CZ20032427A3

CZ20032427A3 - Léčivo s obsahem thiolutin-dioxidu a jeho derivátů, způsob přípravy těchto látek pomocí mikroorganismu a tento mikroorganismus

Info

Publication number: CZ20032427A3
Application number: CZ20032427A
Authority: CZ
Inventors: Claudia Eder; Michael Kurz; Joachim Wink
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2002-02-23
Publication date: 2004-01-14
Also published as: SK11202003A3; CN1501800A; KR20040025902A; PL363374A1; US20050059725A1; YU68403A; IL157792A0; MXPA03007551A; CA2439853A1; DE60213219D1; EE200300430A; NO20033964D0; EP1372640B1; US20020193418A1; ATE333276T1; ZA200306474B; NZ528071A; BR0207884A; RU2003129889A; HRP20030714A2

Description

Léčivo s obsahem thiolutin-dioxidu a jeho derivátů, způsob přípravy těchto látek pomocí mikroorganismu a tento mikroorganismus

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká použití thiolutin-dioxidu a jeho derivátů pro přípravu léčiva pro léčení poruch CNS, způsobu jeho přípravy fermentací pomocí mikroorganismu Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834, a mikroorganismu Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834.

Dosavadní stav techniky

Thiolutin je známá přirozená sloučenina, která je komerčně dostupná (Apin Chemicals, Velká Británie; CMS Speciality Chemicals, Velká Británie; Ubichem plc, Velká Británie). Thiolutin-dioxid je také známá sloučenina. Jeden známý způsob přípravy thiolutin-dioxidu spočívá v oxidaci thiolutinu pomocí kyseliny m-chlorperbenzoové (výtěžek 30 %), jak je popsáno v Schachtner a kol., J. Heterocycl. Chem., 1999, str. 161 až 175.

O thiolutin-dioxidu již bylo dříve popsáno, že vykazuje léčivé vlastnosti. Dokument WO 99/12543 popisuje použití thiolutin-dioxidu jako antineoplastického činidla a dokument WO 96/32396 popisuje použití thiolutin-dioxidu jako antibakteriálního a antimykotického činidla.

Podstata vynálezu

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že je thiolutin-dioxid účinným inhibitorem neurolysinu. Neurolysin náleží k rodině metaloproteáz obsahujících zinek. Pravděpodobně hraje roli při fyziologické inaktivaci neurotensinu, endogenního antipsychotického činidla. Thiolutin-dioxid inhibuje inaktivaci ♦ · · · · » ·* ·· ·» • · 4 · · * • · ·» · · • · · · · · · • · · * · · ·· 99 99

9· • 999 9

9 9 9 9 •99 · « · · • 9 9 9 9

9· 99 99 neurotensinu neurolysinem, a je proto použitelný při léčení neurodegenerativních onemocnění, jako je Parkinsonova a Alzheimerova choroba. Thiolutin-dioxid je rovněž selektivní, a to v tom smyslu, že neblokuje jiné metaloproteázy obsahující zinek, jako jsou enkefalináza nebo angiotensin konvertující enzymy.

Bylo rovněž zjištěno, že mikroorganismus Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834, je schopen vytvářet thiolutin-dioxid v relativně vysokém výtěžku.

Předkládaný vynález se v souladu s tím týká použití sloučeniny obecného vzorce I

ve kterém jsou symboly

Rl, R2 a R3 nezávisle zvoleny ze skupiny zahrnující atom vodíku, alkylové skupiny a acylové skupiny, a jejích fyziologicky tolerovatelných solí pro přípravu léčiva k léčení poruch CNS.

Výhodné jsou sloučeniny obecného vzorce I, ve kterém Rl znamená acylovou skupinu, R2 znamená atom vodíku nebo/a R3 znamená alkylovou skupinu; a jejich fyziologicky přijatelné soli.

Acylové skupiny mohou ve sloučeninách obecného vzorce I obsahovat 2 až 10 uhlíkových atomů, výhodně 2 až 6 uhlíkových ·99 ·

9« 9· 99 ·9 «999 9999 99 9

9« 9999 99 9

99 999 999999 9 9

999» 99 9 9999

99 99 99 94 99 atomů a mohou být přímé či rozvětvené, nasycené nebo jednou či dvakrát nenasycené.

