JPH03297390A

JPH03297390A - Ｆｒ９０１３６２物質、その製法及び用途

Info

Publication number: JPH03297390A
Application number: JP2096389A
Authority: JP
Inventors: Toshihiro Shibata; 柴田　敏裕; Takanao Otsuka; 隆尚大塚; Shigehiro Takase; 茂弘高瀬; Hiroshi Terano; 寺野　紘; Masakuni Okuhara; 正國奥原
Original assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-04-13
Filing date: 1990-04-13
Publication date: 1991-12-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明はＦＲ９０１３６２物質、その製法及び用途に関
するものである。ＦＲ９０１３６２物質は、ストレプト
ミセス属菌の培養物から分離採取された従来未知の新規
物質であり、すぐれたＦＧＦレセプター拮抗作用、血管
新生阻害作用、細胞増殖抑制作用、抗腫瘍作用を示し、
医薬として有用である。

（従来の技術）固形腫瘍の増殖の際、腫瘍が血管新生を促し、新生血管
が腫瘍の増殖を維持することが知られている。そして、
血管内皮細胞の増殖には、繊維芽１３６０゜１２６０゜１２１０゜１１６０゜１１００゜細胞成長因子（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　
Ｆａｃｔｏｒ、　ＦＧＦ）等の細胞成長因子が必要であ
る。即ち、血管内皮細胞の表面上にはＩＧＦのレセプタ
ーが存在し、そこにＦＧＦが結合することにより細胞の
増殖が起こると考えられる。また、ＦＧＦは血管新生の
最初のステップである血管内皮細胞の遊走を促進するこ
とも知られている。

（発明が解決しようとする問題点）現在までに多数の抗腫瘍剤が開発されてきているが、完
全なものは未だ開発されてはいない。

そのひとつの理由は抗腫瘍剤のスクリーニングが生成し
た腫瘍の抑制ないし縮少、消滅を主たる対象として行わ
れていることである。

そこで本発明者らは発想の転換を行い、上記した腫瘍増
殖のメカニズムに鑑み、その基礎的な段階であるＦＧＦ
のレセプターへのｂｉｎｄｉｎｇ段階に注目し、この結
合を阻害する物質をスクリーニングすることにより、腫
瘍の増殖抑制ないし腫瘍の消滅をはかることとした。い
わば、本発明者らは間接的な方法による抗腫瘍効果を期
待したのである。

つまり本発明の直接の目的は、すぐれたＦＧＦレセプタ
ー拮抗物質を開発することである。

また本発明の目的は、更に上記を推進せしめて、すぐれ
た血管新生阻害剤、細胞増殖抑制剤を開発すること、そ
して最終的には卓越した抗腫瘍剤を開発することである
。

（問題点を解決するための手段）本発明は上記目的を達成するために既知の化学物質につ
いてのスクリーニングを行ったけれども目的達成には至
らなかった。

そこで本発明者らは微生物の発酵生産物に着目し、各種
微生物を検索した結果、香川系の土壌から分離した放線
菌４６９５２が培養液中に目的物質を蓄積することを発
見した。そして更にこの物質についてその理化学的性質
を詳細に研究したところ。

従来未知の新規物質であることを確認し、この物質を新
たにＦＲ９０１３６２物質と命名し、そして更に研究の
結果、その工業的製法を確立し、また血管新生阻害作用
、細胞増殖抑制作用、抗腫瘍作用も併せて確認し、本発
明を完成に至った。

本発明に係るＦＲ９０１３６２物質は、次の理化学的性
質を有している。

（１）物質の色及び状態黄色粉末（２）酸性、塩基性、中性の区別酸性（３）比旋光度〔α）Ｄ　＋８２°（Ｃ＝０．５、ジメチルスルホキシド）（４）　　元素分析実測値（％）：　Ｃ，４５，８５；　Ｈ，４，１６；　
Ｎ、　６．０１；ＣＱ、１２．９４（５）溶剤に対する溶解性水（中性〜アルカリ性）に易溶；メタノール、アセトニ
トリルに雛溶；水（酸性）、ヘキサンに不溶。

（６）呈色反応硫酸セリウム反応：陽性ヨウ素蒸気反応：陽性ニンヒドリン反応：陰性工−リッヒ反応：陰性モーリッシュ反応：陰性塩化第二鉄反応：陰性（７）薄層クロマトグラフィ（４：３）率　シリカゲルプレート、Ｋｉｅｓｅｌｇｅｌ　６０　
Ｆ２，４（Ｅ、　Ｍｅｒｃｋ製）傘傘　　Ｅ、　　Ｍｅ
ｒｃｋ製（８）紫外吸収スペクトル λメタノール　（ｌｏｇ　ｉ　　）：　　２４２（ｓｈ
）、　　３０２．　３５６ｎｍλメタノールーＮＨ４０
Ｈ（ｌｏｇ　Ｅ　　）：　　２４４．　２９８．　３５
６ｎｍａｘ（９）赤外吸収スペクトルＢｒ ν□Ｘ：　３３５０．１６４０．１５６０．１５００．
１４２０゜１３６０、　１２６０．　１２１０，１１６
０，１１００゜１０６０．１０１０．９８０，８６０，
７８０ｃｍ−１（１０）　”Ｈ核磁気共鳴スペクトル（４００ＭＨｚ、　ＤＭＳＯ−ｄ、　ａｔ６０℃）δ：
　１０．８３（ＬＨ。

