CZ20004841A3 - Mumbaistatin, způsob jeho přípravy a použití mumbaistatinu jako léčiva - Google Patents

Abstract

Sloučenina mumbaistatin s molekulárním sumárním vzorcem C28H20O12 se připravuje kultivací mikroorganismů druhu streptomyces HIL 008003 (DSM 11641) v aerobních podmínkách v živém médiu obsahujícím zdroj uhlíku a dusíku. Poté se mumbaistatin izoluje a purifíkuje a případně se konvertuje na lakton L 970860 s molekulovým sumárním vzorcem C28Hi80n, nebo soli nebo deriváty mumbaistatinu nebo laktonu. Mumbaistatin nebo lakton L 970860 jsou inhibitory translokázy glukózo-6-fosfátu.

Description

Mumbaistatin, způsob jeho přípravy a použití mumbaistatinu jako léčiva

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nové sloučeniny nazvané mumbaistatin, kterou lze získat kultivací mikroorganismu HIL-008003 (DSM 11641), a jejích farmaceuticky přijatelných solí a derivátů. Mumbaistatin je inhibitor translokázy glukózo-6-fosfátu a lze ho užít k léčení daibetes mellitus. Předkládaný vynález se dále týká způsobu výroby mumbaistatinu, mikroorganismu HIL-008003 (DSM 11641), použití mumbaistatinu a jeho farmaceuticky přijatelných solí a derivátů jakožto léčiva, a zejména jejich použití k léčení diabetes mellitus, a dále se týká farmaceutického přípravku obsahujícího mumbaistatin nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl nebo derivát.

Dosavadní stav techniky

Zvýšená míra vylučování jaterní glukózy je obecným znakem onemocnění diabetes mellitus. Zvláště silná korelace mezi hladinou glukózy v plazmě po hladovění a výstupem jaterní glukózy byla nalezena v případě diabetes mellitus nezávislého na inzulínu (NIDDM). Dvě metabolické dráhy, ve kterých se tvoří glukóza v játrech, jsou glukoneogeneze a glykogenolýza. Konečné kroky obou těchto metabolických drah jsou katalyzovány mikrosomální glukózo-6-fosfatázou, klíčovým enzymem homeostatické regulace hladiny krevní glukózy. Je známo, že hladina tohoto enzymu je zvýšená jak při experimentálním tak i patologickém diabetů. Ovlivnění tohoto enzymu by tedy mělo vést ke snížené tvorbě glukózy v játrech.

Jaterní glukózo-6-fosfatáza je mnohasložkový systém obsahující nejméně tři funkční aktivity: translokázu glukózo6-fosfátu (TI), glukózo-6-fosfátfosfohydrolázu a translokázu fosfát/pyrofosfátu (T2) . Translokáza glukózo-6-fosfátu umožňuje transport glukózo-6-fosfátu do lumen endoplazmatického retikula (ER). Fosfohydroláza, s aktivním místem situovaným na vnitřním (do lumen obráceném) povrchu ER, hydrolyzuje glukózo-6-fosfát a uvolňuje glukózu a fosfát do lumen. Zatímco výtok fosfátu je umožněn translokázou fosfát/pyrofosfátu, přesný mechanismus výtoku glukózy není substrátové z ní činí při dosud znám.

Vysoký stupeň glukózo-6-fosfátu farmakologickou intervenci Ze všech fyziologicky se specifičnosti translokázy potenciální cíl pro léčení diabetes mellitus.

vyskytujících cukerných fosfátů pouze glukózo-6-fosfát je transportován translokázou. Naproti tomu fosfatáza je nespecifická a je známo, že hydrolyzuje celou řadu organických fosforečných esterů.

V odborné literatuře byla popsána řada nespecifických inhibitorů glukózo-6-fosfatázy, např. phlorrhizin (J. Biol. Chem. 242, 1955-1960, 1967, 5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoová kyselina (Biochem. Biophys. Res. Commun. 48, 694-699, 1972, 2,2'-diisothiokyanostilben a 2-isothiokyanato-2'-acetostilben (J. Biol. Chem. 255, 1113-1119, 1980). První terapeuticky využitelný inhibiotr glukózo-6-fosfatázového systému byly navrženy v Evropských patentových přihláškách EP-A-587 087 a EP-A-587 088. Kodaistatiny A, B, C a D, popsané v mezinárodní patentové přihlášce publikované jako WO 98/47888, byly prvními inhibitory translokázy glukózo-6fosfátu z mikrobiálního zdroje.

