DE69931633T2

DE69931633T2 - Mumbaistatin, verfahren zu seiner herstellung sowie seine verwendung als arzneimittel

Info

Publication number: DE69931633T2
Application number: DE69931633T
Authority: DE
Inventors: Nirogi Venkata Satya Mulund RAMAKRISHNA (West); Keshavapura Hosamane Sreedhara Mulund SWAMY (West); Erra Koteswara Satya Vijaya Mulund KUMAR (West); Manoj Maniram Singh Naupada KUSHWAHA; Sridevi Andheri KOTA (East); Mythili Mulund RAMAN (West); Swati Dhananjay Santacruz TARE (E); Sunil Kumar Thane 400 601 DESHMUKH; Dietmar Schummer; Michael Kurz; Herbert Kogler
Original assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Current assignee: Sanofi Aventis Deutschland GmbH
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-06-15
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2019-06-16
Also published as: WO1999067408A1; TR200003570T2; AU4513799A; HUP0102370A2; US6297043B1; CA2336135A1; PL345192A1; AU750509B2; ATE328103T1; JP2002518057A; HUP0102370A3; DE69931633D1; BR9912200A; RU2221870C2; ID27411A; CN1306580A; JP4287593B2; KR20010071564A; EP1090136B1; AR020328A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung namens Mumbaistatin, welche durch Kultur des Mikroorganismus HIL-008003 (DSM 11641) erhalten werden kann, sowie deren pharmazeutisch annehmbare Salze und Derivate. Mumbaistatin ist ein Glucose-6-phosphat-Translocase-Hemmer und kann bei der Behandlung von Diabetes mellitus eingesetzt werden. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung von Mumbaistatin, den Mikroorganismus HIL-008003 (DSM 11641), die Verwendung von Mumbaistatin und von dessen pharmazeutisch annehmbaren Salzen und Derivaten als Arzneimittel, insbesondere deren Verwendung bei der Behandlung von Diabetes mellitus, sowie pharmazeutische Zusammensetzungen, die Mumbaistatin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Derivat von dieser Verbindung enthalten.
Eine erhöhte Glucoseausstoßrate der Leber ist ein allgemeines Symptom von Diabetes mellitus. Insbesondere besteht bei nicht insulinabhängigem Diabetes mellitus (NIDDM) ein enger Zusammenhang zwischen dem Plasmaglucosespiegel in nüchternem Zustand und dem Glucoseausstoß der Leber. Die zwei Wege der Glucosebildung der Leber heißen Gluconeogenese und Glykogenolyse. Der letzten Schritte der beiden Wege werden durch die mikrosomale Glucose-6-phosphatase katalysiert, ein Schlüsselenzym in der homöostatischen Regulierung des Blutglucosespiegels. Sowohl in experimentellen als auch in pathologischen Diabeteszuständen hat sich der Spiegel dieses Enzyms ebenfalls als erhöht erwiesen. Ein Eingriff in dieses Enzymsystem sollte daher eine Verringerung der Glucosebildung in der Leber bewirken.
Die Glucose-6-phosphatase der Leber ist ein Mehrkomponentensystem, das mindestens drei funktionelle Aktivitäten umfasst: Eine Glucose-6-phosphat-Translocase (T1), ein Glucose-6-phosphat- Phosphohydrolase und eine Phosphat/pyrophophat-Translocase (T2). Die Glucose-6-phosphat-Translocase erleichtert den Transport von Glucose-6-phosphat in das Lumen des endoplasmatischen Reticulums (ER). Die Phosphohydrolase, deren Wirkbereich sich auf der dem Lumen zugewandten Seite des ER befindet, hydrolysiert Glucose-6-phosphat und setzt Glucose und Phosphat in das Lumen frei. Obgleich die Phosphatfreisetzung durch die Phosphat/pyrophophat-Translocase erleichtert wird, ist der genaue Mechanismus der Glucosefreisetzung noch nicht geklärt.
Aufgrund ihrer hohen Substratspezifizität stellt die Glucose-6-phosphat-Translocase ein potentielles Zielsystem für einen pharmakologischen Eingriff bei der Behandlung von Diabetes mellitus dar. Neben physiologisch auftretenden Zuckerphosphaten wird nämlich ausschließlich Glucose-6-phosphat von der Translocase transportiert. Die Phosphatase hingegen wirkt unspezifisch und hydrolysiert bekanntermaßen eine Vielzahl von organischen Phosphatestern.
Eine Reihe von unspezifischen Glucose-6-phosphatase-Hemmern sind in der Literatur beschrieben, z.B. Phlorrhizin (J. Biol. Chem. 242, 1955-1960 (1967)), 5,5'-Dithio-bis-2-nitrobenzoesäure (Biochem. Biophys. Res. Commun. 48, 694-699 (1972)), 2,2'-Diisothiocyanatostilben und 2-Isothiocyanato-2'-acetoxystilben (J. Biol. Chem. 255, 1113-1119 (1980)). Die ersten therapeutisch nutzbaren Hemmer des Glucose-6-phosphatase-Systems werden in den Europäischen Patentanmeldungen EP-A-587 087 und EP-A-587 088 vorgeschlagen. Die Kodaistatine A, B, C und D, die in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO98/47888 beschrieben sind, stellen die ersten Glucose-6-phosphat-Translocase-Hemmer mikrobieller Herkunft dar.
