CN108815158A - 全霉素在抑制nlrp3炎症小体活化中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物及医药领域，公开了全霉素在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。本发明的发明人发现，全霉素能够抑制NLRP3蛋白在激动剂刺激下自身去泛素化，抑制NLRP3与ASC蛋白的结合、ASC斑点的形成，以及Caspase‑1的活化，最终抑制IL‑1β及IL‑18的分泌。同时，全霉素还能够在体内抑制单钠尿酸盐诱导的腹膜炎。因此，全霉素可以成为治疗NLRP3异常活化相关性疾病的特效药物。

Description

全霉素在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用
技术领域
本发明涉及生物及医药领域，具体涉及全霉素在制备用于抑制NLRP3炎症小体活化中的应用，全霉素在抑制NLRP3蛋白去泛素化中的应用，全霉素在抑制NLRP3与ASC蛋白结合中的应用，全霉素在抑制Caspase-1蛋白的活化中的应用，全霉素在抑制NLRP3炎症小体分泌IL-1β和/或IL-18中的应用，全霉素在用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用，一种抑制NLRP3炎症小体活化的方法，一种预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的方法，以及全霉素。
背景技术
天然免疫是机体保护自身的第一道防线，而炎症小体作为天然免疫重要组成部分，在识别病原相关分子模式及危险相关分子模式中起至关重要的作用。近期大规模基因组学分析及临床结果表明，NLRP3(NOD-like receptor family,pyrin domain-containingprotein 3)炎症小体在众多疾病发生、发展过程中发挥重要作用，如冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)、痛风、类风湿性关节炎、急、慢性炎症、肺纤维化、代谢性疾病、肿瘤等。因此研究NLRP3炎症小体活化机制，设计特异性调控靶点，正成为攻克相关疾病的新武器。
NLRP3炎症小体(NLRP3inflammasome)由感受蛋白NLRP3、接头蛋白ASC(apoptosis-associated speck like protein containing a CARD，细胞凋亡相关斑点样蛋白)、细胞凋亡相关蛋白Caspase-1蛋白组成。目前研究发现，NLRP3炎症小体活化需要两个阶段：起始阶段(priming)和活化阶段(activation)。起始阶段激活炎症通路，上调NLRP3、IL-1β(白细胞介素-1β)前体等蛋白水平，为随后活化阶段做准备。活化阶段，NLRP3发生去泛素化，然后与ASC结合，进而招募Caspase-1组装形成功能复合体，随后对IL-1β前体和IL-18(白细胞介素-18)前体等进行剪切，最终形成成熟的IL-1β和IL-18。
全霉素(Holomycin，本文简称HL)是由链霉菌产生的一种抗生素，具有广谱的抑菌活性，但是在抑制炎症小体活化及IL-1β分泌方面尚未发现。因此，探究全霉素对NLRP3炎症小体的作用以及全霉素对IL-1β相关疾病的作用具有重大意义。
发明内容
为了克服现有技术存在的上述问题，第一方面，本发明提供了全霉素在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。
第二方面，本发明还提供了全霉素在抑制NLRP3蛋白去泛素化中的应用。
第三方面，本发明还提供了全霉素在抑制NLRP3与ASC蛋白的结合中的应用。
第四方面，本发明提供了全霉素在抑制Caspase-1蛋白的活化中的应用。
第五方面，本发明提供了全霉素在抑制IL-1β分泌中的应用。
第六方面，本发明提供了全霉素在制备用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
第七方面，本发明还提供了一种抑制NLRP3炎症小体活化的方法，该方法包括：将全霉素与NLRP3蛋白和/或其调控蛋白接触。
