DE2517853A1

DE2517853A1 - Azdimycin

Info

Publication number: DE2517853A1
Application number: DE19752517853
Authority: DE
Inventors: William Everett Brown; Wen-Chih Liu; Edward Meyers; Maxwell William Nimeck
Original assignee: ER Squibb and Sons LLC
Current assignee: ER Squibb and Sons LLC
Priority date: 1974-04-22
Filing date: 1975-04-22
Publication date: 1975-10-30
Also published as: JPS50145593A; FR2267792A1; US3898327A

Description

Priorität: 22. April 1974, V.St.A., Nr. 462 822

Die Erfindung betrifft den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Das neue Antibiotikum Azdimycin wird durch Züchten von Streptomyces diastatochromogenes ATCC 3IOI3 oder einer daraus nach üblichen Methoden erhaltenen Mutante oder Variante unter submers-r aeroben Bedingungen in einem üblichen, assimilierbare Kohlenhydrate und Stickstoffverbindungen enthaltenden Nährmedium gezüchtet. Das Antibiotikum wird aus der Kulturflüssigkeit durch Abfiltrieren des Mycels erhalten. Eine weitere Menge des Antibiotikums kann aus dem Mycel durch Extraktion mit einem Alkohol,

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vorzugsweise Methanol, gewonnen werden. Der Alkoholextrakt wird eingedampft, mit der filtrierten Kulturbrühe vereinigt und sodann nochmals mit einer Alkohollösung extrahiert. Das Antibiotikum wird durch Konzentrieren und chromatographische Reinigung isoliert.

Figur 1 zeigt das IR-AbsorptIonsSpektrum des Antibiotikums als Kaiiumbromid-Preßling.

Figur 2 zeigt das NMR-Spektrum von Azdimycin (DMSO - d^).

Der im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Mikroorganismus der Art Streptomyces wird als Streptomyces diastatochromogenes ATCC 3IOI3 bezeichnet. Eine Kultur dieses Stammes wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, V.St.Α., unter der Nummer ATCC 3IOI3 hinterlegt.

Zur Isolierung und Charakterisierung des Mikroorganismus wurde ein Teil einer Bodenprobe aus New Canton, Few Jersey, V.St.Α., in sterilem destilliertem Wasser geschüttelt und. auf einen Nährboden folgender Zusammensetzung überimpft:

Hefeextrakt 4 g

Malzextrakt 10 g

Dextrose 4- g

Agar 20 g

destilliertes V/asser auf 1000 ml

Das Kahrmedium wird aufweinen pH-Wert von 7?3 eingestellt und 30 Minuten bei 121⁰C sterilisiert« Nach 7- bis IGtägiger Inkubation bei 25⁰C werden Kolonien vco. Streptomyces diastatochromoge-

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nes ATCC ^ΛΟΛ^ isoliert und auf ein Nährmedium gleicher Zusammensetzung tiberimpft.

Der Mikroorganismus ist ein Mitglied der Reihe von Pridham mit grauen Sporen. Er erzeugt eine Sporenmasse mit heller graustichig-brauner Farbe (ISCC Nr. 60), die dem Farbstreifen (3 ge) im Color Harmony Manual entspricht. Es erfolgt reichliche Sporenbildung auf einem Standard International Streptomyces Projekt Mhrmedium ISP-3 (Hafermehlagar). Die Unterseite der Kolonie ist farblos. Es~-"wird kein lösliches Pigment gebildet. Auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (ISP-2) erfolgt reichliche Sporenbildung. Die Sporen sind grau. Die Unterseite der Kolonie ist farblos bis gelbstichig-braun. Es wird kein lösliches Pigment ge bildet. Auf einem anorganische Salze enthaltenden Stärkeagar

erfolgt
(ISP-4)/ebenfalls reichliche Sporenbildung von grauer Farbe. Die Unterseite der Kolonie ist farblos und es bildet sich ebenfalls kein lösliches Pigment.