Acylová skupina se 2 uhlíkovými atomy například označuje acetylovou skupinu.

Příklady nasycených, nerozvětvených acylových skupin jsou zbytky kyseliny octové, kyseliny propionové, kyseliny máselné, kyseliny valerové, kyseliny kapronové, kyseliny enantové, kyseliny kaprylové, kyseliny pelargonové a kyseliny kaprinové.

Příklady nerozvětvených acylových skupin, které jsou jednou nenasycené, jsou zbytky od kyseliny akrylové a kyseliny krotonové.

Příkladem nerozvětvené acylové skupiny, která je dvojnásobně nenasycená je zbytek kyseliny sorbové.

Alkylové skupiny mohou ve sloučeninách obecného vzorce I obsahovat 1 až 6 uhlíkových atomů a mohou být přímé nebo rozvětvené. Dále alkylové skupiny zahrnují nasycené, a rovněž tak nenasycené skupiny, kteréžto nenasycené skupiny obsahují jednu či dvě dvojné vazby. Příklady alkylových skupin obsahujících 1 až 6 uhlíkových atomů jsou methylová skupina, ethylová skupina, propylová skupina, butylová skupina, pentylová skupina a hexylová skupina, n-isomery všech těchto skupin, isopropylová skupina, isobutylová skupina, 1-methylbutylová skupina, isopentylová skupina, neopentylová skupina, 2,2-dimethylbutylová skupina, 2-methylpentylová skupina, 3-methylpentylová skupina a isohexylová skupina.

Nenasycenými alkylovými skupinami jsou například alkenylové skupiny, jako je vinylová skupina, 1-propenylová skupina, 2-propenylová skupina (= alylová skupina), 2-butenylová skupina, 3-butenylová skupina, 2-methyl-2—butenylová ·· ·· ·* ΦΦ

ΦΦΦΦ Φ · · · Φ Φ · • » · Φ · · ΦΦΦΦΦΦ · · • · · Φ · * · ΦΦΦΦ

ΦΦ Φ* ΦΦ 4· «· ·* skupina, 3-methyl-2-butenylová skupina, 5-hexenylová skupina či 1,3-pentadienylová skupina.

Podle jednoho provedení použití sloučeniny vzorce II se předkládaný vynález týká

nebo její fyziologicky tolerovatelné soli pro přípravu léčiva k léčení poruch CNS.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou použitelné při léčení poruch způsobených nadnormálními hladinami cirkulujícího neurolysinu. K poruchám CNS, které lze léčit sloučeninami obecného vzorce I patří psychotické poruchy, jako je schizofrénie a neurodegenerativní onemocnění, jako je Alzheimerova a Parkinsonova choroba.

Sloučeniny obecného vzorce I lze získat fermentací pomocí mikroorganismu Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834, nebo jednou z jeho variant či mutací za vhodných podmínek, izolací alespoň jedné sloučeniny a konverzí posledně uvedené, pokud je to vhodné, na fyziologicky tolerovatelnou sůl, derivát nebo fyziologicky tolerovatelnou sůl derivátu.

Předkládaný vynález se v souladu s tím týká způsobu přípravy sloučeniny obecného vzorce I, který zahrnuje kultivaci mikroorganismu Nocardiopsis species ST 100692, DSM

13834, nebo jeho mutací či variant, ve vodném živném mediu, izolaci a purifikaci alespoň jedné cílové sloučeniny a • · • · ·

- 5 popřípadě konverzi na fyziologicky tolerovatelnou sůl, derivát nebo fyziologicky tolerovatelnou sůl derivátu.

Kromě produkce thiolutin-dioxidu mikroorganismus Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834 produkuje za podmínek popsané fermentace rovněž thiolutin. Získaný thiolutin lze izolovat a převést na thiolutin-dioxid způsoby odborníkovi známými.