第八方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的方法，该方法包括：将全霉素给药至患有和/或可能患有NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的患者。
第九方面，本发明还提供了全霉素，该全霉素用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病。
本发明的发明人在研究过程中发现，全霉素能够抑制NLRP3蛋白在激动剂刺激下自身去泛素化，抑制NLRP3与ASC蛋白的结合、ASC斑点的形成，以及Caspase-1的活化，最终抑制IL-1β的分泌。动物实验进一步发现，全霉素能够在体内抑制MSU(单钠尿酸盐)诱导的腹膜炎。因此，全霉素可能成为治疗NLRP3异常活化相关疾病的潜在特效药物。
附图说明
图1显示的是本发明实施例1中全霉素对LPS+ATP诱导的NLRP3炎症小体IL-1β和IL-18的分泌的抑制作用；
图2显示的是本发明实施例1中全霉素对LPS+尼日尼亚菌素诱导的NLRP3炎症小体IL-1β和IL-18的分泌的抑制作用；
图3显示的是本发明实施例1中全霉素对LPS+MSU诱导NLRP3炎症小体IL-1β分泌的抑制作用；
图4显示的是本发明实施例1中全霉素对LPS+尼日尼亚菌素诱导NLRP3炎症小体Caspase1前体(Pro-Casp1)以及IL-1β前体(Pro-IL-1β)的剪切的抑制作用；
图5显示的是本发明实施例2中全霉素对LPS+尼日尼亚菌素诱导的NLRP3炎症小体Caspase1的酶活的抑制作用；
图6显示的是本发明实施例2中全霉素对LPS+尼日尼亚菌素诱导的NLRP3炎症小体Caspase1活化所引起的细胞死亡的抑制作用；
图7显示的是本发明实施例3中全霉素特异性抑制ASC多聚化(斑点)的免疫荧光检测的照片；
图8显示的是本发明实施例3中全霉素特异性抑制ASC多聚化(斑点)的免疫荧光检测的统计学结果；
图9显示的是本发明实施例4中全霉素对LPS+鞭毛蛋白诱导的NLRC4炎症小体IL-1β的分泌的影响结果；
图10显示的是本发明实施例4中全霉素对LPS+Poly(dA:dT)诱导的AIM2炎症小体IL-1β的分泌的影响结果；
图11显示的是本发明实施例4中不同炎症小体激动剂刺激下，全霉素对IL-1β前体及Caspase1前体剪切的影响结果；
图12显示的是本发明实施例5中全霉素在LPS对NF-κB及MAPK信号通路的活化方面的影响结果；
图13显示的是本发明实施例5中全霉素在LPS对NLRP3炎症小体关键蛋白的上调方面的影响结果；
图14显示的是本发明实施例5中全霉素对LPS刺激巨噬细胞后TNF-α的分泌的影响结果；
图15显示的是本发明实施例6中全霉素对炎症小体活化后NLRP3蛋白去泛素化的抑制作用；
图16显示的是本发明实施例7中全霉素对NLRP3与ASC蛋白结合的抑制作用；
图17显示的是本发明实施例8中全霉素对MSU诱导小鼠腹膜炎后腹腔以及血液中IL-1β的分泌的抑制作用；
图18显示的是本发明实施例8中全霉素对MSU诱导小鼠腹膜炎后腹腔TNF-α的分泌的影响；
图19显示的是本发明实施例8中全霉素对MSU诱导小鼠腹膜炎后腹腔中炎性细胞数的侵润的抑制作用。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供了全霉素(HL)在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。
在本发明中，所述全霉素具有如式(I)所示的结构：
在本发明中，术语“NLRP3炎症小体活化”指的是在激活剂(如LPS+ATP)作用下，NLRP3、ASC与Pro-Caspase1结合组装形成多蛋白功能复合体，Pro-Caspase1自剪接为活性形式Caspase1p20/p10，活化的Caspase1剪接Pro-IL-1β及Pro-IL-18等细胞因子前体为活性因子，并释放至细胞外。
在本发明中，所述全霉素抑制NLRP3炎症小体的活化(在体外和/或在体内)，优选地，所述全霉素特异性地抑制NLRP3炎症小体的活化，而不影响NLRC4炎症小体和AIM2炎症小体中的活化。
