KR20010071564A

KR20010071564A - 뭄베이스타틴, 이의 제조방법 및 약제로서의 이의 용도

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Publication number: KR20010071564A
Application number: KR1020007014590A
Authority: KR
Inventors: 라마크리슈나니로기벤카타사탸; 스와미케샤바푸라호사만스리드하라; 쿠마르에라코테스와라사탸비자야; 쿠슈와하마노즈마니람싱; 코타스리데비; 라만마이틸리; 타레스와티다난제이; 데슈무크서닐쿠마르; 슈머디트마르; 쿠르츠미카엘; 코글러헤르베르트
Original assignee: 로버트 흐라이탁, 미쉘 베스트; 아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 1998-06-24
Filing date: 1999-06-15
Publication date: 2001-07-28
Also published as: WO1999067408A1; TR200003570T2; AU4513799A; HUP0102370A2; US6297043B1; CA2336135A1; PL345192A1; AU750509B2; ATE328103T1; JP2002518057A; HUP0102370A3; DE69931633D1; BR9912200A; RU2221870C2; ID27411A; CN1306580A; DE69931633T2; JP4287593B2; EP1090136B1; AR020328A1

Abstract

본 발명은 미생물 HIL-008003(DSM 11641)을 배양하여 수득할 수 있는, 뭄베이스타틴으로 명명되는 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체에 관한 것이다. 뭄베이스타틴은 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제 억제제로, 진성 당뇨병 치료에 사용할 수 있다. 또한 본 발명은 뭄베이스타틴의 제조방법, 미생물 HIL-008003(DSM 11641), 약제로서 뭄베이스타틴 및 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체의 용도, 특히 진성 당뇨병 치료에서의 이의 용도, 및 뭄베이스타틴 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

Description

뭄베이스타틴, 이의 제조방법 및 약제로서의 이의 용도{Mumbaistatin, a process for its production and its use as a pharmaceutical}

본 발명은 미생물 HIL-008003(DSM 11641)을 배양하여 수득할 수 있는, 뭄베이스타틴으로 명명되는 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체에 관한 것이다. 뭄베이스타틴은 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제(translocase) 억제제로, 진성 당뇨병 치료에 사용할 수 있다. 또한 본 발명은 뭄베이스타틴의 제조방법, 미생물 HIL-008003(DSM 11641), 약제로서 뭄베이스타틴 및 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체의 용도, 특히 진성 당뇨병 치료에서의 이의 용도, 및 뭄베이스타틴 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

간의 글루코스 생산비가 증가하는 것은 진성 당뇨병의 일반적인 특징이다. 특히 비-인슐린 의존성 진성 당뇨병(NIDDM)에서의 공복시 혈장 글루코스 농도와 간의 글루코스 생산량 사이엔 밀접한 상호관련이 있다. 간에서 글루코스가 생산되는 2가지 경로는 포도당신생(gluconeogenesis) 및 당원분해(glycogenolysis)이다. 이들 두 경로의 마지막 단계는 혈중 글루코스 농도의 항상성 조절에 있어 중요한 효소인 미소체 글루코스-6-포스파타제에 의해 촉매된다. 이 효소의 농도는 실험적 및 병리학적 진성 당뇨병 상태 모두에서 상승되는 것으로 또한 공지되어 있다. 따라서 이 효소 시스템을 차단하면 간의 글루코스 생산이 감소되어야한다.

간의 글루코스-6-포스파타제는 적어도 하기하는 3가지 기능적인 활성을 갖는 다성분 시스템이다: 글루코스-6-포스파타제 트랜스로카제(T1), 글루코스-6-포스페이트 포스포하이드롤라제 및 포스페이트/피로포스페이트 트랜스로카제(T2). 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제는 글루코스-6-포스페이트가 소포체(ER)의 루멘으로 수송되는 것을 촉진시킨다. ER의 루멘 표면상에 활성 부위가 위치한 포스포하이드롤라제는 글루코스-6-포스페이트를 가수분해시켜 루멘으로 글루코스 및 포스페이트를 방출한다. 포스페이트 유출은 포스페이트/피로포스페이트 트랜스로카제에 의해 촉진되지만, 정확한 글루코스 유출 기전은 아직 확실하지 않다.

글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제의 높은 기질 특이성으로 인해 이는 진성 당뇨병 치료에서 약리학적 중재의 잠재적인 표적이 된다. 따라서 생리학적으로 생성되는 당 포스페이트중에서도 글루코스-6-포스페이트만이 트랜스로카제에 의해 수송된다. 반대로, 포스파타제는 비특이적이어서 다양한 유기 포스페이트 에스테르를 가수분해하는 것으로 공지되어 있다.

