CN108371661B - 硫藤黄菌素在抑制nlrp3炎症小体活化中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物及医药领域，公开了硫藤黄菌素在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。本发明的发明人发现，硫藤黄菌素可以抑制ATP、尼日尼亚菌素(Nigericin)、单钠尿酸盐(MSU)等不同属性的激动剂对NLRP3炎症小体的激活，但不影响NLRC4、AIM2等炎症小体的活化；抑制NLRP3炎症小体的组装，包括NLRP3与ASC结合及ASC斑点形成；抑制NLRP3蛋白去泛素化；同时，硫藤黄菌素还可以抑制单钠尿酸盐诱导的腹膜炎以及脂多糖(LPS)诱导的败血症；因此可以作为预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物。

Description

硫藤黄菌素在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用
技术领域
本发明涉及生物及医药领域，具体涉及硫藤黄菌素在制备用于抑制NLRP3炎症小体活化中的应用，硫藤黄菌素在抑制NLRP3蛋白去泛素化中的应用，硫藤黄菌素在抑制NLRP3与ASC蛋白结合中的应用，硫藤黄菌素在用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用，一种抑制NLRP3炎症小体活化的方法，一种预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的方法，以及硫藤黄菌素。
背景技术
炎症小体(inflammasome)是由感受蛋白、接头蛋白ASC(apoptosis-associatedspeck like protein containing a CARD，细胞凋亡相关斑点样蛋白)及Caspase1为关键蛋白组装而成的多蛋白复合体，接受免疫原刺激活化后，可以激活Caspase1，进而促进Pro-IL-1β等细胞因子前体的切割成熟；同时，激活的Caspase1还可以引发细胞焦亡(pyroptosis)。作为机体固有免疫的感受器，炎症小体在识别病原相关分子模式(PAMP)及危险相关分子模式(DAMP)中起关键作用。然而炎症小体异常活化则可能造成炎症效应的放大和器官损伤，引发多种免疫相关疾病。在炎症小体中，目前核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)样受体家族含Pyrin结构域蛋白3(NOD-like receptor family,pyrin domain-containing protein 3,NLRP3)炎症小体越来越受到人们的关注。
NLRP3炎症小体具有广谱识别多种类型的病原体或危险信号的能力，在机体免疫应答和疾病发生过程中具有重要作用。NLRP3基因突变导致的异常活化是遗传性疾病Cryopyrin蛋白相关周期综合征(CAPSs)的主要发病原因。NLRP3炎症小体的异常活化也与多种复杂性疾病的发生密切相关，如败血症、二型糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖、痛风、阿尔茨海默病等。因此，进一步发现新的NLRP3炎症小体特异的高效抑制剂对治疗NLRP3相关疾病至关重要。
硫藤黄菌素(thiolutin，本文中也简称THL)是一种由链霉菌产生的硫基微生物抗生素，具有广谱的抑菌活性，其在炎症方面的研究尚未见报道。因此，探索硫藤黄菌素在炎症方面的作用，特别是对NLRP3炎症小体的作用及其机制具有重大的研究意义。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述问题，第一方面，本发明提供了硫藤黄菌素在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。
第二方面，本发明还提供了硫藤黄菌素在抑制NLRP3蛋白去泛素化中的应用。