Mikrobiologisch wird die Sporenmasse auf Sporophoren gebildet, die in langen offenen Spiralen angeordnet sind. Unter dem Elektronenmikroskop sieht die Oberfläche der Sporen glatt aus.

Streptomyces dxastatochromogenes ATCC 3IOI3 zeigt u.a. folgende KuItürmerkmale :

Auf Natriumcaseinat enthaltendem Tyrosinagar wird melanoides Pigment erzeugt. Im Temperaturbereich von 14 bis 36°C gutes vegetatives Wachstum. Das Temperaturoptimum liegt bei 20 bis 25°C. Die Verwertung von Kohlenhydraten, ist nachstehend angegeben:

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- negativer Kontrollversuch + positiver Kontrollversuch

(1)

Minimalme dium

Glucose

Mannit +

Inosit " +

Sorbit

D-XyIose +

L-Arab ino se +

Rhamnose +

Fructose +

Raffinose -

Galactose +

Trehalose +

Melibiose C⁺)

Sucrose . -

Lactose · +

Das in Klammern angegebene Pluszeichen zeigt ein etwas ge-

ringeres Wachstum an, als der positive Kontrollversuch.

Streptomyces diastatochromogenes ATCC 3^013 erzeugt Azdimycin, eine Verbindung mit antibiotischer Wirkung gegenüber Bakterien. Die Züchtung wird vorzugsweise bei einer - Temperatur von etwa 25⁰C unter submsrs-aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium durchgeführt, das assimilierbare Kohlenhydrate und Stickstoff quellen enthält. Die Fermentation wird etwa 60 bis 150 Stunden, vorzugsweise etwa 120 Stunden^durchgeführt. Nach beendeter Fermentation wird die Kulturflüssigkeit mit einer Filtrierhilfe versetzt und filtriert. Das Antibiotikum, wird aus dem Γφ-cel, d.h. dem Filterkuchen, mit. einem. Alkohol, vorzugsweise

_l

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einem niederen Alkohol, wie Methanol, extrahiert. Der Alkoholextrakt wird unter vermindertem Druck eingedampft». Es hinterbleibt eine wäßrige Suspension, die mit der filtrierten Kulturbrühe vereinigt wird. Das Gemisch wird auf einen pH-Wert von etwa 3 angesäuert. Die wäßrige Lösung wird dann mit einer wäßrigen Lösung eines niederen Alkanols, vorzugsweise mit Wasser gesättigtem n-Butanol, extrahiert. Der organische Extrakt wird zu einem Sirup eingedampft. Die weitere Reinigung erfolgt durch Verteilungschromatographie in einer mit Kieselsäure und Cellulose gefüllten Säule mit einem Gemisch von n-Butanol, Äthylacetat und Wasser im Volumenverhältnis 1 :6 :1 als Entwicklungslösungsmittel. Die biologisch aktive Fraktion wird sodann nochmals an Kieselsäure chromatographiert. Die Eluierung wird mit einer Reihe von Lösungsmitteln in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt, nämlich mit einem Gemisch von Benzol und Chloroform im Volumenverhältnis 2:1, mit einem Gemisch von Benzol und Chloroform im Volumenverhältnis 1:1, Chloroform, einem Gemisch von Äthylacetat und Chloroform im Volumenverhältnis 1:1, Äthylacetat, einem Gemisch von Äthylacetat und Methanol im Volumenverhältnis 9:1 und mit einem Gemisch von Äthylacetat und Methanol im Volumenverhältnis 3:1· Die biologisch aktiven Fraktionen werden vereinigt und sodann auf Kieselgelplatten mit einer 12prozentigen Lösung von Methanol in Chloroform als Entwicklungslösungsmittel chromatographiert. Eine unter sichtbarem Licht erscheinende gelbe Bande wird weggeschabt und mit Methanol eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingedampft und zur vollständigen Reinigung nochmals chromatographiert.