글루코스-6-포스파타제의 일련의 비-특이적 억제제는, 예를 들어 플로리진[참조 문헌: J. Biol. Chem. 242, 1955-1960 (1967)], 5,5'-디티오-비스-2-니트로벤조산[참조 문헌: Biochem. Biophys. Res. Commun. 48, 694-699(1972)], 2,2'-디이소티오시아네이토스틸벤 및 2-이소티오시아네이토-2'-아세톡시스틸벤[참조 문헌: J. Biol. Chem. 255, 1113-1119 (1080)]이 문헌에 기술되어 있다. 치료적으로 유용한 글루코스-6-포스파타제 시스템의 억제제는 유럽 특허원 제587 087호 및 제587088호에서 먼저 제안되었다. 국제 특허 제PCT/EP 98/02247호에 기술되어 있는 코다이스타틴 A, B C 및 D는 미생물 공급원으로부터의 최초의 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제 억제제이다.

본 발명에 이르러, 뭄베이스타틴으로 명명된, 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제 억제 활성이 높은 신규한 화합물을 다른 미생물 공급원으로부터 수득할 수 있음이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명은 분자식이 C₂₈H₂₀O₁₂이고 도 9의¹H NMR 스펙트럼에 도시된¹H NMR 분광 데이타 및 도 10의¹³C NMR 스펙트럼에 도시된¹³C NMR 분광 데이타와 같이 제시되는 물리-화학적 및 스펙트럼 특성중 하나 이상이 있음을 특징으로 하는, 뭄베이스타틴으로 명명된 화합물, 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체(예: 에스테르, 에테르, 및 모든 입체이성체형 및 모든 호변이성체형을 포함한 명백한 화학적 등가체)에 관한 것이다.

뭄베이스타틴은 퀴논 화합물 부류에 속하는, 지금까지 보고되지 않았던 신규한 구조를 갖는다. 분자식 조사 수단을 사용하는 화학 이론적인 문헌 조사는 뭄베이스타틴이 신규한 화합물임을 확립시킨다. 뭄베이스타틴의 구조적 특징을 나타내는 다른 화합물은 존재하지 않는다.

뭄베이스타틴은 배양물 번호 제HIL-008003호 또는 또한 배양물 번호 제Y-9645874호(이후 HIL-008003으로 칭함)로서 언급되는 미생물을 배양하여 수득할 수 있다. 뭄베이스타틴 제조에 사용되는 상기한 미생물은 인도 마하라슈트라(Maharashtra)의 암볼리(Amboli) 부근의 히란야케시(Hiranyakeshi) 강바닥으로부터 수집한 토양 샘플로부터 분리하였다. 미생물 HIL-008003은 스트렙토마이세스 리트모시디니(Streptomyces litmocidini)로 확인되었다. 미생물은 1997년 7월 4일자로 도이췌 삼릉 폰 미크로오가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; DSMZ, Mascheroder Weg 1b, D-38124, Braunschweig, Germany)에 기탁하였고 DSM 11641의 수탁 번호를 부여받았다.

따라서, 본 발명은 스트렙토마이세스 종 HIL-008003, 이의 돌연변이체 및 변이체로부터 뭄베이스타틴으로 명명된 신규한 화합물, 및 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체를 생산하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하나 이상의 탄소원, 하나 이상의 질소원 및 임의로 영양 무기염 및/또는 미량 원소를 포함하는 영양 배지중에서 호기성 조건하에 배양물 번호 제HIL-008003호, 이의 돌연변이체 또는 변이체를 배양한 다음, 통상적인 방법으로 상기한 화합물을 분리하고 정제함을 포함한다.

영양 배지는 바람직하게는 탄소원, 질소원, 영양 무기염 및 임의의 미량 원소를 포함한다. 탄소원에는, 예를 들어 전분, 글루코스, 수크로스, 덱스트린, 프럭토스, 당밀, 글리세롤, 락토스 또는 갈락토스가 있고, 글루코스가 바람직하다. 질소원에는, 예를 들어 대두 가루, 땅콩 가루, 효모 추출물, 고기 추출물, 펩톤, 트립톤, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 젤라틴 또는 카스아미노산이 있고, 대두 가루 및 옥수수 침지액이 바람직하다.

영양 무기염 및 미량 원소에는, 예를 들어 인산수소나트륨, 인산수소칼륨,염화나트륨, 염화코발트, 염화칼슘, 탄산칼슘, 질산칼륨, 황산암모늄 또는 황산마그네슘이 있고, 염화코발트 및 탄산칼슘이 바람직하다.

배양물 번호 제HIL-008003호는 일반적으로 25 내지 30℃의 온도 및 6.0 내지 8.0의 pH에서 배양한다. 바람직하게는, 배양물 번호 제HIL-008003호는 27℃(±1℃) 및 pH 7.0에서 배양한다.