Es ist gegenwärtig entdeckt worden, dass aus einer andersartigen mikrobiellen Quelle eine neue Verbindung mit hoher Glucose-6-phosphat-Translocase-Hemmungsaktivität gewonnen werden kann, und diese Verbindung wurde Mumbaistatin genannt. Die vorliegende Erfindung betrifft somit eine Verbindung namens Mumbaistatin mit der Molekülformel C₂₈H₂₀O₁₂, die durch eine beliebige oder mehrere ihrer unten angegebenen physikalisch-chemischen und spektralen Eigenschaften, wie etwa durch ihre ¹H-NMR-spektroskopischen Daten, die im ¹H-NMR-Spektrum der 9 dargestellt sind, und ihre ¹³C-NMR-spektroskopischen Daten, die im ¹³C-NMR-Spektrum der 10 dargestellt sind, gekennzeichnet ist, sowie die pharmazeutisch annehmbaren Salze und Derivate dieser Verbindung, wie etwa die Ester die Ether und die offensichtlichen chemischen Entsprechungen, einschließlich sämtlicher stereoisomerer Formen und sämtlicher tautomerer Formen.
Mumbaistatin weist eine bislang unbekannte neuartige Struktur auf, die zur Stoffklasse der Chinone gehört. Eine Literatursuche in den "Chemical Abstracts" unter Verwendung der Molekülformel als Suchbegriff bestätigte, dass es sich bei Mumbaistatin um eine neuartige Verbindung handelt. Keine andere Verbindung wies die strukturellen Eigenschaftsmerkmale von Mumbaistatin auf.
Mumbaistatin kann durch Kultur eines Mikroorganismus, der als Kultur Nr. HIL-008003 oder auch auf Kultur Nr. Y-9645974 bezeichnet wird (im Folgenden wird die Bezeichnung HIL-008003 verwendet), gewonnen werden. Dieser Mikroorganismus, der zur Gewinnung von Mumbaistatin benutzt wird, wurde aus einer Bodenprobe isoliert, die aus dem Flussbett des Hiranyakeshi in der Nähe von Amboli, Maharashtra in Indien stammt. Der Mikroorganismus HIL-008003 wurde als Streptomyces litmocidini identifiziert. Der Mikroorganismus wurde am 4. Juli 1997 bei der DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1b, D-38124, Braunschweig, Deutschland – hinterlegt und trägt die Eingangsnummer DSM 11641.
Die vorliegende Erfindung stellt somit darüber hinaus ein Verfahren zur Herstellung der neuartigen Verbindung namens Mumbaistatin und deren pharmazeutisch annehmbaren Salzen und Derivaten durch die Streptomyces-Art HIL-008003 und ihre Mutanten und Varianten bereit. Das Verfahren umfasst die Anzucht der Kultur Nr. HIL-008003 und ihrer Mutanten und Varianten unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das eine oder mehrer Kohlenstoffquellen, eine oder mehrere Stickstoffquellen und wahlweise anorganische Nährsalze und/oder Spurenelemente enthält, sowie die anschließende Isolierung und Aufreinigung der Verbindung in einer herkömmlichen Art und Weise.
Vorzugsweise enthält das Nährmedium Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und Quellen anorganischer Salze sowie wahlweise Spurenelemente. Bei den Kohlenstoffquellen kann es sich zum Beispiel um Stärke, Glucose, Saccharose, Dextrin, Fructose, Molasse, Glycerin, Lactose oder Galactose handeln, wobei Glucose bevorzugt wird. Bei den Stickstoffquellen kann es sich zum Beispiel um Sojamehl, Erdnussmehl, Hefeextrakt, Rindfleischextrakt, Pepton, Trypton, Malzextrakt, Maisquellwasser, Gelatine oder Casaminosäuren handeln, wobei Sojamehl und Maisquellwasser bevorzugt werden. Bei den anorganischen Nährsalze und Spurenelementen handelt es sich zum Beispiel um Natriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Kobaltchlorid, Calciumchlorid, Calciumcarbonat, Kaliumnitrat, Ammoniumsulfat oder Magnesiumsulfat, wobei Kobaltchlorid und Calciumcarbonat bevorzugt werden.
Die Anzucht der Kultur Nr. HIL-008003 wird üblicherweise bei Temperaturen zwischen 25 und 30°C und einem pH-Wert zwischen 6,0 und 8,0 durchgeführt. Vorzugsweise erfolgt die Anzucht von Kultur Nr. HIL- 008003 bei 27 °C (±1 °C) und einem pH-Wert von 7,0.
Wenn eine optimale Ausbeute des Mumbaistatins der vorliegenden Erfindung erreicht ist, wird die Fermentation von HIL-008003 vorzugsweise für eine Dauer von ungefähr 40 bis 70 Stunden durchgeführt. Es ist besonders bevorzugt, die Fermentation für eine Dauer von ungefähr 40 bis 48 Stunden zum Beispiel in Schüttelkolben oder auch in Laborfermentern durchzuführen, wobei die Kultur von Flüssigkeit bedeckt ist. Bei Bedarf kann ^®Desmophen (Polypropylenoxid) in den Fermentern als Schaumverhüter verwendet werden. Das Voranschreiten der Fermentation und die Bildung von Mumbaistatin können nachgewiesen werden, indem die Hemmung der Glucose-6-phosphat-Translocase-Aktivität in unbehandelten und mit ^®Triton X-100 aufgeschlossenen Rattenlebermikrosomen auf Mikrotiterplatten bei Raumtemperatur gemessen wird, wobei ein colorimetrischer