法为在土豆中加水煮沸30～60min，过滤，即得；所述土豆和水的质量体积比为1:(5～10)g/mL；
所述葡萄糖的浓度为20g/L，蛋白胨的浓度为3g/L，KH2PO4的浓度为2g/L。
进一步地，
步骤A中，所述培养为于25-30℃恒温静置培养20-40天；
优选地，步骤A中，所述培养为于28℃恒温静置培养30天；
和/或，步骤B中，所述浸提条件为于60～70℃水浴1～5h，所述浸提次数为1～3次；
优选地，步骤B中，所述浸提条件为于60℃水浴4h，所述浸提次数为3次；
和/或，步骤C中，所述提纯为将浸膏进行硅胶柱层析后，用分子筛分离纯化，再用高效液相色谱制备；
优选地，
步骤C中，所述硅胶柱层析采用的填料为200～300目柱层析硅胶；
和/或，所述硅胶柱层析为将浸膏与硅胶按等质量比混合均匀后，干法上样，用二氯乙烷和甲醇混合溶液进行梯度洗脱，二氯乙烷和甲醇的体积比分别为20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，收集二氯乙烷和甲醇体积比3:1的洗脱液，旋转蒸发得干物质；
和/或，所述用分子筛分离纯化时使用等体积比氯仿和甲醇混合溶液；
和/或，所述高效液相色谱采用的填料为ODS C-18柱层析硅胶，流动相为35％乙腈水溶液，流速为0.8mL/min。
进一步地，
步骤a中，所述培养为25-30℃、180rpm避光培养3～5天，再25～30℃、静置培养10～15天；
优选地，所述培养为28℃、180rpm避光培养3天，再28℃、静置培养10～15天；
和/或，步骤b中，所述加入甲醇提取为超声提取；
和/或，步骤d中，所述提纯为将浸膏进行硅胶柱层析后，用分子筛分离纯化，再用高效液相色谱制备；
优选地，
步骤d中，所述硅胶柱层析采用的填料为200～300目柱层析硅胶；
和/或，所述硅胶柱层析为将浸膏与硅胶按等质量比混合均匀后，干法上样，用二氯乙烷和甲醇混合溶液进行梯度洗脱，二氯乙烷和甲醇的体积比分别为20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，收集二氯乙烷和甲醇体积比3:1的洗脱液，旋转蒸发得干物质；
和/或，所述用分子筛分离纯化时使用等体积比氯仿和甲醇混合溶液；
和/或，所述高效液相色谱采用的填料为ODS C-18柱层析硅胶，流动相为35％乙腈水溶液，流速为0.8mL/min。
本发明还提供了前述的化合物、或其盐、或其酯、或其溶剂合物作为食用色素，和/或在制备抗炎药物中，和/或在制备功能性食品中的用途；
优选地，所述食用色素为水溶性食用真菌色素；
更优选地，所述食用色素为水溶性红色食用真菌色素；
进一步地优选地，所述食用色素为具有抗炎活性的水溶性红色食用真菌色素。
本发明还提供了一种药物，它是以前述的化合物、或其盐、或其酯、或其溶剂合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而得的制剂。
本发明还提供了一种食品，它含有前述的化合物、或其盐、或其酯、或其溶剂合物。
本发明中，菌株Penicillium sp.CIB411是申请号为201810361313.8的专利申请(申请公布日为2019年3月1日)中公开的已经保藏的菌株CIB411，于2017年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.14993。
本发明的有益效果为：
(1)本发明制备的化合物无细胞毒性，且具有显著抗炎活性；此外，该化合物可作一种可溶性红色食用色素。即本发明制备得到的是一种安全性好、水溶性好、色泽鲜艳、性能稳定、色价高又具抗炎活性的天然保健红色素。对本发明化合物进行抗炎活性测试，检测结果表明该化合物能够显著降低LPS诱导的NO产生水平，其IC50达到9.58μM，具有抗炎活性，且无明显细胞毒性。
(2)本发明化合物由真菌经发酵产生，可通过对发酵产物进行甲醇提取后，再用硅胶柱层析和高效液相色谱分离纯化，易于操作和实施，易于工业化大规模生产，具备广阔的应用前景。
综上，本发明提供了一种水溶性天然真菌食用红色素，该红色色素抗炎活性好、水溶性好、稳定性好、安全性好，同时能够显著改善食品的颜色，可作为功能性食用色素开发利用。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明具有式a结构的化合物的1H NMR图谱；
