KR20040025902A

KR20040025902A - Ｃｎｓ 장애 치료용 의약의 제조시 티오루틴 디옥사이드및 이의 유도체의 용도 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20040025902A
Application number: KR10-2003-7011817A
Authority: KR
Inventors: 에더클라우디아; 쿠르츠미하엘; 빈크요아힘
Original assignee: 아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2002-02-23
Publication date: 2004-03-26
Also published as: CZ20032427A3; ZA200306474B; IL157792A0; CA2439853A1; NO20033964D0; PL363374A1; HRP20030714A2; WO2002072089A3; DE60213219D1; JP2004521927A; WO2002072089A2; EP1238668A1; US20020193418A1; MXPA03007551A; EP1372640A2; BR0207884A; BG108161A; NZ528071A; RU2003129889A; AU2002250997B2

Abstract

본 발명은 CNS 장애 치료용 의약의 제조시 티오루틴 디옥사이드와 이의 유도체의 용도, 미생물 노카르디옵시스 종 ST 100692, DSM 13834의 발효에 의한 이의 제조방법 및 미생물 노카르디옵시스 종 ST 100692, DSM 13834에 관한 것이다.

Description

ＣＮＳ 장애 치료용 의약의 제조시 티오루틴 디옥사이드 및 이의 유도체의 용도 및 이의 제조방법{Use of thiolutin dioxide and its derivatives in the manufacture of a medicament for the treatment of CNS disorders and a process for the preparation thereof}

본 발명은 CNS 장애 치료용 의약의 제조시 티오루틴 디옥사이드(thiolutin dioxide)와 이의 유도체의 용도, 미생물 노카르디옵시스(Nocardiopsis) 종 ST 100692, DSM 13834의 발효에 의한 이의 제조방법 및 미생물 노카르디옵시스 종 ST 100692, DSM 13834에 관한 것이다.

티오루틴은 시판되고 있는 공지된 천연 화합물이다(시판원: Apin Chemicals, UK; CMS Speciality Chemicals, UK; Ubichem plc, UK). 티오루틴 디옥사이드 또한 공지된 화합물이다. 티오루틴 디옥사이드의 한가지 공지된 제조방법은 문헌[참조: Schachtner et al., J. Heterocycl. Chem., 1999, 161-175]에 기재되어 있는 바와 같이 티오루틴을 m-클로르퍼벤조산을 사용하여 산화시키는 것이다(수율: 30%).

티오루틴 디옥사이드는 의약적 특성을 갖는 것으로 이미 기술된 바 있다. WO 99/12543에는 항종양제로서의 티오루틴 디옥사이드의 용도가 기재되어 있으며, WO 96/32396에는 항균제 및 항진균제로서의 티오루틴 디옥사이드의 용도가 기재되어 있다.

놀랍게도, 본 발명에 이르러 티오루틴 디옥사이드가 효과적인 신경용해소(neurolysin) 억제제임이 밝혀졌다. 신경용해소는 아연 함유 메탈로프로테아제의 부류에 속한다. 이는 내인성 항정신병제인 뉴로텐신(neurotensin)의 생리학적 불활성화와 관련된다. 티오루틴 디옥사이드는 신경용해소의 뉴로텐신 불활성화를 억제하기 때문에 파킨슨병 및 알쯔하이머병과 같은 신경퇴행성 질병의 치료에서 유용하다. 티오루틴 디옥사이드는 또한 엔케팔리나제 또는 안지오텐신 전환 효소와 같은 다른 아연 함유 메탈로프로테아제는 차단하지 않는다는 점에서 선택적이다.

또한, 본 발명에 이르러 미생물 노카르디옵시스 종 ST 100692, DSM 13834가 비교적 고수율로 티오루틴 디옥사이드를 형성시킬 수 있음이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명은 CNS 장애 치료용 의약의 제조시 하기 화학식 I의 화합물 및 생리학적으로 허용되는 이의 염의 용도에 관한 것이다.