HIL-008003은 약 40 내지 약 70시간 동안 발효시키는 것이 바람직한데, 이 경우에 본 발명의 몸베이스타틴이 최적의 수율로 수득된다. 예를 들어, 진탕 플라스크뿐만 아니라 실험실 발효기에서 침지 조건하에 약 40 내지 약 48시간 동안 발효를 수행하는 것이 특히 바람직하다. 경우에 따라, 발효기에서 소포제로서 데스모펜(^RDesmophen, 폴리프로필렌 옥사이드)을 사용할 수 있다. 발효의 진행 및 뭄베이스타틴 형성은 문헌[참조 문헌: Enzymology 174, 58-67 (1989)]에 기술되어 있는 바와 같이, 약간 변형시킨 비색계 검정을 사용하여 실온에서 미세역가 플레이트중에서 비처리된 랫트 간 미소체 및^R트리톤 X-100 파괴된 랫트 간 미소체의 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제 활성을 측정함으로써 검출할 수 있다. 생성된 배양물 브로쓰에서, 뭄베이스타틴은 주로 배양 여액에 존재하므로, 물과 혼합되지 않는 용매(예: 에틸 아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 부탄올)를 사용하여 pH 5 내지 8에서 배양 여액을 추출하거나, 중합체성 수지[예:^RDiaion HP-20(Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japan),^RAmberlite XAD(Rohm andHaas Industries, U.S.A)] 또는 활성탄을 사용하는 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 pH 5 내지 8에서의 이온 교환 크로마토그래피에 의해 회수할 수 있다. 바람직한 방법은 디아이온(^RDiaion) HP-20상에 흡착시킨 다음, 용리액(예: 물, 메탄올, 아세톤, 아세토니트릴, n-프로판올, 이소프로판올 또는 이들의 혼합물)을 사용하여 화합물을 탈착시키는 것이다. 활성 용출물의 농축 및 냉동건조로 조 화합물을 수득한다.

조 물질은 하기의 기술중 하나를 사용하여 추가로 정제할 수 있다: 정지상으로서 알루미나 또는 실리카 겔을 사용하고 에틸 아세테이트, 클로로포름, 메탄올 또는 이들의 혼합물과 같은 용리액을 사용하는 표준 상 크로마토그래피; 정지상으로 RP-18이라고도 불리는 역상 실리카 겔형 디메틸옥타데실실릴실리카 겔 또는 RP-8로도 불리는 디메틸옥틸실릴실리카 겔을 사용하고 물, 완충제(예: 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트(pH 2 내지 8)) 및 유기 용매(예: 메탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 테트라하이드로푸란 또는 이들 용매의 혼합물)와 같은 용리액을 사용하는 역상 크로마토그래피; 메탄올, 클로로포름, 아세톤, 에틸 아세테이트 또는 이들 용매의 혼합물과 같은 용매중 세파덱스 LH-20(^RSephadex LH-20; Pharmacia Chemical Industries, Sweden), TSK겔 토요펄 HW-40F(^RToyopearl HW-40F; HosoHaas, Tosoh Corporation, Japan)과 같은 수지 또는 물중의 세파덱스 G-10 및 G-25와 같은 수지를 사용하는 겔 투과 크로마토그래피; 또는 물, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, n-프로판올, 테트라하이드로푸란, 아세톤, 아세토니트릴, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 에틸 아세테이트, 석유 에테르, 벤젠 및 톨루엔과 같은 용매 둘 이상으로 구성된 2상 용리 시스템을 사용하는 역류 크로마토그래피. 이러한 기술을 반복해서 사용하거나 상이한 기술을 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직한 방법은 토요펄 다음에 역상 개질된 실리카 겔(RP-18)상에서 크로마토그래피하는 것이다.

화합물 뭄베이스타틴은 약제학적으로 허용되는 염 또는 유도체, 예를 들어 본 발명에 모두 포함되는 에스테르 및 에테르, 및 기타 명백한 화학적 등가체로 전환시킬 수 있다. 본 발명은, 그 자체로는 약제로 사용하기에 적합하지 않지만 약제학적으로 허용되는 염 및 유도체를 제조하는데 있어 중간체로 사용할 수 있는 뭄베이스타틴의 모든 염 및 유도체를 또한 포함한다. 본 발명은 뭄베이스타틴, 및 모든 입체이성체형 및 호변이성체형의 이의 모든 염 및 유도체를 포함한다. 염 및 유도체는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 공정에 의해 제조할 수 있다. 나트륨염 및 칼륨염과 같은 염은, 예를 들어 뭄베이스타틴을 적합한 나트륨 또는 칼륨 염기로 처리하여 제조할 수 있다.