Alternativní způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I podle předkládaného vynálezu v souladu s tím zahrnuje kultivaci mikroorganismu Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834, nebo jeho mutace či varianty ve vodné živném mediu, izolaci a purifikaci thiolutinu, konverzi thiolutinu na alespoň jednu cílovou sloučeninu a popřípadě další konverzi na fyziologicky tolerovatelnou sůl, derivát nebo fyziologicky tolerovatelnou sůl derivátu.

Mikroorganismus Nocardiopsis species ST 100692 byl uložen dne 13. listopadu 2000 za podmínek budapešťské smlouvy u Deutsche Sammlung von Mikroorganismen u Zellkulturen (Německé sbírky mikroorganismů a buněčných kultur, Mascheroder weg lb, D-38124 Braunschweig, pod číslem DSM 13834.

iso, 17:0, 17:0 chromově žluté,

Taxonomické vyšetření mikroorganismu Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834, pomocí analýzy mastných kyselin za použití plynné chromatografie ukázalo, že charakteristickými kyselinami jsou: 14:0 iso, 15:0 anteiso, 15:0 iso, 16:0, 16:0 iso, 17:0 anteiso a 18:0. Kolonie je barvy vytváří bílé vzdušné mycelium, zejména na mediu ISP 2 (kvasnicový slad) a ISP 3 (ovesná kaše).

Namísto kmene DSM 13834 lze rovněž použít jeho mutace a varianty, pokud syntetizují sloučeniny podle vynálezu. Tyto mutace lze vytvářet způsoby o sobě známými pomocí fyzikálních prostředků, například ozařování, jako je například • · • · • ·

ethyl-methansulfonát (EMS); 2-hydroxy-4-methoxybenzofenon (MOD) nebo N-methyl-N'-nitro-N-nitroguanidin (MNNG).

Vyhledávání mutací a variant, které produkují sloučeniny podle vynálezu lze provádět stanovováním biologické aktivity účinných látek, které se hromadí v kultivačním bujónu, například pomocí testování inhibičního účinku vůči neurolysinu způsobem popsaným níže.

Vhodné a výhodné jsou, jako zdroje uhlíku pro aerobní fermentaci, asimilovatelné uhlovodany a cukerné alkoholy, jako je glukóza, laktóza či D-mannitol, a přirozené produkty obsahující uhlovodany, jako je například sladový výtažek. Vhodnými zdroji dusíku jsou aminokyseliny, peptidy a proteiny a jejich degradační produkty, jako jsou peptony či tryptony, rovněž masové extrakty, mletá semena, například kukuřice, pšenice, sojy nebo bavlníku, destilační rezidua z produkce alkoholu, masné moučky nebo kvasinkové extrakty, rovněž však ammoniové soli a nitráty. Anorganickými solemi, které může živný roztok obsahovat, jsou například chloridy, uhličitany, sírany nebo fosforečnany alkalických kovů nebo kovů alkalických zemin, železa, zinku, kobaltu a manganu.

Tvorby thiolutin-dioxidu se obzvláště dobře dosáhne v živném mediu, které obsahuje přibližně 0,5 až 5 % glukózy, výhodně 1 až 2 %, 0,5 až 5% sojové mouky, výhodně 1 až 2 %, 0,1 až 1,5 % kukuřičného výluhu (kapalného), výhodně 0,3 až 0,8 %, 0,05 až 1,0 % uhličitanu vápenatého, výhodně 0,1 až 0,5 % a 0,005 až 1 % chloridu sodného, výhodně 0,3 až 0,8, v každém případě vztaženo ke hmotnosti celého živného roztoku.

Kultivace probíhá aerobně, tj . například ponořená pomocí protřepávání nebo míchání v protřepávacích baňkách či fermenterech, kde je to vhodné se zaváděním vzduchu nebo kyslíku. Fermentaci lze například provádět v lahvích se širokým hrdlem nebo baňkách s kulatým dnem rozličných objemů, • · • ·· · ve skleněných fermenterech nebo nádržích z nerezavějící oceli. Lze ji provádět v teplotním rozmezí činícím přibližně 20 až 35 °C, výhodně přibližně při 25 až 30 °C. Hodnota pH by se měla pohybovat mezi 4 a 10, výhodně mezi 6 a 8. Mikroorganismy se za těchto podmínek obecně kultivují po dobu pohybující se od 20 do 200 hodin, výhodně 24 až 150 hodin.