Assay mit einigen Abänderungen benutzt wird, der in Methods in Enzymology 174, 58-67 (1989) beschrieben ist. In der erhaltenen Kulturbrühe befindet sich das Mumbaistatin in erster Linie im Filtrat und kann daher durch Extraktion des Kulturfiltrats bei einem pH-Wert von 5 bis 8 mit einem Lösemittel, das mit Wasser nicht mischbar ist, wie beispielsweise Ethylacetat, Dichlormethan, Chloroform oder Butanol gewonnen werden, oder aber mittels Chromatographie mit hydrophoben Wechselwirkungen unter Verwendung von Polymerharzen wie etwa ^®Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japan), und ^®Amberlite XAD (Rohm and Haas Industries, U.S.A.) oder von Aktivkohle, oder es kann mittels Ionenaustauschchromatographie bei einem pH-Wert von 5 bis 8 gewonnen werden. Das bevorzugte Verfahren ist die Adsorption an ^®Diaion HP-20 mit anschließender Desorption der Verbindung, wobei Eluenten wie etwa Wasser, Methanol, Aceton, Acetonitril, n-Propanol, Isopropanol oder Kombinationen dieser Verbindungen verwendet werden. Durch Aufkonzentrierung und Gefriertrocknung des Wirkstoffeluats wird eine Rohform der Verbindung erhalten.
Dieser Rohstoff kann durch Anwendung einer beliebigen der folgenden Techniken weiter aufgereinigt werden: Normalphasen Chromatographie mit Aluminiumoxid oder Kieselgel als stationäre Phase und Eluenten wie etwa Ethylacetat, Chloroform, Methanol oder Kombinationen dieser Verbindungen; Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung von Umkehrphasenkieselgelen wie Dimethyloctadecylsilyl-Kieselgel, auch als RP-18 bezeichnet, oder Dimethyloctylsilyl-Kieselgel, auch als RP-8 bezeichnet, als stationäre Phase und Eluenten wie etwa Wasser, Puffern wie etwa Phosphat, Acetat, Citrat (pH-Wert 2 bis 8) und organischen Lösungsmitteln wie etwa Methanol, Acetonitril, Aceton, Tetrahydrofuran oder Kombinationen dieser Verbindungen; Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Harzen wie etwa ^®Sephadex LH 20 (Pharmacia Chemical Industries, Sweden), TSKgel ^®Toyopearl HW-40F (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japan) in Lösemitteln wie etwa Methanol, Chloroform, Aceton, Ethylacetat oder Kombinationen dieser Lösemittel oder aber ^®Sephadex G-10 und G-25 in Wasser; Gegenstromchromatographie unter Verwendung eines zweiphasigen Eluentensystems, das aus zwei oder mehr Lösemitteln wie etwa Wasser, Methanol, Ethanol, Isopropanol, n-Propanol, Tetrahydrofuran, Aceton, Acetonitril, Dichlormethan, Chloroform, Ethylacetat, Petrolether, Benzol oder Toluol besteht. Diese Techniken können wiederholt angewendet werden, oder es kann eine Kombination der verschiedenen Techniken angewendet werden. Das bevorzugte Verfahren ist Chromatographie mit ^®Toyopearl, gefolgt von umkehrphasenmodifiziertem Kieselgel (RP-18).
Die Verbindung Mumbaistatin kann zu pharmazeutisch annehmbaren Salzen und Derivaten umgesetzt werden. Unter den Derivaten des Mumbaistatins sind Ester und Ether zu verstehen. Die Erfindung deckt auch sämtliche Salze und Derivate des Mumbaistatins ab, die an sich nicht zur Verwendung als Arzneimittel geeignet sind, aber die als Zwischenprodukte in der Herstellung von pharmazeutisch annehmbaren Salzen und Derivaten verwendet werden können. Die Erfindung erstreckt sich auf Mumbaistatin und sämtliche seiner Salze und Derivate in all ihren stereoisomeren Formen und tautomeren Formen. Die Salze und Derivate können nach Standardverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Salze wie Natrium- und Kaliumsalze, zum Beispiel, können hergestellt werden, indem das Mumbaistatin mit geeigneten Natrium- oder Kaliumbasen behandelt wird.
Ester können zum Beispiel hergestellt werden, indem Mumbaistatin in Gegenwart von Reagenzien wie etwa Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) mit Carbonsäuren umgesetzt wird, oder durch Behandlung der Verbindung mit Acylierungsmitteln wie etwa Säurechloriden. Weitere Verfahren zur Herstellung von Ester finden sich in der Literatur, zum Beispiel in J. March, Advanced Organic Synthesis, 4. Ausgabe, John Wiley & Sons, 1992.
Zu den Mumbaistatinestern, die von der vorliegenden Erfindung abgedeckt werden, gehören intramolekulare Ester, d.h. Lactone. Von einer als L970860 bezeichneten Verbindung sowie ihren pharmazeutisch annehmbaren Salzen und Derivaten in sämtlichen stereoisomeren und tautomeren Formen sei spezifisch erwähnt, dass sie Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Bei der Verbindung L970860 handelt es sich um ein Lacton, das durch Behandlung von Mumbaistatin mit Trifluoressigsäure erhalten werden kann. Es hat die Molekülformel C₂₈H₁₈O₁₁ und ist durch eine beliebige oder mehrere ihrer unten angegebenen physikalisch-chemischen und spektralen Eigenschaften, wie etwa durch ihre ¹H-NMR-spektroskopischen Daten, die im ¹H-NMR-Spektrum der 7 dargestellt sind, und ihre ¹³C-NMR-spektroskopischen Daten, die im ¹³C-NMR-Spektrum der