ｂｒｏａｄ）、８．３８（ｉｔ（、ｄ、　Ｊ＝６Ｈｚ）
、８．１０（ＩＨ。

ｄ、Ｊ：８Ｈ２）、８．０３（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝９Ｈｚ
）、７．９１（ＩＨ，ｓ）、７．８０（１）１．　ｄｄ
、　Ｊ：２Ｈｚ　ａｎｄ９Ｈｚ）、７．４９（１）１．
　ｄ、　Ｊ＝８Ｈｚ）、７．４７（（１）１゜ｄ、　Ｊ
＝８Ｈｚ）、　７．４０（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝６）１ｚ）
、７．２９（１Ｂ、　ｂｒｏａｄ）、７．２４（ＩＨ，
ｂｒｏａｄ）、７．２３（１）１）、　７．１８（ＩＨ
，ｍ）、７．１６（ＬＨ，ｓ）、７．０８（ＩＨ，ｄｄ
、　Ｊ＝３Ｈｚ　ａｎｄ　８Ｈｚ）、６．８９−６．８
２（３Ｈ，ｍ）、６．８６（２Ｈ，ｄ、　Ｊ＝８Ｈｚ）
、６．６５（２Ｈ，ｍ、　Ｊ：８Ｈｚ）、５．５２（Ｉ
Ｉ（、ｄ、　Ｊ＝３Ｈｚ）、５．４８（ＬＨ，ｄ、　Ｊ
：９Ｈｚ）、５．４４（ｌ）ｌ、ｄ。

Ｊ：８Ｈ２）、５．１３（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝３）１ｚ）
、４．９７（ＩＨ。

ｄ、　Ｊ＝６）１ｚ）、４．８５（ＩＨ，ｂｒｏａｄ、
　Ｊ＝１２Ｈｚ）、４．７１（１）１．ｄ、　Ｊ＝６Ｈ
ｚ）、４．１０（ＩＨ，ｍ）、３．４５（１）１．　ｍ
）、３．３３（ＩＨ，ｍ）、２．９９（ＬＨ。

ｍ）、２．９３（３Ｈ，Ｓ）、２．８９（ＩＨ，ｍ）（
ｔｉ）”３Ｃ核磁気共鳴スペクトル（１００ＭＨｚ、ＤＭＳＯ−Ｃ６ａｔ６０℃）δ　：　
１８１．３（ｓ）、１７２．５（ｓ）、１７０．３（ｓ
）、１７０．２（ｓ）、１６９．８（ｓ）、１６７．４
（ｓ）、１６７．０（ｓ）、１６６．６（ｓ）、１６４
．２（ｓ）、１５５．８（ｓ）、ｔ５５．４（ｓ）、１
５４．０（ｓ）、１５２．７（Ｓ）、１４９．８（Ｓ）
、１３９．４（ｓ）、１３６．５（ｓ）、１３４．７（
ｓ）、１３１．８（Ｓ）、１３１．４（ｄ）、１３１．
２（ｓ）、１３０．９（ｄ）、１３０．８（ｄ）、１２
９．５（ｄ）、１２７．６（ｄ）ｘ２．１２７．２（ｄ
）、１２６．９（ｓ）、１２６．６（ｄ）、１２６．４
（ｓ）、１２４．９（ｓ）、１２４．０（ｓ）、１２３
．９（ｄ）　　、　　１２３．６（ｄ）、１２３．４（
ｄ）、１２２．９（ｓ）、１２２．３（Ｓ）、１２２．
０（ｄ）、１１８．５（ｄ）、１１４．７（ｄ）ｘ２．
１１４．６（ｄ）、１１４．５（ｄ）、１１２．７（ｓ
）、１１１．９（Ｓ）、１１０．９（ｄ）、６２．３（
ｄ）、５８．２（ｄ）、５７．５（ｄ）、５５．４　（
ｄ）、５５．２（ｄ）、５２．６（ｄ）、３４．１（ｔ
）、３ｏ、９（ｑ）、２８．５（ｔ）本発明に係るＦＲ９０１３６２物質は、例えば本発明者
らが香川系で採取した土壌から新たに分離した放線菌Ｎ
（１６９５２によって生産される。放線菌Ｎα６９５２
はストレプトミセス属に属するものと認められ、ストレ
プトミセス・コエルレセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅ
ｓｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）と同定された。

本菌株の凍結乾燥サンプルは、工業技術院微生物工業技
術研究所（〒３０５、茨城系つくば市東１−１−３）　
ヘＦＥＲＭ−Ｐ　ＮＣ１１３６４の番号で寄託された。

（寄託日＝　１９９０年３月２０日）ＷＳ６９５２物質の生産は、単に説明を目的として挙げ
ただけの本明細書記載の特定の微生物の使用に限定され
るものではないことを理解すべきである。

この発明は、記載の微生物からＸ線照射、紫外線照射、
Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、
２−アミノプリン等の変異処理により取得できる人工変
異株並びに自然変異株を含めてＷＳ６９５２物質を生産
しうる全ての変異株の使用をも包含するものである。

次にストレプトミセス・コエルレセンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ　ｅｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ）　ＮＣ６９
５２の菌学的性質を示す。