Kultivace se výhodně provádí v několika stupních, tj. z počátku se v kapalném živném mediu vytvoří jedna či více předkultur, ty se poté přenesou do aktuálního produkčního media, tj . hlavní kultivace, například v obj . poměru 1:10. Předkultura se například získá přenosem sporulovaného mycelia do živného roztoku a jeho ponecháním růst po dobu přibližně 20 až 120 hodin, výhodně 24 až 90 hodin. Sporulované mycelium lze například získat ponecháním kmene růst po dobu 1 až 40 dní, výhodně 5 až 12 dní, na pevném či kapalném živném mediu, například kvasnicovém sladovém agaru nebo bramborodextrózovém agaru.

Postup fermentace a tvorby sloučenin podle vynálezu lze sledovat způsoby odbornému pracovníkovi známými, jako například testováním biologické aktivity pomocí bioanalýz nebo chromatografickými metodami, jako je tenkovrstvá chromatografie (TLC) nebo kapalinová chromatografie s vysokou rozlišovací schopností (HPLC).

Sloučeniny obecného vzorce I se mohou vyskytovat jak v myceliu, tak v kultivačním filtrátu, avšak hlavní množství se obvykle nachází v biomase (myceliu). Proto je vhodné separovat posledně jmenované od předešle jmenovaného pomocí filtrace nebo odstřeďování. Filtrát se extrahuje rozpouštědlem nemísícím se s vodou, jako je 1-butanol, ethylacetát, chloroform či podobně. Mycelium se vhodně extrahuje methanolem nebo acetonem, avšak lze také použít výše uvedená rozpouštědla němísici se s vodou.

Extrakce lze provádět v širokém rozmezí hodnot pH, vhodné je však pracovat s neutrálním prostředím, výhodně mezi pH 4 a pH 8. Organické extrakty lze například koncentrovat ve vakuu a sušit.

Jedním purifikačním způsobem je chromatografie na adsorpčních pryskyřicích, jako na Diaion® HP-20 (Mitsubishi Casei., Tokyo) , na Amberlite® XAD7 (Rohm and Haas, USA) a na Amberchrom® CG (Toso Haas, Philadelphia, USA) . Vhodné jsou rovněž mnohé nosiče s reverzní fází, například RP18, které se staly obecné známými například v rámci vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC).

Sloučeniny obecného vzorce I lze izolovat a purifikovat analogicky ke způsobům popsaným výše nebo jinými způsoby odborníkovi známými.

Deriváty thiolutin-dioxidu jsou výše uvedeným obecným vzorcem též pokryty. Tyto deriváty mají stejné účinky nebo se za mírných podmínek převedou na sloučeniny vykazující stejné účinky jako thiolutin-dioxid. Deriváty lze připravit způsoby odborníkovi dobře známými. Příklady způsobů přípravy některých z derivátů thiolutin-dioxidu obecného vzorce I jsou uvedené níže.

1) (Exocyklickou) acetylovou skupinu thiolutin-dioxidu lze odštěpit kyselinou či bází, jak je popsáno v literatuře, např. v „Protective Groups in Organic Synthesis, 3. vydání, T. Greene & P. Wuts, John Wiley & Sons, 1999, str. 553 až 555.

2) Volnou aminoskupinu thiolutin-dioxidu lze alkylovat například pomocí redukční alkylace, jak je popsáno v „Advanced Organic Chemistry, 4. vydání, J. March, John Wiley & Sons, 1992, str. 898 až 900.

• · ··

3) Aminoskupinu thiolutin-dioxidu lze acylovat například pomocí chloridů nebo anhydridů kyselin, standardními způsoby odborníkovi v oboru známými.