图2为本发明具有式a结构的化合物的13C NMR图谱；
图3为本发明具有式a结构的化合物的31P NMR图谱；
图4为本发明具有式a结构的化合物的HRESIMS图谱。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、本发明食用真菌色素的制备
一、菌种的发酵
1、将菌株Penicillium sp.CIB411接种到PDA培养基斜面上，28℃避光培养7天，待菌丝长满整个斜面，得到斜面种子。
2、将步骤1得到的斜面种子(菌丝体)转接到液体种子培养基中，28℃、180rpm避光培养4天，得到种子培养液。
液体种子培养基：溶剂为土豆汁(土豆汁的制法：200g土豆，加水约1000mL，煮沸30min，过滤，滤液补足1000mL)，溶质及其含量如下：葡萄糖20g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO4 2g/L。
3、将10mL种子培养液接种至装有发酵培养基的三角瓶中，28℃恒温静置培养30天。
发酵培养基的制备方法：取100g大米，加水浸泡24h，滤干水分，放入500mL三角瓶，加入0.3g蛋白胨，混合均匀，灭菌(121℃，30min)。
二、本发明食用真菌色素的提取分离
1、将200mL甲醇加入发酵好的三角瓶中，60℃下水浴4h，过滤得到浸提液。分别浸提3次，合并滤液，真空减压浓缩得到浸膏。
2、浸膏与硅胶按质量比1:1的比例拌合均匀后，干法上样，进行硅胶柱层析，以二氯乙烷/甲醇混合溶液(二氯乙烷和甲醇的体积比分别为20:1，10:1，5:1，3:1，1:1，纯甲醇)作为洗脱液，收集二氯乙烷和甲醇的体积比为3:1的洗脱液，旋转蒸发后得到干物质A。
3、干物质A进一步用分子筛(氯仿：甲醇1:1，v/v)分离纯化，得到含有目标产物的混合物，再用高效液相色谱(流速为0.8mL/min，流动相为35％乙腈水溶液，v/v)制备，得到本发明食用真菌色素(即式a所示化合物)。
Figure BDA0003032005960000061
三、化合物的结构确证数据
式a所示化合物为红色粉末，化学名称为：(7R)-5-氯-2-(2-(((2,3-二羟基丙氧基)(羟基)磷酰基)氧基)乙基)-3-((S，1E，3E)-3,5-二甲基庚-1,3-二烯-1-基)-7-甲基-6,8-二氧基-2,6,7,8-四氢异喹啉-7-基乙酸酯，分子式为C26H35ClNO10P，表征数据如下：
HR-ESI-MS:m/z 588.1759[M+H]+，1H-NMR(400MHz,MeOD-d4):δ8.24(1H,s,H-1),7.18(1H,s,H-4),6.58(1H,d,J＝15.5Hz,H-9),7.11(1H,d,J＝15.4Hz,H-10),5.78(1H,d,J＝9.7Hz,H-12),2.54(1H,m,H-13),1.45(1H,m,H-14),1.37(1H,m,H-14),0.90(3H,t,J＝7.3Hz,H-15),1.03(3H,d,J＝6.6Hz,H-16),1.94(3H,s,H-17),1.52(3H,s,H-18),2.12(3H,s,H-20),4.42(2H,m,H-1′),4.16(2H,m,H-2′),3.79(2H,m,H-3′),3.71(1H,m,H-4′),3.52(2H,m,H-5′)；13C-NMR(100MHz,MeOD-d4):δ144.6(C-1),148.3(C-3),112.6(C-4),151.9(C-4a),101.3(C-5),185.6(C-6),86.2(C-7),194.9(C-8),116.4(C-8a),117.1(C-9),146.8(C-10),134.0(C-11),148.8(C-12),36.2(C-13),31.1(C-14),12.4(C-15),20.6(C-16),12.8(C-17),23.8(C-18),171.6(C-19),20.2(C-20),55.6(C-1′),64.5(C-2′),67.8(C-3′),72.5(C-4′),63.7(C-5′)；31P-NMR(600MHz,MeOD-d4):δ0.61.
