JPH04159289A - Ｗａ３９０９物質、その製法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はＷＡ３９０９物質、その製法及び用途に関する
ものである。ＷＡ３９０９物質は、ダクチロスポランジ
ウム属菌の培養物から分離採取された従来未知の新規物
質であり、すぐれた免疫抑制作用を示し、臓器移植等に
伴う拒絶反応の抑制剤、自己免疫疾患の予防治療剤等各
種医薬として有用である。

（従来の技ｖ＃） 生体には自己成分に対する免疫応答を抑制する機構があ
るが、この抑制機構が障害を受けると。

自己成分に対する免疫応答がおこり、抗原抗体反応によ
る病理的変化に基づく自己免疫疾患と称する症状が種々
呪われてくる。この自己免疫疾患としては、例えば溶血
性貧血、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、
リウマチ熱等が挙げられるが、これらは比較的重篤な症
状を示すものが多いことは良く知られているところであ
る。

しかしながら、これらの自己免疫疾患は、難病と一般的
にいわれるように、有効な治療法がないのが現状である
。

また一方、生体臓器移植や体内埋込型人工臓器には、免
疫応答の結果による拒絶反応が常に付随しており、この
拒絶反応を抑制しなければ臓器移植や人工臓器の埋込み
は不可能となり、尊い人命が失われることにもなる。

しかしながら現在のところ、効果にすぐれ且つ安全性の
高い満足できるような免疫抑制剤は開発されていないの
が技術の現状である。

（発明が解決すべき問題点） 本発明は、生体臓器移植等に伴う拒絶反応の抑制、自己
免疫疾患の予防、治療等各種医療の分野において、すぐ
れた免疫抑制剤の開発が強く望まれていることに鑑みて
なされたものであって、新規な免疫抑制物質を開発する
目的でなされたものである。

（問題点を解決するための手段） 本発明は、上記した目的を達成するためになされたもの
である。

そこで本発明者らは、安全性の面から天然物に着目し、
微生物の発酵生産物に注目するに至り、各種微生物を検
索した結果、千葉系で採取された土壌から新たに分離し
た放線菌ＮＱ３９０９株が培善液中に目的物質を蓄積す
ることを発見した。そして更にこの物質についてその理
化学的性質を詳細に研究したところ、従来未知の新規物
質であることを確認し、この物質を新たにＷＡ３９０９
物質と命名し、そして更に研究の結果、その工業的製法
を確立し、本発明を完成するに至った。

本発明に係るＷＡ３９０９物質は、次の理化学的性質を
有している。

（１）物質の色及び状態 淡黄色柱状結晶 （２）融点 １３５〜１３８℃ （３）比旋光度 〔α〕も３：　＋１１．０’（Ｃ＝１．０、メタノール
）（４）分子式 ％式％ 計算値（％）　（Ｃ□ｏＧ５　Ｎｏ１３・Ｈ２Ｏに対し
）：Ｃ・６４・３９；Ｈ１７，８７；　Ｎ、１．６３実
測値（％）：Ｃ１６４，６０；　Ｈ１７，７９；　Ｎ、
１．４７（６）溶剤に対する溶解性 メタノール、エタノール、酢酸エチル、アセトン、アセ
トニトリル、クロロホルム。

塩化メチレン、ジエチルエーテルに易溶；水、ｎ−ヘキ
サンに不溶。

（７）呈色反応 硫酸セリウム反応：陽性 ヨード反応：陽性 過マンガン酸カリウム反応：陽性 塩化第二鉄−フエリシアン化カリウム反応：陽性エール
リッヒ反応：陽性 ニンヒドリン反応：陰性 （８）薄層クロマトグラフィ 犀定机　　　　ＩＩ　　　ｍ　　　　　　　Ｒｆ（ｉ！
シリカゲル　塩化メチレン：メタノール　０．４９（ｔ
Ｏ：１） 酢酸エチル　　　　　　　　０．４０ （９）赤外吸収スペクトル ｖＫＢ’　：　３４００．２９６０．２９３０．１７２
０．１６９０゜ａｘ １６２０、１４５０．１３７０．１２９０．１２５０．
１１７０゜１１１０、１１００．　９９０．９７０ｃｍ
−１（ｌＯ）紫外吸収スペクトル λメタ’＝（ｌｏｇ　ｔ　　）：　　２２８（５３，６
００）。