상기 화학식에서,

R1, R2 및 R3은 서로 독립적으로 H, 알킬 및 아실이다.

R1이 아실이고 R2가 H이고/이거나 R3이 알킬인 화학식 I의 화합물 및 생리학적으로 허용되는 이의 염이 바람직하다.

화학식 I의 화합물 내의 아실 라디칼은 2개 내지 10개, 바람직하게는 2개 내지 6개의 탄소원자를 가질 수 있으며 직쇄 또는 측쇄이며 포화되거나 1회 또는 2회 불포화될 수 있다.

2개의 탄소원자를 갖는 아실 라디칼은 예를 들어, 아세틸 라디칼을 의미한다.

포화 직쇄 아실 라디칼의 예로는, 아세트산 잔기, 프로피온산 잔기, 부티르산 잔기, 발레르산 잔기, 카프로산 잔기, 에난트산 잔기, 카프릴산 잔기, 펠라르곤산 잔기 및 카프르산이 있다.

1회 불포화된 직쇄 아실 잔기의 예로는 아크릴산 잔기 및 크로톤산 잔기가 있다.

2회 불포화된 직쇄 아실 라디칼의 예로는 소르브산 잔기가 있다.

화학식 I의 화합물 내의 알킬 라디칼은 1개 내지 6개의 탄소원자를 가질 수 있으며 직쇄 또는 측쇄일 수 있다. 또한, 알킬 라디칼은 포화 및 불포화 그룹을 포함하며, 불포화 그룹은 1개 또는 2개의 이중 결합을 함유한다. 1개 내지 6개의 탄소원자를 함유하는 알칼 라디칼의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸 및 헥실, 상기 모든 라디칼의 n-이성체, 이소프로필, 이소부틸, 1-메틸부틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 2,2-디메틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸 및 이소헥실이 있다.

불포화 알킬 라디칼로는 예를 들어, 비닐, 1-프로페닐, 2-프로페닐(=알릴), 2-부테닐, 3-부테닐, 2-메틸-2-부테닐, 3-메틸-2-부테닐, 5-헥세닐 또는 1,3-펜타디에닐과 같은 알케닐 잔기가 있다.

하나의 양태에서, 본 발명은 CNS 장애 치료용 의약의 제조시 하기 화학식 II의 화합물 또는 생리학적으로 허용되는 이의 염의 용도에 관한 것이다.

화학식 I의 화합물은 정상 수준 이상의 순환 신경용해소에 의해 유발되는 장애를 치료하는데 유용하다. 화학식 I의 화합물로 치료될 수 있는 CNS 장애로는 정신분열증과 같은 정신증장애 및 알쯔하이머병과 파킨슨병과 같은 신경퇴행성 장애가 포함된다.

화학식 I의 화합물은 미생물 노카르디옵시스 종 ST 100692, DSM 13834 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체 중 하나를 적합한 조건하에 발효시키고, 하나 이상의 화합물을 분리시키고, 경우에 따라 이를 생리학적으로 허용되는 염, 유도체 또는 상기 유도체의 생리학적으로 허용되는 염으로 전환시켜 수득할 수 있다.

따라서, 본 발명은 미생물 노카르디옵시스 종 ST 100692, DSM 13834 또는 이의 변이체 또는 돌연변이체를 수성 영양 배지내에서 배양하고, 하나 이상의 표적 화합물을 분리 및 정제하고, 임의로 생리학적으로 허용되는 염, 유도체 또는 상기 유도체의 생리학적으로 허용되는 염으로 전환시킴을 포함하는, 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.

티오루틴 디옥사이드를 생산하는 것 이외에, 노카르디옵시스 종 ST 100692, DSM 13834는 상기한 발효 조건하에 티오루틴을 또한 생산한다. 수득된 티오루틴은 분리시켜 당해 숙련가에 공지된 방법으로 티오루틴 디옥사이드로 전환시킬 수 있다.