在本发明中，所述全霉素不影响所述NLRP3炎症小体活化过程中所述NLRP3炎症小体关键蛋白和/或炎症因子的基因转录和/或蛋白表达的过程(其中，所述关键蛋白为NLRP3、ASC、Pro-Caspase1、Pro-IL-1β；所述炎症因子为IL-1β和/或TNF-α)，而是抑制所述NLRP3炎症小体活化过程中NLRP3蛋白去泛素化、NLRP3与ASC蛋白结合、Caspase-1蛋白的活化和IL-1β的分泌中的至少一种。
第二方面，本发明还提供了全霉素在抑制NLRP3蛋白去泛素化中的应用，特别是在体外抑制NLRP3蛋白去泛素化中的应用。
在本发明中，术语“去泛素化”指的是去除NLRP3蛋白翻译后修饰所结合的泛素链。
第三方面，本发明还提供了全霉素在抑制NLRP3与ASC蛋白的结合中的应用，特别是在体外抑制NLRP3与ASC蛋白的结合中的应用。
第四方面，本发明还提供了全霉素在抑制Caspase-1蛋白的活化中的应用，特别是在体外抑制Caspase-1蛋白的活化中的应用。或者本发明还提供了全霉素(特别是在体外)抑制Caspase-1的酶活力、Caspase-1的剪切以及Caspase-1活化引起的细胞焦亡(pyroptosis)中的至少一种中的应用。
第五方面，本发明提供了全霉素在抑制IL-1β和/或IL-18分泌中的应用，特别是在体外抑制IL-1β和/或IL-18分泌中的应用。
第六方面，本发明还提供了全霉素在制备用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
第七方面，本发明还提供了一种抑制NLRP3炎症小体活化的方法，该方法包括：将全霉素与NLRP3蛋白和/或者其调控蛋白接触。
在本发明中，所述接触为体外接触和/或体内接触。其中，所述体内接触的方式可以通过给药途径实现，对所述全霉素体内给药方式没有特别的限定，例如，所述给药途径可以包括腹腔注射、静脉注射、肌肉注射和皮下注射中的至少一种。
在本发明中，所述全霉素通过抑制NLRP3蛋白的去泛素化而抑制所述NLRP3炎症小体的活化；和/或所述全霉素通过抑制NLRP3与ASC蛋白的结合而抑制所述NLRP3炎症小体的活化；和/或所述全霉素通过抑制Caspase-1蛋白的活化而抑制所述NLRP3炎症小体的活化。
本发明中，NLRP3的调控蛋白通常包括乳腺癌易感蛋白复合物亚基蛋白3(BRCC3)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)等。
第八方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的方法，该方法包括：将全霉素给药至患有和/或可能患有NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的患者。
根据本发明，对给药的方式没有特别的要求，但所述全霉素的给药方式优选为腹腔注射、静脉注射、肌肉注射和皮下注射中的至少一种。
在本发明中，对所述全霉素给药时的剂型没有特别的限定，可以为本领域常规使用的用于药物给药的各种剂型，优选地，所述全霉素的剂型为注射剂。
在本发明中，对所述全霉素的给药剂量没有特别的要求，以小鼠为例，可以为1-5mg/kg体重。
在本发明中，所述患者可以为哺乳动物，如啮齿类动物和/或灵长类动物，例如，人和/或鼠。
第九方面，本发明还提供了全霉素，该全霉素用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病。
本发明中，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病可以为常见的NLRP3炎症小体异常活化引起的疾病，优选为冷吡啉相关周期性综合征(CAPS)、痛风、类风湿性关节炎、腹膜炎、败血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝病、肺纤维化和神经退行性疾病中的至少一种。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。单位“M”即“mol/L”；C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
实施例1
本实施例用于说明在不同的NLRP3特异性激动剂刺激下，全霉素都能明显抑制NLRP3炎症小体活化后IL-1β或IL-18的加工成熟及释放。