本菌体の形態観察、培養性状、生理学的性質を調べるた
めの培地、方法は主にシャーリングとゴツトリーブ（１
）、ワックスマン（２）に従った。３０℃、１４〜２１
日間培養後それぞれの観察を行った。色名は“メシュー
エン・ハンドブック・オブ・カラー（３）から引用した
。炭素源の利用性はプリドハム・ゴツトリーブの方法（
６）に従った。生育温度は酵母エキス・麦芽エキス寒天
培地、温度勾配機（アトバンチツク東洋、ＴＮ−３）を
用いた。細胞壁の分析はベラカー等の方法（４）、山口
の方法（５）に従った・（１）形態的特徴オートミル寒天、酵母エキス・麦芽エキス寒天。

無機塩・でんぷん寒天培地上で３０℃、１４日培養後、
光学及び電子顕微鏡観察を行った。栄養菌糸はよく発達
し断裂しない。気中菌糸は単純分枝しらせん状の胞子連
鎖を形成する。１つの胞子連鎖は３０個以上の胞子を連
鎖する。胞子は、とげ状の表面を有し、大きさは０．５
−０．８　ｘ　Ｏ，８−１，２μｍの卵型であった。菌
核、胞子のう、遊走子等は観察されなかった。

（２）培養性状結果を表１に示す。気菌糸は青味灰色を呈する。

生育裏面は酵母エキス・麦芽エキス寒天、グリセリン・
アスパラギン寒天上で茶色、無機塩・でんぷん寒天上で
は灰味黄色を呈する。メラノイド色素生産はＩＳＰ　１
ブロス、チロシン寒天でみられた。

他の可溶性色素の生産はみられなかった。

表　Ｉ　　Ｎｏ６９５２株の培養性状培　　地酵母エキス・麦芽エキス寒天培養性状Ｇ：良好Ａ：豊富、青味法（２３Ｄ３）Ｒ：茶（６Ｅ７）〜茶味橙（５Ｂ４）Ｓ：なしＧ：良好Ａ：豊富、青味法（２３Ｄ３）Ｒ：灰味黄（２Ｂ３）Ｓ：なしＧ：良好Ａ：豊富、青味法（２３０３）Ｒ：薄い黄（４Ａ３）〜灰味黄（２Ｂ３）Ｓ：なしオートミール寒天無機塩・でんぷん寒天グリセリン・アスパラギン寒天　Ｇ：良好Ａ：豊富、青
味法（２３０３）Ｒ：茶（６Ｄ７）Ｓ：なしＧ：良好Ａ：希薄、白（ＩＡＩ）Ｒ：茶（６Ｆ５）Ｓ：薄い茶Ｇ：良好Ａ：豊富、青味法（２３Ｃ２）Ｒ：暗い茶（８Ｆ４）Ｓ：茶Ｇ：良好Ａ：希薄、白（ＩＡＩ）Ｒ：灰味橙（５Ｂ３）Ｓ：なしシュークロース・硝酸寒天ペプトン・酵母エキス・鉄寒天チロシン寒天略号　Ｇ：生育　Ａ：気菌糸　Ｒ：生育裏面の色Ｓ：可
溶性色素（３）細胞壁タイプＮα６９５２株の全菌体分解物の分析の結果、ＬＬ−ジアミノピメリン酸の存在が確認できた。従って本菌株の
細胞壁は■型であると考えられる。

（５）生理的性質生理的性質と炭素源の利用性の結果を表２．３にそれぞ
れ示す。

生育温度範囲至適生育温度ゼラチン液化ミルク凝固ミルクペプトン化でんぷん加水分解メラノイト色素生産セルロース分解１１℃−３９°Ｃ３１℃ わずかに陽性陰性陽性陽性陽性陰性表　３Ｎ０６９５２株の炭素源利用性炭素源　　　生　育Ｄ−グルコース　　　　　　　　＋シュークロース　　　　　　　十〇−キシロース　　　　　　　　　＋Ｄ−フラクトース　　　　　　　＋Ｌ−ラムノース　　　　　　　　　＋ラフィノース　　　　　　　　＋Ｌ−アラビノース　　　　　　　＋イノシトール　　　　　　　　＋マンニトール　　　　　　　　＋＋：利用する。

形態Ｉｉｌ！察及び化学分析の結果から、Ｎα６９５２
株はストレプトミセス属に属すると考えられる（７）。

そこで本菌株を文献に記載された回置の種と比較した（
８）−（１２）。その結果、本菌株はストレプトミセス
・コエルレセンスと極めて近似していることを認めたの
で、Ｎ１１６９５２株と、ストレプトミセス・コエルレ
センスＪＣＭ　４３６０両株について詳細に比較実験を
行った。その結果、雨林の性質は表４に示す若干の相違
点を除き殆ど同一であった。これらの相違は雨林を別種
とみなすには不充分であると考えられる。そこで、Ｎα
６９５２株をストレプトミセス・コエルレセンスと同定
し、ストレプトミセス・コエルレセンスＮα６９５２と
命名した。

表　４　　Ｎｏ、６９５２株とＪＣＭ４３６０株の相違
点条件　　　性　質ＪＣＭ４３６０　　Ｎｏ、６５９２生育温度範囲　　１４〜４０℃　　１１〜３９℃ミルク
凝固　　　　陽性　　　　陰性引用文献：（１）　Ｓｈｉｒｌｉｎｇ、　Ｅ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｄ
、　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ　５ｐｅｃ１ｅｓ。

Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　
ＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　１
６，３１３−３４０．１９６６（２）　Ｗａｋｓｍａｎ
＋　Ｓ、　Ａ、：　Ｔｈｅ　ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅ
ｓ　Ｖｏｌ、　２：Ｃ１ａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、　
１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｅｓｃｒｉ
ｐｔｉｏｎｏｆ　ｇｅｎｅｒａ　ａｎｄ　５ｐｅｃｉｅ
ｓ：　Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｋｉ
ｎｓＣｏ、、　　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、　　１９６１（
３）　　Ｋｏｒｎｅｒｕｐ、　　Ａ、　ａｎｄ　Ｊ、　
　Ｈ，Ｗａｎｓｃｈｅｒ：　ＭｅｔｈｕｅｎＨａｎｄｂ
ｏｏｋ　　ｏｆ　　Ｃｏ１ｏｕｒ、　　電ｅｔ、ｈｕｅ
ｎ、　　Ｌｏｎｄｏｎ、　　１９７Ｂ（４）　ＢｅＣｋ
ｅｒ、　　ｓ、、　　Ｍ、　　Ｐ、　　Ｌｅｃｈｅｖａ
ｌｉｅｒ、　Ｒ，Ｅ、　Ｇｏｒｄｏｎ　ａｎｄＨ，Ａ、
Ｌｅｃｈｅｖａｌｊｅｒ：　　Ｒａｐｉｄ　ｄｉｆｆｅ
ｒｅｎｔｉａｔｊｏｎｂｅｔｗｅｅｎ　Ｎｏｃａｒｄｊ
ａ　ａｎｄ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｂｙ　ｐａｐ
ｅｒｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｏｆ　ｗｈｏｌｅ
−ｃｅｌｌ、ｈｙｄｒｏＪ−ｙｓａｔｅｓ：　　Ａｐｐ
ｌ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　　１２．　４２１−４２３．　
１９６４（５）　Ｙａｍａｇｕｃｈｉ、　　Ｔ、：　Ｃ
ｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃｅｌｌ　ｗａｌ
ｌｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｒｐｈｏＬｏｇ
ｉｃａｌｌｙ　ｄｉｓｔｉｎｃｔａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ
ｔｅｓ：　　Ｊ、Ｂａｃｔｃｒｉｏｌ、８９，４４４−
４５３．１９６５（６）　　Ｐｒｉｄｈａｍ、　Ｔ、　
　Ｇ＋ａｎｄ　Ｄ、　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ：　　Ｔｈｅ　
ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆ　ｃａｒｂｏｎ　ｃｏｍｐ
ｏｕｎｄｓ　ｂｙ　　ｓｏｍｅ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ
ｔａｌｅｓ　ａｓａｎ　ａｉｄ　ｆｏｒ　５ｐｅｃｊ、
ｅｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ：Ｊ、Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ。

５６：　　１０７−１１４．１９４８（７）　　Ｂｕｃｈａｎａｎ、　　Ｒ，Ｅ、　ａｎｄ　
Ｎ、　Ｅ、　Ｇｉｂｂｏｎｓ：　　Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭ
ａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａ
ｃｔｅｒｊｏＬｏｇｙ、８ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ、　　ｐ
ｐ、　　７４ｇ−８２９：　　Ｔｈｅ　Ｗｉｌｌｉａｍ
ｓ　ａｎｄ　ＷｉｌｋｉｎｓＣｏ、、　　Ｂａｌｔｉｍ
ｏｒｅ、１９７４（８）　Ｓｈｉｒｌｉｎｇ、　Ｅ、　
Ｂ＋ａｎｄ　Ｄ、　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ：　Ｃｏｏｐｅｒ
ａｔｉｖｅｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｙｐｅ　
ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　社コニ吏シ皇狙、　２゜５ｐｅ
ｃｉｅｓ　ｄｅｓｃ’ｒｉｐｔｉｏｎｓ　ｆｒｏｍ　ｆ
ｉｒｓｔ　５ｔｕｄｙ、　　Ｉｎｔｅｒｎ。

Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１８：　
６９−１８９．　１９６８（９）　Ｓｈｉｒｌｉｎｇ＋
　Ｅ、　Ｂ＋ａｎｄ　Ｄ、　Ｇｏｔｔｌｉｅｂ：　Ｃｏ
ｏｐｅｒａｔｉｖｅｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔ
ｙｐｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｏｆ　７．３゜Ａｄｄｉｔｉ
ｏｎａｌ　５ｐｅｃｉｅｓ　ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ
　ｆｒｏｍ　ｆｉｒｓｔ　ａｎｄｓｅｃｏｎｃｌ　５ｔ
ｕｄｉｅｓ、　Ｉｎｔｅｒｎ、　Ｊ、　５ｙｓｔ、　Ｂ
ａｃｔｅｒｉｏｌ、　　１８：２７９−３９２．１９６
８（１０）Ｓｈｉｒｌｉｎｇ、　Ｅ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｄ
、　ＧＯｔｔｌｉｅｂ：　Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｄｅ
ｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　　ｏｆ　　ｔｙｐｅ　　ｃｕｌｔ
ｕｒｅ　　ｏｆ　　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、　　４
゜５ｐｅｃｉｅｓ　　ｄｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎｓ　　ｆ
ｒｏｍ　　ｔｈｅ　　５ｅｃｏｎｄ　　、　　ｔｈｉｒ
ｄａｎｄ　　　ｆｏｒｔｈ　　５ｔｕｄｉｅｓ＋　Ｉｎ
ｔｅｒｎ、　　Ｊ、　　５ｙｓｔ、　　Ｂａｃｔｅｒｊ
、ｏｌ。