8 dargestellt sind, gekennzeichnet ist. Die Lactonbildung bei der Umwandlung von Mumbaistatin zu L970860 kann zum Zwecke Isolierung oder Aufreinigung des Mumbaistatins genutzt werden.
Ether können zum Beispiel hergestellt werden, indem Mumbaistatin unter basischen Bedingungen mit Alkylierungsmitteln umgesetzt wird. Weitere Verfahren zur Herstellung von Ether finden sich in der Literatur, zum Beispiel in Advanced Organic Synthesis, 4. Ausgabe, J. March, John Wiley & Sons, 1992.
Mumbaistatin hemmt sehr wirkungsvoll die mikrosomale Glucose-6-phosphat-Translocase aus Rattenleber. Die in pharmakologischen Versuchen erzielten Ergebnis sind unten aufgeführt. Mumbaistatin und seine pharmazeutisch annehmbaren Salze und Derivate sind daher als pharmazeutische Wirkstoffe von Nutzen, insbesondere bei der Behandlung von Diabetes mellitus, und im Allgemeinen bei der Behandlung oder Prophylaxe von Zuständen, die durch eine erhöhte Aktivität der Glucose-6-phosphat-Translocase verursacht oder damit in Verbindung gebracht werden, oder von Zuständen in welchen eine Verringerung der Glucose-6-phosphat-Translocase-Aktivität beabsichtigt ist. Mumbaistatin und seine pharmazeutisch annehmbaren Salze und Derivate können Tieren, vorzugsweise Säugetieren, und insbesondere Menschen als alleiniges Arzneimittel oder in Mischung untereinander verabreicht werden, oder sie können in Form von pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, welche sich zur enteralen oder parenteralen Verabreichung eignen. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung Mumbaistatin und seine pharmazeutisch annehmbaren Salze und Derivate zur Verwendung als Arzneimittel sowie die Verwendung von Mumbaistatin und von dessen pharmazeutisch annehmbaren Salzen und Derivaten zur Herstellung von Medikamenten zur Verringerung der Glucose-6-phosphat-Translocase-Aktivität, insbesondere zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung von Diabetes mellitus. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine wirksame Menge an Mumbaistatin und/oder eines oder mehrerer seiner pharmazeutisch annehmbaren Salze und/oder Derivate gemeinsam mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägerstoff enthalten.
Mumbaistatin kann oral, intramuskulär, intravenös oder mittels anderer Verabreichungsverfahren verabreicht werden. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die Mumbaistatin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Derivat dieser Verbindung einzeln oder in Kombination enthalten, können nach Standardverfahren durch Mischen der Verbindung(en) mit einem oder mehreren pharmakologisch annehmbaren Trägerstoffen und/oder Hilfsstoffen wie beispielsweise Füllstoffen, Emulgatoren, Gleitmitteln, Mitteln zur Geschmacksmaskierung, Farbstoffen oder Puffersubstanzen sowie durch Verarbeiten der Mischung zu einer geeigneten pharmazeutischen Form wie beispielsweise Tabletten, Filmtabletten, Kapseln oder einer enteral oder parenteral verabreichbaren Suspension oder Lösung hergestellt werden.
Als Beispiele für Hilfsstoffe und/oder Trägerstoffe wären Stärke, Tragant, Lactose, Talkum, Agar-Agar, Polyglykole, Ethanol und Wasser zu nennen. Wässrige Suspensionen oder Lösungen sind zur parenteralen Verabreichung geeignet und werden in diesem Fall bevorzugt. Es ist ebenfalls möglich, die Wirksubstanzen in reiner Form, ohne Trägerstoffe oder Verdünnungsmittel, in geeigneter Form, zum Beispiel in Kapseln, zu verabreichen. Pharmazeutische Zusammensetzung, die Mumbaistatin oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz oder Derivat dieser Verbindung umfassen, können auch weitere pharmazeutisch wirksame Bestandteile enthalten.
Wie üblich hängen die galenische Formulierung, das Verabreichungsverfahren und die für einen bestimmten Fall geeignete Dosierung von der behandelten Art und vom Stadium der betreffenden Krankheit oder des betreffenden Zustand ab, wobei die Optimisierung unter Anwendung von Verfahren erfolgen kann, die innerhalb des Fachgebietes bekannt sind.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der vorliegenden Erfindung, schränken aber deren Geltungsbereich nicht ein.
Abkürzungen: MeOH Methanol; DMSO Dimethylsulfoxid; TFA Trifluoressigsäure Beispiel 1 Isolierung der Kultur HIL-008003 aus dem Boden (a) Zusammensetzung des Nährmediums zur Isolierung