에스테르는, 예를 들어 디사이클로헥실카보디이미드(DCC)와 같은 시약의 존재하에 뭄베이스타틴을 카복실산과 반응시키거나, 화합물을 아실화제(예: 산 클로라이드)로 처리하여 제조할 수 있다. 에스테르를 제조하는 또다른 방법은 문헌에 제시되어 있다[참조 문헌: J. March, Advanced Organic Synthesis, 4th Edition, John Wiley & Sons, 1992].

본 발명에 포함되는 뭄베이스타틴의 에스테르에는 분자내 에스테르, 예를 들어 락톤이 포함된다. 본 발명의 주제로서 구체적으로 언급되는 화합물은 L970860으로 명명되는 화합물, 및 모든 입체이성체 및 호변이성체형의 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체이다. 화합물 L970860은 뭄베이스타틴을 트리플루오로아세트산으로 처리하여 수득할 수 있는 락톤이다. 이는 분자식이 C₂₈H₁₈O₁₁이고 도 7의¹H NMR 스펙트럼에 도시된¹H NMR 분광 데이타 및 도 8의¹³C NMR 스펙트럼에 도시된¹³C NMR 분광 데이타와 같이 제시되는 물리-화학적 및 스펙트럼 특성중 하나 이상을 갖는 것이 특징이다. L970860을 수득하기 위한 뭄베이스타틴의 락톤화는 뭄베이스타틴을 분리하거나 정제할 목적에 사용될 수 있다.

에테르는, 예를 들어 뭄베이스타틴을 염기성 조건하에 알킬화제와 반응시켜 이로부터 제조할 수 있다. 에테르의 또다른 제조방법은 문헌[참조 문헌: Advanced Organic Synthesis, 4th Edition, J. March, John Wiley & Sons, 1992]에 제시되어 있다.

뭄베이스타틴은 랫트 간 미소체의 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제를 효능적으로 억제시킨다. 약리학적 시험에서 수득한 결과는 하기에 나타내었다. 따라서, 뭄베이스타틴 및 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체는 특히 진성 당뇨병의 치료, 보다 일반적으로는 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제의 상승된 활성에 의해 유발되거나 이와 관련된 상태, 또는 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제 활성을 감소시켜야만되는 상태의 치료 및 예방에 있어 약제학적 활성 성분으로서 유용하다. 뭄베이스타틴 및 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 사람에게 약제로서 그 자체를 투여하거나 다른 화합물과 혼합해서 투여하고, 장 또는 비경구 투여를 허용하는 약제학적 조성물 형태로 투여할 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 약제로서 사용하기 위한 뭄베이스타틴, 및 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체, 및 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제 활성을 감소시키는 약제, 특히 진성 당뇨병 치료용 약제를 제조하기 위한 뭄베이스타틴 및 약제학적으로 허용되는 이의 염 및 유도체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 뭄베이스타틴 및/또는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 이의 염/또는 유도체의 유효량과 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.

뭄베이스타틴은 경구, 근육내, 정맥내 또는 다른 투여 방식으로 투여할 수 있다. 뭄베이스타틴, 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체를 단독으로 또는 혼합물로 포함하는 약제학적 조성물은 혼합물(들)을 하나 이상의 약리학적으로 허용되는 부형제 및/또는 보조제(예: 충전제, 유화제, 윤활제, 차폐 향미제, 착색제 또는 완충 물질)와 혼합하고 혼합물을 적합한 약제학적 형태(예: 정제, 제피제, 캡슐제, 또는 장내 또는 비경구 투여용으로 적합한 현탁제 또는 용제)로 전환시킴으로써 표준 기술에 따라 제조할 수 있다.

언급할 수 있는 보조제 및/또는 부형제의 예에는 전분, 트라가칸트, 락토스, 활석, 한천-한천, 폴리글리콜, 에탄올 및 물이 있다. 비경구 투여용으로 적합하고 바람직한 것은 물중의 현탁제 또는 용제이다. 비히클 또는 담체 없이 적합한 형태, 예를 들어 캡슐로 활성 물질을 또한 투여할 수 있다. 뭄베이스타틴 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체를 포함하는 약제하적 조성물은 또한 다른약제학적 활성 성분을 포함할 수 있다.

통상적으로, 생약 제형 및 투여방법 뿐만 아니라 특별한 경우에 적합한 투여량 범위는 치료될 종 및 개별적인 상태 또는 질환의 상태에 좌우되고, 당해 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 최적화시킬 수 있다.

약제학적 활성 성분으로서의 용도 및 유도체 제조시 중간체로서의 용도 이외에, 뭄베이스타틴, 및 이의 염 및 유도체는, 예를 들어 시험관내 진단시 진단용 보조제 및 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제 억제가 요구되는 생화학적 조사에서 연구용 보조제로서 또한 사용할 수 있다.

하기의 실시예는 본 발명을 설명하는 것으로, 본 발명의 범위를 제한하지는 않는다.