Podstata vynálezu

Bylo zjištěno, že z různých mikrobiálních zdrojů je možné získat novou sloučeninu s vysokou inhibiční aktivitou pro translokázu glukózo-6-fosfát, která byla nazvána mumbaistatin. Předkládaný vynález se týká této sloučeniny mumbaistatinu, která má sumární vzorec C28H20O12 a která je charakterizována jednou nebo několika fyzikálně-chemickými vlastnostmi a spektrálními vlastnostmi uvedenými dále v popisu, jako jsou např. ¹H NMR spektroskopická data, uvedená na ¹H NMR spektru na obr. 9, a ¹³C NMR spektroskopická data, uvedená na ¹³C NMR spektru na obr. 10, a jeho farmaceuticky přijatelných solí a derivátů, jako jsou estery, ethery a zřejmé chemické ekvivalenty, včetně všech stereoisomerních a tautomerních forem.

Mumbaistatin má novou, dosud nepopsanou strukturu, patřící do třídy chinonových sloučenin. Průzkum chemické literatury v databázi Chemical Abstract užitím molekulového vzorce jakožto vyhledávacího klíče ukázal, že mumbaistatin je nová sloučenina. Žádná jiná sloučenina nemá strukturní vlastnosti mumbaistatinu.

Mumbaistatin je možné získat kultivací mikroorganismu označeného jako kultura HIL-008003 nebo Y-9645974 (v této přihlášce označován jako HIL-008003). Tento mikroorganismus použitý k produkci mumbaistatinu byl izolován ze vzorků půdy z řečiště řeky Hiranyakeshi v blízkosti Amboli, Maharashtra v Indii. Mikroorganismus označený HIL-008003 byl později identifikován jako Streptomyces litmocidini a byl uložen dne 4. července 1997 v Německé sbírce mikroorganismů a buněčných kultur (DSMZ, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124, Braunschweig, Německo) jako vzorek č. DSM 11641.

laktóza, galaktóza, např. sojový nebo

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob přípravy nové sloučeniny nazvané mumbaistatin a jejích farmaceuticky přijatelných solí a derivátů z kmenu Streptomyces litmocidini HIL-008003, jeho mutant a variant. Tento způsob spočívá v tom, že se kultivuje kultura HIL-008003 v aerobních podmínkách v živném médiu obsahujícím jeden nebo více zdrojů uhlíku a jeden nebo více zdrojů dusíku a případně další anorganické soli sloužící k výživě a/nebo stopové prvky, a pak se sloučenina podle předkládaného vynálezu izoluje a purifikuje obvyklým způsobem.

Živné médium výhodně obsahuje zdroje uhlíku, dusíku a dalších živných anorganických solí a případně i stopové prvky. Zdrojem uhlíku je např. škrob, glukóza, sacharóza, dextrin, fruktóza, melasa, glycerol, výhodně glukóza. zdrojem dusíku je arašídový bujón, kvasničný extrakt, hovězí extrakt, pepton, tryptonový nebo sladový extrakt, kukuřičný výluh, želatina nebo casaminové kyseliny, výhodně sojový bujón a kukuřičný výluh.

Surový materiál může být dále purifikován pomocí kterékoliv z technik jako jsou:

- chromatografie s normální fází užívající oxid hlinitý nebo silikagel jakožto stacionární fázi a eluenty jako ethylacetát, chloroform, methanol nebo jejich kombinace,

- chromatografie s reverzní fází užívající silikagel pro reverzní fázi jako je např. dimethyloktadecylsilylsilikagel, zvaný též RP-18, nebo dimethyloktylsilylsilikagel, zvaný též RP-8, jakožto stacionární fázi, a eluenty jako voda, pufry, např. fosfátový, acetátový nebo citrátový (pH 2 až 8) a organická rozpouštědla jako methanol, acetonitril, aceton, tetrahydrofuran nebo jejich kombinace,

- gelová permeační chromatografie užívající pryskyřice φ * jako jsou Sephadex®LH-20 (Pharmacia Chemical Industries, Švédsko), TSKgel® Toypearl HW-40F (TosoHaas, Tosoh Corp., Japonsko) s rozpouštědly jako je methanol, chlorofom, aceton, ethylacetát nebo jejich kombinace, a nebo Sephadex® G-10 a G-25 s vodou, nebo protiproudová chromatografie užívající dvoufázový rozpouštědlový systém ze dvou a více rozpouštědel jako je voda, methanol, ethanol, isopropanol, n-propanol, tetrahydrofuran, aceton, acetonitril, methylenchlorid, chloroform, ethylacetát, petrolether, benzen a toluen.