Maisstärke: 10,0 g

Kasein: 1,0 g

Pepton: 1,0 g

Hefeextrakt: 1,0 g

K₂HPO₄: 0,5 g

Agarpulver: 13,0 g

Entmineralisiertes: 1,0 Liter

Wasser

pH-Wert: 7,5
(b) Bodenkultur und Isolierung
10 g Boden, der dem Flussbett des Hiranyakeshi in der Nähe von Amboli, Maharashtra in Indien entnommen wurde, wurde in 90 ml sterilisiertes entmineralisiertes Wasser in einem 250 ml Erlenmeyerkolben gegeben und dann 2 Stunden lang auf einem Drehschüttler (200 U/min.) geschüttelt. Von der oben genannten Bodensuspension wurde in Zehnerpotenzen eine Verdünnungsreihe bis 10^–5 hergestellt. Von der letzten Verdünnung wurde 1 ml Suspension in die Mitte einer sterilen Petrischale (Durchmesser 15 cm) aus Glas gegeben, in welche dann ungefähr 50 ml des oben genannten Isolierungsmediums, dem 25 μg/ml Amphotericin B als Antimykotikum zugesetzt wurde, eingegossen wurden. Vor dem Eingießen war das Medium wurde auf 45 °C gekühlt worden, und die Schale wurde gründlich geschwenkt. Nach dem Absetzenlassen der Mischung aus der Bodensuspension und dem Medium wurde diese 7 Tage lang bei 28 °C (±1°C) bebrütet. Die Petrischale wurde regelmäßig in Augenschein genommen und der Mikroorganismus Nr. HIL-008003 (Kultur Nr. Y-9645974) wurde aus den wachsenden Mikroorganismen isoliert.
Beispiel 2
Weiterzucht der Kultur HIL-008003
Die Kultur Nr. HIL-008003 wurde in folgendem Medium weiterkultiviert:

Malzextrakt: 10,0 g

Hefeextrakt: 4,0 g

Glucose: 4,0 g

Agarpulver: 13,0 g

Entmineralisiertes: 1,0 Liter

Wasser

pH-Wert: 7,0
Nach gründlichem Auslösen der oben genannten Bestandteile unter Erhitzen, wurde das Medium auf Reagenzgläser verteilt und dann 20 Minuten lang bei 121 °C sterilisiert. Anschließend wurden die Reagenzgläser abgekühlt und zur Erstarrung in Schräglage gebracht. Die Schrägager-Ansätze wurden mittels einer Drahtschlaufe mit der gewachsenen Kultur Nr. HIL-008003 bestrichen und bei 28 °C (±1°C) bebrütet, bis sich ein gutes Wachstum zeigte. Die gewachsenen Kulturen wurden im Kühlschrank bei 8 °C gelagert. Beispiel 3 Fermentation der Kultur HIL-008003 in Schüttelkolben Zusammensetzung des Impfmediums:

Glucose: 15,0 g

Sojamehl: 15,0 g

Maisquellwasser: 5,0 g

NaCl: 5,0 g

CaCO_3: 2,0 g

Entmineralisiertes: 1,0 Liter

Wasser

pH-Wert: 7,0
Das oben genannte Impfmedium wurde in Mengen von je 80 ml auf 500 ml fassende Erlenmeyerkolben verteilt und 20 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert. Die Kolben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt, worauf jeder Kolben mit einer Schlaufe voll von der oben genannten gewachsenen Kultur aus Beispiel 2 beimpft wurde, um dann zur Herstellung einer Impfkultur 72 Stunden lang bei 27 °C (±1 °C) auf einem Drehschüttler mit 240 U/min. geschüttelt zu werden. Zusammensetzung des Produktionsmediums