履ａｘ ２３５　（ｓｈ）　（５０，４００）　、　２４８　（
４４、３００）　。

２８０（ｓｈ）（１９，７００）ｎｍ λメタノール−ＨＣＱ（ｌｏｇ　ｉ　　）：　　２２９
（５５，６００）。

ａｘ ２３５（ｓｈ）　（５３，６００）　、　２４８（ｓｈ
）　（４２，０００）　。

２８０（ｓｈ）　（１８，３００）ｎｍλメタ′−ルー
”ＯＨ（ｌｏｇ　ｔ　）：　　２２８（５２，１００）
。

票ａｘ ２３５（ｓｈ）　（５０，４００）　、２４８（４６，
５００）　。

２７８（ｓｈ）　（２２，３００）ｎｍ（Ｉｔ）１Ｈ核
磁気共鳴スペクトル （ＣＤ２ＣＱ２，４００ＭＨｚ） δ：　１３．２５（ＩＨ，ｂｒ　ｓ）、８．６７（ＩＨ
，ｂｒ　ｓ）、７．２４（ｌ）Ｉ、　ｄ、　Ｊ＝１５．
５Ｈｚ）、６．８７（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝１５．５Ｈｚ）
、６．６１−６．５０（２１（、ｍ）。

６．１４（ＩＦＩ、　ｄｄ、　Ｊ＝１５．５　ａｎｄ　
１０．５Ｈｚ）。

５．９４（ＩＨ，ｍ）、　５．８３〜５．７６（２Ｈ，
ｍ）。

５．６９〜５．６０（２Ｈ，ｍ）、 ５．４１（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ＝１５．５　ａｎｄ　８Ｈ
ｚ）、５．１４（１１（、ｄｄ、　Ｊ＝１５　ａｎｄ　
９Ｈｚ）、５．０５（ＩＨ，ｍ）、４．９０（ＬＨ，ｍ
）、４．６６（ＩＨ，ｂｒ　ｄ、　Ｊ＝４Ｈｚ）、４．
１７〜４．０４（２Ｈ，■）、３．９１（ＬＨ，ｍ）。

３．４７（３Ｈ，Ｓ）、３．２９（ｉｌｌ、　＋ａ）、
３．２４（３Ｈ，ｓ）、２．６５〜２．４８（５Ｈ，Ｉ
Ｉ）、２．３７（ＩＨ，ｍ）、２．１５〜２．０６（２
Ｈ，ｍ）、２．００〜ｉ、８７（２Ｈ，ｍ）、１，９６
（３）１．　ｓ）、１．９３（３８，ｓ）、１．７７（
ＩＨ，ｍ）、１．７１（３）１．　ｂｒ　ｄ、　Ｊ＝７
Ｈｚ）、１．５１（ＬＨ，ｍ）。

１．２９（ＩＨ，ｍ）、１．０５（３）１．　　ｄ、　
　Ｊ：６．５Ｈｚ）、１．００（３Ｈ，ｄ、　　Ｊ＝７
１１ｚ）、０．９２（３）１．　　ｄ、　　Ｊ＝６．５
Ｈｚ）、０．８２（３８，ｄ、Ｊ＝６．５）１ｚ）、０
．８１（３Ｈ，ｄ、　　Ｊ＝７）１ｚ）。

（１２）１３Ｃ核磁気共鳴スペクトル （ＣＤ２ＣＱ２，１００ＭＨｚ） δ：　１９８．０　（ｓ）、１７５．４　（ｓ）、１６
７．５　（ｓ）。

１６４．８　（ｓ）、１６４．２　（ｓ）、１４３．９
　（ｓ）、１４３．４　（ｄ）、　１４１．７　（ｓ）
、１３３．８　（ｄ）、１３３．７　（ｄ）、１３３．
４　（ｄ）、１３３．３　（ｓ）、１３３．２７　（ｄ
）、　１３３．２　（ｄ）、１３１．３　（ｄ）、１３
０．１　（ｄ）、１３０．０　（ｄ）、１２７．２　（
ｄ）、１２５．５　（ｄ）、１１５．２　（ｓ）、９９
．９　ＣＢ）−８２，５（ｄ）、８１．３　（ｄ）、７
６．８　（ｄ）、７５．２　（ｄ）、　７５．１　（ｄ
）、７０．８　（ｄ）、６０．０　（ｑ）、５５．８　
（Ｑ）、　４１．８　（ｄ）、４１．７５　（ｔ）、４
１．５　（ｄ）、　４０．８（ｄ）、４０．１　（ｔ）
、　３７．７　（ｄ）、３７．１　（ｄ）、３２．６　
（ｔ）、２６．２　（ｔ）、２１．９　（（１）、２０
．３　　（ｑ）、ｔｓ、ｔ　　（ｑ）、１７．４　　（
Ｑ）、１４．１（９）、１３．３　　（ｑ）、　　９．
８　　（ｑ）、７．１　　（ｑ）。