Tyto metody lze užívat opakovaně nebo lze kombinovat různé metody. Výhodným způsobem je chromatografie přes Toypearl® následovaná reverzní fází modifikovaného silikagelu (RP-18).

Sloučenina mumbaistatin může být

konvertována na
, jako jsou	např.
ekvivalenty,	které
.. Vynález se	také
které samy	osobě
být užity	jako
přij atelných	solí

jsou také součástí předkládaného vynálezu týká všech solí a derivátů mumbaistatinu, nejsou vhodné jako léčiva, ale mohou a derivátů. Vynález zahrnuje soli a deriváty mumbaistatinu ve všech izomerních a tautomerních formách. Soli a deriváty mumbaistatinu mohou být připraveny standardními postupy, které jsou odborníkovi známy. Soli jako jsou např. sodné a vápenaté soli mohou být připraveny např. působením vhodné sodné a vápenaté baze na mumbaistatin. Estery mohou být připraveny např. reakcí mumbaistatinu s karboxylovými kyselinami za přítomnosti činidla jako je např. dicyklohexylkarbodiimid (DCC) nebo působením acylačních činidel, jako jsou např. acylchloridy, na mumbaistatin. Další způsoby přípravy esterů byly např. popsány v publikaci

J. March, Advanced Organic Synthesis, 43. vydání, John Willey and Sons, 1992.

K esterům mumbaistatinu podle předkládaného vynálezu patří také intramolekulární estery, tj. laktony. Specifickou sloučeninou tohoto typu je sloučenina označená L970860 a její farmaceuticky přijatelné soli a deriváty včetně všech stereomerních a tautomerních forem. Sloučenina L970860 je lakton, připravitelný tak, že se působí kyselinou trifluoroctovou na mumbaistatin. Má molekulový sumární vzorec C₂8Hi₈0h a je charakterizován kteroukoliv z následujících fyzikálně chemických a spektrálních vlastností, jako jsou např. ^XH NMR spektroskopická data uvedená v A NMR spektru na obr. 7 a ¹³C NMR spektroskopická data uvedená na obr. 8. Laktonizace mumbaistatinu, kterou vzniká sloučenina L970860, může být využita pro izolaci a purifikaci mumbaistatinu.

Ethery mohou být připraveny např. reakcí mumbaistatinu s alkylačními činidly v bazických podmínkách. Další metody přípravy etherů byly popsány v odborné literatuře, např. Advanced Organic Synthesis, 4th Edition, J. March, John Willey and Sons, 1992.

Mumbaistatin je silným inhibitorem translokázy glukózo6-fosfátu z mikrosomů jater potkana. Výsledky získané ve farmakologických testech jsou uvedeny níže. Mumbaistatin a jeho farmaceuticky přijatelné soli a deriváty jsou proto vhodné jako farmaceuticky účinné látky, zejména pro přípravky k léčení diabetes mellítus, a obecně k léčení a profylaxi stavů, které jsou způsobeny nebo alespoň souvisí se zvýšenou aktivitou translokázy glukózo-6-fosfátu, nebo v případech, kdy je cílem snížení aktivity translokázy glukózo-6-fosfátu.

Mumbaistatin a jeho farmaceuticky přijatelné soli a deriváty mohou být podávány zvířatům, výhodně savcům, a zvláště lidem, jako léky samy o sobě, ve směsi, nebo jako

Mumbaistatin intrámuskulárně, farmaceutické přípravky vhodné pro enterální nebo parenterální podávání. Předkládaný vynález se tudíž také týká mumbaistatinu a jeho farmaceuticky přijatelných solí a derivátů pro použití jako léků a také použití mumbaistatinu a jeho farmaceuticky přijatelných solí a derivátů pro výrobu léků ke snížení aktivity translokázy glukózo-6-fosfátu, zejména pro výrobu léků k léčení diabetes mellitus. Předkládaný vynález se dále týká farmaceutického přípravku, který obsahuje účinné množství mumbaistatinu a/nebo jednu nebo několik jeho farmaceuticky přijatelných solí a/nebo derivátů společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.

může být podáván perorálně, intravenózně nebo i jinými způsoby.