Glucose: 20,0 g

Sojamehl: 10,0 g

CaCO₃: 0,2 g

Kobaltchlorid: 0,001 g

Entmineralisiertes: 1,0 Liter

Wasser

pH-Wert: 7,0 g
Das Produktionsmedium wurde in Mengen von je 60 ml auf 500 ml fassende Erlenmeyerkolben verteilt und 20 Minuten lang bei 121 °C autoklaviert. Die Kolben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt und dann mit der oben genannten Impfkultur beimpft (1 % v/v). Die Fermentation wurde 40–48 Stunden lang auf einem Drehschüttler mit 240 U/min. und bei einer Temperatur von 27 °C (±1 °C) durchgeführt.
Die Produktion von Mumbaistatin wurde kontrolliert, indem die Hemmung von Glucose-6-phosphat-Translocase gemessen wurde. Nach dem Ende der Produktionsphase wurde die Kulturbrühe zentrifugiert, und Mumbaistatin wurde wie in Beispiel 5 beschrieben aus dem Kulturfiltrat isoliert und aufgereinigt.
Beispiel 4
Fermentation der Kultur HIL-008003 in Fermentern
Schritt 1: Herstellung der Impfkultur in Schüttelkolben
Das Impfmedium aus Beispiel 3 wurde in Mengen von je 160 ml auf 1 L fassende Erlenmeyerkolben verteilt und 20 Minuten lang autoklaviert. Wie in Beispiel 3 beschrieben, wurde die Impfkultur in diesen Kolben gezüchtet.
Schritt 2: Herstellung der Impfkultur im Fermenter
80 Liter des in Beispiel 3 beschriebenen Impfmediums wurden in einem 100 Liter fassenden Marubishi-Fermenter 45 Minuten lang bei 121 °C in situ sterilisiert, auf 27 °C ±1°C abgekühlt und mit 4,5 Litern der oben genannten Impfkultur beimpft.
Die Fermentation wurde mit den folgenden Parametern betrieben:

Temperatur: 27 °C (±0,5 °C)

Rührgeschwindigkeit: 80 U/min.

Belüftung: 50 l/min.

Fermentationsdauer: 24 Stunden
Schritt 3: Fermentation in großem Maßstab
700 Liter des in Beispiel 3 beschriebenen Produktionsmediums wurden in einem 1000 Liter fassenden Marubishi-Fermenter nach Zusatz von 150 ml of ^®Desmophen (Polypropylenoxid) als Schaumverhüter 45 Minuten lang bei 121 °C in situ sterilisiert, auf 27 °C ± 1 °C abgekühlt und mit 75 Litern der Impfkultur aus Schritt 2 beimpft.
Die Fermentation wurde mit den folgenden Parametern betrieben:

Temperatur: 27 °C (±0,5 °C)

Rührgeschwindigkeit: 50 U/min.

Belüftung: 450 l/min.