따라서, 본 발명의 따르는 화학식 I의 화합물의 대안적 제조방법은 미생물 노카르디옵시스 종 ST 100692, DSM 13834 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체를 수성 영양 배지 내에서 배양하고, 티오루틴을 분리 및 정제하고, 티오루틴을 하나 이상의 표적 화합물로 전환시키고, 임의로 생리학적으로 허용되는 염, 유도체 또는 상기 유도체의 생리학적으로 허용되는 염으로 추가로 전환시킴을 포함한다.

미생물 노카르디옵시스 종 ST 100692는 부다페스트 조약하에 2000년 11월 13일자로 제DSM 13834호하에 도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌[Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, 독일 데-38124 브라운슈바이크 마쉐로더 벡 1베 소재]에 기탁하였다.

가스 크로마토그래피를 사용한 지방산 분석에 의한 미생물 노카르디옵시스 종 ST 100692, DSM 13834의 분류 검사는 다음과 같은 특징적 산을 나타냈다: 14:0 iso, 15:0 anteiso, 15:0 iso, 16:0, 16:0 iso, 17:0, 17:0 iso, 17:0 anteiso 및 18:0. 콜로니 색상은 특히 ISP 2(효모-맥아) 및 ISP 3(오트밀) 배지에서 백색 공기 균사체를 형성하는 크롬 황색이다.

균주 DSM 13834의 돌연변이체 및 변이체가 본 발명에 따르는 화합물을 합성한다면, 균주 DSM 13834 대신에 이의 돌연변이체 및 변이체를 사용할 수도 있다.이러한 돌연변이체는 물리적 수단, 예를 들어, 방사선조사, 에틸 메탄설포네이트(EMS);2-하이드록시-4-메톡시벤조페논(MOB) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니딘(MNNG)에 의해 자체 공지된 방식으로 생성시킬 수 있다.

본 발명에 따르는 화합물을 생산하는 돌여변이체 및 변이체는, 예를 들어, 하기에서 기술하는 방법으로 신경용해소 억제효과를 시험하여 배양 브로쓰내에 축척된 활성 물질의 생물학적 활성을 측정함으로써 선별할 수 있다.

호기성 발효용 탄소원으로는 동화 탄수화물 및 당 알콜, 예를 들어, 글루코즈, 락토즈 또는 D-만니톨 및 탄수화물 함유 천연 산물, 예를 들어, 맥아 추출물이 적합하고 바람직하다. 적합한 질소 함유 영양소로는 아미노산, 펩타이드 및 단백질, 및 이들의 분해 산물, 예를 들어, 펩톤 또는 트립톤, 또한 고기 추출물, 예를 들어, 옥수수, 밀, 콩, 대두 또는 면 식물의 분쇄된 종자, 알콜 생성으로부터의 증류 잔사, 고기 가루 또는 효모 추출물 뿐만 아니라, 암모늄염 및 질산염이 있다. 영양액에 함유될 수 있는 유기 염으로는 예를 들어, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속, 철, 아연, 코발트 및 망간의 염산염, 탄산염, 황산염 또는 인산염이 있다.

티오루틴 디옥사이드의 형성은 예를 들어, 글루코즈 0.5 내지 5%, 바람직하게는 1 내지 2%, 대두분 0.5 내지 5%, 바람직하게는 1 내지 2%, 옥수수 침지액(액체) 0.1 내지 1.5%, 바람직하게는 0.3% 내지 0.8%, 탄산칼슘 0.05% 내지 1.0%, 바람직하게는 0.1% 내지 0.5% 및 염화나트륨 0.05% 내지 1%, 바람직하게는 0.3% 내지 0.8%를 함유하는 영양 배지내에서 특히 잘 달성되며, 각각의 경우에 완전 영양액의 중량을 기준으로 한다.