Farmaceutický přípravek obsahující mumbaistatin nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli nebo deriváty samotné nebo jejich kombinaci může být připraven standardním způsobem smícháním jednotlivých složek s jedním nebo několika farmaceuticky přijatelnými excipienty a/nebo pomocnými látkami, jako jsou např. plnidla, emulgátory, lubrikanty, ochucovadla, barviva a pufry, a tato směs se pak upraví do vhodné lékové formy jako jsou např. tablety, potahované tablety, tobolky, suspenze nebo roztoky vhodné pro enterální nebo parenetrální podávání.

K příkladům vhodných excipientů a/nebo pomocných látek patří např. škrob, tragakant, laktóza, mastek, agar-agar, polyglykoly, ethanol a voda. Výhodné pro parenterální podávání jsou suspenze nebo roztoky ve vodě. Je také možné podávat účinnou látku jako takovou, tj . bez vehikula nebo rozpouštědla, ve formě tobolek. farmaceutické přípravky obsahující mumbaistatin nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli nebo deriváty mohou obsahovat také další farmaceuticky účinné složky.

• · · · · · ► ·> · · · <

• ♦ · · 4

Jak je obvyklé, galenické formulace a způsoby podáváni, stejně jako dávkováni, vhodné pro konkrétní případy, jsou závislé na tom, jaký biologický druh je léčen, na stavu a závažnosti nemoci, a mohou být optimalizovány metodami odborníkům známými.

Kromě užití jako účinné látky nebo jako meziproduktu pro výrobu derivátů, mumbaistatin a jeho soli nebo deriváty mohou být užity pro pomocné nebo diagnostické účely, např. pro in vitro diagnostiku a pro výzkumné účely při biochemickém výzkumu, kdy je potřeba inhibovat translokázu glukózo-6fosfátu.

Následující příklady jsou ilustrativní a předmět předkládaného vynálezu nijak neomezují. V příkladech jsou užity zkratky: MeOH pro methanol, DMSO pro dimethylsulfoxid a TFA pro trifluorocotovou kyselinu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Izolace kultury HIL-008003 z půdy

a)Složení izolačního živného média

Kukuřičný škrob: 10,0 g Kasein: 1,0 g Pepton: 1,0 g Kvasničný extrakt: 1,0 g K₂HPO₄: 0,5 g Agar v prášku: 13,0 g Demineralizovaná voda: 1,0 1 pH: 7,0 • ·

b) Kultivace z půdy a izolace g půdy odebrané z údolí řeky Hiranyakeshi v blízkosti

Amboli, Maharashtra, Indie, bylo přidáno k 90 ml sterilní demineralizované vody do 250ml Erlenmayerovy baňky, která pak byla třepána 2 hodiny na rotační třepačce (220 rpm) . Takto vytvořená půdní suspenze byla pak sériově naředěna vždy lOx v každém kroku až do 10-5. 1 ml z posledního ředění byl nanesen do středu skleněné Petriho misky (průměr 15 cm) , do které pak bylo nalito 50 ml výše popsaného izolačního média s přídavkem 25 μg/ml amfotericinu jakožto fungicidního činidla. Médium bylo před nalitím zchlazeno na 45 °C a misky byly promíchány důkladným kroužením. Směs suspenze a média pak byla ponechána, aby se usadila a dále byla inkubována ve 28°C (±1°C) po 7 dnů. Petriho misky byly pravidelně vizuálně kontrolovány a z mikroorganismů, které na nich narostly, byla izolována kultura HIL-008003 (kultura č. Y-9645974).

Příklad 2

Udržování kultury HIL-008003

Kultura HIL-008003 byla udržována v médiu následujícího složení:

Sladový extrakt: 10,0 g

Kvasničný extrakt: 4,0 g

Glukóza: 4,0 g

Agar v prášku: 13,0 g

Demineralizovaná voda: 1,0 1 pH: 7,0

Po důkladném rozpuštění výše uvedených složek za současného zahřívání bylo médium rozděleno do zkumavek a pak sterilizováno 20 minut při 121 °C. Zkumavky pak byly zchlazeny a médium ztuhlo v šikmé poloze. Na šikmé plochy média ve zkumavkách pak byla přeočkována kultura HIL-008003 drátěnou očkovací kličkou a zkumavky byly inkubovány při 28°C dokud nebyl zaznamenán viditelný růst. Dobře rostoucí kultury byly uchovány v lednici při 8 °C.