4/1100

Aufgrund seiner physikalischen, und chemischen. Eigenschaften hat Azdimycin Ähnlichkeit mit den Antibiotika X5-108 und Mocimycin, jedoch kann es von ihnen unterschieden werden. Das Dünnschichtchromatogramm an Glasfasern, die mit Kieselsäure imprägniert wurden (I.T.L.C, Typ SAi¹, Gelman Instrument Company, Ann Arbor, Michigan, V.St.A.) zeigt folgende Unterschiede zwischen Azdimy-■ ein und. dem Antibiotikum X5108 an:

R_f-¥ert Lösungsmittel Azdimycin X5108

1) Gemisch von Chloroform und

Methanol (Volumenverhältnis 0,4- 0,6

9:1)

2) Gemisch gleicher Volumenteile

Chloroform, Methanol und V/asser, 0,23 0,4-5

untere Phase

Azdircycin unterscheidet sich von Mocimycin in seinem Sauerstoffgehalt, da Mocimycin 4- Sauerstoffatome weniger enthält als Azdimycin. Dieser Unterschied ist wesentlich. Es wurde festgestellt, daß Mocimycin das Des-N-methyl-Derivat des Antibiotikums X5108 ist.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispieli

Schrägröhrchen mit einem Tomatenmark-Hafermehl-Agar werden mit Streptomyces diastatochromogenes ATCC 31013 beimpft. Sodann werden die Schrägröhrchen 10 bis 14- Tage inkubiert und hierauf zum Beimpfen von 100 ml eines Nährmediums■folgender Zusammensetzung verwendet.

L J

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	- 7 -	β	2517853 π
		15
Geröstetes	So j abohnenmehl	15
Hi-Stärke		50
Glucose		0
CoCl₂*6H₂O		10	,005
CaCO _

Destilliertes Wasser auf 1000 ml.

Das Nährmedium wird 30 Minuten bei 121⁰C sterilisiert. Die
Sporulierkolben werden 72 Stunden.bei 25°C auf einer Drehschüttelmaschine inkubiert, die mit einem Hub von 5 cm und 280 U/min betrieben wird.

Aus dem Sporulierkolben wird eine 5volumprozentige Übertragung in 500 ml fassende Erlenmeyer-Kolben durchgeführt, die 100 ml
des vorstehend beschriebenen Nährmediums enthalten.

Die Kolben werden in gleicher Weise wie die Sporulierkolben bebrütet und geschüttelt. Proben werden am dritten, fünften und
sübten Tag entnommen. Das Mycel wird abgeschleudert. Der Überstand wird mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 angesäuert und sodann mit 0,5 Volumen mit Wasser gesättigtem n-Butanol extrahiert. Das Mycel wird mit dem gleichen Volumen Methanol wie der Überstand extrahiert. Beide Extrakte werden durch Dünnschichtchromatographie und durch Bestimmung der antibiotischen Aktivität untersucht. Zur Chromatographie werden geeignete Mengen aif Glasfaserplatten, die mit Kieselsäure imprägniert wurden, aufge tragen und mit der unteren Schicht eines aus Chloroform, Methanol und Wasser im Volumenverhältnis 1:1:1 bestehenden Gemisches entwickelt. In diesem Lösungsmittelsystem hat Azdimycin einen

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E~-Wert von etwa 0,23. Das Antibiotikum wird durch, sein Antibiogramm gegenüber Escherichia coli ATCG 10536 nachgewiesen.

Beispiel 2

Ein 250 Liter Ansatz von Streptomyces diastatochromogenes ATCC 3.IOI3 wird in einem 375 Liter fassenden Edelstahlfermenter unter den nachstehend aufgeführten Bedingungen verarbeitet.