배양은 호기적으로, 즉 예를 들어, 진탕기 플라스크 또는 발효조에서 진탕 또는 교반하고 경우에 따라 공기 또는 산소를 도입하면서 침지시킴으로써 수행한다. 발효는 예를 들어, 유리 발효조 또는 스테인레스 강 탱크 내에서 각종 용적의 입구가 넓은 병 또는 환저 플라스크에서 수행할 수 있다. 발효는 약 20 내지 35℃, 바람직하게는 약 25 내지 30℃의 온도 범위에서 수행할 수 있다. pH는 4 내지 10, 유리하게는 6 내지 8이어야 한다. 미생물은 이러한 조건하에 일반적으로 20시간 내지 200시간, 바람직하게는 24시간 내지 150시간 동안 배양한다.

배양은 유리하게는 여러 단계로 수행하며, 즉 먼저 하나 이상의 예비배양물을 액체 영양 배지내에서 제조한 다음, 실제 생산 배지인 주 배양물에 예를 들어 1:10의 용적비로 옮긴다. 상기 예비배양물은 예를 들어, 포자형성된 균사체를 영양액으로 옮기고, 약 20시간 내지 120시간, 바람직하게는, 24시간 내지 90시간 동안 생장시킴으로써 수득할 수 있다. 상기 포자형성된 균사체는, 예를 들어, 균주를 약 1일 내지 40일, 바람직하게는 5일 내지 12일 동안 고체 또는 액체 영양 배지, 예를 들어, 효모-맥아 아가 또는 감자 덱스트로스 아가에서 생장시킴으로써 수득할 수 있다.

발효 진행 및 본 발명에 따르는 화합물의 형성은 당해 숙련가에게 공지된 방법에 따라서, 예를 들어, 생물학적 활성을 생검으로 또는 박막 크로마토그래피(TLC) 또는 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)와 같은 크로마토그래피 방법을 사용하여 시험함으로써 수행할 수 있다.

화학식 I의 화합물은 균사체 및 배양 여액 둘다에서 발생할 수 있으나, 대부분의 양은 통상적으로 바이오매스(균사체)에서 발견된다. 따라서, 배양 여액을 여과 또는 원심분리에 의해 균사체로부터 분리시키는 것이 편리하다. 여액은 1-부탄올, 에틸 아세테이트 또는 클로로포름 등과 같은 수불용성 용매로 추출한다. 균사체는 편의상 메탄올 또는 아세톤으로 추출하나, 상기한 수불용성 용매를 사용할 수도 있다.

추출은 광범위한 pH 범위에서 수행할 수 있으나, 천연 배지에서 바람직하게는 pH 4 내지 pH 8에서 수행하는 것이 편리하다. 유기 추출물은 예를 들어, 진공하에 농축시키고 건조시킨다.

한가지 정제 방법은 Diaion^RHP-20(제조원: Mitsubishi Casei., Tokyo), Amberlite^RXAD7(제조원: Rohm and Hass, USA) 및 Amberchrom^RCG(제조원: Toso Hass, Philadelphia, USA)에서의 크로마토그래피이다. 또한, 예를 들어, 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)의 테두리 안에서 일반적으로 공지되어 온 다수의 역상 지지체, 예를 들어, RP18도 적합하다.

화학식 I의 화합물은 상기한 방법과 유사하게 또는 당해 숙련가에게 공지된 방법을 사용하여 분리 및 정제시킬 수 있다.

티오루틴 디옥사이드의 유도체도 상기 화학식 I에 포함된다. 이러한 유도체는 티오루틴 디옥사이드와 동일한 효과를 갖거나, 온화한 조건하에 티오루틴 디옥사이드와 동일한 효과를 갖는 화합물로 전환된다. 유도체는 당해 숙련가에 익히 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 화학식 I에 포함되는 몇가지 티오루틴디옥사이드 유도체의 제조방법의 예는 하기에 제시한다.

(1) 티오루틴 디옥사이드의 (외향환) 아세틸 그룹은 문헌[참조: 'Protective Groups in Organic Synthesis', 3rd Edition, T. Green & P. Wuts, John Wiley & Sons, 1999, pp 553-555]에 기재된 바와 같은 산 또는 염기를 사용하여 절단시킬 수 있다.