K dalším derivátům sloučenin obecného vzorce I patří ty sloučeniny, které jsou výsledkem redukce alespoň jedné dvojné vazby sloučeniny obecného vzorce I, jako je thiolutin-dioxid, způsoby popsanými v literatuře, například v P. N. Rylander, „Hydrogenation Methods, Academie Press, New York (1985), kapitola 2, nebo dehydrohalogenací způsoby popsanými v H. 0. House in „Modern Synthetic Reactions, W. A. Benjymin, lne. , New York (1972), str. 446 až 452.

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu lze převést na farmaceuticky přijatelné soli. Soli lze připravit standardními způsoby odborníkovi v oboru známými.

Fyziologicky tolerovatelné soli sloučenin obecného vzorce I znamenají jak organické, tak anorganické, soli těchto sloučenin, jak je popsáno v Remington's Pharmaceutical Sciences (17. vydání, str. 1418 (1985)). Soli, jako jsou sodné a draselné soli, lze například připravit podrobením sloučenin podle vynálezu působení vhodných sodných nebo draselných bází.

Dalším provedením předkládaného vynálezu je použití profarmak sloučeniny obecného vzorce I. Takové profarmakum se může in vivo metabolizovat na sloučeninu obecného vzorce I, jako je thiolutin-dioxid. Tato profarmaka mohou být sama účinná či nikoliv.

Sloučeniny obecného vzorce I se mohou vyskytovat v různých polymorfních formách, například jako amorfní a krystalické polymorfní formy. Všechny polymorfní formy sloučenin obecného vzorce I spadají do rámce předkládaného vynálezu a jsou dalším provedením vynálezu.

·

Sloučeniny podle předkládaného vynálezu a jejich farmaceuticky přijatelné soli a deriváty lze podávat zvířatům, výhodně savcům, a zejména lidem, jako léčivo samotné nebo ve směsích s jinou sloučeninou.

Vhodné farmaceutické kompozice v souladu s tím obsahují účinné množství jedné či více sloučenin vzorce I nebo II nebo jejich farmaceuticky přijatelných s farmaceuticky přijatelným nosičem.

solí, společně

Sloučeniny podle vynálezu lze podávat orálně, intramuskulárně, intravenózně nebo jinými způsoby podávání. Farmaceutické kompozice, které obsahují tyto sloučeniny nebo jejich farmaceuticky přijatelnou sůl nebo derivát, popřípadě s dalšími farmaceuticky účinnými látkami, lze připravit smícháním účinných sloučenin s jednou nebo více farmakologicky přijatelnými pomocnými látkami nebo/a excipienty. Směs lze poté převést do vhodné farmaceutické formy, jako jsou tablety, potažené tablety, kapsle, granule, prášky, emulze, suspenze nebo roztoky.

Příklady pomocných látek nebo/a excipientů, které lze uvést, jsou plnidla, emulgační činidla, lubrikanty, maskovací ochucovadla, barvící činidla a pufrovací látky, tragakant, laktóza, talek, agar-agar, polyglykoly, éthanol a voda. Pro parenterální podávání jsou vhodné a výhodné suspenze nebo roztoky ve vodě. Lze také podávat účinné látky jako takové, bez nosičů či ředidel, ve vhodné formě, například v kapslích.

Způsob přípravy vhodného léčiva zahrnuje konverzi alespoň jedné sloučeniny podle předkládaného vynálezu s farmaceuticky vhodným a fyziologicky přijatelným nosičem a, pokud je to vhodné, dalšími účinnými látkami, přísadami nebo pomocnými látkami do vhodné dávkové formy.

• φ • φ φφφφ • ·

	-li-	φ · Φ · · • · φ φ Φ · · • · · · · · ΦΦ ·· · ·	φ e · · •φφφφ · φ φ · ·· φ·
Jak	je obvyklé, závisejí galenický	přípravek a	způsob
podávání,	jakož i dávkové rozmezí,	které jsou	vhodné
v konkrétním případě, na ošetřovaném druhu	a stavu příslušného
stavu či	onemocnění, a lze je optimalizovat způsoby	v oboru
známými.	Při použití pevných dávkových	forem, např.	tablet

nebo kapslí lze podávat až 500 mg, výhodně 0,1 až 250 mg denně. Při parenterálním podávání lze podávat až 300 mg, výhodně 0,5 až 150 mg za den.