Produktionsdauer: 40–44 Stunden
Die Produktion der Verbindung wurde kontrolliert, indem die Hemmung von Glucose-6-phosphat-Translocase gemessen wurde. Bei Abbruch der Fermentation betrug der pH-Wert der Kulturbrühe 6,0 bis 7,0. Die Kulturbrühe wurde nach Fermentationsende zentrifugiert und der Glucose-6-phosphat-Translocase-Hemmer Mumbaistatin wurde wie unten in Beispiel 5 beschrieben aus dem Kulturfiltrat isoliert.
Beispiel 5
Isolierung und Aufreinigung von Mumbaistatin
Ungefähr 1000 Liter der Kulturbrühe wurden nach Beendigung der Fermentation durch Zentrifugation vom Myzel (12 kg) getrennt. Es zeigte sich, dass die Zielverbindung Mumbaistatin sich in erster Linie im Kulturfiltrat befindet. Das Kulturfiltrat (730 Liter) wurde auf eine mit ^®Diaion HP-20 (28 Liter, 3-4 % v/v) gefüllte Säule gegeben. Die Säule wurde gründlich mit entmineralisiertem Wasser (250 Liter) gewaschen und dann mit einem stufenweisen Gradienten mit MeOH in Wasser eluiert. Auf diese Weise wurde mit 10 % MeOH (120 Liter) und mit 40 % MeOH (300 Liter) eluiert. Die aufgefangenen Fraktionen hatten ein Volumen von jeweils 15 Litern. Die mit 40 % MeOH erhaltenen Wirkstoffeluate (15 × 16 Liter) wurden vereint, unter reduziertem Druck von 10-100 mm Hg bei 35 °C aufkonzentriert und zur einer Ausbeute von 240 g Rohwirkstoff gefriergetrocknet, wobei dieser einen IC₅₀-Wert von 5 μg/ml aufwies.
Die Rohstoff (240 g) wurde auf eine zweite HP-20 Säule gegeben. Die Säule wurde gründlich mit entmineralisiertem Wasser (150 Liter) gewaschen und dann mit einem stufenweisen Gradienten mit MeOH in Wasser eluiert. Auf diese Weise wurde mit 20 % MeOH (80 Liter) und mit 40 % MeOH (100 Liter) eluiert. Die aufgefangenen Fraktionen hatten ein Volumen von jeweils 10 beziehungsweise 2 Litern. Die mit 40 % MeOH erhaltenen Wirkstoffeluate (2 × 30 Liter) wurden vereint, unter reduziertem Druck von 10-100 mm Hg bei 35 °C aufkonzentriert und zur einer Ausbeute von 20 g angereichertem Material gefriergetrocknet, wobei dieses einen IC₅₀-Wert von 1 μg/ml aufwies.
Das auf diese Weise erhaltene angereicherte Material wurde mittels zweier aufeinander folgender Gelpermeationschromatographie-Läufe über ^®Sephadex LH-20 aufgereinigt, wobei die Substrat-zu-Gel-Verhältnisse variierten. So wurde das oben genannte angereicherte Material in 4 Chargen von je 5 g aufgeteilt, die jeweils auf Glassäulen der Maße 4 cm × 120 cm gegeben wurden, welche mit ^®Sephadex LH-20 (1,5 Liter) gefüllt waren. Als mobile Phase wurde Wasser verwendet, und die Flussrate betrug konstant 2,5 ml/min. Die Fraktionen wurden in Volumengrößen von je 25 ml aufgefangen. Die Wirkstoffeluate wurde mittels HPLC kontrolliert, wobei eine ^®Lichrocart 100 RP-18 Säule (250 mm × 4 mm) sowie ein über 20 Minuten laufender Gradient von 0,1 wässriger TFA zu CH₃CN bei einer Flussrate von 1 ml/min. verwendet wurden und die Detektion bei 270 nm durchgeführt wurde. Die Wirkstoffeluate der Zielverbindung wurden vereint, unter reduziertem Druck von 10-100 mm Hg bei 35 °C auf konzentriert und zur einer Ausbeute von 1 g hochangereichertem Material gefriergetrocknet, wobei dieses einen IC₅₀-Wert von 0,1 bis 0,3 μg/ml aufwies.
Das oben genannte Material wurde in zwei Chargen von 500 mg aufgeteilt, welches zur weiteren Aufreinigung jeweils auf Glassäulen (2,5 cm × 110 cm) gegeben wurden, die mit ^®Sephadex LH-20 gefüllt waren. Als mobile Phase wurde Wasser verwendet, und die Flussrate betrug konstant 0,5 ml/min. Die Fraktionen wurden in Volumengrößen von je 6 ml aufgefangen. Die Vereinigung der Fraktionen basierte auf HPLC-Untersuchungen (Bedingungen wie oben erwähnt). Die Wirkstoffeluate der Zielverbindung wurden vereint, unter reduziertem Druck von 10-100 mm Hg bei 35 °C aufkonzentriert und zur einer Ausbeute von 160 mg der halbreinen Verbindung gefriergetrocknet, wobei diese einen IC₅₀-Wert von 0,06 μg/ml aufwies.
Schließlich wurde das halbreine Material mittels preparativer HPLC über eine Säule des Typs ^®Eurosphere 100 C18, 10 μ (250 × 16 mm) aufgereinigt, wobei über eine Dauer von 30 min. ein Gradient von 5 % Methanol in Wasser 40 % Methanol in Wasser gefahren wurde. Die Flussrate betrug konstant 6 ml/min, und die Detektion erfolgt bei 270 nm, wobei reines Mumbaistatin (70 mg) erhalten wurden.
Die ¹H-NMR und ¹³C-NMR Spektrum von Mumbaistatin waren von schlechter Qualität. Die Charakterisierung der Ursprungsverbindung Mumbaistatin beruhte daher in erster Linie auf der Spektralanalyse des Lactons L970860, welches durch Behandlung von Mumbaistatin mit TFA gemäß dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren erhalten wurde.
Beispiel 6
Herstellung des Lactons L970860
Nach dem Lösen von 70 mg Mumbaistatin in Methanol (5 ml) wurde 0,1%ige TFA (50 ml) hinzugegeben, und die Reaktionsmischung wurde 1 Stunde lang auf 50 °C erwärmt. Die Mischung wurde dann unter reduziertem Druck von 10-100 mm Hg bei 35 °C bis zur Trockene verdampft. Das auf diese Weise erhaltene Reaktionsprodukt wurde mittels preparativer HPLC über eine Säule des Typs ^®Eurosphere 100 C18, 10 μ (250 mm × 16 mm) aufgereinigt, wobei über eine Dauer von 20 min. bei einer Flussrate von 6 ml/min ein Gradient von 30 % CH₃CN in 0,1%iger TFA zu 80 % CH₃CN in 0,1%iger TFA gefahren wurde und die Detektion bei 270 nm erfolgte, wobei reines L970860 (55 mg) erhalten wurde.
Die physikalisch-chemischen und spektralen Eigenschaften von Mumbaistatin und von dem Lacton L970860 sind zusammenfassend in Tabelle 1 aufgeführt. Die spektroskopischen Daten der Verbindungen sind den 2, 3 und 5 bis 10 der Zeichnungen zu entnehmen. Die 1 und 4 zeigen HPLC-Chromatogramme. Die Inhalt der einzelnen Zeichnungen ist Tabelle 1 zu entnehmen. Tabelle 1

Pharmakologische Charakterisierung der Verbindungen Mumbaistatin und Lacton L970860.