（１３）物質の酸、塩基性の区分 弱酸性物質 本発明に係る１ｉｌＡ３９０９物質は、例えば本発明者
らが千葉系で採取した土壌から新たに分離した放線菌Ｎ
α３９０９によって生産される。放線菌Ｎα３９０９株
はダクチロスポランジウム属に属するものと認められ、
ダクチロスポランジウムエスピーＮｕ　３９０９（Ｄａ
ｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｓｐ、　Ｎｏ、３９
０９）と命名された。

本菌株の凍結乾燥サンプルは、工業技術院微生物工業技
術研究所（〒３０５、茨城系つくば市東ｌ−１−３）へ
ＦＥＲＭ　Ｐ−１１７４３の番号で寄託された。、（寄
託日＝　１９９０年９月２５日） ＷＡ３９０９物質の生産は、単に説明を目的として挙げ
ただけの本明細書記載の特定の微生物の使用に限定され
るものではないことを理解すべきである。

この発明は、記載の微生物からＸ線照射、紫外線照射、
Ｎ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロングアニジン、
２−アミノプリン等の変異処理により取得できる人工変
異株並びに自然変異株を含めてＷＡ３９０９物質を生産
しうる全ての変異株の使用をも包含するものである。

次にダクチロスポランジウムエスピーＮＱ３９０９（Ｄ
ａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕＩＩｓｐ、　Ｎｏ、３
９０９）の菌学的性質を示す。

本菌体の形態観察、培養性状、生理学的性質を調べるた
めの培地、方法は主にシャーリングとゴツトリーブ（１
）、ワックスマン（２）の方法に従った。

形態観察にはＨＶ寒天（３）も使用した。光学顕微鏡並
びに臨界点乾燥で試料調製後、走査型電子顕微鏡による
観察を行った。各観察は、主に３０℃、１４日間培養後
それぞれの観察を行った１色名は“メシューエン・ハン
ドブック・オブ・カラー”（４）から引用した。細胞壁
アミノ酸はベラカー等（５）及び山口（６）の方法に従
った。全菌体糖はロシュベリエ等の方法（７）で同定し
た。細胞壁のアシル型は内口と相国の方法（８）で調べ
た。

（１）形態的特徴 Ｎα３９０９株の栄養菌糸はよく発達し、不規則に分枝
するが、断裂しない。気菌糸形成は見られない。

ＨＶ寒天、リンゴ酸カルシウム寒天上で、栄養菌糸から
気中に立ちあがる突起が観察された。この突起は、単独
又は叉状で、０．５〜０．８　Ｘ　２〜５μ園の大きさ
を有する。各々の突起中には２〜６個の胞子様細胞が直
列に並んでいる。また、栄養菌糸には多くのグロボース
・ボディ（９）、（１０）が着生しているのが観察され
た。その大きさは０．８〜３．０μｍであった。

（２）培養性状及び生理的性質 本菌株の培養性状及び生理的性質を表１，２にそれぞれ
示す。炭素源利用性パターンを表３に示す、生育は多く
の培地で普通だが、全ての培地でグロボース・ボディが
ｔＲ察された、灰味赤色の可溶性色素がチロシン寒天培
地で産生された。