第三方面，本发明还提供了硫藤黄菌素在抑制NLRP3与ASC蛋白的结合中的应用。
第四方面，本发明提供了硫藤黄菌素在制备用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
第五方面，本发明还提供了一种抑制NLRP3炎症小体活化的方法，该方法包括：将硫藤黄菌素与NLRP3和/或其调控蛋白接触。
第六方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的方法，该方法包括：将硫藤黄菌素给药至患有和/或可能患有NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的患者。
第七方面，本发明还提供了硫藤黄菌素，该硫藤黄菌素用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病。
本发明的发明人在研究过程中发现，硫藤黄菌素可以抑制ATP、Nigericin、MSU等不同属性的激动剂对NLRP3炎症小体的激活，但不影响NLRC4、AIM2等炎症小体的活化；还可以抑制NLRP3炎症小体的组装，包括NLRP3与ASC结合及ASC斑点形成；抑制NLRP3蛋白去泛素化；同时，硫藤黄菌素还可以抑制单钠尿酸盐(MSU)诱导的腹膜炎以及脂多糖(LPS)诱导的败血症。可见，硫藤黄菌素可以作为预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物。
附图说明
图1显示的是本发明实施例1中硫藤黄菌素对LPS+ATP诱导的NLRP3炎症小体活化后IL-1β分泌的抑制作用；
图2显示的是本发明实施例1中硫藤黄菌素对LPS+Nigericin诱导的NLRP3炎症小体活化后IL-1β分泌的抑制作用；
图3显示的是本发明实施例1中硫藤黄菌素对LPS+MSU诱导的NLRP3炎症小体活化后IL-1β分泌的抑制作用；
图4显示的是本发明实施例1中硫藤黄菌素对LPS+Nigericin诱导的NLRP3炎症小体活化后IL-1β前体(Pro-IL-1β)及Caspase1前体(Pro-Casp1)剪切加工的抑制作用；
图5显示的是本发明实施例2中硫藤黄菌素对LPS+ATP诱导的NLRP3炎症小体活化下游Caspase1活化的抑制作用
图6显示的是本发明实施例2硫藤黄菌素对LPS+ATP诱导的NLRP3炎症小体活化下游Caspase1激活导致细胞死亡的抑制作用。
图7显示的是本发明实施例3中硫藤黄菌素抑制ASC多聚化的免疫荧光检测照片；
图8显示的是本发明实施例3中硫藤黄菌素抑制ASC多聚化的免疫荧光检测的统计学结果；
图9显示的是本发明实施例4中硫藤黄菌素对LPS+鞭毛蛋白(Flagellin)诱导的NLRC4炎症小体活化后IL-1β分泌的影响；
图10显示的是本发明实施例4中硫藤黄菌素对LPS+Poly(dA:dT)诱导的AIM2炎症小体活化后IL-1β分泌的影响；
图11显示的是本发明实施例4中在NLRP3炎症小体特异性激动剂(ATP、Nigericin、MSU)、NLRC4炎症小体特异性激动剂Flagellin及AIM2炎症小体特异性激动剂Poly(dA:dT)处理下，硫藤黄菌素对IL-1β分泌的影响；
图12显示的是本发明实施例4中在NLRP3炎症小体特异性激动剂(ATP、Nigericin、MSU)、NLRC4炎症小体特异性激动剂Flagellin及AIM2炎症小体特异性激动剂Poly(dA:dT)处理下，硫藤黄菌素对IL-1β及Caspase1剪切加工的影响；
图13显示的是本发明实施例5中硫藤黄菌素对LPS-TLR4通路下游NF-κB及MAPK信号通路活化的影响；
图14显示的是本发明实施例5中硫藤黄菌素对LPS刺激后NLRP3炎症小体关键蛋白表达的影响；
图15显示的是本发明实施例5中硫藤黄菌素对LPS刺激后TNF-α水平的影响；
图16显示的是本发明实施例6中硫藤黄菌素对NLRP3蛋白去泛素化的抑制作用；
图17显示的是本发明实施例7中硫藤黄菌素对NLRP3与ASC蛋白结合的抑制作用；