１９：　　３９１−５１２．１９６９（１１）Ｓｋｅｒｍａｎ、Ｖ、Ｂ、Ｄ、；　Ｖ、ＭｃＧ
ｏｗａｎ　＆　Ｐ、Ｈ，Ａ、５ｎｅａｔｈ：Ａｐｐｒｏ
ｖｅｄ　　１ｉｓｔ　　ｏｆ　　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　
　ｎａｍｅｓ、　　Ｉｎｔｅｒｎ、　　Ｊ。

５ｙｓｔ、　　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　３０：　　２
２５−４２０．　１９８０（１２）Ｍｏｏｒｅ、　Ｗ、
　Ｅ、　Ｃ，、Ｅ、　Ｐ、　Ｃａｔｏ　＆　Ｌ、　Ｖ、
　Ｈ，Ｍｏｏｒｅ：Ｉｎｄｅｘ　　ｏｆ　　Ｂａｃｔｅ
ｒｉａｌ　　ａｎｄ　　Ｙｅａｓｔ　　Ｎｏｍｅｎｃｌ
ａｔｕｒａｌＣｈａｎｇｅｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ　ｉ
ｎ　ｔｈｅ　１．　Ｊ、　Ｓ、　　Ｂ、　５ｉｎｃｅ　
ｔｈｅ１９８０　Ａｐｐｒｏｖｅｄ　Ｌｉ５ｔｓ　ｏｆ
　Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｎａｍｅｓ、　　Ｉｎｔｅｒｎ
。

Ｊ、５ｙｓｔ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、３５：　　３８２
−４０７．１９８５本発明に係るＦＲ９０１３６２物質
は、ストレプトミセス属に属する該物質生産菌（例えば
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｒｕｌｅｓｃｅｎｓ　
Ｎｎ６９５２）を資化しうる炭素及び窒素源を含む栄養
培地中に接種し、好気条件下で培養することにより　（
例えば、振どう培養、通気攪拌培養等）、生産せしめる
ことができる。

炭素源としては、グルコース、シュークロース、澱粉、
フラクトース、グリセリンその他の炭水化物を使用する
のが好ましい。

窒素源としては、オートミール、イーストエキストラク
ト、ペプトン、グルテンミール、綿実粉、大豆ミール、
コーンステイープリカー、乾燥イースト、小麦胚芽、落
花生粉、チキン骨肉ミール等を使用するのが好ましいが
、アンモニウム塩（例えば、硝酸アンモニウム、硫酸ア
ンモニウム、リン酸アンモニウム等）、尿素、アミノ酸
等の無機及び有機の窒素化合物も有利に使用することが
できる。

これらの炭素源及び窒素源は、併用するのが有利である
が、純粋なものを必らずしも使用する必要はない。純粋
でないものには、生長因子や微量要素が含まれているか
らである。

必要ある場合には、例えば次のような無機塩類を培地に
添加してもよい：炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、リン
酸ナトリウム、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、塩化
カリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、マグネ
シウム塩、銅塩、コバルト塩等。

特に、培地が強く発泡するのであれば、必要あるときに
、液体パラフィン、動物油、植物油、鉱物油、シリコン
等を添加してもよい。

目的物質を大量に工業生産するには、他の発酵生産物の
場合と同様に、通気撹拌培養するのが好ましい。少量生
産の場合は、フラスコを用いる振どう培養が好適である
。

また、培養を大きなタンクで行う場合。

ＦＲ９０１３６２物質の生産工程において菌の生育遅延
を防止するため、はじめに比較的少量の培地に生産菌を
接種培養した後、次に培養物を大きな生産タンクに移し
てそこで生産培養するのが好ましい。

この場合、前培養に使用する培地及び生産培養に使用す
る培地の組成は、両者ともに同一であってもよいし必要
あれば両者を変えてもよい。

培養は通気攪拌条件で行うのが好ましく、例えばプロペ
ラやその低機械による攪拌、ファーメンタ−の回転また
は振どう、ポンプ処理、空気の吹込み等既知の方法が適
宜使用される。通気用の空気は滅菌しておくのが良い。

培養温度は、本ＦＲ９０１３６２物質生産菌が本物質を
生産する範囲内で適宜変更しうるが、通常は１０〜４０
℃、好ましくは２５〜３５℃で培養するのがよい。

培養時間は、培養条件や培養量によっても異なるが、通
常は約１日〜１週間である。

発酵終了後、培養物から目的とするＦＲ９０１３６２物
質を回収する。すなわち、菌体は、直接水及び／又は有
機溶媒による抽出、あるいは、これを機械的に又は超音
波等既知の手段を用いて破壊した後、水及び／又は有機
溶媒で抽出した後、常法にしたがって回収、精製する。

培養液の場合は、直接。

常法にしたがって回収、精製すればよい。

回収、精製方法としては、例えば、水、有機溶媒、これ
らの混合溶媒による溶媒抽出；クロマトグラフィー；単
一溶媒又は混合溶媒からの再結晶等常法が適宜単独であ
るいは組合わせて使用できる。

ＦＲ９０１３６２物質の回収、精製は上記のように既知
の方法を適宜利用して行うが、例えば次のようにしても
よい。まず、培養物の抽出液を、酢酸エチル、アセトン
、またはこれらの混合溶媒で抽出し、抽出液を蒸発又は
蒸留して濃縮する。濃縮残渣をクロマトグラフィ又は再
結晶処理して、必要あれば更に凍結乾燥してもよい。