약어: MeOH, 메탄올; DMSO, 디메틸설폭사이드; TFA, 트리플루오로아세트산

실시예 1

토양으로부터 배양물 제HIL-008003의 분리

(a) 영양 분리 배지의 조성

옥수수 전분 10.0g

카세인 1.0g

펩톤 1.0g

효모 추출물 1.0g

K₂HPO₄0.5g

한천 분말 13.0g

탈염수 1.0ℓ

pH 7.5

(b) 토양 플레이팅 및 분리

인도 마하라슈트라(Maharashtra)의 암볼리(Amboli) 부근의 히란야케시(Hiranyakeshi) 강 바닥으로부터 수집한 토양 10g을 250㎖들이 에를렌메이어 플라스크중 멸균 탈염수 90㎖에 가한 다음, 회전 진탕기(220rpm)상에서 2시간 동안 진탕시킨다. 상기한 토양 현탁액을 10에서 10^-5까지 10단계로 일련으로 희석시킨다. 최종 희석액으로부터, 현탁액 1㎖를 멸균 유리 페트리 플레이트(직경 15㎝) 중앙에 위치시킨 다음, 항균제로서 암포테리신 B 25㎍/㎖가 보충된 상기한 분리 배지 약 50㎖를 붓는다. 배지는 붓기전에 45℃로 냉각시키고 플레이트를 전체적으로 회전시킨다. 토양 현탁액과 배지 혼합물은 방치하여 고정시키고 28℃(±1℃)에서 7일 동안 항온처리한다. 페트리 플레이트를 주기적으로 관찰하고, 미생물 배양물 번호 제HIL-008003호(배양물 번호 제Y-9645974호)를 성장하는 미생물중에서 분리한다.

실시예 2

배양물 HIL-008003의 유지

배양물 번호 제HIL-008003호는 다음 배지에서 유지한다:

맥아 추출물 10.0g

효모 추출물 4.0g

글루코스 4.0g

한천 분말 13.0g

탈염수 1.0ℓ

pH 7.0

상기한 성분들은 가열하여 완전히 용해시킨 다음, 시험관에 분배하고 121℃에서 20분 동안 멸균시킨다. 시험관을 냉각시킨 다음, 경사진 위치로 방치하여 고화시킨다. 철사 고리에 의해 배양물 번호 제HIL-008004호의 배양물을 경사진 한천에 도말하고, 우수한 성장이 관찰될 때까지 28℃(±1℃)에서 배양한다. 우수하게 성장한 배양물은 냉장고에서 8℃에 보관한다.

실시예 3

진탕 플라스크에서 배양물 HIL-008003의 발효

씨드 배지 조성:

글루코스 15.0g

대두 가루 15.0g

옥수수 침지액 5.0g

NaCl 5.0g

CaCO₃2.0g

탈염수 1.0ℓ

pH 7.0

상기한 씨드 배지는 500㎖들이 에를렌메이어 플라스크중 80㎖의 양으로 분배하고 121℃에서 20분 동안 오토클레이브한다. 플라스크를 실온으로 냉각시키고, 상기한 실시예 2에서 성장시킨 배양물을 루프를 사용하여 접종한 다음, 회전 진탕기상에서 27℃(±1℃)에서 72시간 동안 240rpm으로 진탕시켜 씨드 배양물을 수득한다.

생산 배지 조성:

글루코스 20.0g

대두 가루 10.0g

CaCO₃0.2g

염화코발트 0.001g

탈염수 1.0ℓ

pH 7.0

생산 배지는 500㎖들이 에를렌메이어 플라스크중 60㎖의 양으로 분배하고 121℃에서 20분 동안 오토클레이브한다. 플라스크를 실온으로 냉각시킨 다음, 상기한 씨드 배양물을 사용하여 접종한다(1% v/v). 회전 진탕기상에서 240rpm으로27℃(±1℃)에서 40 내지 48시간 동안 발효시킨다.

뭄베이스타틴 생산은 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제의 억제를 측정하여 모니터한다. 수집한 후, 배양 브로쓰를 원심분리하고, 하기 실시예 5에서 기술하는 바와 같이 배양 여액으로부터 뭄베이스타틴을 분리하고 정제한다.

실시예 4

발효기에서 배양물 HIL-008003의 발효

단계 1: 진탕 플라스크에서 씨드 배양물 제조

실시예 3의 씨드 배지를 1ℓ들이 에를렌메이어 플라스크중 160㎖의 양으로 분배하고 20분 동안 오토클레이브한다. 씨드 배양물은 실시예 3에서 기술한 바와 같이 상기한 플라스크에서 배양한다.

단계 2: 발효기에서 씨드 배양물 제조

100ℓ들이 마루비쉬(Marubishi) 발효기중에서 상기 실시예 3에서 기술한 바와 같은 씨드 배지 80ℓ를 121℃에서 45분 동안 반응계내에서 멸균시키고, 27±1℃로 냉각시키고 상기한 씨드 배양물 4.5ℓ를 씨딩한다.