①.小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)的培养及分化：取10周龄左右的C57BL/6小鼠骨髓细胞，用RPMI 1640培养基+10％灭活血清+100ng/ml MSCF(巨噬细胞集落刺激因子，Peprotech)培养，每三天换一次液，培养7天即可获得成熟的BMDM。
②.接种2.5×105个细胞/孔至24孔板中，RPMI 1640培养基+10％灭活血清不含MCSF培养过夜，然后100ng/mL脂多糖(LPS，Invivogen公司，tlrl-pb5lps)刺激BMDM6h，随后加入不同浓度的全霉素(HL，0nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、250nM；TRC公司，H458490)处理2h，撤去全霉素，用5mM ATP(Invivogen公司，tlrl-atp)刺激45min，上清中IL-1β采用CBA微球(BD公司，560232)进行检测，IL-18采用IL-18ELSIA检测试剂盒(Thermo FisherScientific，KMC0181)。结果如图1所示。
③.接种2.5×105个细胞/孔至24孔板中，RPMI 1640培养基+10％灭活血清不含MCSF培养过夜，然后100ng/mL脂多糖(LPS，Invivogen公司，tlrl-pb5lps)刺激BMDM6h，随后加入不同浓度全霉素(HL，0nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、250nM；TRC公司，H458490)处理2h，撤去全霉素，用20μM尼日尼亚菌素(Nigericin，Invivogen公司，tlrl-nig)刺激45min，上清中IL-1β采用CBA微球(BD公司，560232)进行检测，IL-18采用IL-18ELSIA检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific,KMC0181)。结果如图2所示。
④.接种2.5×105个细胞/孔至24孔板中，RPMI 1640培养基+10％灭活血清不含MCSF培养过夜，然后100ng/mL脂多糖(LPS，Invivogen公司，tlrl-pb5lps)刺激BMDM6h，随后加入不同浓度全霉素(HL，0nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、250nM；TRC公司，H458490)处理2h，去上清，加入200μg/ml单钠尿酸盐(MSU，Invivogen公司，tlrl-msu)刺激6h，上清中IL-1β采用CBA微球(BD公司，560232)进行检测。结果如图3所示。
⑤.接种2.5×106个细胞/孔至12孔板中，RPMI 1640培养基+10％血清不含MCSF培养过夜，然后100ng/mL脂多糖(LPS，Invivogen公司，tlrl-pb5lps)刺激BMDM6h，随后加入不同浓度全霉素(HL，0nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、250nM；TRC公司，H458490)处理2h，撤去全霉素，加入20μM尼日尼亚菌素刺激45min(采用无血清培养基配制)，上清蛋白用10kD超滤管浓缩，细胞内蛋白用2×上样缓冲液进行裂解，Western Blot检测Caspase1的前体(Pro-Casp1)及其剪接体(p20)和IL-1β前体(Pro-IL-1β)及其剪接体(p17)。结果如图4所示。
炎症小体活化后，细胞分泌大量成熟的IL-1β和IL-18。由图1-3的结果显示，在不同的NLRP3炎症小体激动剂刺激下，全霉素能够梯度抑制IL-1β和IL-18的分泌，并且全霉素对IL-1β的IC50为10nM左右。图4结果显示，全霉素能够梯度抑制IL-1β前体的加工和剪切。综上可知，全霉素能够高效抑制NLRP3炎症小体IL-1β的加工成熟及释放。
实施例2
本实施例用于说明全霉素能够抑制NLRP3炎症小体中Caspase-1的酶活以及其活化引起的细胞焦亡。
①.BMDM的获取：同实施例1的步骤①。