Následující příklady provedení vynálezu mají sloužit pro další dokreslení předkládaného vynálezu, aniž by však v nějakém směru omezovaly rozsah předkládaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava suspenze spor produkčního kmene Nocardiopsis species DSM 13834

100 ml živného roztoku (4 g/1 kvasnicového extraktu, 15 g/1 rozpustného škrobu, 1 g/1 K₂HPO₄, 0,5 g/1 MgSO₄ x 7 H₂O v 1000 ml vody, s hodnotou pH před sterilizací 7,0) ve sterilní Erlenmeyerově baňce o objemu 300 ml se naočkuje kmenem Nocardiopsis species DSM 13834 a inkubuje se při 28 °C

a 180 rpm	(otáčkách	za minutu) na rotační	třepačce po	dobu 5
dní. Následně se	1,5 ml této kultury	zředí 1,5	ml 99%
glycerinu	a uchovává	při -20 °C.
Příklad 2
Příprava	kultivace	nebo předkultivace	produkčního	kmene

v Erlenmeyerově baňce

Sterilní Erlenmeyerova baňka obsahující 100 ml následujícího živného roztoku: 15 g/1 sojové mouky, 15 g/1 » 9 · • 9 ·

9 9

9 9 9 • 9 · » 9»

9··· glukózy, 5 g/1 kapalného kukuřičného výluhu, 5 g/1 NaCl a 2 g/1 CaCO₃ se naočkuje kulturou vypěstovanou v šikmé zkumavce (stejný živný roztok, avšak s 2 % agaru) nebo 1 ml glycerinové kultury (viz příklad 1) a inkubuje se na třepačce při 180 rpm a 25 °C. Maximální produkce thiolutin-dioxidu se dosáhne po přibližně 96 hodinách. Ponořená kultura stará 72 hodin (připravená způsobem popsaným pro třepanou kulturu, avšak s následujícím mediem: 15 g/1 glukózy, 15 g/1 sojové mouky, 5 g/1 kukuřičného výluhu, 2 g/1 CaCO₃ a 5 g/1 NaCl, pH 7,5) postačuje pro naočkování 10 a 1001 fermenterů inokulem ve výši přibližně 5 %.

Příklad 3

Produkce thiolutin-dioxidu

Pracuje se s fermenterem o objemu 200 podmínek za následujících

Živné medium:

Inkubační doba: Inkubační teplota Rychlost míchání: Provzdušňování:

sojová mouka 15 g/1 glukóza 15 g/1 kukuřičný výluh 5 g/1 NaCl 5 g/1 CaCO₃ 2 g/1 pH 7,2 (před sterilizací) 60 až 80 hodin 28 °C 50 rpm 150 1/min

Pěnění se potlačuje opakovaným přidáním několika málo kapek 1 až 2 ml ethanolového polyolového roztoku. Produkčního maxima se dosáhne po 69 hodinách.

• ·

Příklad 4

Izolace thiolutin-dioxidu

1 kultivačního roztoku získaného v příkladu 3 se lyofilizují a lyofilizát se následně extrahuje methanolem (2 až 3 1) . Methanolový extrakt se omezí ve vakuu a zředí vodou s obsahem methanolu ve výši 10 %. Zředěný extrakt se vloží na sloupec s kapacitou 1 1 naplněný adsorpční pryskyřicí CHP-20P. Eluce se provádí s gradientem rozpouštědla od vody k acetonitrilu. Průtok sloupcem (30 ml/min) se provádí po frakcích o objemu 30 ml a shromažďují se frakce obsahující požadovanou sloučeninu, koncentrují se ve vakuu a lyofilizují se za vzniku přibližně 30 mg žlutohnědého prášku. Výsledný prášek se vloží na sloupec naplněný LUNA® 10 uC18(2) (šířka x výška = 21 mm x 250 mm) a eluuje se gradientem od 10 do 60 % acetonitrilu v 0,1% ammoniumacetát/voda. Rychlost průtoku elučního media činí 25 ml/min a výtok ze sloupce se shromažďuje po frakcích o objemu 25 ml. Thiolutin-dioxid se nalezne ve frakcích 15 a 16. Lyofilizací řečených frakcí se získá 1,8 mg thiolutin-dioxidu s čistotou > 95 %.