1. Stufe

Inoculum: Kultur von Streptomyces diastatochromogenes. ATCC 31013, die durch Gefriertrocknen in Milch konserviert und auf einem Tomatenmark-Hafermehl -Agar in Schrägröhrchen gezüchtet wurde. Das Oberflächenwachstum eines Schrägröhrchens wird in 11 ml einer 0,01prozentigen Dupanollösung suspendiert und als Inoculum verwendet.

Mhrmedium g

Geröstetes Sojabohnenmehl 15 Hi-Stärke . 15

Glucose 50

CoCl₂-GH^O 0,005

CaGO₅ ^O

destilliertes Wasser auf 1000 ml.

1500 ml dieses Nährmediums in einem 4 Liter fassenden Kolben werden 96 Stunden auf einer. Drehschüttelmaschine inkubiert, die bei einem Hub von 5 cm und 125 U/min betrieben wird.

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2. Stufe

Inoculum: I5OO ml der ersten Stufe.

Nährmedium.: Es wird das gleiche Nährmedium wie in der ersten Stufe verwendet, jedoch unter Zusatz von 0,5 g Ucon LB 625 als Ant i s chaummi11 e1.

30 Liter des das Inoculum enthaltenen Nährmediums werden 96 Stunden inkubiert. Während der Inkubation wird die Kulturflüssigkeit in einer Menge von 0,065 m steriler Luft/min belüftet und in einer Geschwindigkeit von 220 U/min gerührt.

3. Stufe

Inoculum: 12 500 ml aus der zweiten Stufe.

Nährmedium: Es wird das gleiche Nährmedium wie in der zweiten Stufe verwendet.

250 Liter des Nährmediums mit dem Inoculum werden 144 Stunden inkubiert. Während der Inkubation wird die KuItürflüssigkeit in einer Geschwindigkeit von 155 U/min gerührt und in einer Menge von 0,283 m steriler Luft/min belüftet.

Beispiel 3

Aus zwei Ansätzen werden gemäß Beispiel 2 insgesamt 420 Liter KuItürflüssigkeit erhalten,, die mit 22,7 kg rasch filtrierender Diatomeenerde als Filtrierhilfe versetzt werden. Das Gemisch wird abfiltriert. Es werden etwa 125 kg Mycel als Filterrückstand erhalten. Der Filterrückstand wird mit Wasser gewaschen, und die Waschlösungen werden mit dem FiItrat vereinigt. Es wer-. den 450 Liter Lösung erhalten. _j

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Beispiel 4

Der in Beispiel 3 erhaltene Filterrückstand (125 kg) wird dreimal mit jeweils 100 Liter Methanol extrahiert. Nach jeder Extraktion wird der Filterkuchen filtriert. Die Methanolextrakte werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 3,5 Liter eingedampft. Die erhaltene wäßrige Saspension wird zu den 450 Liter des in Beispiel 3 erhaltenen Filtrats gegeben.

Beispiel 5

Die vereinigten wäßrigen Schichten werden mrt 1000 ml konzentrierter Salzsäure auf einen pH-Wert von 3 eingestellt und sodann dreimal mit jeweils I50 Liter mit Wasser gesättigtem n-Butanol extrahiert. Die vereinigten Butanolextrakte ergeben 219,5 Liter, die unter vermindertem Druck auf 4 Liter eingedampft werden. Ein Anteil von etwa 800 ml des Butanolkonzentrats wird nochmals unter vermindertem Druck eingedampft. Es werden etwa 100 g eines viskosen Sirups erhalten, der der Verteilungschromatographie unterworfen wird.

Et v/a 400 g Kieselsäure werden gründlich mit 200 g Cellulosepulver und sodann mit 50 ml der unteren Schicht eines aus n-Butanol, Äthylacetat und Wasser im Volumenverhältnis 1:6:1 bestehenden Gemisches vermischt. Das benetzte Adsorptionsmittelgemisch wird mit einem Überschuß der oberen Schicht des Lösungsmittelsystems versetzt. Die entstandene Aufschlämmung wird in eine Chromatographie-Säule aus Glas gefüllt. Die Abmessungen des Adsorptionsbettes betragen 6 χ 60 cm.