(2) 티오루틴 디옥사이드의 유리 아미노 그룹은 예를 들어, 문헌[참조: 'Advanced Organic Chemistry', 4th Edition, J. March, John Wiley & Sons, 1992, pp 898-900]에 기재된 바와 같은 환원성 알킬화를 통해 알킬화시킬 수 있다.

(3) 티오루틴 디옥사이드의 아미노 그룹은 예를 들어, 당해 숙련가에게 공지된 표준 공정에 의해 산 클로라이드 또는 무수물을 사용하여 아실화시킬 수 있다.

화학식 I의 화합물의 추가의 유도체로는 티오루틴 디옥사이드와 같은 화학식 I의 화합물의 하나 이상의 이중 결합을 예를 들어, 문헌[참조: P. N. Rylander, 'Hydrogenation Methods', Academic Press, New York(1985), Chpt. 2]에 기재된 방법에 의해 환원시키거나 문헌[참조: H.O. House in 'Modern Synthetic Reactions', W.A. Benjymin, Inc., New York (1972), pp 446-452]에 기재된 방법에 의해 할로겐화수소제거시켜 수득되는 화합물들이 포함된다.

본 발명에 따르는 화합물은 약제학적으로 허용되는 염으로 전환시킬 수 있다. 상기 염은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 표준 공정을 사용하여 제조할 수 있다.

화학식 I의 화합물의 생리학적으로 허용되는 염은 문헌[참조: Remington'sPharmaceutical Sciences(17th edition, page 1418 (1985)]에 기술되어 있는 이의 유기 염 및 무기 염 둘다를 의미한다. 예를 들어, 나트륨 및 칼륨 염과 같은 염은 본 발명에 따르는 따르는 화합물을 적합한 나트륨 또는 칼륨 염기로 처리하여 제조할 수 있다.

본 발명의 추가의 양상은 화학식 I의 화합물의 전구약물의 용도이다. 이러한 전구약물은 생체내에서 티오루틴 디옥사이드와 같은 화학식 I의 화합물로 대사될 수 있는 것이다. 상기 전구약물은 그 자체로 활성이거나 활성이 아닐 수 있다.

화학식 I의 화합물은 각종 다형체 형태, 예를 들어, 무정형 및 결정 다형체 형태로서 존재할 수 있다. 화학식 I의 화합물의 모든 다형체 형태는 본 발명의 범주에 포함되며 본 발명의 추가 양상이다.

본 발명에 따르는 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 염 및 유도체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 사람에게 단독의 약제로서 또는 서로 혼합된 약제로서 투여할 수 있다.

따라서, 적합한 약제학적 조성물은 하나 이상의 화학식 I 또는 II의 화합물 또는 약제학적으로 허용되는 이의 염의 유효량과 함께 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

본 발명에 따르는 화합물은 경구, 근육내, 정맥내 또는 기타 투여 방식에 의해 투여할 수 있다. 상기 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 또는 유도체와 함께 임의로 기타 약제학적으로 허용되는 활성 물질을 함유하는 약제학적 조성물은 당해 활성 화합물을 하나 이상의 약리학적으로 허용되는 보조제 및/또는 부형제와 혼합하여 제조할 수 있다. 이어서 혼합물을 정제, 제피 정제, 캡슐제, 입제, 산제, 유제, 좌제 또는 액제와 같은 적합한 약제 형태로 전환시킬 수 있다.

보조제 및/또는 부형제의 예로는 충전제, 유화제, 윤활제, 풍미 차폐제, 착색제 및 완충 물질 트라가칸트, 락토즈, 활석, 아가-아가, 폴리글리콜, 에탄올 및 물을 언급할 수 있다. 비경구 투여에 적합하고 바람직한 것은 현탁제 또는 수중 액제이다. 또한, 활성 물질은 비히클 또는 희석제 없이 그 자체로 적합한 형태, 예를 들어, 캡슐제로서 투여할 수 있다.

적합한 약제의 제조방법은 하나 이상의 본 발명에 따르는 화합물과 함께 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 담체 및 경우에 따라 추가의 적합한 활성 물질, 첨가제 또는 부형제를 적합한 투여 형태로 전환시킴을 포함한다.