图18显示的是本发明实施例8中硫藤黄菌素对MSU诱导小鼠腹膜炎后小鼠腹腔中IL-1β浓度的影响；
图19显示的是本发明实施例8中硫藤黄菌素对MSU诱导小鼠腹膜炎后小鼠腹腔中炎性细胞数的影响；
图20显示的是本发明实施例8中硫藤黄菌素对MSU诱导小鼠腹膜炎后小鼠腹腔中炎性细胞Caspase1活化的影响；
图21显示的是本发明实施例9中硫藤黄菌素对LPS诱导小鼠败血症后小鼠存活率的影响；
图22显示的是本发明实施例9中硫藤黄菌素对LPS诱导小鼠败血症后小鼠血清中IL-1β浓度的影响；
图23显示的是本发明实施例9中硫藤黄菌素对LPS诱导小鼠败血症后小鼠血清中IL-6浓度的影响；
图24显示的是本发明实施例9中硫藤黄菌素对LPS诱导小鼠败血症后小鼠血清中TNF-α浓度的影响。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了硫藤黄菌素(thiolutin，THL)在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。
在本发明中，所述硫藤黄菌素具有如式(I)所示的结构：
在本发明中，术语“NLRP3炎症小体活化”指的是在激活剂(如LPS+ATP)作用下，NLRP3、ASC与Pro-Caspase1结合组装形成多蛋白功能复合体，Pro-Caspase1自剪接为活性形式Caspase1 p20/p10，活化的Caspase1剪接Pro-IL-1β及Pro-IL-18等细胞因子前体为活性因子，并释放至细胞外。
在本发明中，所述硫藤黄菌素抑制NLRP3炎症小体的活化(在体外和/或在体内)，优选地，所述硫藤黄菌素特异性地抑制NLRP3炎症小体的活化，而不影响NLRC4炎症小体和AIM2炎症小体中的活化。
在本发明中，所述硫藤黄菌素不影响所述NLRP3炎症小体活化过程中所述NLRP3炎症小体关键蛋白和/或炎症因子的基因转录和/或蛋白表达的过程。其中，所述关键蛋白为NLRP3、ASC、Pro-Caspase1、Pro-IL-1β；所述炎症因子为IL-1β和/或TNF-α，而是抑制所述NLRP3炎症小体活化过程中NLRP3蛋白去泛素化和/或NLRP3与ASC蛋白结合。
第二方面，本发明还提供了硫藤黄菌素在抑制NLRP3蛋白去泛素化中的应用，特别是在体外抑制NLRP3蛋白去泛素化中的应用。
在本发明中，术语“去泛素化”指的是去除NLRP3蛋白翻译后修饰所结合的泛素链。
第三方面，本发明还提供了硫藤黄菌素在抑制NLRP3与ASC蛋白的结合中的应用，特别是在体外抑制NLRP3与ASC蛋白的结合中的应用。
第四方面，本发明还提供了硫藤黄菌素在制备用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
第五方面，本发明还提供了一种抑制NLRP3炎症小体活化的方法，该方法包括：将硫藤黄菌素与NLRP3蛋白和/或者其调控蛋白接触。
在本发明中，所述接触为体外接触和/或体内接触。其中，所述体内接触的方式可以通过给药途径实现，对所述硫藤黄菌素体内给药方式没有特别的限定，例如，所述给药途径可以包括静脉注射、肌肉注射和皮下注射中的至少一种。
在本发明中，所述硫藤黄菌素通过抑制NLRP3蛋白的去泛素化而抑制所述NLRP3炎症小体的活化；和/或所述硫藤黄菌素通过抑制NLRP3与ASC蛋白的结合而抑制所述NLRP3炎症小体的活化。
本发明中，NLRP3的调控蛋白通常包括乳腺癌易感蛋白复合物亚基蛋白3(BRCC3)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等。
第六方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的方法，该方法包括：将硫藤黄菌素给药至患有和/或可能患有NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的患者。
根据本发明，对给药的方式没有特别的要求，但所述硫藤黄菌素的给药方式优选为静脉注射、肌肉注射和皮下注射中的至少一种。