②.接种5×106细胞于60mm(非处理)的培养皿中，RPMI 1640培养基+10％灭活血清不含MCSF培养过夜，然后100ng/mL脂多糖(LPS，Invivogen公司，tlrl-pb5lps)刺激BMDM6h，随后加入全霉素(HL，100nM；TRC公司，H458490)处理2h，撤去全霉素，收集细胞至无菌流式管中，装载FAM-YVAD-FMK底物荧光探针(ImmunoChemistry公司，FAM-FLICATMCaspase 1分析试剂盒，97)，PBS清洗一次，加入20μM尼日尼亚菌素刺激不同时间(0min、15min、30min、45min)，PBS清洗一次，随后流式检测底物结合荧光强度。结果如图5所示。***p<0.0001。
③.接种2×104个细胞/孔至96孔板中，RPMI 1640培养基+10％血清不含MCSF培养过夜，然后100ng/mL脂多糖(LPS，Invivogen公司，tlrl-pb5lps)刺激BMDM6h，随后加入不同浓度全霉素(HL，0nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、250nM；TRC公司，H458490)处理2h，撤去全霉素，加入20μM尼日尼亚菌素45min，随后细胞死亡情况用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(promega，G1780)进行检测。结果如图6所示。
FAM-YVAD-FMK底物荧光探针能够被活化的Caspase-1识别并剪切随后释放荧光，是目前检测Caspase-1酶活性的有效工具。由图5结果可知，全霉素能够抑制Caspase-1酶活。图6结果显示，全霉素能够梯度抑制Caspase-1活化后引起的细胞死亡。综上表明，全霉素能够抑制NLRP3炎症小体中Caspase-1的活化及其引起细胞死亡。
实施例3
本实施例用于说明全霉素能够特异性抑制NLRP3炎症小体活化过程中ASC的多聚化。
①.BMDM的获取：同实施例1的步骤①。
②.在24孔板放置75％乙醇灭菌过的盖玻片，随后接种5×105个细胞/孔，RPMI1640培养基+10％血清不含MCSF培养过夜，然后100ng/mL脂多糖刺激BMDM6h，随后加入全霉素(HL，100nM；TRC公司，H458490)处理2h，撤去全霉素，加入20μM尼日尼亚菌素刺激45min，4％的多聚甲醛固定细胞后，免疫荧光法检测ASC斑点的形成。结果如图7-8所示。***p<0.0001。
炎症小体的活化过程中，ASC空间结构上发生多聚化，并形成斑点，通过免疫荧光方法可以在激光共聚焦显微镜下观察到明显的斑点。图7-8结果显示，全霉素能够明显抑制NLRP3炎症小体激动剂尼日尼亚菌素处理下巨噬细胞中ASC斑点的形成，但是全霉素对Poly(dA:dT)(AIM2炎症小体激动剂)所引起的ASC斑点的形成则没有抑制效果。
实施例4
本实施例用于进一步说明全霉素能够特异性抑制NLRP3炎症小体，而对NLRC4、AIM2等炎症小体没有影响。
①.BMDM的获取：同实施例1的步骤①。
②.接种2.5×105个细胞/孔至24孔板中，RPMI 1640培养基+10％血清不含MCSF培养过夜，然后100ng/mL脂多糖(LPS，Invivogen公司，tlrl-pb5lps)刺激BMDM6h，随后加入不同浓度全霉素(HL，0nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、250nM；TRC公司，H458490)处理2h，撤去全霉素，转染100ng鞭毛蛋白NLRC4炎症小体特异激动剂(Flagellin，Invivogen公司，tlrl-epstfla)16h，上清中IL-1β采用CBA微球(BD公司，560232)进行检测。结果如图9所示。
③.接种2.5×105个细胞/孔至24孔板中，RPMI 1640培养基+10％血清不含MCSF培养过夜，然后100ng/mL脂多糖(LPS，Invivogen公司，tlrl-pb5lps)刺激BMDM6h，随后加入不同浓度全霉素(HL，0nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、250nM；TRC公司，H458490)处理2h，撤去全霉素，转染0.5μg Poly(dA:dT)AIM2炎症小体特异激动剂(Invivogen公司，tlrl-patn)16h，上清中IL-1β采用CBA微球(BD公司，560232)进行检测。结果如图10所示。