통상적인 바와 같이, 생약 제형 및 투여 방법 뿐만 아니라 특수한 경우에 적합한 투여량 범위는 치료하고자 하는 종 및 각각의 질병 또는 질환의 상태에 따라 좌우되며, 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 최적화시킬 수 있다. 고체 투여 형태, 예를 들어, 정제 또는 캡슐제를 사용하여 500mg 이하, 바람직하게는 0.1 내지 250mg을 1일마다 투여할 수 있다. 비경구 적용의 경우, 1일마다 300mg 이하, 바람직하게는 0.5 내지 150mg를 투여할 수 있다.

하기 실시예는 본 발명을 설명하나 이의 범주를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1: 생산 균주 노카르디옵시스 종 DSM 13834의 포자 현탁액의 제조

300㎖들이 멸균 에를렌마이어 플라스크내의 영양액(1000㎖ 물중의 4g/ℓ 효모 추출물, 15g/ℓ 가용성 전분, 1g/ℓK₂HPO₄, 0.5g/ℓ MgSO₄×7H₂O, 멸균시키기 전 pH 7.0) 100㎖에 균주 노카르디옵시스 종 DSM 13834를 접종시키고, 회전 진탕기에서 28℃ 및 180rpm로 7일 동안 배양한다. 이어서, 상기 배양물 1.5㎖를 99% 글리세린 1.5㎖으로 희석시키고 -20℃에서 저장한다.

실시예 2: 에를렌마이어 플라스크에서 생산 균주의 배양물 또는 예비배양물의 제조

영양액(15g/ℓ대두분, 15g/ℓ 글루코즈, 5g/ℓ 옥수수 침지액, 5g/ℓ NaCl 및 2g/ℓCaCO₃) 100㎖를 함유하는 멸균 에를렌마이어 플라스크에, 사면 시험관(동일한 영양액이나 2% 아가를 함유함)에서 증식시킨 배양물 또는 글리세린 배양물(실시예 1 참조) 1㎖을 접종시키고, 진탕기에서 180rpm 및 25℃에서 항온처리한다. 티오루틴 디옥사이드의 최대 생산은 약 96시간 후에 도달된다. 72간 동안 침지시킨 배양물(진탕 배양에 대해 기술한 방법에 따르지만 배지(15g/ℓ글루코즈, 15g/ℓ대두분, 5g/ℓ옥수수 침지액, 2g/ℓCaCO₃및 5g/ℓNaCl, pH 7.5)를 사용하여 제조함)은 약 5%의 접종률로 10ℓ 및 100ℓ발효조를 접종시키기에 충분하다.

실시예 3: 티오루틴 디옥사이드의 제조

200ℓ발효조를 다음 조건하에 작동시킨다:

영양 배지: 대두분 15g/ℓ

글루코즈 15g/ℓ

옥수수 침지액 5g/ℓ

NaCl 5g/ℓ

CaCO₃2g/ℓ

pH 7.2(멸균시키기 전)

배양 시간: 60 내지 80시간

배양 온도: 28℃

교반기 속도: 50rpm

통기율: 150ℓ/분

에탄올계 폴리올 용액 1 내지 2㎖ 수방울을 반복적으로 첨가하여 발포를 억제한다. 최대 생산량은 69시간 후에 도달된다.