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Etwa 100 g des vorstehend beschriebenen Sirups werden in 20 ml der unteren Schicht des oben beschriebenen Lösungsmittelsystems gelöst. Diese Lösung wird mit 20 g des Gemisches aus Kieselsäure ' und Cellulose, das für die Chromatographie-Säule verwendet wurde, versetzt. Das Gemisch wird im Überschuß der oberen Schicht des Lösungsmittelsystems eingeschlämmt und am Kopf der Säule eingefüllt. Die Säule wird mit der oberen Schicht des vorstehend beschriebenen Lösungsmittelsystems entwickelt. Es werden Fraktionen von jeweils 50 ml aufgefangen und auf ihre antibiotische Aktivität nach dem Blättchentest gegen Escherichia coli ATCC 10536 untersucht. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Es werden 20 g Produkt erhalten.

Beispiel 6

20 g des in Beispiel 5 erhaltenen Produkts werden in 20 ml eines Gemisches von Benzol und Chloroform im Volumenverhältnis 2:1 gelöst und auf eine mit Kieselsäure gefüllte Säule mit den Abmessungen 4 χ 60 cm gegeben, die mit 200 g Kieselsäure in einem Gemisch von Benzol und Chloroform im Volumenverhältnis 2:1 eingeschlämmt wurde. Zunächst wird die Säule mit 0,5 Liter des gleichen Lösungsmittelgemisches, das zum Aufschlämmen der Kieselsäure verwendet wurde, sodann mit 0,5 Liter eines Gemisches gleicher Volumenteile Benzol und Chloroform, mit 0,5 Liter Chloroform, 0,5 Liter eines Gemisches gleicher Volumenteile Chloroform und Äthylacetat, sodann mit 0,5 Liter Äthylacetat, 0,5 Liter eines Gemisches von Äthylacetat und Methanol im Volumenverhältnis 9:1 und schließlich mit 0,5 Liter eines Gemisches von Äthylacetat und Methanol im Volumenverhältnis 3:1 eluiert. Die

L . -I

bei der Chromatographie anfallenden Fraktionen von jeweils 15 ml werden auf ihre antibiotische Aktivität nach dem Blättchentest gegen Escherichia coli ATCC 10536 untersucht. Die aktiven Fraktionen werden vereinigt und zur Trockne eingedampft. Es werden etwa 3 S Produkt erhalten.

Beispiel 7

Das in Beispiel 6 erhaltene Produkt (3g) wird in 10 ml Methanol gelöst und in einem Abstand von etwa 2 cm vom Boden auf 1000 ,u dicke Kieselgelplatten mit den Abmessungen 20 χ 20 cm aufgetragen. Die Platten werden mit einer 12prozentigen Lösung von Methanol in Chloroform entwickelt. Das Azdimycin erscheint als dunkle Bande im UV-Licht (254 nm Lampe) und als gelbe Bande im sichtbaren Licht. Der E_f-Wert beträgt etwa 0,25. Diese Bande wird von der Platte abgekratzt und das Kieselgel mit Methanol eluiert. Das Methanoleluat wird zur Trockne eingedampft, der Eückstand in einer geringen Menge Methanol nochmals gelöst und erneut auf die vorstehend beschriebene Weise an Kieselgelplatten chromatographiert. Dieses Verfahren kann noch ein- oder zweimal wiederholt werden, um die Reinigung zu vervollständigen. Ausbeute 150 mg reines Azdimycin.
Aussehen: gelbliches, amorphes Pulver. Analyse: -C 59,95%; H 7,25%; H" 3,05%. UV-Absorptionsspektrum: Maximum in Methanol bei 233 nm (E

900) und 323 nm (E^_m = 4-50);

1% Maximum in verdünnter Salzsäure bei 233 nm (E^ = 900) und

34-5 nm (E^_m = 450).
F. 180 bis 182°C.