Příklad 3

Fermentace kultury HIL008003 v protřepávaných kultivačních nádobách

Složení kultivačního média:

Glukóza: 15, 0 g Sojová moučka: 15,0 g Kukuřičný výluh: 5, 0 g NaCl: 5,0 g CaCCh : 2,0 g Demineralizovaná voda: 1,0 1 pH: 7,0

Toto médium bylo rozděleno do po 8 0ml do 500ml Erlenmayerových baněk a sterilizováno v autoklávu 20 minut při 121 °C. Baňky pak byly ochlazeny na teplotu místnosti a každá baňka byla inokulována očkovací kličkou z dobře rostoucí kultury popsané v příkladu 2 a pak dále kultivována na rotační třepačce 72 hodin při 240 rpm ve 27 °C (±1°C) , čímž byla připravena očkovací kultura.

• ·

Složení produkčního média:

Glukóza:

Sojová moučka:

CaCCh:

Chlorid kobaltnatý: Demineralizovaná voda: pH:

20,0 g 10, 0 g

2,0 g

0,001 g

1,0 1 7,0

Toto produkční médium bylo rozděleno do po 60 ml do 500ml Erlenmayerových baněk a sterilizováno v autoklávu 20 minut při 121 °C. Baňky pak byly ochlazeny na teplotu místnosti a každá baňka byla inokulována výše popsanou očkovací kulturou (1 % objem.). Fermentace dále probíhala na rotační třepačce při 240 rpm ve 27 °C (± 1°C) po dobu 40 až 48 hodin.

Produkce mumbaistatinu byla monitorována měřením inhibice translokázy glukózo-6-fosfátu. Po sklizení bylo kultivační médium centrifugováno a mumbaistatin byl izolován z filtrátu postupem popsaným v příkladu 5.

Příklad 4

Fermentace kultury HIL008003 ve fermentoru

1. fáze: Příprava očkovací kultury v protřepávané lahvi

Očkovací médium z příkladu 3 bylo rozděleno po 160 ml do 11 Erlenmayerových baněk a sterilizováno 20 minut v autoklávu. Očkovací kultura byla pěstována stejně jak bylo popsáno v příkladu 3.

2. fáze: Příprava očkovací kultury ve fermentoru

1 očkovacího média popsaného v příkladu 32 ve 1001

Marubishiho fermentoru bylo sterilizováno in šitu 45 minut při 121 °C, ochlazeno na 27 °C ± 1 °C a pak zaočkováno 4,5 1 očkovací kultury popsané v 1. fázi.

Fermentace probíhala s následujícími hodnotami příslušných parametrů:

Teplota:	27	°C (± 0,5 °C
Třepání:	80	ot/min (rpm)
Aerace:	50	1/min (lpm)
Doba kultivace:	24	hodin

3. fáze: Velkoobjemová fermentace

700 1 produkčního média popsaného v příkladu 3 v 10001

Marubishiho fermentoru společně se 150 ml přípravku Desmophen® (polypropylenoxid) jakožto proptipěnotvorného činidla bylo sterilizováno in šitu 45 minut při 121°C, ochlazeno na 27°C ± 1°C a pak zaočkováno 75 1 očkovací kultury popsané ve 2. fázi

Fermentace probíhala příslušných parametrů:

s následujícími hodnotami

Teplota:

Třepání:

Aerace:

Doba kultivace:

°C (± 0,5 °C) 50 ot/min (rpm)

450 1/min (lpm) až 44 hodin

Produkce mumbaistatinu byla monitorována měřením inhibice translokázy glukózo-6-fosfátu. Když byla fermentace přerušena, hodnota pH kultivačního média byla 6,0 až 7,0. Po sklizení bylo kultivační médium centrifugováno a mumbaistatin byl izolován z filtrátu postupem popsaným v příkladu 5.

Příklad 5

Izolace a purifikace mumbaistatinu

Přibližně 1000 1 kultivačního média bylo sklizeno a mycélia (12 g) byla odstraněna centrifugací. Požadovaná sloučenina, tj. mumbaistatin, byla zjištěna především ve filtrátu kultivačního média. Filtrát kultivačního média (730 1) byl nanesen na kolonu Diaion® HP-20 (28 litrů, 3 až % obj.). Pak byla kolona důkladně propláchnuta demineralizovanou vodou (250 1) a pak eluována krokovým gradientem MeOH ve vodě. Takže eluce byla provedena 10% MeOH (120 1) a 40% MeOH (300 1). Byly odebírány frakce velikosti 15 1. Frakce aktivního eluátu (15 x 16 1) získané se 40% MeOH byly sloučeny, koncentrovány za sníženého tlaku 1,333 až 13,33 kPa (10 až 100 mm Hg) při 35 °C a lyof ylizovány, což poskytlo 240 g surového aktivního produktu, který vykazoval hodnotu

IC50 5 ng/ml.
Surový materiál (240 g)	byl nanesen	na druhou	kolonu
HP-20.	Kolona byla důkladně	propláchnuta	demineralizovanou
vodou	(150 1) a pak eluován krokovým gradientem MeOH ve	vodě.
Takže	eluce byla provedena	20% MeOH (80	1) a 40%	MeOH

(100 1) . Byly odebírány frakce velikosti 10 1 a pak 2 1.