表　Ｉ　　Ｎｎ３９０９株の培養性状 培　　　地　　　　　　　　栄養菌糸の色　生育　可溶
性色素酵母エキス・麦芽エキス寒天　　橙（５Ａ６）　
　　豊富　　な　しオートミール寒天　　　　　　明る
い橙（６Ａ５）普通　　な　し無機塩・でんぷん寒天　
　　　明るい橙（６Ａ５）普通　　な　しグリセロール
・ アスパラギン寒天　　　　　　黄味白（４Ａ２）　　貧
弱　　な　しペプトン・酵母エキス・鉄寒天　　橙（５
Ａ７）　　　普通　　な　しチロシン寒天　　　　　　
　　赤味白（７Ａ２）　　貧弱　　灰味赤グルコース・
アスパラギン寒天　簿い橙（５Ａ３）　　ｆ通　　な　
しシュークローズ・硝酸寒天　　　黄味白（４Ａ２）　
　普通　　な　しカルシウム・リンゴ酸寒天　　　橙味
白（６Ａ２）　　貧弱　　な　しＨＶ寒天　　　　　　
　　　　　橙味灰（５Ｂ２）　　貧弱　　な　し表　２
　　ＮＧ３９０９株の生理的性質条　　件　　　　　　
　　　　　性　　質生育温度範囲　　　　　　　　　　
１４−３６℃（至適）（２４℃） ゼラチン液化　　　　　　　　　　　十ミルク凝固　　
　　　　　　　　　　　−ミルクペプトン化　　　　　
　　　　　−スターチ分解　　　　　　　　　　　　十
メラノイド色素産生　　　　　　　　−カルシウム・リ
ンゴ酸分解　　　　　−食塩耐性　　　　　　　　　　
≧２％、く３％セルロース分解　　　　　　　　　　　
−表３　　＆３９０９株の炭素源利用性 化合物　生　育 Ｄ−グルコース　　　　　＋ シュークロース　　　＋ Ｄ−キシロース　　　　　＋ Ｄ−フラクトース　　　＋ Ｌ−ラムノース　　　　　− ラフィノース　　　　　− Ｌ−アラビノース　　　− イノシトール　　　　−１ マンニトール　　　　− ＋：利用する。−：利用しない （３）全菌体化学分析 全菌体分解物の分析から、メソジアミノピメリン酸の存
在を示した。キシロースとアラビノースも検出された。

キシロースと７ラビノースの存在は本菌体がロシュベリ
エ等の分類（７）によるＤ型に属することを示す。アシ
ル型テストではグリコレートが検出された。

全菌体分析の結果から１本菌株は、細胞壁が■。

Ｄ型のアクチノプラネテス（Ａｃｔｉｎｏｐｌａｎｅｔ
ｅｓ）グループに属することを示す（１１）。気中への
突起構造は、未成熟な指型胞子のうと似ている。また豊
富なグロボース・ボディの着生は、ダクチロスポランジ
ウム（Ｄａｅｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）の特徴の
１つと考えられる。

そこで本菌株は、ダクチロスポランジウム（Ｄａｃｔｙ
ｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ）属（９）、（１１）に属す
るとするのが妥当と考えられ、そこで本菌株を Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｓｐ、　＆３９
０９と命名した口供用文献： （１）　Ｓｈｉｒｌｉｎｇ、　Ｅ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｄ
、　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ：Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆＳｔｒｅｐｔｏ園
ｙｃｅｓ　　５ｐｅｃｉｅｓ。

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙｓ　Ｉ
Ｌ　３１３−３４０．１９６６（２）　　Ｉａｋｓｍａ
ｎ、　　Ｓ、　　Ａ、：　　Ｔｈｅ　　ａｃｔｉｎｏｓ
＋ｙｃｅｔｅｓ　　Ｖｏｌ、２　：Ｃ１ａｓｓｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ、　１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ
ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｒａ　ａｎｄ
　５ｐｅｃｉｅｓ　：Ｔｈｅ　ｖｉｌｌｉａｍｓ　ａｎ
ｄ　Ｖｉｌｋｉｎｓ　Ｃｏ、、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ。

（３）Ｈａｙａｋａｗａ、Ｍ、、Ｈ＋　Ｎｏｎｏｍｕｒ
ａ　：Ｊ、　Ｆｅｒｍｅｎ、　　Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　
　６５．　５０１−５０９．１９８７（４）Ｋｏｒｎｅ
ｒｕｐ、Ａ、ａｎｄ　　Ｊ、Ｈ，Ｗａｎｓｃｈｅｒ　：
　ＭｅｔｈｕｅｎＨａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｃｏ１ｏｕ
ｒ、Ｍｅｔｈｕｅｎ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９７８（５）Ｂ
ｅｃｋｅｒ、Ｂ、、Ｍ、Ｐ、Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ、
Ｒ，Ｅ。