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Molekulargewicht 850 (durch das Massenspektrogramm bestimmt); Löslichkeit: löslich in Methanol und Äthanol,

unlöslich, in Wasser, Benzol und Diäthylather;

Summenformel: ^C43H₆₀_62^lT2⁰16

IR-Absorptionsspektrum: vgl. Figur 1

NMR-Spektrum: vgl. Figur 2

Farbreaktion: positive Reaktion mit ITinhydrin,

braune Färbung bei Behandlung mit einer Lösung von Eisen(III)-chlorid in Methanol, dunkelbraune Färbung mit Anthron, keine Farbänderung bei Behandlung mit einer Lösung von Chlorwasserstoff in Methanol .

Das Antibiotikum Azdimycin eignet sich zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten, die beispielsweise durch Streptococceri, wie Streptococcus pyogenes, hervorgerufen werden.Das Antibiotikum kann zur Desinfektion, beispielsweise als Spray oder Stäubemittel mit einer Wirkstoffkonzentration bis zu 1%,in Form von Cremes oder Salben mit einer Wirkstoffkonzentration bis zu 1% oder als Injektionspräparat eingesetzt werden.

Beispiel 8

Das in Beispiel 7 erhaltene Produkt wird nach, dem Röhrchentest (zweifache Verdünnung) in seiner antibiotischen Aktivität gegenüber verschiedenen Mikroorganismen untersucht. Es werden folgende Ergebnisse erhalten.

L -J

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Testorganismus

25	17853	ml
minimale Hemmkonzen-
tration, ψ/\	,03
-τ 50	,3
0
6
> 50
7 50	,5
> 50
12

Staphylococcus aureus 209P
Streptococcus pyogenes- C203
Escherichia coli ATCC 10536
Escherichia coli SC 8294·*
Pseudomonas aeruginosa SC 8329
Candida albicans SC 5314*
Trichomonas vaginalis SC 560*

(*) Squibb KuItürSammlung

Beispiel 9

Mäusen wird intraperitoneal eine Dosis von 1000 LD von Streptococcus pyogenes C 203 injiziert. 1 und 5 Stunden nach der Injektion wird den Tieren subcutan das in Beispiel 7 erhaltene reine Produkt injiziert. -Etwa 100 bis 200 mg/kg des erfindungsgemäßen Antibiotikums sind ausreichend, um 50% der Mäuse am Leben zu erhalten.

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Claims

Patentansprüche

Λ »j Azdimycin, mit dem ΙΕ-Absorptionsspektrum gemäß Figur 1 (KBr-Preßling), dem NMR-Spektrum (DMSO-dg) gemäß Figur 2, den UV-Absorptionsmaxima in Methanol bei 233 nm (E . = 900)

Λ%
und 323 nm (E/ = 450) und in verdünnter Salzsäure bei 233

ΛΟ/ AO/

^{= 9}°° ^{und 5}^ ^nm (^Eicm ^{= 4}^O), einem Schmelzpunkt von

etwa 180 bis 182°C_} einem Molekulargewicht (Massenspektrum) von etwa 850 und der Summenformel
2. Verfahren zur Herstellung von Azdimycin, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptomyces diastatochromogenes ATCC ~$ΛΟΛ~$ oder eine daraus nach üblichen Methoden erhaltene Mutante oder Variante unter submers-aeroben Bedingungen in einem üblichen, assimilierbare Kohlenhydrate und Stickstoffverbindungen enthaltenden Nährmedium züchtet und das Antibiotikum aus der Gär maische isoliert und reinigt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung bei etwa 25°C durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung während eines Zeitraums von etwa 60 bis I50 Stunden durchführt.
5. Arzneimittel, bestehend aus einer Verbindung gemäß Anspruch und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/ oder Hilfsstoffen.