このようにして得たＦＲ９０１３６２物質は、遊離の形
で使用するほか１例えば次のような塩基で処理するとい
った常法によって薬剤上許容できる塩の形で使用しても
よく、これらの塩類も本発明の権利範囲に包含される。

塩基として好適なものの例は次のとおりである：アルカ
リ金属（例えばナトリウム、カリウム等）、アルカリ出
金属（例えばマグネシウム、カルシウム等）、　これら
の水酸化物又は炭酸塩、アルカリ金属アルコキサイド（
例えばナトリウムメトキサイド、ナトリウムエトキサイ
ド、カリウムｔ−ブトキサイド等）その他。

本発明に係る薬剤組成物は、ＦＲ９０１３６２物質及び
／又はその塩を有効成分としてこれに常用される無機又
は有機の担体を加えて、固体、半固体又は液体の形で、
経口投与剤のほか、外用剤等の非経口投与剤に製剤化す
る。

経口投与のための製剤としては、錠剤、丸剤、顆粒剤、
軟・硬カプセル剤、散剤、細粒剤、粉剤。

乳濁剤、懸濁剤、シロップ剤、エリキシル剤等が挙げら
れる。非経口投与のための製剤としては。

注射剤、軟膏、ローション、トニック、スプレー懸濁剤
、油剤、乳剤、坐剤等が挙げられる。本発明の有効成分
を製剤化するには、常法にしたがえばよく、界面活性剤
、賦形剤、着色料、着香料。

保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張剤その健常用さ
れる佐薬を適宜使用する。

本発明に係る薬剤組成物の投与量は、その種類、治療な
いし予防対象疾病の種類、投与方法、患者の年令、患者
の症状、処理時間等によって相違するが、静脈投与の場
合は成人ひとり当り１日に有効成分（ＦＲ９０１３６２
物質及び／又はその塩類）を０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ
投与し、筋肉投与の場合は同じ＜０．１〜１００ａ＋ｇ
／ｋｇ投与し、経口投与の場合も同じ＜０．１〜１００
ｍｇ／ｋｇの範囲内で投与する。なお、本物質をラット
に対して体重１ｋｇ当り１００ｍｇ経口投与したが、格
別の毒性は認められず安全であった。

以下、本発明を実施例について更に詳しく説明する。

実施例１（１）　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｃｏｅｒｕｌｅｓ
ｃｅｎｓ　＆６９５２　（ＦＥＲＭ−Ｐ１１３６４　）
の斜面培養物を表５に示した前培養培地（５０ｍ＋２／
２２５ｍｕ容コルベン、８本）に−白金耳ずつ接種し、
３０℃で３日間培養した。さらにこの培養物を２００＋
ｍ１２ずつ１表５に示す生産培地２０Ｑを注入した２０
ｆｉ容ジヤーフアメーター２基（通気量１ｖｖＭ。

回転数２５０ｒｐ＋＊）に加えて５日間培養した。

表５（２）培養終了後、培養液４５Ｑに濾過助剤を加えて濾
過し、濾液３３Ｑと菌体を得た。濾液は廃棄し、菌体に
３０Ｑのアセトンを加え、−時間抽畠後濾過し、３ＬＱ
の抽出液を得た。この抽出液を１０１２まで減圧上濃縮
し、これに脱イオン水５Ｑを加えて１５Ｑの水溶液を得
た。

この溶液をＨＰ−２０樹脂（三菱化成製）２１１に吸着
させ、脱イオン水６Ｑで洗浄後、８０％メタノール６Ｑ
、及び５０％メタノール０．ＩＮ水酸化ナトリウム溶液
６Ｑで溶出した。この溶出液を６Ｎ塩酸で中和後、４Ｑ
まで減圧上濃縮した。濃縮液に６Ｎ塩酸を加えてｐＨを
２に下げ、これに酢酸エチル４Ｑを加え。

攪拌後酢酸エチル層を得た。この操作を２回繰り返し、
先に得た酢酸エチル層と合わせ、減圧下濃縮乾固させた
（２５．０ｇ）、この濃縮物は、ＹＭＣ−００５ゲル（
山村化学研究新製）　８００ｍＱにまぶし、４０％アセ
トニトリル０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）溶液で
充填したＯＤＳカラム（ＹＭＣ）　２　Ｑに付した。４
０％アセトニトリル０．１％ＴＦＡ溶液９１２、続いて
４５％アセトニトリル０．１％ＴＦＡ溶液２Ｑ、さらに
５０％アセトニトリル０．１％ＴＦ＾溶液１．６５　Ｑ
で洗浄後、５０％アセトニトリル０．１％ＴＦＡ溶液６
Ｉｌで活性画分を溶出した。

この溶出液は直ちに水酸化ナトリウム水溶液で中和した
。

この溶出液のうちＩＱは、３００ｍ１２まで減圧上濃縮
した後、ＩＮ塩酸でｐＨ２に下げ、酢酸エチル３００鱈
を加えて攪拌後、酢酸エチル層を得た。この抽出操作を
繰り返し、前に得た酢酸エチル層と合わせて減圧上濃縮
したところ、黄色粉末３２４Ｂが得られた。