Ｇｏｒｄｏｎ　　ａｎｄ　　Ｈ，Ａ＋　Ｌｅｃｈｅｖａ
ｌｉｅｒ　：　Ｒａｐｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉ
ｏｎ　　ｂｅｔｗｅｅｎ　　Ｎｏｃａｒｄｉａ　　ａｎ
ｄＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　　ｂｙ　　ｐａｐｅｒ　
　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｏｆｗｈｏｌｅ−ｃ
ｅｌｌ　　ｈｙｄｒｏｌｙｓａｔｅｓ　：　Ａｐｐｌ、
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

１２．４２１−４２３．１９６４ （６）Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、Ｔ、：　Ｃｏｍｐａｒｉｓ
ｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌｗａｌｌ　ｃｏｍｐｏｓ
ｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｌｙｄ
ｉｓｔｉｎｃｔ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ　：　Ｊ
、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　８９゜４４４−４５３
．１９６５ （７）Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ、Ｍ、Ｐ、＆　　Ｈ，Ａ
、Ｌｅｃｈｅｖａｌｉｅｒ　：Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｏ
ｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　　ａｓ　ａ　　ｃｒｉｔｅｒｉｏ
ｎ　　１ｎｔｈｅ　　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　
　ｏｆ　　ａｅｒｏｂｉｃａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ
、Ｉｎｔ、Ｊ、５ｙｓｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

２０、　４３５−４４３（１９７０）。

（８）Ｕｃｈｉｄａ、Ｋ　　＆　　Ｋ、Ａｉｄａ　：　
Ａｃｙｌ　　ｔｙｐｅ　ｏｆｂａｃｔｅｒｉａｌ　　ｃ
ｅｌｌ　　讐ａｌｌ　：　Ｉｔｓ　　ｓｉｍｐｌｅｉｄ
ｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　　ｂｙ　　ｃｏｌｏｒｉｉ
ｅｔｒｉｃ　　ｍｅｔｈｏｄ、Ｊ。

Ｇｅｎ、　　Ａｐｐｌ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　　
２３．　２４９−２６０（１９７７）。

（９）Ｔｈｉｅｍａｎｎ、Ｊ、Ｅ、；　Ｈ，Ｐａｇａｎ
ｉ　　＆　　Ｇ、Ｂｅｒｅｔｔａ　：Ａ　　ｎｅｗ　　
ｇｅｎｕｓ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　Ａｃｔｉｎｏｐｌａ
ｎａｃｅａｅ　：Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ
　　ｇｅｎ、ｎｏｖ、　　＾ｒｃｈ。

阿１ｃｒｏｂｉｏ１．．　５８　：　４２−５２．　１
９６７（１０）Ｓｈａｒｐｌｅｓ、　　Ｇ、　　Ｐ、＆
　　Ｓ、　　Ｔ、　　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　：　Ｆｉｎｅ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　ｇｌｏｂｏ
ｓｅ　　ｂｏｄｉｅｓ　　ｏｆＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒ
ａｎｇｉｕｍ　　ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｅ。

Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、８４　　：　　２
１９−２２２．１９７４（１１）す１ｌｌｉａ＋ｍｓ、
Ｓ、Ｔ　：　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　ｉ＋ａｎｕａｌ　ｏｆ
ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　　ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、
Ｖｏｌ、４゜Ｖｉｌｌｉａ＋ｍｓ　　ａｎｄ　　Ｖｉｌ
ｋｉｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、１９８９本発明に係る
ＷＡ３９０９物質は、ダクチロスポランジウム属に属す
る該物質生産菌（例えばＤａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇ
ｉｕｍ　ｓｐ、　Ｎｃｉ３９０９）を資化しうる炭素及
び窒素源を含む栄養培地中に接種し、好気条件下で培養
することにより（例えば、振どう培養、通気攪拌培養等
）、生産せしめることができる。

炭素源としては、グルコース、シュークロース、澱粉、
フラクトース、グリセリンその他の炭水化物を使用する
のが好ましい。

窒素源としては、オートミール、イーストエキストラク
ト、ペプトン、グルテンミール、綿実粉。

大豆ミール、コーンステイープリカー、乾燥イースト、
小麦胚芽、落花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するの
が好ましいが、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿
素、アミノ酸等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使
用することができる。

これらの炭素源及び窒素源は、併用するのが有利である
が、純粋なものを必らずしも使用する必要はない。純粋
なものには、生長因子や微量要素が含まれているからで
ある。