Fyziálně-chemické a spektroskopické vlastnosti thiolutin-dioxidu lze následovně shrnout:

Molekulový vzorec: Molekulová hmotnost: UV maxima:

1H- a 13-C NMR:

C₈H₈N₂O₄S2

260,3

230, 302, 388 nm viz tabulka 1

- 14 ····

Tabulka 1

1H- a 13-C NMR: Chemické posuny thiolutin-dioxidu v DMSO při 300K

	1H	13C
1	2,10	22,51
2	-	170,46
3	10,65	-
4	-	123,01
5	-	164,27
6	3,10	27,85
7	-	145,48
8	-	114,05
9	7,55	109,58

Příklad 5

Thiolutin-dioxid jako inhibitor neurolysinu

Byla provedena analýza na CyBio pipetovacím systému ve formátu třistaosmdesátičtyřjamkové desky v konečném analyzačním objemu ve výši 16 μΐ.

Stručeně: 4 μΐ příslušně zředěných mikrobiálních extraktů (zředění v 50mmol Tris pufru o pH 7,5) bylo rozmístěno na testovací desky (Greiner, bílé desky s 384 nízkoobjemovými jamkami) . Poté byly do každé jamky přidány 4 μΐ neurolysinu (předem zředěného 1:5, 360 ng proteinu). Po 10 minutách preinkubace vzorků a enzymu při pokojové teplotě byla vyvolána reakce přidáním 8 μΐ substrátu (Mcc-Pro-Leu-Gly-D-Lys (Dnp)-OH, CALBIOCHEM) v Tris pufru. Konečná testovací koncentrace substrátu činila 4 μτηοΐ.

Data byla nejprve korigována s ohledem na slepé vzorky. Poté, po odečtení hodnot v časovém bodu nula od příslušných

9·9· hodnot po 30 minutách, byla inhibiční aktivita vzorku vyjádřena jako

100 - (čistá intenzita sloučeniny/čistá intenzita kontroly) x 100 (%)

Každá testovací deska obsahovala přiměřený počet pozitivních kontrol a slepých vzorků (pufr namísto enzymu).

Byla stanovena hodnota IC₅₀ thiolutin-dioxidu ve výši 0,6 pmol.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití sloučeniny obecného vzorce I

R2

Rl, R2 a R3 nezávisle zvoleny ze skupiny zahrnující atom vodíku, alkylové skupiny a acylové skupiny, a jejích fyziologicky tolerovatelných solí a derivátů pro přípravu léčiva k léčení poruch CNS.
2. Použití sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1, ve které Rl znamená acylovou skupinu, R2 znamená atom vodíku a R3 znamená alkylovou skupinu.
3. Použití podle nároku 1, při němž je sloučeninou thiolutin-dioxid vzorce II
4. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I vyznačující se tím, že se kultivuje mikroorganismus • · »· ···*

Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834, nebo jeho mutace či varianty, za aerobních podmínek v živném mediu obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku dokud není v živném mediu obsažena alespoň jedna sloučenina obecného vzorce I, sloučenina se izoluje a purifikuje.
5. Způsob přípravy sloučeniny obecného vzorce I vyznačující se tím, že se kultivuje mikroorganismus Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834, nebo jeho mutace či varianty, za aerobních podmínek v živném mediu obsahujícím zdroje uhlíku a dusíku dokud není v živném mediu obsažen thiolutin, thiolutin se izoluje a převede na alespoň jednu sloučeninu obecného vzorce I.
6. Způsob podle nároku 4 nebo nároku 5 vyznačující se tím, že se dále uvedená sloučenina obecného vzorce I převede na fyziologicky přijatelnou sůl, derivát nebo fyziologicky přijatelnou sůl derivátu.