Mumbaistatin hemmt auf sehr wirksame Weise die Aktivität mikrosomaler Glucose-6-phosphat-Translocase aus Rattenleber, wobei der IC₅₀-Wert ungefähr 25 nM beträgt. Dagegen hemmt Mumbaistatin die Phosphatase-Aktivität in Mikrosomen, die mit Detergentien aufgeschlossen wurden, mit einem IC₅₀-Wert von ungefähr > 100 μM, was das hohe Ausmaß der Spezifizität für Translocase zeigt. Darüber hinaus beeinträchtigte Mumbaistatin nicht die Aktivität von Phosphat/pyrophophat-Translocase. Mumbaistatin ist ein reversibler und wettbewerbsfähiger Hemmer von Glucose-6-phosphat-Translocase.
Weiterhin wurde in isoliert Rattenleberzellen die Wirkung von Mumbaistatin auf den Glucoseausstoß untersucht. Es hemmt sowohl die fructoseinduzierte Gluconeogenese und die glucagoninduzierte Glykogenolyse mit IC₅₀-Werten von ungefähr 0,3 μM beziehungsweise 0,6 μM.
L970860 hemmt die Aktivität mikrosomaler Glucose-6-phosphat-Translocase aus Rattenleber mit einem IC₅₀-Wert von ungefähr 1,8 μM. BELEG EINER ORIGINALHINTERLEGUNG erteilt gemäß der Bestimmung 7.1 von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE die unten auf dieser Seite ausgewiesen ist

¹ Wenn Bestimmung 6.4 (d) Anwendung findet, handelt es sich bei diesem Datum um das Datum, an dem der Status einer Internationalen Hinterlegungsstelle erworben wurde. LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG erteilt gemäß der Bestimmung 10.2 von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE die unten auf dieser Seite asgewiesen ist
- ¹ Angabe des Originalhinterlegungsdatums oder, wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Übertragung stattgefunden hat, des relevantesten Datums (Datum der erneuten Hinterlegung oder Datum der Übertragung)
- ² Im Fall einer Bezugnahme auf die Bestimmung 10.2(a) (ii) und (iii), Angabe des letzten Lebensfähigkeitstests
- ³ Zutreffendes ankreuzen
- ⁴ Auszufüllen, wenn die Information angefordert wurde oder wenn der Test negativ ausgefallen ist.

Claims

Mumbaistatin, eine Verbindung mit der Molekülformel C₂₈H₂₀O₁₂, das durch sein ¹H-NMR-Spektrum, wie es in 9 dargestellt ist, und sein ¹³C-NMR-Spektrum, wie es in 10 dargestellt ist, charakterisiert wird, und seine pharmazeutisch annehmbaren Salze, Ester und Ether in all ihren stereoisomeren und tautomeren Formen.
Lacton L970860, eine Verbindung mit der Molekülformel C₂₈H₁₈O₁₁, das durch sein ¹H-NMR-Spektrum, wie es in 7 dargestellt ist, und sein ¹³C-NMR-Spektrum, wie es in 8 dargestellt ist, charakterisiert wird, und seine pharmazeutisch annehmbaren Salze in all ihren stereoisomeren und tautomeren Formen.
Verfahren für die Herstellung von Mumbaistatin oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Ethers von Mumbaistatin, wie in Anspruch 1 beansprucht, oder für die Herstellung des Lactons L970860, wie in Anspruch 2 beansprucht, umfassend Kultivierung des Mikroorganismus Streptomyces, Species HIL-008003, DSM 11641, unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, das Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, gefolgt von Isolierung und Reinigung in üblicher Weise und gegebenenfalls Überführen in das Lacton L970860 oder Überführen in ein Salz, einen Ester oder Ether von Mumbaistatin.
Streptomyces, Species HIL-008003, DSM 11641.
Verwendung von Mumbaistatin oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz oder Ester oder Ether von Mumbaistatin, wie in Anspruch 1 definiert, oder des Lactons L970860, wie in Anspruch 2 beansprucht, für die Herstellung eines Pharmazeutikums.
Verwendung von Mumbaistatin oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz oder Ester oder Ether von Mumbaistatin, wie in Anspruch 1 beansprucht, oder des Lactons L970860, wie in Anspruch 2 beansprucht, für die Herstellung eines Pharmazeutikums zur Behandlung von Diabetes mellitus.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine wirksame Menge an Mumbaistatin oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz oder Ester oder Ether von Mumbaistatin, wie in Anspruch 1 beansprucht, oder des Lactons L970860, wie in Anspruch 2 beansprucht, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.