必要ある場合には、例えば次のような無機塩類を培地に
添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン
酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、マグネ
シウム塩、銅塩、コバルト塩等。

特に、培地が強く発泡するのであれば、必要あるときに
、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物油、シリコン
等を添加してもよい。

目的物質を大量に工業生産するには、他の発酵生産物の
場合と同様に１通気攪拌培養するのが好ましい。少量生
産の場合は、フラスコを用いる振どう培養が好適である
。

また、培養を大きなタンクで行う場合、　ＷＡ３９０９
物質の生産工程において菌の生育遅延を防止するため、
はじめに比較的少量の培地に生産菌を接種培養した後、
次に培養物を大きな生産タンクに移してそこで生産培養
するのが好ましい、この場合、前培養に使用する培地及
び生産培養に使用する培地の組成は１両者ともに同一で
あってもよいし必要あれば両者を変えてもよい。

培養は通気攪拌条件で行うのが好ましく、例えばプロペ
ラやその他機械による攪拌、ファーメンターの回転また
は振どう、ポンプ処理、空気の吹込み等既知の方法が適
宜使用される。通気用の空気は滅菌したものを用いる。

培養温度は、本１１Ａ３９０９物質生産菌が本物質を生
産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は１〜４０℃、
好ましくは１４〜３６℃で培養するのがよい。培養時間
は、培養条件や培養量によっても異なるが通常は約１日
〜１週間である。

発酵終了後、培養物から目的とする１１Ａ３９０９物質
を回収する。すなわち、菌体は、直接水及び／又は有機
溶媒による抽出、あるいは、これを機械的に又は超音波
等既知の手段を用いて破壊した後、水及び／又は有機溶
媒で抽出した後、常法にしたがって回収、精製する。培
養液の場合は、直接、常法にしたがって回収、精製すれ
ばよい。

回収、精製方法としては、例えば、水、有機溶媒、これ
らの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグラフィー；単
一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が適宜単独であ
るいは組合わせて使用できる。

ＷＡ３９０９物質の回収、精製は上記のように既知の方
法を適宜利用して行うが、例えば次のようにしてもよい
。まず、培養物のアセトン抽出液を、酢酸エチル、ヘキ
サン、またはこれらの混合溶媒で抽出し、抽出液を蒸発
又は蒸留して濃縮する。濃縮残渣をクロマトグラフィ又
は再結晶処理して、必要あれば更に凍結乾燥してもよい
。

このようにして得たＷＡ３９０９物質は、遊離の形で使
用するほか、例えば次のような塩基で処理するといった
常法によって薬剤上許容できる塩の形で使用してもよく
、これらの塩類も本発明の権利範囲に包含される。

塩基として好適なものの例は次のとおりである：アルカ
リ金属（例えばナトリウム、カリウム等）、アルカリ土
金属（例えばマグネシウム、カルシウム等）、これらの
水酸化物又は炭酸塩、アルカリ金属アルコキサイド（例
えばナトリウムメトキサイド、ナトリウムエトキサイド
、カリウムｔ−ブトキサイド等）その他。

本発明に係る薬剤組成物は、ＷＡ３９０９物質及び／又
はその塩を有効成分としてこれに常用される無機又は有
機の担体を加えて、固体、半固体又は液体の形で、経口
投与剤のほか、外用剤等の非経口投与剤に製剤化する。

経口投与のための製剤としては１錠剤、丸剤、顆粒剤、
軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤、乳濁剤、懸濁
剤、シロップ剤、エリキシル剤等が挙げられる。非経口
投与のための製剤としては、注射剤、点滴剤、輸液、軟
膏、ローション、トニック、スプレー、懸濁剤、油剤、
乳剤、半開等が挙げられる１本発明の有効成分を製剤化
するには、常法にしたがえばよく、界面活性剤、賦形剤
１着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、
等張剤その他常用される佐薬を適宜使用する。

本発明に係る薬剤組成物の投与量は、その種類、治療な
いし予防対象疾病の種類、投与方法、患者の年令、患者
の症状、処理時間等によって相違するが、静脈投与の場
合は成人ひとり当り１日に有効成分（％ｌＡ３９０９物
質及び／又はその塩類）を０．１〜Ｌｏｏｋ／ｋｇ投与
し、筋肉投与の場合は同じ＜０．１〜１００■／ｋｇ投
与し、経口投与の場合も同じく１〜１０００■／ｋｇの
範囲内で投与する。