Frakce aktivního eluátu (2 x 30 1) získané se 40% MeOH byly sloučeny, koncentrovány za sníženého tlaku 1,333 až 13,33 kPa (10 až 100 mm Hg) při 35 °C a lyof ylizovány, což poskytlo 20 g obohaceného materiálu, který vykazoval IC₅₀ 1 ng/ml.

Takto získaný obohacený materiál byl dále purifikován dvakrát po sobě gelovou permeační chromatografií na Sephadex® LH-20 s různým poměrem substrátu a gelu. Takže výše popsaný obohacený materiál prošel 4 vrstvami obsahujícími po 5 g Sephadex® LH-20 (1,5 1) ve skleněné koloně 4 cm x 120 cm.

Mobilní fáze byla voda a průtok byl udržován na 2,5 ml/minuta. Byly odebírány frakce velikosti 25 ml. Aktivní eluát byl monitorován HPLC na koloně Lichrocart® 100RP-18 (250 mm x 4 mm) s gradientem 0,1% vodné TFA na CH₃CN ve 20 minutách při průtoku 1 ml/minuta a detekci ve 270 nm. Aktivní eluáty s požadovanou složkou byly sloučeny a koncentrovány za sníženého tlaku 1,333 až 13,33 kPa (10 až 100 mm Hg) při 35 °C a lyofylizovány, což poskytlo 1 g vysoce obohaceného materiálu, který vykazoval IC₅o 0,1 až 0,3 pg/ml.

Takto získaný materiál byl dále purifikován ve dvou várkách po 500 mg přes Sephadex® LH-20 ve skleněné koloně (2,5 cm x 110 cm). Mobilní fáze byla voda a průtok byl udržován na 0,5 ml/minuta. Byly odebírány frakce velikosti 6 ml. Frakce byly na základě HPLC analýzy (viz výše) sloučeny. Aktivní eluáty s požadovanou složkou byly sloučeny a koncentrovány za sníženého tlaku 1,333 až 13,33 kPa (10 až 100 mm Hg) při 35 °C a lyof ylizovány, což poskytlo 160 mg semipurifikované sloučeniny, která vykazovala IC₅o 0,06 pg/ml.

Nakonec byl semipurifikovaný materiál dále purifikován preparativní HPLC na koloně Eurosphere® 100 C18, 10 μη (250 x 16 mm) užitím gradientu 5% methanolu a 40% methanolu ve vodě po 30 minutách. Průtok byl udržován na 6 ml/minuta a detekce byla při 270 nm, čímž byl získán čistý mumbaistatin (70 mg).

Mumbaistatin poskytl spektra ¹H NMR a ¹³C NMR špatné kvality. Charakterizace parentální sloučeniny mumbaistatinu byla tedy primárně založena na spektrální analýze laktonu L970860, který byl získán působením TFA ne mumbaistatin postupem, který je popsán v příkladu 6.

Příklad 6

Příprava laktonu L970860

K 70 mg mumbaistatinu rozpuštěného v 5 ml methanolu bylo přidáno 50 ml 0,1% TFA a reakční směs se zahřívala 1 hodinu při 50 °C. Pak byla směs odpařena za sníženého tlaku 1,333 až 13,33 kPa (10 až 100 mm Hg) při 35 °C do sucha. Takto získaný reakční produkt byl purifikován preparativní HPLC na koloně Eurosphere® 100, C18, 10 μ (250 mm x 16 mm) užitím gradientu 30 % CH3CN v 0,1% TFA až 80 % CH₃CN v 0,1% TFA ve 20 minutách při průtoku 6 ml/minuta a detekci při 270 nm, čímž bylo získáno 55 mg čistého L970860.

Fyzikálně chemické a spektrální vlastnosti mumbaistatinu a laktonu L970860 jsou souhrnně uvedeny v tabulce 1.