实施例2、本发明食用真菌色素的制备
一、菌种的发酵
1、将菌株Penicillium sp.CIB411接种到PDA培养基斜面上，28℃避光培养7天，待菌丝长满整个斜面，得到斜面种子。
2、将步骤1得到的斜面种子(菌丝体)转接到液体培养基中，28℃、180rpm避光培养3天，再28℃、静置培养10～15天，得液体发酵物。
液体培养基：溶剂为土豆汁(土豆汁的制法：200g土豆，加水约1000mL，煮沸30min，过滤，滤液补足1000mL)，溶质及其含量如下：葡萄糖20g/L、蛋白胨3g/L、KH2PO4 2g/L。
二、本发明食用真菌色素的提取分离
1、将培养好的液体发酵物进行抽滤，滤液部分用等体积正丁醇进行萃取，萃取3次，合并萃取液；菌丝体部分(滤饼部分)加入2倍体积的甲醇超声提取30分钟，提取3次，合并提取液。分别真空减压浓缩萃取液和提取液，得到各个部分浸膏，合并各部分浸膏得总浸膏。
2、总浸膏与硅胶按质量比1:1的比例拌合均匀后，干法上样，进行硅胶柱层析，以二氯乙烷/甲醇混合溶液(二氯乙烷和甲醇的体积比分别为20:1，10:1，5:1，3:1，1:1，纯甲醇)作为洗脱液，收集二氯乙烷和甲醇的体积比为3:1的洗脱液，旋转蒸发后得到干物质A。
3、干物质A进一步用分子筛(氯仿：甲醇1:1，v/v)分离纯化，得到含有目标产物的混合物，再用高效液相色谱(流速为0.8mL/min，流动相为35％乙腈水溶液，v/v)制备，得到本发明食用真菌色素(即式a所示化合物)。
Figure BDA0003032005960000071
三、化合物的结构确证数据
本发明式a化合物的结构数据同实施例1。
实施例3、本发明食用真菌色素的抗炎活性及细胞毒性实验
一、抗炎活性
将式a化合物作用于脂多糖(LSP)诱导的RAW264.7小鼠巨噬细胞，通过检测RAW264.7细胞中一氧化氮(NO)的产生水平来检测其抗炎活性。
1、药物溶液的配制
(1)将式a化合物用DMSO配制成100μM溶液，置于-4℃保存；
(2)脂多糖(lipopolysaccharide from Escherichia Coli E 0127:B8-purifiedby phenol extraction，LPS)，购自Sigma-Aldrich公司，用重蒸水配制成100μg/mL溶液，-20℃保存。
2、细胞株：RAW264.7小鼠巨噬细胞，由中国科学研究院上海分院提供。
3、试验方法:
用含10％PBS、1％双抗(青霉素、链霉素)的DMEM培养基对复苏后细胞进行培养，待细胞生长至对数期时，收集细胞并按照1.5×105细胞/孔的量接种到24孔板，置于5％CO2、37℃培养箱中培养过夜。再以不同浓度梯度的式a所示化合物处理细胞1小时，加入LPS(终浓度为1.0μg/mL)，诱导24小时，每个浓度设3个重复。最后用Griess反应检测细胞培养基中的一氧化氮(NO)浓度。
4、抗炎活性结果
一氧化氮(NO)的产生水平与炎症反应的强弱密切相关。实验表明式a所示化合物能显著降低LPS诱导的NO产生水平，其IC50达到9.58μM。说明该化合物具有良好的抗炎活性。
二、细胞毒性实验
1、试验方法：
用含10％PBS、1％双抗(青霉素、链霉素)的DMEM培养基对复苏后RAW264.7小鼠巨噬细胞进行培养，待细胞生长至对数期时，收集细胞并按照4×104细胞/孔的量接种到96孔板，置于5％CO2、37℃培养箱中培养过夜。然后将一系列不同浓度梯度的式a所示化合物加入到培养基中，再置于细胞培养箱中培养24小时，每个浓度设3个重复，用Alamar-Blue法检测细胞存活率。
2、细胞毒性实验结果
在50μM的浓度下，式a所示化合物没有显著抑制细胞的增殖，说明该化合物无显著细胞毒性。
实施例4、本发明食用真菌色素的食品染色实验
将式a化合物溶解于食用酒精中，配成0.1％的溶液，将其按照一定的比例添加至米酒、果酒等饮品中，饮品呈现从浅红至深红不同程度的颜色，颜色悦目诱人，通过评析发现，添加a化合物的饮品能显著增加消费者的消费欲望和心情。同时该化合物的添加赋予了该饮品抗炎保健作用。
本发明式a化合物为水溶性食用真菌色素，体现在5mg的式a化合物中加入1mL的水后，化合物能迅速溶解，颜色均匀透明且无沉淀。专利CN109400527A所涉及的化合物为脂溶性(非水溶性)，体现在5mg的该化合物中加入1mL的水后，化合物不能溶解完全，液体混浊、明显存在固体沉淀。
综上，本发明制备的化合物无细胞毒性，且具有显著抗炎活性；此外，该化合物可作为一种可溶性红色食用色素。即本发明制备得到的是一种安全性好、水溶性好、色泽鲜艳、性能稳定、色价高又具抗炎活性的天然保健红色素。本发明化合物由真菌经发酵产生，可通过对发酵产物进行甲醇提取后，再用硅胶柱层析和高效液相色谱分离纯化，易于操作和实施，易于工业化大规模生产，具备广阔的应用前景。

Claims (10)

1.式I所示的化合物、或其盐、或其酯、或其溶剂合物：
Figure FDA0003032005950000011
其中，
R1、R2、R3、R4分别独立选自氢、C1～C6烷基；