また、先の溶出液の残り５ＱはＩＱまで減圧上濃縮した
後、脱イオン水８００ｍＱを加えた。この水溶液１．８
ＱをＨＰ−２０８５樹脂（三菱化成製）２７０ｍＱに吸
着させて、脱イオン水８１０ｍＱで洗浄後、８０％メタ
ノール８００−で溶出した。溶出液を３００ｍ１２まで
減圧上濃縮し、凍結乾燥を行なうと黄色粉末２．４０　
ｇが得られた。

実施例２実施例１で製造したＦＲ９０１３６２物質について、そ
のＦＧＦ　（繊維芽細胞成長因子）レセプター結合活性
を次のようにして確認した。

マイクロタイタープレート（９６穴）の各ウェルに、ハ
ムスター由来腎細胞であるＢＨＫ−２１細胞２．５　Ｘ
　１０’ｃｅｌｌｓ／ｍＱ（１０％ＦＢＳ含有ＭＥＭ培
地（イーグルの最少必須培地）中）を１００　ｔｔ　Ｑ
（２，５Ｘ　ｌＯ’ｃｅｌｌｓ）加え、　ＣＯ２インキ
ュベーター中で、３７℃で１日培養した。培養後、コン
フルエントに達したことを顕微鏡で確認して使用した。

培地を抜きとり、結合培地（アルファＭＥＭ−２５＋ａ
ＭＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，５）　−０，１５％ゼラチン
）１５０μＱを加え、ＣＯ２インキュベーター中で、３
７℃で３０分間培養した後、プレートを氷冷した。そし
て以下の操作はすへて水冷下で行なった。

培地を抜きとり、１２５工で標識した塩基性繊維芽細胞
増殖因子（（１２’　Ｉ〕−ｂＦＧＦ）及びサンプル（
ＦＲ９０１３６２物質）あるいは非標識ｂＦＧＦを加え
た結合培地５０μＱを加え、４℃（冷蔵庫中）で２時間
インキュベートした。

反応終了後、水冷下、洗浄バッファー（０，１％牛血清
アルブミン含有リン酸緩衝液（０，１％ＢＳＡ含有ＰＢ
Ｓ（−）））、　１ｓｏμρで素早く３回洗浄した後、
ヘパリン（２５０μｇ／＋ｏＱ）含有洗浄バッファー１
５０μＱで１回洗浄した。次に０．１％ＢＳＡ含有０．
５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００溶液１００μρを加えて室
温で１５分開放置し、細胞を溶解させた後、これをＲＩ
Ａチューブに移し、ガンマ−カウンターで放射活性を測
定した。尚、非特異的結合は非標識ｂＦＧＦを（１２’
Ｉ）−ｂＦＧＦの２００倍濃度加えた場合の結合とし、
特異的結合は総結合量より非特異的結合を差し引いて求
めた。

ソノ結果、　ＦＲ−９０１３６２は濃度依存的ニ〔１２
ｓ■〕−ｂＦＧＦのＢＨＫ−２１細胞への結合を阻害し
、ＩＣ，。値は１．５μｇ／ＩＩＩＱであることが確認
された。

実施例３鶏受精卵の漿尿膜（ＣＡＭ）における血管新生に対する
本化合物の抑制作用をＮ、Ｇ、Ｔａｎａｋａらの方法（
Ｅｘｐ、　Ｐａｔｈｏｌ、　３０．１４３．１９８６）
に多少の改良を加えて検討、確認した。

３日令の鶏受精卵の卵殻に約１Ｃ１１四方の小窓を開け
、２日間培養後、実施例１で得た本化合物を含有する０
、５％メチルセルロースディスク（直径的２　ｍｍ）を
５日令のＣＡＭ上に置いた。さらに２日間培養後、顕微
鏡下で、漿尿膜に新生された血管に対する本化合物の抑
制程度を［９した。

血管新生阻害活性は、試験された総検体あたりの血管新
生阻害作用がｆＲ察された検体の割合で示した。

その結果、表６に示されるように、本化合物はすぐれた
血管新生阻害活性を示した。

表　６　　ＣＡＭ法による本化合物の血管新生阻害作用
化合物　　濃度（μｇ／ディスク）　　血管新生阻害活
性ＦＲ９０１３６２２００９０％１００　　　　　　　　　６４％５０５０％２５４０％１０１０％実施例４実施例１で製造したＦＲ９０１３６２物質について、そ
の抗腫瘍活性を次のよう（こ確認した。

（１）ヒト血管内皮細胞ＨＥ−９の細胞増殖抑制活性は
予めフィブロネクチンでコーティングしたマイクロタイ
タープレート（９６穴）に１５％牛脂児血清、２００　
　ｐｇ／ｓＱ　ＥＣＧ５　（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　
ｃｅｌｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）およ
び２０　μｇ／ｍＱペパリンを含むＭＣＤＢ１５１培地
ｌＯＯμＱを加えた後、一定濃度のサンプル２０μＱを
加え、種々の濃度の希釈液を作製した。その後、ヒト血
管内皮細胞を１００　μｍ２（２Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓ
／１００　ｐ　Ｑ−ｃｕｌｔｕｒｅ　ｍｅｄｉｕｎ＋）
加え、Ｃ０２インキユベーター中で３７℃、５日間培養
する。細胞増殖抑制は、ＮＴＴ法（Ｔ、Ｍｏｓｍａｎ；
　　Ｊ、　　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　
　６５．　５５゜１９８３）により算出した。