④.接种2.5×106个细胞/孔至12孔板中，RPMI 1640培养基+10％血清不含MCSF培养过夜，然后100ng/mL脂多糖(LPS，Invivogen公司，tlrl-pb5lps)刺激BMDM6h，随后加入不同浓度全霉素(HL，0nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、250nM；TRC公司，H458490)处理2h，撤去全霉素，分别用5mM ATP、20μM尼日尼亚菌素处理45min，200μg/mL MSU处理6h，100ng鞭毛蛋白和1ug Poly(dA:dT)处理16h(需采用无血清培养基配制)，上清蛋白用10kD超滤管浓缩，细胞内蛋白用2×上样缓冲液进行裂解，Western Blot检测Caspase1的前体(Pro-Casp1)及其剪接体(p20)和IL-1β前体(Pro-IL-1β)及其剪接体(p17)。结果如图11所示。
由图9-11可知，不同浓度的全霉素均不能抑制NLRC4、AIM2炎症小体Caspase-1的剪切和IL-1β的分泌。但是全霉素能够很好的抑制NLRP3炎症小体激动剂ATP、尼日尼亚菌素、MSU所引起的IL-1β的分泌。综上结果进一步表明，全霉素能够特异性抑制NLRP3炎症小体的活化。而特异性往往决定了成药性与靶向性，同时也暗示着成药后的低副作用。
实施例5
本实施例用于说明全霉素不影响LPS引起的炎症信号通路的活化以及LPS对NLRP3炎症小体关键蛋白的上调。
①.BMDM的获取：同实施例1的步骤①。
②.接种2.5×106个细胞/孔至12孔板中，RPMI 1640培养基不含MCSF培养过夜，100nM全霉素处理BMDM 1h，然后100ng/mL脂多糖(LPS，Invivogen公司，tlrl-pb5lps)刺激BMDM不同时间(0min、5min、15min、30min、60min、120min)，2×上样缓冲液进行裂解细胞提取蛋白，Western Blot检测NF-κB及MAPK信号通路相关蛋白表达水平。结果如图12所示。
③.接种2.5×106个细胞/孔至12孔板中培养过夜，不同浓度全霉素(10nM、25nM、50nM、100nM、250nM)处理2h，然后用100ng/mL LPS处理4h，2×上样缓冲液进行裂解细胞提取蛋白，Western Blot检测IL-1β、Caspase-1、ASC、NLRP3蛋白表达的情况。结果如图13所示。
④.接种2.5×105个细胞/孔至24孔板中培养过夜，不同浓度全霉素(0nM、10nM、25nM、250nM、500nM、1000nM)处理2h，随后100ng/mL LPS刺激BMDM 12h，最后利用CBA微球检测上清中细胞因子。结果如图14所示。
LPS刺激巨噬细胞，通过活化NF-κB及MAPK等炎症信号通路，一方面产生大量的IL-1β、IL-18前体，另一方面上调NLRP3炎症小体的关键蛋白。由图12-14可知，全霉素不影响LPS刺激下信号通路的活化，以及其他炎症因子TNF-α的产生及分泌，同时也不影响LPS对炎症小体活化关键蛋白NLRP3、IL-1β、ASC、Caspase-1等蛋白的表达水平。由此可以推断，全霉素抑制NLRP3炎症小体的活化，并不是通过影响炎症小体活化的准备阶段，而是直接影响炎症小体活化过程的组装阶段。
实施例6
本实施例用于说明全霉素能够特异性抑制NLRP3蛋白去泛素化进而影响炎症小体的组装和活化。
①.BMDM的获取：同实施例1的步骤①。
②.2×107个细胞种至100mm培养皿中培养过夜，LPS刺激4h后，接着加入100nM全霉素处理2h，去上清，加入20μM尼日尼亚菌素处理1h，用NLRP3抗体IP、Western Blot检测NLRP3泛素化水平。结果如图15所示。
NLRP3蛋白静息状态下处于高泛素化，在其活化过程中，泛素化会被去泛素化。如图15所示，在尼日尼亚菌素刺激下，正常对照组NLRP3泛素化显示去除，但是处理组中，全霉素则能明显抑制尼日尼亚菌素对NLRP3的泛素化去除。这表明全霉素能够抑制NLRP3的去泛素化。