Spektroskopické	údaj e	pro tyto sloučeniny jsou uvedeny na
obrázcích 2, 3	a 5	až 10. Obrázky	1 a 4	ukazují HPLC
chromatogramy. v tabulce 1.	Obsah	j ednotlivých	obrázků	je uveden

Farmakologická charakterizace mumbaistatinu a laktonu L970860

Mumbaistatin fofát/pyrofosfátu.

Mumbaistatin silně inhibuje aktivitu translokázy glukózo-6-fosfátu z mikrosomů potkanů, přičemž hodnota IC50 je 25 nM. Naproti tomu mumbaistatin inhibuje aktivitu fosfatázy mikrosomů rozrušených detergentem s hodnotou IC50 > 100 μΜ, což ukazuje na vysokou specifičnost pro translokázu. neovlivňuje aktivitu

Mumbaistatin je translokázy reverzibilní a kompetitivní inhibitor translokázy glukózo-6-fosfátu.

Tabulka 1

	mumbaistatin	L970860
Povaha sloučeniny	červenohnědá tuhá	červenohnědá tuhá
Rozpustnost	MeOH a DMSO	MeOH a DMSO
Teplota tání	>250°C (rozkládá se)	>250°C (rozkládá se)
[a]D	-50° (c 0,024, MeOH)	-45° (c 0,02, MeOH)
HPLC (vysokotlaká kapalin, chromatografie)	retenční čas: 10,83 minuty viz obr. 1	retenční čas: 13,08 minuty viz obr. 4
ESI-MS (elektrorozptyl. ionizační hmotnost)	547 (M-H)	529 (M-H)
Sumární vzorec	C2gH2o022	C2gHigOn
UV spektra	viz obr. 2	viz obr. 5
IR spektra	viz obr. 3	viz obr. 6
:H NMR	viz obr. 9 (600 MHz, D4-MeOH, 27 °C)	viz obr. 7 (300 MHz, D6-DMSO)
13C NMR	viz obr. 10 (150 MHz, D4-MeOH, 27 °C)	viz obr. 8 (75 MHz, D6-DMSO)

Mumbaistatin byl dále testován na izolovaných potkanních hepatocytech na účinek na výstup glukózy. Ukázalo se, že inhibuje jak fruktózou indukovanou glukoneogenezi, tak i glukagonem indukovanou glykogenolýzu s hodnotami IC50 0,3 μΜ a 0,6 μΜ, v uvedeném pořadí.

L970860 inhibuje aktivitu translokázy glukózo-6-fosfátu z mikrosomů potkanů, přičemž hodnota IC₅₀ je 1,8 μΜ.

·

Doklad o uložení v Německé sbírce mikroorganismů (DSMZ)

3UDAPEST TREATY ON THE INTERNATIONAL RECCGNITION OF THE DEPOSIT OF M1CROORGANISMS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDUŘE

INTERNATIONAL FORM

Koechsc Marion Rousssl GmbH

65926 Frankfurt

RECEIPT IN THE CASE OF AN ORIGINÁL DEPOSIT issued pursuant to Rule 7.1 by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY identified □( the tonem of this page

1. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM
Identification reference gjven by the DEPOS1TOR: KIL 008003	Acccssion number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORTTY: DSM 11641
II. SCIENTIFIC DESCRIPT1ON AND/OR PROPOSED TAXONOMIC DESIGNATION
The micrcorsanism identified under I. abovc was acccmpanied by: ( ) a scicnufx dcscripuon (X ) a proposed taxonomie designafion (Mark with a cross where applicabJc).
III. RECEIPT AND ACCEPTANCE
This International Dcpositary Authority acccpts the microorcanism itíenúficd under I. above, which was rcceived by it on 19 97-07-04 (Dáte of the originál deposit)1.
IV. RECEIPT OF REQUEST FOR CONVERSION
The microorganism idenúfied under l above was rcceived by this International Dcpositary Authoriry on (dáte of originál deposit) and a request to conven the originál deposit to a deposit under the Budapcst Treary was rcceived by it on (dáte of receipt of request for convcnion).
V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Namc: · DSMZ-DEUTSCKE SAMMLUNG VON M1KROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Addrcsi: Maschcrodcr Wcg 1 b D-3SI24 Braunschweig	Signarurx(s) of personfs) having the powcr io represent the International Dcpositary Authonry or of authortxcd officiaJ(s): Dáte: 1997-07-07

' Where Rule 6.4 (d) applies. such dáte is the dáte on wmeh the sutus of intemauonal dcpositary authoriry was acquired. Furm DSMZ-BP/4 (sulc page) Ú196 • · ·· · · «