在本发明中，对所述硫藤黄菌素给药时的剂型没有特别的限定，可以为本领域常规使用的用于药物给药的各种剂型，优选地，所述硫藤黄菌素的剂型为注射剂。
第七方面，本发明还提供了硫藤黄菌素，该硫藤黄菌素用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病。
本发明中，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病可以为常见的NLRP3炎症小体异常活化引起的疾病，优选为败血症和/或腹膜炎。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1
本实施例用于说明硫藤黄菌素对NLRP3炎症小体活化下游事件IL-1β加工成熟及释放的抑制作用。
①.小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)的获取：取C57B6/L小鼠骨髓细胞，按1×106cells/ml的密度接种，用RPMI 1640培养基(加入10％血清及20％L929细胞上清)培养9d，每隔3天换新鲜培养液一次。
②.在24孔板中，按2.5×105个细胞/孔的密度接种BMDM，500ng/mL脂多糖(LPS，Invivogen公司，tlrl-pb5lps)预处理6h，加入不同浓度硫藤黄菌素(THL，0nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM；Cayman公司，11350)处理1h，去上清，加入2mM ATP(Invivogen公司，tlrl-atp)刺激1h，收集上清，利用CBA微球(BD公司，560232)检测IL-1β水平。结果如图1所示。
③.在24孔板中，按2.5×105个细胞/孔的密度接种BMDM，500ng/mL LPS预处理6h，加入不同浓度硫藤黄菌素(0nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM)处理1h，去上清，加入20μM尼日利亚菌素(Nigericin，Invivogen公司，tlrl-nig)刺激1h，收集上清，利用CBA微球检测IL-1β水平。结果如图2所示。
④.在24孔板中，按2.5×105个细胞/孔的密度接种BMDM，500ng/mL LPS预处理6h，加入不同浓度硫藤黄菌素(0nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM)处理1h，去上清，加入200μg/ml单钠尿酸盐(MSU，Invivogen公司，tlrl-msu)刺激6h，收集上清，利用CBA微球检测IL-1β水平。结果如图3所示。
⑤.在12孔板中，按1×106个细胞/孔的密度接种BMDM(无血清RPMI1640培养基)，500ng/mL LPS预处理6h，加入不同浓度硫藤黄菌素(0nM、25nM、50nM、100nM、250nM、500nM)处理1h，去上清，加入20μM Nigericin刺激1h，收集上清(10kD超滤管浓缩)及细胞裂解液，Western Blot检测Caspase1的前体(Pro-Casp1)及其剪接体(p20)和IL-1β前体(Pro-IL-1β)及其剪接体(p17)的表达。结果如图4所示。
由图1-3的结果可以看出，在NLRP3炎症小体特异性激动剂ATP、Nigericin、MSU等处理下，LPS预处理的BMDM会释放大量IL-1β，而硫藤黄菌素可以显著的抑制这种IL-1β的释放，且具有良好的剂量效应关系。硫藤黄菌素在纳摩尔级的剂量范围内就可以发挥显著的抑制效果。由图4可知，硫藤黄菌素可以抑制Pro-IL-1β的加工成熟。同时，硫藤黄菌素也可以抑制Pro-Caspase1的剪接活化。以上结果表明，硫藤黄菌素可以显著抑制NLRP3炎症小体活化下游IL-1β的加工成熟及释放。
实施例2
本实施例用于说明硫藤黄菌素对NLRP3炎症小体活化下游事件Caspase1活化的抑制作用。
①.BMDM的获取：同实施例1的步骤①。