발효는 하기의 매개변수를 사용하여 수행한다:

온도: 27℃(±0.5℃)

교반: 80rpm

통기: 50lpm

수집 시간: 24시간

단계 3: 대규모 발효

1000ℓ들이 마루비쉬(Marubishi) 발효기중에서 상기 실시예 3에서 기술한 바와 같은 생산 배지 700ℓ와 소포제로서 데스모펜(^RDesmophen: 폴리프로필렌 옥사이드) 150㎖를 함께 121℃에서 45분 동안 반응계내에서 멸균시키고, 27±1℃로 냉각시키고, 단계 2의 씨드 배양물 75ℓ를 씨딩한다.

발효는 하기의 매개변수를 사용하여 수행한다:

온도: 27℃(±0.5℃)

교반: 50rpm

통기: 450lpm

수집 시간: 40 내지 44시간

화합물 생산은 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제의 억제를 측정하여 모니터한다. 발효가 중단될 때, 배양 브로쓰의 pH는 6.0 내지 7.0이다. 수집 후, 배양 브로쓰를 원심분리하고, 하기 실시예 5에서 기술하는 바와 같이 배양 여액으로부터 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제 억제제 뭄베이스타틴을 분리시킨다.

실시예 5

뭄베이스타틴의 분리 및 정제

배양 브로쓰 약 1000ℓ를 수집하고 원심분리하여 균사체(12㎏)를 분리시킨다. 목적하는 화합물인 뭄베이스타틴은 배양 여액에 주로 존재하는 것으로 나타난다. 배양 여액(730ℓ)은 디아이온 HP-20(28ℓ, 3 내지 4% v/v) 칼럼으로 통과시킨다. 탈염수(250ℓ)로 칼럼을 완전히 세척한 다음, 물중 MeOH의 단계적인 구배를 사용하여 용출시킨다. 이어서, 10% MeOH(120ℓ) 및 40% MeOH(300ℓ)를 사용하여 용출시킨다. 15ℓ로 분획을 수집한다. 40% MeOH로부터 수득한 활성 용출물(15×16ℓ)를 합하고, 35℃에서 10 내지 100mm의 감압하에 농축시키고 냉동건조시켜 IC₅₀이 5㎍/㎖인 활성 조 물질 240g을 수득한다.

조 물질(240g)은 제2 HP-20 칼럼을 통해 통과시킨다. 칼럼을 탈염수(150ℓ)로 완전히 세척한 다음, 물중 MeOH의 단계적인 구배를 사용하여 용출시킨다. 이어서, 20% MeOH(80ℓ) 및 40% MeOH(100ℓ)를 사용하여 용출시킨다. 각각 10ℓ 및 2ℓ로 분획을 수집한다. 40% MeOH로부터 수득한 활성 용출물(2×30ℓ)를 합하고, 35℃에서 10 내지 100mm Hg의 감압하에 농축시키고 냉동건조시켜 IC₅₀이 1㎍/㎖인 농축된 물질 20g을 수득한다.

이로써 수득한 농축된 물질은 겔에 대한 기질의 비를 변화시키면서 세파덱스 LH-20상에서 2회의 연속적인 겔 투과 크로마토그래피로 정제한다. 이어서, 상기한 농축된 물질은 4㎝×120㎝ 유리 칼럼중에 충전된 세파덱스^RLH-20(1.5ℓ)를 통해 각각 5g짜리 4개로 개별적으로 통과시킨다. 이동상은 물이고 유속은 2.5㎖/분으로 유지한다. 분획은 25㎖로 수집한다. 활성 용출물은 1㎖/분의 유속으로 20분 동안0.1%의 수성 TFA 내지 CH₃CN의 구배를 사용하여 리크로카트(^RLichrocart) 100 RP-18(250㎜×4㎜)상에서 HPLC한 다음, 270nm에서 검출하여 모니터한다. 목적하는 성분을 갖는 활성 용출물을 수집하고 35℃에서 10 내지 100mm Hg의 감압하에 농축시키고 냉동건조시켜, IC₅₀이 0.1 내지 0.3㎍/㎖인 매우 농축된 물질 1g을 수득한다.

상기한 물질은 유리 칼럼(2.5㎝×110㎝)중에 충전된 세파덱스 LH-20을 통해 통과시켜 500㎎짜리 2개로 추가로 정제한다. 이동상은 물이고 유속은 0.5㎖/분을 유지한다. 분획은 6㎖로 수집한다. 분획은 HPLC를 기본으로 하여 수집한다(조건은 상기한 바와 같다). 목적하는 화합물을 갖는 활성 분획을 수집하고 35℃에서 10 내지 100mm Hg의 감압하에 농축시키고 냉동건조시켜, IC₅₀이 0.06㎍/㎖인 반정제된 화합물 160㎎을 수득한다.