실시예 4: 티오루틴 디옥사이드의 분리

실시예 3에서 수득한 배양액 3ℓ를 동결건조시킨 다음, 동결건조물을 메탄올(2 내지 3ℓ)로 추출한다. 메탄올 추출물을 진공하에 환원시키고, 10%의 메탄올 함량을 함유하는 물로 희석시킨다. 희석된 추출물을 흡착 수지 CHP-20P로 팩킹된 용적 1ℓ의 컬럼에 충전시킨다. 물 내지 아세토니트릴의 용매 구배를 사용하여 용출시킨다. 컬럼을 통한 유출(30㎖/분)을 30㎖의 분획으로서 수행하고, 목적하는 화합물을 함유하는 분획을 수집하고 진공하에 농축시키고 동결건조시켜 황갈색 분말 약 30mg을 수득한다. 수득된 분말을 LUNA^R10uC18(2)이 팩킹된 컬럼(폭×높이=21mm×250mm)에 충전시키고, 0.1% 암모늄 아세테이트/물 중의 10% 내지 60% 아세토니트릴 구배를 사용하여 용출시킨다. 용출 매질의 유속은 25㎖/분이며, 컬럼으로부터의 유출물을 25㎖의 분획으로서 수집한다. 티오루틴 디옥사이드는 분획 15 및 16에서 발견된다. 상기한 분획들을 동결건조시켜 95% 순도를 초과하는 티오루틴 디옥사이드 1.8mg를 수득한다.

티오루틴 디옥사이드의 물리화학적 및 분광학적 특성은 다음과 같이 요약할 수 있다.

분자식: C₈H₈N₂O₄S₂

분자량: 260.3

UV-최대치: 230, 302, 388nm

1H- 및 13C-NMR: 표 1 참조

1H- 및 13C-NMR: 300K에서 DMSO 중의 티오루틴 디옥사이드의 화학적 이동

	1H	13C
1	2.10	22.51
2	-	170.46
3	10.65	-
4	-	123.01
5	-	164.27
6	3.10	27.85
7	-	145.48
8	-	114.05
9	7.55	109.58

실시예 5: 신경용해소 억제제로서의 티오루틴 디옥사이드

검정은 384-웰 형태에서 CyBio 피펫팅 시스템 상에서 16㎕의 최종 검정 용적으로 수행한다. 간략하게 언급하면, 적절하게 희석된 미생물 추출물 4㎕(50mM 트리스 완충액 중의 희석액, pH 7.5)을 시험 플레이트(Greiner, 백색 384-소용적 웰 플레이트)에 나눠 넣는다. 이어서, 신경용해소 4㎕(1:5로 미리 희석시킴, 단백질 360ng)을 각 웰에 첨가한다. 10분 후, 트리스 완충액 중의 기질(Mcc-Pro-Leu-Gly-D-Lys(Dnp)-OH, CALBIOCHEM) 8㎕을 첨가하여 실온에서 샘플과 효소의 예비배양을 개시한다. 기질의 최종 시험 농도는 4μM이다.

피펫팅 후, 플레이트를 즉시 형광광도계(SpectraFluorplus, SLT)에 놓고 형광의 초기량을 판독한다(λex: 360nm/λex 405nm) 이어서 반응을 30℃에서 30분 동안 진행시키고 최종 형광을 판독한다.

데이터를 먼저 블랭크 보정한다. 이어서 시점 0에서의 수치를 30분후의 각 수치로부터 공제한 후, 샘플 억제 활성을 다음 수학식 1로서 표현한다.

각 시험 플레이트는 적당한 수의 양성 대조군 및 블랭크(효소 대신에 완충액)을 함유한다.

티오루틴 디옥사이드의 IC50은 0.6μM인 것으로 밝혀졌다.

특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약

국 제 양 식

하기 국제 기탁기관에서 정한 규칙 7.1에 따라 발행된 원 기탁에 관한 수탁증

아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하

데-65926 프랑크푸르트/마인

I. 미생물의 동정
기탁자가 첨부한 참고 동정:ST 100692	국제 기탁기관이 부여한 수탁 번호:DSM 13834
II. 과학적 설명 및/또는 제안된 분류학상의 명칭
상기 I에 명시된 미생물에는 하기의 사항을 기재한 문서가 첨부되어 있다:( ) 과학적 설명( ) 제안된 분류학상의 명칭(적용되는 경우에는 크로스로 표시함)
III. 수령 및 기탁
본 국제 기탁기관은 2000년 11월 7일(원 기탁일)¹에 수령된 상기 I에 명시된 미생물을 수탁한다.
IV. 이관청구의 수령
본 국제 기탁기관은 (원 기탁일)에 상기 I에 명시된 미생물을 수령하였고,(이관청구 접수일)에 원 기탁물의 부다페스트 조약하의 기탁물로의 이관청구를수령하였다.
V. 국제 기탁기관
명칭 : DSMZ-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하주소 : 독일 데-38124 브라운슈바이크마쉐로더 벡 1베	국제 기탁기관을 대표하는권한을 갖는 사람(들)또는 증명관(들)의 서명(들):(서 명)날짜 : 2000년 11월 13일