R5选自氢、C1～C6烷基、卤素。
2.根据权利要求1所述的化合物、或其盐、或其酯、或其溶剂合物，其特征在于：所述化合物如式II所示：
Figure FDA0003032005950000012
其中，
R1、R2、R3、R4分别独立选自氢、C1～C6烷基；
R5选自氢、C1～C6烷基、卤素。
3.根据权利要求1或2所述的化合物、或其盐、或其酯、或其溶剂合物，其特征在于：所述化合物的结构如下：
Figure FDA0003032005950000013
4.权利要求3所述的化合物的制备方法，其特征在于：所述化合物由菌株Penicilliumsp.CIB411经发酵产生；所述菌株Penicillium sp.CIB411保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14993。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
A.将菌株Penicillium sp.CIB411接种于固体发酵培养基中，培养得到发酵产物；
B.将甲醇加入到步骤A得到的发酵产物中，混合后浸提，过滤得到浸提液，将浸提液减压浓缩，得到浸膏；
C.将步骤B得到的浸膏提纯，即得；
所述固体发酵培养基的制备方法为：取大米，加水浸泡24～48h后滤干水分，加入蛋白胨，混合均匀，即得；所述大米和蛋白胨的质量比为100:0.3；
或者，它包括如下步骤：
a.将菌株Penicillium sp.CIB411接种于液体发酵培养基中，培养得到发酵产物；
b.将步骤a得到的发酵产物抽滤，滤液用正丁醇进行萃取，得萃取液；滤饼加入甲醇提取，得提取液；
c.分别将步骤b得到的萃取液和提取液减压浓缩得浸膏，将各部分浸膏合并，得总浸膏；
d.将步骤c得到的浸膏提纯，即得；
所述液体发酵培养基的溶剂为土豆汁，溶质为葡萄糖、蛋白胨和KH2PO4；
所述土豆汁的制备方法为在土豆中加水煮沸，过滤，即得；所述土豆和水的质量体积比为1:(5～10)g/mL；
所述葡萄糖的浓度为20g/L，蛋白胨的浓度为3g/L，KH2PO4的浓度为2g/L。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
步骤A中，所述培养为于25-30℃恒温静置培养20-40天；
和/或，步骤B中，所述浸提条件为于60～70℃水浴1～5h，所述浸提次数为1～3次；
和/或，步骤C中，所述提纯为将浸膏进行硅胶柱层析后，用分子筛分离纯化，再用高效液相色谱制备；
优选地，
步骤C中，所述硅胶柱层析采用的填料为200～300目柱层析硅胶；
和/或，所述硅胶柱层析为将浸膏与硅胶按等质量比混合均匀后，干法上样，用二氯乙烷和甲醇混合溶液进行梯度洗脱，二氯乙烷和甲醇的体积比分别为20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，收集二氯乙烷和甲醇体积比3:1的洗脱液，旋转蒸发得干物质；
和/或，所述用分子筛分离纯化时使用等体积比氯仿和甲醇混合溶液；
和/或，所述高效液相色谱采用的填料为ODS C-18柱层析硅胶，流动相为35％乙腈水溶液，流速为0.8mL/min。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：
步骤a中，所述培养为25-30℃、180rpm避光培养3～5天，再25～30℃、静置培养10～15天；
和/或，步骤b中，所述加入甲醇提取为超声提取；
和/或，步骤d中，所述提纯为将浸膏进行硅胶柱层析后，用分子筛分离纯化，再用高效液相色谱制备；
优选地，
步骤d中，所述硅胶柱层析采用的填料为200～300目柱层析硅胶；
和/或，所述硅胶柱层析为将浸膏与硅胶按等质量比混合均匀后，干法上样，用二氯乙烷和甲醇混合溶液进行梯度洗脱，二氯乙烷和甲醇的体积比分别为20:1、10:1、5:1、3:1、1:1、0:1，收集二氯乙烷和甲醇体积比3:1的洗脱液，旋转蒸发得干物质；
和/或，所述用分子筛分离纯化时使用等体积比氯仿和甲醇混合溶液；
和/或，所述高效液相色谱采用的填料为ODS C-18柱层析硅胶，流动相为35％乙腈水溶液，流速为0.8mL/min。
8.权利要求1～3任一项所述的化合物、或其盐、或其酯、或其溶剂合物作为食用色素，和/或在制备抗炎药物中，和/或在制备功能性食品中的用途；
优选地，所述食用色素为水溶性食用真菌色素；
更优选地，所述食用色素为水溶性红色食用真菌色素；
进一步地优选地，所述食用色素为具有抗炎活性的水溶性红色食用真菌色素。
9.一种药物，其特征在于：它是以权利要求1～3任一项所述的化合物、或其盐、或其酯、或其溶剂合物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而得的制剂。
10.一种食品，其特征在于：它含有权利要求1～3任一项所述的化合物、或其盐、或其酯、或其溶剂合物。
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