최종적으로, 반정제된 물질은 물중 5% 메탄올 내지 물중 40% 메탄올의 구배를 사용하여 에우로스피어(^REurosphere) 100 C18, 10μ(250×16mm) 칼럼상에서 제조적 HPLC를 30분 동안 수행하여 정제한다. 유속은 6㎖/분으로 유지하고 270nm에서 검출하여 순수한 뭄베이스타틴(70㎎)을 수득한다.

뭄베이스타틴은¹H NMR 및¹³C NMR 스펙트럼의 질이 불량한 것으로 나타난다. 따라서, 모 화합물인 뭄베이스타틴의 특징은, 1차적으로 실시예 6에서 기술하는 방법을 사용하여 뭄베이스타틴을 TFA로 처리함으로써 수득되는 락톤 L970860의 스펙트럼 분석을 기초로 한다.

실시예 6

락톤 L970860의 제조

메탄올(5㎖)중에 용해된 뭄베이스타틴 70㎎에 0.1% TFA(50㎖)를 가하고, 반응 혼합물은 50℃에서 1시간 동안 가열한다. 혼합물을 10 내지 100mm Hg의 감압하에 35℃에서 증발시켜 무수물을 수득한다. 이로써 수득한 반응 생성물은 0.1% TFA중 30% CH₃CN 내지 0.1% TFA중 80% CH₃CN의 구배를 사용하여 에우로스피어 100 C18, 10μ(250mm×16mm) 칼럼상에서 6㎖/분의 유속으로 20분 동안 제조적 HPLC를 수행하고 270nm에서 검출함으로써 정제하여 순수한 L970860(55㎎)을 수득한다.

뭄베이스타틴 및 락톤 L970860의 물리-화학적 특성 및 스펙트럼 특성은 표 1에 요약하였다. 화합물의 분광 데이타는 도 2, 3 및 5 내지 10에 나타내었다. 도 1 내지 4는 HPLC 크로마토그램을 나타낸다. 개별적인 도면의 내용은 표 1에 나타내었다.

	뭄베이스타틴	L970860
특징	적갈색 고체	적갈색 고체
가용성	MeOH 및 DMSO	MeOH 및 DMSO
융점	>250℃(분해)	>250℃(분해)
[α]_D	-50.0°(c 0.024, MeOH)	-45.0°(c 0.02, MeOH)
고압 액체 크로마토그래피(HPLC)	보유 시간: 10.83분도 1	보유 시간: 13.08분도 4
ESI-MS(전기분무 이온화 질량)	547(M-H)^-	529(M-H)^-
분자식	C₂₈H₂₀O₁₂	C₂₈H₁₈O₁₁
UV	도 2	도 5
IR(KBr)	도 3	도 6
¹H NMR	도 9(600㎒, D₄-MeOH, 27℃)	도 7(300㎒, D₆-DMSO)
¹³C NMR	도 10(150㎒, D₄-MeOH, 27℃)	도 8(75㎒, D₆-DMSO)

뭄베이스타틴 및 락톤 L970860의 약리학적 특성

뭄베이스타틴은 약 25nM의 IC₅₀으로 랫트의 간 미소체의 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제 활성을 효능적으로 억제한다. 이와 반대로, 뭄베이스타틴은 약 100μM을 초과하는 IC₅₀으로 세제로 파괴된 미소체중 포스파타제 활성을 억제하는데, 이는 트랜스로카제에 대한 이의 특이성이 높다는 것을 나타낸다. 추가로, 뭄베이스타틴은 포스페이트/피로포스페이트 트랜스로카제의 활성에 영향을 미치지 않는다. 뭄베이스타틴은 글루코스-6-포스파타제 트랜스로카제의 가역적이고 경쟁적인 억제제이다.

추가로, 분리한 랫트 간세포에서 글루코스 생산에 대한 뭄베이스타틴의 효과를 평가한다. 이는 각각 약 0.3μM 및 0.6μM의 IC₅₀으로 프럭토스-유도된 포도당신생 및 글루카곤-유도된 당원분해를 억제한다.

L970860은 약 1.8μM의 IC₅₀으로 랫트 간 미소체의 글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제 활성을 억제한다.