实施例7
本实施例用于说明全霉素能够抑制NLRP3与ASC蛋白的结合。
①.BMDM的获取：同实施例1的步骤①。
②.2×107个细胞种至100mm培养皿中培养过夜，LPS刺激4h后，接着加入100nM全霉素处理2h，去上清，加入20μM尼日尼亚菌素处理0.5h，用ASC抗体IP、Western Blot检测NLRP3结合情况。结果如图16所示。
炎症小体活化过程中，NLRP3发生去泛素化，进而与ASC结合，随后招募Caspase-1，然后对IL-1β进行剪切。图16的结果表明，全霉素能够抑制NLRP3与ASC的结合。
实施例8
本实施例用于说明全霉素抵抗单钠尿酸盐(MSU)诱导的小鼠腹膜炎，同时在体内验证了全霉素对NLRP3炎症小体活化的抑制作用。
10周龄的C57BL/6小鼠腹腔提前1h注射2mg/kg全霉素，随后每只小鼠腹腔注射1mg的MSU，6h后腹腔注入5ml预冷的PBS抽取腹腔内含物。离心后上清检测IL-1β和TNF-α水平(结果如图17-18所示)。下层细胞标记CD45、CD11b、Ly6C、Ly6G流式抗体，流式分析腹腔炎性细胞的侵润情况。结果如图19所示。***p<0.0001。
MSU(NLRP3炎症小体特异性激动剂)可以通过诱导机体分泌促炎因子IL-1β，放大炎症反应，随后大量的中性粒细胞和单核细胞的侵入导致腹膜炎的发生。由图17-19结果可以看出，小鼠注射全霉素能够明显抵抗MSU诱导的腹膜炎中腹腔IL-1β的释放以及炎性细胞的侵入，但是不影响TNF-α的分泌。以上结果表明全霉素在体内也能有效抑制NLRP3炎症小体活化，促进小鼠抵抗MSU诱导的腹膜炎。
通过以上实施例1-8的结果可以看出，全霉素能够特异性抑制ATP、尼日尼亚菌素、MSU等NLRP3炎症小体激动剂引起的活化，但是对其他炎症小体活化没有影响。进一步发现，全霉素通过抑制NLRP3的去泛素化和NLRP3与ASC的结合方式抑制炎症小体活化。同时腹膜炎实验表明，全霉素在体内同样也能发挥抑制NLRP3炎症小体的功能。由此可见，全霉素可作为预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.全霉素在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用，包括在体内和/或体外抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。
2.全霉素在抑制NLRP3蛋白去泛素化中的应用，特别是在体外抑制NLRP3蛋白去泛素化中的应用。
3.全霉素在抑制NLRP3与ASC蛋白结合中的应用，特别是在体外抑制NLRP3与ASC蛋白结合中的应用。
4.全霉素在抑制Caspase-1蛋白的活化中的应用，特别是在体外抑制Caspase-1蛋白的活化中的应用或者抑制Caspase-1的酶活力、Caspase-1的剪切以及Caspase-1活化引起的细胞焦亡中的至少一种中的应用。
5.全霉素在抑制IL-1β分泌中的应用，特别是在体外抑制IL-1β分泌中的应用。
6.全霉素在制备用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其中，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病为冷吡啉相关周期性综合征、痛风、类风湿性关节炎、腹膜炎、败血症、动脉粥样硬化、非酒精性脂肪肝病、肺纤维化和神经退行性疾病中的至少一种。
8.一种抑制NLRP3炎症小体活化的方法，其特征在于，该方法包括：将全霉素与NLRP3蛋白和/或其调控蛋白接触。
9.一种预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的方法，其特征在于，该方法包括：将全霉素给药至患有和/或可能患有NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的患者。
10.全霉素，其特征在于，该全霉素用于预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病。
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