その他の細胞については、マイクロタイタープレート（
９６穴）で予め各々の培地を加えて稀釈した薬剤に、各
濃度の細胞をまき、ＣＯ□インキュベーター中で培養し
、数日後、その増殖抑制を見た。

すなわち、マウス白血病細胞Ｐ３８８細胞は、ダルベツ
コ培地（Ｄｕｌ培地）（ｌＯ％ＦＢＳ）を用い、　１．
２５ｘ１０’　ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの細胞濃度で３日
間培養する。また、マウス繊維肉腫細胞Ｍｅｔｈ　Ａは
、Ｄｕｌ培地（１０％ＦＢＳ）を用い、１　、２　Ｘ　
１０’ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで２日間、マウス骨髄細胞
は、Ｄｕｌ培地（１０％ＦＢＳ、Ｌ−９２９ｃｅｌｌ培
養上清液）を用い、Ｉ　Ｘ　１０５ｃｅｌｌｓ／ｌ＋ｅ
ｌｌで４日間培養し、その活性を阿ＴＴ法により算出し
た。その結果ＦＲ９０１３６２物質は、ヒト血管内皮細
胞ＨＥ−９、及びマウス骨髄細胞の増殖を抑制すること
がわかった。にＩＣを求めると、その抑制は他のそれら
に建入、約１００倍以上抑制されることが確認された（
表７）。

表　７　　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ細胞増殖抑制活性：検鏡に
よる細　　胞　　　　　　　　　　ＭＩＣヒト血管内皮細胞　　ＨＥ−９０，２３μｇ／ｍｕマウ
ス白血病細胞　　Ｐ２Ｓ５　　１９マウス繊維肉腫細胞
　Ｍｅｔｈ　Ａ　　５６マウス骨髄細胞　　　　　　　
　０．２３（２）マウス繊維肉腫　Ｍｅｔｈ　Ａ細胞を
マウスＢａ１ｂ／ｃ（＃、８週令）腹腔中で継代し、８
日後にその細胞ｌ　Ｘ　１０’ｃｅｌｌｓずつＢａ１ｂ
／ｃマウスにｉｄ（皮内）移植し、１４日後に腫瘍サイ
ズを測定する。ＦＲ−９０１３６２物質は、ｄａｙ２−
４、　およびｄａｙ７−１１に尾静脈から各濃度で０．
２ｔ１２ずつ投与し、抗腫瘍効果を検討した。相対的腫
瘍重量はＮＣＩ（ＵＳＡ）のマニュアルによって測定し
た。

その結果１本発明に係るＦＲ９０１３６２物質を用いる
ことにより１本物質がすぐれた抗腫瘍作用を有すること
が確認され（表８）、相対腫瘍重量についてもコントロ
ールに比べて有意に抗腫瘍効果が認められた。

コントロールＦＲ９０１３６２物質　５　ｎ＋ｇ／ｋｇ５８１　ｍｇ
／ｋｇ　　　　　　　７Ｑ実施例５　　錠剤の製造（１）実施例１で製造した物質　　５０ｇ（２）ラクト
ース　　　　　　　　９０ｇ（３）コーンスターチ　　
　　　　２９ｇ（４）ステアリン酸マグネシウム　１ｇ
（１）、（２）及び（３）（但し１７ｇ）を混合し、（
３）（但し７ｇ）から調製したペース１−とともに顆粒
化した。

得られた顆粒に（３）（但し５ｇ）と（４）を加えてよ
く混合し、この混合物を圧縮錠剤機により圧縮して、１
錠あたり有効成分（１）を５０ｍｇ含有する錠剤１００
０個を製造した。

実施例６　　注射剤の製造（１）実施例１で製造した物質　　　　　５ｇ（２）食
塩　　　　　　　　９ｇ（３）クロロブタノール　　　　　　　　５ｇ（４）炭
酸水素ナトリウム　　　　　　　１ｇ（１）〜（４）の
全成分を蒸留水１０００＋＋＋１２に溶解した後、アン
プルに１ｍＱずつ分注して、注射剤１０００本を製造し
た。

（発明の効果）本発明はＦＲ９０１３６２物質を提供するものであるが
、この物質は従来未知の新規抗生物質であって、すぐれ
たＦＧＦレセプター拮抗作用、血管新生阻害作用、細胞
増殖抑制作用、抗腫瘍作用を示し、医薬、特に抗腫瘍剤
として、腫瘍の予防ないし治療に有用である。

また、本発明によって、微生物を利用する上記物質の工
業的製法も確立された。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）以下の物性を有することを特徴とするＦＲ９０１
３６２物質：（Ａ）比旋光度〔α〕▲数式、化学式、表等があります▼（Ｃ＝０．５
、ジメチルスルホキシド）（Ｂ）元素分析実測値（％）：Ｃ、４５．８５；Ｈ、４．１６；Ｎ、６
．０１；Ｃｌ、１２．９４（Ｃ）紫外吸収スペクトル ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｄ）赤外吸収スペクトル ▲数式、化学式、表等があります▼
（２）ストレプトミセス属に属するＦＲ９０１３６２物
質生産菌を培養してＦＲ９０１３６２物質を生成せしめ
、これを採取することを特徴とするＦＲ９０１３６２物
質の製造方法。
（３）ＦＲ９０１３６２物質を有効成分とする繊維芽細
胞成長因子（ＦＧＦ）レセプター拮抗剤、血管新生阻害
剤、細胞増殖抑制剤及び／又は抗腫瘍剤。