특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약

국 제 양 식

하기 국제 기탁기관에서 정한 규칙 7.1에 따라 발행된 원 기탁에 관한수탁증

훽스트 마리온 뤼쎌 게엠베하

65926 프랑크푸르트

I. 미생물의 동정
기탁자가 첨부한 참고 동정:HIL 008003	국제 기탁기관이 부여한 수탁 번호:DSM 11641
II. 과학적 설명 및/또는 제안된 분류학상의 명칭
상기 I에 명시된 미생물에는 하기의 사항을 기재한 문서가 첨부되어 있다:( ) 과학적 설명(ｘ) 제안된 분류학상의 명칭(적용되는 경우에는 크로스로 표시함)
III. 수령 및 수탁
본 국제 기탁기관은 1997년 7월 4일(원 기탁일)¹에 수령된 상기 I에 명시된 미생물을수탁한다.
IV. 이관청구의 수령
본 국제 기탁기관은 (원 기탁일)에 상기 I에 명시된 미생물을 수령하였고,(이관청구 접수일)에 원 기탁물의 부다페스트 조약하의 기탁물로의 이관청구를 수령하였다.
V. 국제 기탁기관
명칭: DSMZ-도이췌 삼릉 폰 미크로오가니즈멘운트 젤쿨투렌 게엠베하주소 : 데-38124 브라운슈바이크마쉐로더 벡 1베	국제 기탁기관을 대표하는권한을 갖는 사람(들)또는 증명관(들)의 서명(들):(서 명)날짜 : 1997년 7월 7일

1. 규칙 6.4(d)가 적용되는 경우, 이 날짜는 국제 기탁기관의 자격이 획득된 날짜이다.

국 제 양 식

하기 국제 기탁기관에서 정한 규칙 10.2에 따라 발행된생존 진술서

훽스트 마리온 뤼쎌 게엠베하

65926 프랑크푸르트

I. 기탁자	II. 미생물 동정
성명 : 훽스트 마리온 뤼쎌 게엠베하주소 : 65926 프랑크푸르트	국제 기탁기관이 부여한 수탁 번호:DSM 11641기탁일 또는 이관일¹:1997년 7월 4일
III. 생존 진술
II란에 명시된 미생물의 생존성은 1997년 7월 4일²에 시험되었다.이때 상기 미생물은(ｘ)³생존 상태( )³비생존 상태였다.
IV. 생존 시험 수행시의 조건⁴

V. 국제 기탁기관
명칭: DSMZ-도이췌 삼릉 폰 미크로오가니즈멘운트 젤쿨투렌 게엠베하주소 : 데-38124 브라운슈바이크마쉐로더 벡 1베	국제 기탁기관을 대표하는권한을 갖는 사람(들)또는 증명관(들)의 서명(들):(서 명)날짜 : 1997년 7월 7일

1. 원 기탁일, 또는 신규 기탁이나 이관이 이루어진 경우, 가장 최근의 날짜(신규 기탁일 또는 이관일)를 가리킨다.

2. 규칙 10.2(a) (ii) 및 (iii)이 적용되는 경우, 가장 최근의 생존 시험을 의미한다.

3. 해당 칸에 크로스로 표시한다.

4. 정보가 요청되고 시험 결과가 부정적인 경우 기입한다.

Claims

도 9 및 도 10에 각각 나타낸¹H NMR 스펙트럼 및¹³C NMR 스펙트럼에 의해 특징지워지고 분자식 C₂₈H₂₀O₁₂의 화합물인 뭄베이스타틴, 약제학적으로 허용되는 이의 염, 및 모든 입체이성체형 및 호변이성체형의 이의 유도체.
탄소원 및 질소원을 함유하는 영양 배지중에서 호기성 조건하에 미생물 스트렙토마이세스(Streptomyces) 종 HIL-008003(DSM 11641)을 배양한 다음, 통상적인 방법으로 분리하고 정제하여 수득할 수 있는, 분자식 C₂₈H₂₀O₁₂의 화합물인 뭄베이스타틴, 약제학적으로 허용되는 이의 염, 및 모든 입체이성체형 및 호변이성체형의 이의 유도체.
도 7 및 도 8에 각각 나타낸¹H NMR 스펙트럼 및¹³C NMR 스펙트럼에 의해 특징지워지고 분자식 C₂₈H₁₈O₁₁의 화합물인 락톤 L980860, 약제학적으로 허용되는 이의 염, 및 모든 입체이성체형 및 호변이성체형의 이의 유도체.
탄소원 및 질소원을 함유하는 영양 배지중에서 호기성 조건하에 미생물 스트렙토마이세스 종 HIL-008003(DSM 11641)을 배양한 다음, 통상적인 방법으로 분리하고 정제함을 포함하여, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 뭄베이스타틴, 또는 이의 염 또는 유도체를 제조하는 방법.
스트렙토마이세스 종 HIL-008003(DSM 11641).
약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 뭄베이스타틴, 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 뭄베이스타틴, 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체의 유효량과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
글루코스-6-포스페이트 트랜스로카제 억제제로 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 뭄베이스타틴, 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체.
진성 당뇨병 치료에 사용하기 위한, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 뭄베이스타틴, 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염 또는 유도체.