②.在12孔板中，按1×106个细胞/孔的密度接种BMDM(无血清RPMI1640培养基)，500ng/mL LPS预处理6h，加入100nM硫藤黄菌素处理1h，去上清，装载FAM-YVAD-FMK底物荧光探针(ImmunoChemistry公司，FAM-FLICATMCaspase 1分析试剂盒，97)，PBS清洗一次，加入2mM ATP刺激不同时间(0min、30min、60min、90min)，收集细胞，流式检测底物结合荧光强度。结果如图5所示。
③.在96孔板中，按1×105个细胞/孔的密度接种BMDM(无血清RPMI 1640培养基)，500ng/mL LPS预处理6h，加入不同浓度硫藤黄菌素(0nM、25nM、50nM、100nM、250nM、500nM)处理1h，加入2mM ATP刺激1h，用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(碧云天公司，C0017)评估细胞死亡情况。结果如图6所示。
由图5的结果可以看出，硫藤黄菌素可以抑制BMDM细胞内Caspase1与底物的结合，说明硫藤黄菌素可以抑制Caspase1活化。由图6的结果可以看出，硫藤黄菌素可以抑制Caspase1激活所引起的细胞死亡。以上结果表明，硫藤黄菌素可以抑制NLRP3炎症小体活化所引起的Caspase1的激活。
实施例3
本实施例用于说明硫藤黄菌素对NLRP3炎症小体活化下游事件ASC多聚化的抑制作用。
①.BMDM的获取：同实施例1的步骤①。
②.在24孔板中，按2.5×105个细胞/孔的密度接种BMDM，500ng/mL LPS预处理BMDM 6h，加入100nM硫藤黄菌素处理1h，去上清，加入20μMNigericin处理1h，免疫荧光法检测ASC斑点的形成。结果如图7-8所示。
由图7-8的结果可以看出，硫藤黄菌素可以显著减少NLRP3炎症小体激动剂Nigericin处理下BMDM中ASC斑点的形成，而不影响AIM2炎症小体激动剂Poly(dA:dT)刺激所引起的ASC斑点的形成，说明硫藤黄菌素可以特异性抑制NLPR3炎症小体活化下游ASC的多聚化。
实施例4
本实施例用于说明硫藤黄菌素对NLRP3炎症小体活化的特异性抑制作用。
①.BMDM的获取：同实施例1的步骤①。
②.在24孔板中，按2.5×105个细胞/孔的密度接种BMDM，500ng/mL脂多糖预处理6h，加入不同浓度硫藤黄菌素(THL，0nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM)处理1h，去上清，转染100ng NLRC4炎症小体特异激动剂鞭毛蛋白(Flagellin，Invivogen公司，tlrl-epstfla)16h，收集上清，利用CBA微球检测IL-1β水平。结果如图9所示。
③.在24孔板中，按2.5×105个细胞/孔的密度接种BMDM，500ng/mL脂多糖预处理6h，加入不同浓度硫藤黄菌素(THL，0nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM)处理1h，去上清，转染1μg AIM2炎症小体特异激动剂Poly(dA:dT)(Invivogen公司，tlrl-patn)16h，收集上清，利用CBA微球检测IL-1β水平。结果如图10所示。
④.在24孔板中，按2.5×105个细胞/孔的密度接种BMDM，500ng/mL LPS预处理6h，加入100nM硫藤黄菌素处理1h，去上清，分别用2mM ATP、20μM Nigericin处理1h，200μg/mLMSU处理6h，100ng Flagellin和1μg Poly(dA:dT)处理16h，收集上清，利用CBA微球检测IL-1β水平。结果如图11所示。
⑤.在12孔板中，按1×106个细胞/孔的密度接种BMDM(无血清RPMI 1640培养基)，500ng/mL LPS预处理6h，加入100nM硫藤黄菌素处理1h，去上清，分别用2mM ATP、20μMNigericin处理1h，200μg/mL MSU处理6h，100ng Flagellin和1ug Poly(dA:dT)处理16h，收集上清(10kD超滤管浓缩)及细胞裂解液，Western Blot检测Caspase1的前体(Pro-Casp1)及其剪接体(Casp-1 p20)和IL-1β前体(Pro-IL-1β)及其剪接体(IL-1β p17)的表达。结果如图12所示。