以下、本発明を実施例について更に詳しく説明する。

実施例１ （１）　１ｄＡ３９０９物質の発酵生産前培養培地 可溶性澱粉　　　　　１（％） シュークロース　　　　ｌ グルコース　　　　　　１ 綿実粉　　　　　　　１ ペプトン　　　　　　０・５ 大豆粉　　　　　　　０．５ ＣａＣＯ，０、１％ 本培養培地 酸加水分解澱粉　　　２（％） シュークロース　　　　２ 落花生粉　　　　　　　１ 大豆ミール　　　　　ｌ ＣａＣ０，０，２ ５００ｎ＋Ｑ容工ルレンマイヤーフラスコ３本に上記前
培養培地　１２０＋ｎＱを分注し、１２０℃、３０分間
滅菌した。この各々の培地に、約１週間前に継代した新
鮮なりａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ　ｓｐ、　Ｎ
（１３９０９（ＦＥＲＭ　Ｐ−１１７４３）株の斜面培
養物を１白金耳ずつ接種し、３０℃で３日間振どう培養
した。次に、上記本培養培地２０Ｑを３０Ｑ容のジャー
ファーメンタ−に注入し、１２５℃、３０分間滅菌した
後、前培養物を全量接種し、３０℃、５日間培養した。

攪拌は、２００ｒｐｍ、通気量は２０Ｒ／ｍｉｎで行な
った。

培養物中のｔｉｌＡ３９０９物質の量は、Ａ、ｎｉｇｅ
ｒを検定菌としたパルプ法による抗菌活性、または、１
（ＰＬＣ（カラム：　ＹＭＣＡ−３０２５−５１２０Ａ
　００５、溶媒＝７０％アセトニトリル０．１％Ｈ，Ｐ
Ｏ４、検出：　ＵＶ２５０ｎｍ、流量：　　１　ｍＱ／
ｍ１ｎ）で定量した。検定サンプルは、全ブロスに等量
のアセトンを添加し、濾過後、適量まで濃縮したものを
用いた。

培養５日目で、ブロースのｐＨは、６．９．　ＰＭＶ　
２８（２０００ｒｐｍ）、力価はｌＯｕｇ／ｍＱであっ
た。

（２）すＡ３９０９物質の抽出、精製 法のフローにしたがって、　ＷＡ３９０９物質の抽出及
び精製を行った。

ブロス　　１６１２ 濃縮物　　１５１２ シリカゲル　カラム　クロマトグラフィー１６Ｑの発酵
ブロスに等量のアセトン（１６Ｑ＞を添加し、十分に攪
拌した。これを室温で数時間放置後、濾過した。得られ
た濾液２８Ｑを減圧下で１５Ｑまで濃縮した。これを等
量の酢酸エチルで２回抽出し、酢酸エチル層を濃縮乾固
した。得られた残渣を３０Ｏｎ＋Ｑのシリカゲルカラム
（Ｓｉｌｉｃａｒ　ＣＣ−４゜Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄ
ｔ社製）に付し、ヘキサン、ヘキサン：酢酸エチル＝２
：１で展開後、ヘキサン：酢酸エチル＝１：１で溶出し
た。溶出区を濃縮乾固し、５０％アセトニトリルに溶解
後、３０ｃｍＲの逆相のＹＭＣゲルカラム（ＹＭＣ０Ｄ
Ｓ−Ａ　６０−２００／６０）に付し、７０％アセトニ
トリル、８０％アセトニトリルで展開後。

９０％アセトニトリルで溶出した。溶出区を濃縮乾固し
、酢酸エチル３ｗ＋Ｑに溶解後、１５＋Ｑのヘキサンを
添加し、目的物質を析出させ、８３■の淡黄色粉末を得
た。

（３）　ＷＡ３９０９物質の物理化学的性質このように
して得られたＷＡ３９０９物質の物理化学的性質は、先
に述べたとおりである。

本物質は、解析の結果、分子量８４０、分子式％式％ 値８６２．４３５３）に対する分子量、ＨＲＦＡＢ−Ｍ
Ｓ　ｍＨｚ　８６２゜４３９５）を有する新規物質であ
って、現時点ではポリエンマクロライドであると推定さ
れる。