BUDAPEŠŤ TREATY ON THE INTERNATIONAL RECOGNIT1ON OF THE DEPOSIT OF MICROORGANISWS FOR THE PURPOSES OF PATENT PROCEDUŘE

INTERNATIONAL FORM

Hoechst Marion Roussel GmbH

55926.Frankfurt

VIABÍLITY STATEMENT issucd purcuant to Rule 102 by the ÍNTERNaTIONaL DEPOSITARY AUTHORITY idcndficd 3t the bottom of this page

I. DEPOSITOR	II. IDENTIFICATION OF THE MICROORGANISM
Name: Hoechsc Marion Roussel GmbH Addxess: 55 926 Frankfurt	Aceession number given by the INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY; DSM 11641 Dále of ihe deposit or the transfer': 1997-07-04
III. VIABÍLITY STATEMENT
The viabílity of the microorginism identiftcd under 11 abovc was tested on 1957-07-04 5 . On ihat dáte. the said microorganism was (X)J viable ( )J no longer viable
IV. CONDITIONS UNDER WHICH THE VIABÍLITY TEST HAS BEEN PERFORMED
V. INTERNATIONAL DEPOSITARY AUTHORITY
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Address: Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig	Signaturc(s) of penonfi) having the power to rtpresent the International Depositary Authority or of authoriaed official(s): Dáte: 1997-07-07

Indieate the dáte of originál deposit or, wherc a new deposit or a transfer has bcen madc. the most recent rclcvant tíatc (dáte of the new deposit or dáte of the transfer).

In the cascs refcrrcd to in Rule 10.2(a) (ií) and (ni), refer io the most recent viabílity test

Mark wíth a cross the applicable box.

Fill in »f the information has been requested and if the rcsults of the test were negative.

Form DSMZ>8P/9 (sole page) 0196

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Mumbaistatin, sloučenina s molekulovým sumárním vzorcem C23H20O12, která je charakterizována svým ¹H NMR spektrem (obr. 9) a ¹³C NMR spektrem (obr. 10), a jeho farmaceuticky přijatelné soli a deriváty ve všech stereoizomerních a tautomerních formách.
2. 2. Mumbaistatin, sloučenina s molekulovým sumárním vzorcem C28H20O12, která je připravitelná kultivací mikroorganismů druhu Streptomyces HIL-008003 (DSM 11641) v aerobních podmínkách v živném médiu obsahujícím zdroj uhlíku a dusíku, a následnou izolací a purifikaci obvyklým způsobem, a jeho farmaceuticky přijatelné soli a deriváty ve všech stereoizomerních a tautomerních formách.
3. 3. Lakton L970860, sloučenina s molekulovým sumárním vzorcem Ο₂₈Η₁₈Οιι, která je charakterizována svým ¹H NMR spektrem (obr. 7) a ¹³C NMR spektrem (obr. 8), a jeho farmaceuticky přijatelné soli a deriváty ve všech stereoizomerních a tautomerních formách.
4. 4. Způsob přípravy mumbaistatinu podle nároku 1 nebo 2 nebo laktonu L970860 podle nároku 3, nebo jejich solí nebo derivátů, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy se kultivuje mikroorganismus druhu Streptomyces HIL-008003 (DSM 11641) v aerobních podmínkách v živném médiu obsahujícím zdroj uhlíku a dusíku, a následně se mumbaistatin izoluje a purifikuje obvyklým způsobem, a případně se konvertuje na lakton *· * · · · ···· >··· ·«· ··· »··* »t

   L970860 nebo soli nebo deriváty mumbaistatinu nebo laktonu.
5. 5. Kmen Streptomyces sp. HIL-008003 (DSM 11641).
6. 6. Mumbaistatin podle nároku 1 nebo 2 nebo lakton L970860 podle nároku 3, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli nebo deriváty, pro použití jako léčivo.
7. 7. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje účinné množství mumbaistatinu podle nároku 1 nebo 2 nebo laktonu L970860 podle nároku 3, nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí nebo derivátů, a dále obsahuje farmaceuticky přijatelný nosič.
8. 8. Mumbaistatin podle nároku 1 nebo 2 nebo lakton L970860 podle nároku 3, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli nebo deriváty, pro použití jako inhibitor translokázy glukózo-6-fosfátu.
9. 9. Mumbaistatin podle nároku 1 nebo 2 nebo lakton L970860 podle nároku 3, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli nebo deriváty, pro použití k léčení diabetes mellitus.

   1 /10