¹. 규칙 6.4(d)가 적용되는 경우, 이 날짜는 국제 기탁기관의 자격이 획득된 날짜이다.

양식 DSMZ-BP/4(단독면)0196

국 제 양 식

하기 국제 기탁기관에서 정한 규칙 10.2에 따라 발행된 생존 진술서

아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하

데-65926 프랑크푸르트/마인

I. 기탁자	II. 미생물 동정
성명 : 아벤티스 파마 도이칠란트 게엠베하주소 : 데-65926 프랑크푸르트/마인	국제 기탁기관이 부여한 수탁 번호:DSM 13834기탁일 또는 이관일¹:2000년 11월 07일
III. 생존 진술
II란에 명시된 미생물의 생존성은 2000년 11월 7일²에 시험되었다.이때 상기 미생물은(ｘ)³생존 상태( )³비생존 상태였다.
IV. 생존 시험 수행시의 조건⁴

V. 국제기탁기관
명칭 : DSMZ-도이췌 잠룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하주소 : 독일 데-38124 브라운슈바이크마쉐로더 벡 1베	국제 기탁기관을 대표하는권한을 갖는 사람(들)또는 증명관(들)의 서명(들)(서 명)날짜 : 2000년 11월 13일

¹. 원 기탁일, 또는 신규 기탁이나 이관이 이루어진 경우, 가장 최근의 날짜(신규 기탁일 또는 이관일)를 가리킨다.

². 규칙 10.2(a) (ii) 및 (iii)이 적용되는 경우, 가장 최근의 생존 시험을 의미한다.

³. 해당 칸에 크로스로 표시한다.

⁴. 정보가 요청되고 시험 결과가 부정적인 경우 기입한다.

양식 DSMZ-BP/9(단독면)0196

Claims

CNS 장애 치료용 의약의 제조시 화학식 I의 화합물 및 이의 생리학적으로 허용되는 염 및 유도체의 용도.

화학식 I

상기 화학식에서,

R1, R2 및 R3은 서로 독립적으로 H, 알킬 및 아실이다.
제1항에 있어서, R1이 아실이고, R2가 H이며, R3이 알킬인 화학식 I의 화합물의 용도.
제1항에 있어서, 화합물이 화학식 II의 티오루틴 디옥사이드인 용도.

화학식 II
미생물 노카르디옵시스 종 ST 100692, DSM 13834 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체를 호기성 조건하에 탄소원과 질소원을 함유하는 영양 배지 내에서 하나 이상의 화학식 I의 화합물이 당해 영양 배지내에 존재할 때까지 배양하는 단계 및 당해 화합물을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 화학식 I의 화합물의 제조방법.
미생물 노카르디옵시스 종 ST 100692, DSM 13834 또는 이의 돌연변이체 또는 변이체를 호기성 조건하에 탄소원과 질소원을 함유하는 영양 배지내에서 티오루틴이 당해 영양 배지내에 존재할 때까지 배양하는 단계, 당해 티오루틴을 분리하는 단계 및 하나 이상의 화학식 I의 화합물로 전환시키는 단계를 포함하는, 화학식 I의 화합물의 제조방법.
제4항 또는 제5항에 있어서, 화학식 I의 화합물을 생리학적으로 허용되는 염, 유도체 또는 상기 유도체의 생리학적으로 허용되는 염으로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
노카르디옵시스 종 ST 100692(DSM 13834).