由以上图9-12的结果可以看出，在NLRC4炎症小体特异性激动剂Flagellin和AIM2炎症小体特异性激动剂Poly(dA:dT)的处理下，硫藤黄菌素对BMDM IL-1β的分泌、Pro-IL-1β及Pro-Caspase1的剪接加工都没有明显影响。而硫藤黄菌素可以显著抑制NLRP3炎症小体特异性激动剂ATP、Nigericin、MSU所引起的IL-1β的加工成熟及释放。以上结果说明硫藤黄菌素特异性地抑制NLRP3炎症小体的活化，而不影响NLRC4炎症小体和AIM2炎症小体的活化。
实施例5
本实施例用于说明硫藤黄菌素不影响LPS-TLR4信号通路以及NLRP3关键蛋白的表达。
①.BMDM的获取：同实施例1的步骤①。
②.在12孔板中，按1×106个细胞/孔的密度接种BMDM(无血清RPMI1640培养基)，100nM硫藤黄菌素处理BMDM 1h，然后用500ng/mL LPS处理不同时间(0min、5min、15min、30min、60min、120min)，Western Blot检测NF-κB及MAPK信号通路相关蛋白的表达情况。结果如图13所示。
③.在12孔板中，按1×106个细胞/孔的密度接种BMDM(无血清RPMI1640培养基)，不同浓度硫藤黄菌素(0nM、25nM、50nM、100nM、500nM)处理1h，然后用500ng/mL LPS处理6h，收集细胞，Western Blot检测IL-1β前体(Pro-IL-1β)、Caspase-1前体(Pro-Casp1)、ASC、NLRP3蛋白表达的情况。结果如图14所示。
④.在24孔板中，按2.5×105个细胞/孔的密度接种BMDM，不同浓度硫藤黄菌素(0nM、50nM、100nM、250nM、500nM、1000nM)处理1h，然后用500ng/mL LPS处理12h，收集上清，CBA微球检测TNF-α细胞因子的情况。结果如图15所示。
由以上图13-15的结果可以看出，LPS刺激可以明显激活NF-κB及MAPK信号通路，但硫藤黄菌素并不影响LPS刺激下游IκB蛋白水平以及P65、ERK、P38等蛋白磷酸化水平的改变(如图13所示)。此外，硫藤黄菌素也不影响Pro-IL-1β、Pro-Casp1、ASC、NLRP3蛋白的表达(如图14所示)，对LPS刺激后细胞上清TNF-α的水平也没有明显影响(如图15所示)。这些结果说明硫藤黄菌素对NLRP3炎症小体活化的抑制并不是通过影响LPS-TLR4信号通路或NLRP3炎症小体关键蛋白的表达所实现。
实施例6
本实施例用于说明硫藤黄菌素对NLRP3蛋白去泛素化的抑制作用。
①.BMDM的获取：同实施例1的步骤①。
②.500ng/mL LPS预处理BMDM 6h，加入100nM硫藤黄菌素处理1h，去上清，加入20μM Nigericin处理1h，用NLRP3抗体IP、Western Blot检测NLRP3泛素化水平。结果如图16所示。
由图16的结果可以看出，在对照组中，Nigericin刺激可以显著的降低NLRP3泛素化水平(第3泳道)，而硫藤黄菌素的处理则可以抑制这一过程(第6泳道)。说明硫藤黄菌素可以抑制NLRP3蛋白的去泛素化。
实施例7
本实施例用于说明硫藤黄菌素对NLRP3与ASC蛋白结合的抑制作用。
①.BMDM的获取：同实施例1的步骤①。
②.500ng/mL LPS预处理BMDM 6h，加入100nM硫藤黄菌素处理1h，去上清，加入20μM Nigericin处理1h，用ASC抗体IP、Western Blot检测NLRP3结合情况。结果如图17所示。
由图17的结果可以看出，在对照组中，Nigericin刺激可以显著的促进ASC与NLRP3的结合，而硫藤黄菌素的处理则可以抑制这一过程。以上结果表明，硫藤黄菌素可以抑制NLRP3与ASC蛋白的结合。
实施例8