実施例２ 実施例１で製造したＷＡ３９０９物質について、マウス
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）によるＴ細胞増殖抑制活性
の測定を次のようにして行い、該活性を確認した。

刺激細胞として１５００ｒａｄのＸ線を照射したＣ５７
ＢＬマウスの牌細胞をＩ×１０７個／ＩＩＱとなるよう
に、完全培地に懸濁した。応答細胞として、Ｂａ１ｂ／
ｅマウスの牌細胞を２Ｘ１０’個／厘Ｑとなるように、
完全培地に懸濁した。

９６穴平底プレートに両細胞懸濁液を１：１の割合で混
合し、５０μΩずつ分注した。そして、３７℃、５％Ｃ
Ｏ□インキュベーターにて４日間培養後、〔３Ｈ〕−チ
ミジンを加え、１晩培養し、チミジンの取り込み量より
Ｔ細胞の増殖抑制活性を測定した。

その結果ＷＡ３９０９物質は、ＭＬＲ系で、濃度依存的
に増殖抑制作用が認められた。またＥＣ，。値は、ＭＬ
Ｒの系で０．８６■ｇｕｙｓΩであった。

以上の結果から、Ｗ　Ａ　３９０９物質は免疫抑制作用
を有することが判明し、Ｗ　Ａ　３９０９物質は１例え
ば移植に伴う拒絶反応の抑制および自己免疫疾患の予防
治療等に有角であることがわかった。

実施例３　　錠剤の製造 （１）実施例１で製造した物質　　　ｓｏｇ（２）ラク
トース　　　　　　　　　９０ｇ（３）コーンスターチ
　　　　　　　２９ｇ（４）ステアリン酸マグネシウム
　　　１ｇ（１）、（２）及び（３）（但し１７ｇ）を
混合し、（３）（但し７ｇ）から調製したペーストとと
もに顆粒化した。

得られた顆粒に（３）（但し５ｇ）と（４）を加えてよ
く混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して、１
錠あたり有効成分（１）を５ｃｍｇ含有する錠剤１００
０個を製造した。

実施例４　　注射剤の製造 （１）実施例１で製造した物質　　　５ｇ（２）食塩　
　　　　　　９ｇ （３）クロロブタノール　　　　　　５ｇ（４）炭酸水
素ナトリウム　　　　　１ｇ（１）〜（４）の全成分を
蒸留水１０００ｔＱに溶解した後、アンプルに１ｍＲず
つ分注して、注射剤１０００本を製造した。

（発明の効果） 本発明はＷＡ３９０９物質を提供するものであるが、こ
の物質は従来未知の新規薬理活性物質であって、すぐれ
た免疫抑制作用を示し、医薬、例えば臓器移植等に伴う
拒絶反応の抑制剤、自己免疫疾患等の予防及び／又は治
療剤として、非常に有用である。

また、本発明によって、微生物を利用する上記物質の工
業的製法も確立された。

代理人　弁理士　戸　１）親　男 手続補正書 平成　２年１１月　９日

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）以下の物性を有することを特徴とするＷＡ３９０
   ９物質： （Ａ）融点 １３５〜１３８℃ （Ｂ）比旋光度 〔α〕＿Ｄ＾２＾３：＋１１．０°（Ｃ＝１．０、メタ
   ノール）（Ｃ）元素分析 計算値（％）（Ｃ＿４＿６Ｈ＿６＿５ＮＯ＿１＿３・Ｈ
   ＿２Ｏに対し）：Ｃ、６４．３９；Ｈ、７．８７；Ｎ、
   １．６３実測値（％）：Ｃ、６４．６０；Ｈ、７．７９
   ；Ｎ、１．４７（Ｄ）赤外吸収スペクトル ν＿ｍ＿ａ＿ｘ＾Ｋ＾Ｂ＾ｒ：３４００、２９６０、２
   ９３０、１７２０、１６９０、１６２０、１４５０、１
   ３７０、１２９０、１２５０、１１７０、１１１０、１
   １００、９９０、９７０ｃｍ＾−＾１
2. （２）ダクチロスポランジウム属に属するＷＡ３９０９
   物質生産菌を培養してＷＡ３９０９物質を生成せしめ、
   これを採取することを特徴とするＷＡ３９０９物質の製
   造方法。
3. （３）ＷＡ３９０９物質を有効成分とする免疫抑制剤。