本实施例用于说明硫藤黄菌素促进小鼠抵抗单钠尿酸盐(MSU)诱导的腹膜炎，同时在体内验证硫藤黄菌素对NLRP3炎症小体活化的抑制作用。
C57BL/6小鼠腹腔注射MSU，建立腹膜炎模型：腹腔注射2.5mg/kg硫藤黄菌素，1h后注射1mg MSU，6h后腹腔注射3mL PBS，抽取腹水。离心后，上清用于检测IL-1β细胞因子的浓度(结果如图18所示)。下层细胞计数，并标记CD45、Ly6G、Ly6C，流式分析炎性细胞的数量(结果如图19所示)。此外，收集腹腔细胞，装载Caspase1荧光标记底物FAM-YVAD-FMK，流式检测腹腔中性粒细胞(CD11b+Ly6G+)及炎性单核细胞(CD11b+Ly6G-Ly6C+)内Caspase1活化情况(结果如图20所示)。
由以上图18-20的结果可以看出，腹腔注射MSU(NLRP3炎症小体特异性激动剂)可以促进腹腔炎性细胞中IL-1β的释放，进而募集中性粒细胞及炎性单核细胞等炎性细胞，引发腹膜炎。而硫藤黄菌素处理可以显著降低腹腔IL-1β的水平，抑制中性粒细胞及炎性单核细胞在腹腔的募集，同时，抑制中性粒细胞及炎性单核细胞中Caspase1的活化。以上结果表明硫藤黄菌素在体内也能有效抑制NLRP3炎症小体活化，促进小鼠抵抗MSU诱导的腹膜炎。
实施例9
本实施例用于说明硫藤黄菌素促进小鼠抵抗LPS诱导的败血症。
C57BL/6小鼠腹腔注射LPS，建立败血症模型：a.腹腔注射2.5mg/kg硫藤黄菌素，1h后注射20mg/kg LPS(致死剂量)，检测小鼠存活率，结果如图21所示；b.腹腔注射2.5mg/kg硫藤黄菌素，1h后注射20mg/kg LPS，6h后采血，检测血清IL-1β、IL-6、TNF-α等细胞因子的浓度，结果分别如图22-24所示。
由图21-24的结果可以看出，LPS处理可以引发小鼠系统性炎症因子风暴，导致败血症发生，最终引起小鼠死亡。而硫藤黄菌素可以大大降低小鼠血清IL-1β及IL-6等细胞因子的水平(图22-23)，进而促进小鼠抵抗败血症的发生，显著提高小鼠存活率(图21)。硫藤黄菌素并不影响TNF-α的水平(图24)，也间接说明硫藤黄菌素的保护作用是通过抑制NLRP3炎症小体活化来实现。以上结果表明，硫藤黄菌素可以促进小鼠抵抗LPS诱导的败血症。
通过以上实施例1-9的结果可以看出，硫藤黄菌素可以抑制ATP、Nigericin、MSU等不同属性的激动剂对NLRP3炎症小体的激活，但不影响NLRC4、AIM2等炎症小体的活化；硫藤黄菌素通过抑制NLRP3去泛素化和/或抑制NLRP3与ASC结合的方式来抑制NLRP3炎症小体活化。同时，硫藤黄菌素还可以抑制MSU诱导的腹膜炎以及LPS诱导的败血症。可见，硫藤黄菌素可以作为预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.硫藤黄菌素在体外抑制NLRP3炎症小体活化中非治疗目的的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，该应用包括：将硫藤黄菌素与NLRP3蛋白和/或其调控蛋白接触。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述硫藤黄菌素通过抑制NLRP3蛋白去泛素化而抑制所述NLRP3炎症小体的活化；和/或所述硫藤黄菌素通过抑制NLRP3与ASC蛋白的结合而抑制所述NLRP3炎症小体的活化。
4.硫藤黄菌素在体外抑制NLRP3蛋白去泛素化中非治疗目的的应用。
5.硫藤黄菌素在体外抑制NLRP3与ASC蛋白结合中非治疗目的的应用。
6.硫藤黄菌素在制备用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用，其中，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病为败血症、腹膜炎、Cryopyrin蛋白相关周期综合征、二型糖尿病、动脉粥样硬化、肥胖、痛风和阿尔茨海默病中的至少一种。
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