CN103458898A - 诱发自噬的化合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

Description

诱发自噬的化合物及其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求于2011年3月23日提交的美国临时申请号61/466,479和于2012年3月15日提交的美国非临时申请号13/420,628的优先权，并且所述申请的公开内容通过引用结合于本文中。
技术领域
本发明涉及包含诱发自噬的化合物的组合物。具体地，本发明涉及包含用于通过诱发自噬来降解神经系统中的异常蛋白沉积物的诱发自噬的化合物的组合物，以及相关的治疗方法，诸如治疗与异常蛋白聚集和/或沉积相关的神经变性疾病和癌症。
背景技术
巨自噬(Macroautophagy)，在本文中称为自噬(autophagy)，是一种用于胞浆内容物的细胞降解和再利用以维持细胞内环境稳定的高度保守的生理过程。自噬底物通常是细胞器、长寿命蛋白和聚集倾向(aggregate-prone)蛋白。由于其清除胞浆内容物的功能性，此高度保守的过程已经显示是治疗以形成细胞内聚集物为特征的疾病(诸如大脑衰老和神经变性)的有希望的方式。自噬途径的功能障碍是引起许多癌症的原因。
聚集倾向蛋白相关的疾病(aggregate-prone disorder)的特征在于在特定组织中形成细胞内聚集物。例如：神经变性疾病与大脑的受累区域中异常蛋白聚集物的积累有关。导致疾病的聚集倾向蛋白的一个例子是α-突触核蛋白(α-syn)。由于α-syn基因座位的重复或三体化引起的α-syn的过表达已经显示会导致家族型帕金森病(PD)。α-syn的点突变(A53T和A30P)增加其聚集倾向，也引起家族型PD的早期发作。而且，已经发现转基因小鼠以及转基因苍蝇中野生型(WT)和突变型α-syn的过表达导致具有多巴胺能神经元损失和胞质内包涵体的进行性运动缺陷。一般认为α-syn寡聚体(其是原纤维聚集物的中间体)的积累或包涵体形成是有毒性的并且会导致神经元直接死亡。这些发现表明α-syn是用于治疗PD和其他突触核蛋白病的有价值治疗靶标。
聚集倾向蛋白相关的疾病的其他实例包括阿尔茨海默病;亨廷顿病;脊髓小脑性共济失调1、2、3、6、7和17型;脊髓小脑性肌萎缩(spinobullar muscularatrophy);齿状核红核-苍白球丘脑下部核萎缩(dentatorubral-palli-doluysianatrophy);由神经元蛋白tau的突变导致的不同形式的痴呆;由超氧化物歧化酶1(SOD1)的突变导致的各种形式的运动神经元疾病以及由外周髓鞘蛋白22(PMP22)的突变导致的各种形式的周围神经病。
除α-syn以外，充分确定类似寡聚α-syn的其他大的致病蛋白聚集物,tau和突变型舞蹈病蛋白(mutant huntingtin),也极大地依赖于自噬途径进行清除，因为它们不能通过蛋白酶体的狭窄核心进行降解。此外,最近使用缺少自噬相关基因atg5或atg7的突变型小鼠的报道表明：基础的自噬作用在神经元功能中具有重要的作用。
某些细菌和病毒感染也可以通过上调自噬作用来治疗，因为病原体可以被自噬体吞噬并转移至溶酶体进行降解。例如：结核分支杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）；A族链球菌和I型单纯疱疹病毒。
在本领域中已经对激活自噬用于治疗诸如治疗神经变性疾病和癌症的方式进行了探索。例如：Bradner等人(WO2008/122038)公开了多种自噬调节剂，例如用于治疗或预防神经变性疾病、增生性疾病以及传染病的具有双吲哚基马来酰亚胺核心的化合物;Rubinsztein等人(US20070155771)描述了使用雷帕霉素通过刺激自噬活性用于治疗以细胞内蛋白聚集物形成为特征的病症，以及Yuan等人(US2010/0267704)公开了使用诱导自噬的化合物包括洛哌丁胺、胺碘酮、尼古地平、匹莫齐特的治疗作用。
然而，目前在哺乳动物大脑中上调自噬作用的小分子诸如雷帕霉素,是特异性mTOR抑制剂。在从酵母至人的生物体中，除自噬作用以外，已知TOR蛋白还控制数个细胞过程。因此，这些mTOR依赖性小分子自噬诱导物的长期使用可能导致并发症。此外，还已知在中枢神经系统中的自噬与在非神经元细胞中的自噬受到不同的调控，并且其在神经元细胞中的诱导显示比与在非神经元细胞中的诱导更难。这些经典的自噬诱导物不能诱导小鼠大脑皮质中的自噬或仅在神经元中诱导轻度的自噬。
异钩藤碱(IsoRhy),是一种钩藤羟吲哚生物碱，已经用于诱导多种生物学结果的组合物的组分,所述生物学结果诸如对缺血诱导的神经元损害的保护效应；抑制李斯特菌素O(Listeriolysin O)诱导的一氧化氮和内皮素-1释放和预防血管紧张素II诱导的增生。尽管如此，在现有技术中不存在涉及此类化合物(羟吲哚生物碱)诱导自噬的任何报道或发现。
因此，对用于治疗可以受益于自噬作用的疾病(包括但不限于神经变性疾病、免疫性疾病、心脏疾病和癌症)的在神经元中不依赖于mTOR、特异性诱导自噬的强效药剂存在着需求。
发明内容
本发明涉及式(I)的化合物的新应用,
Figure BDA0000383856070000031
本申请的申请人首次证明式(I)的化合物是强效自噬诱导物并且能够降解神经元中的异常胞浆内容物，尤其是聚集倾向蛋白，由此来治疗可以受益于自噬作用的疾病，诸如神经变性疾病和癌症。
本发明的第一个方面涉及一种包含结构式(I)化合物(也称为异钩藤碱(IsoRhy))或其异构体和其药学上可接受的盐的药物组合物，其用于治疗可以从通过诱导自噬作用降解胞质蛋白、细胞器或病原体而获益的疾病。具体地，式(I)的化合物诱导神经元中的自噬。本发明的结构式(I)的化合物是一种从钩藤种中分离的四环羟吲哚生物碱，所述钩藤种包括但不限于桂钩藤(Uncariarhynchophylla)、大叶钩藤(Uncaria macrophylla Wall)、华钩藤(Uncaria sinensis(Oliv.)Havil)和绒毛钩藤(Uncaria tomentosa)。此化合物的官能团可以被本领域技术人员已知的包括但不限于氢、-CH3、和葡萄糖在内的部分取代，其中自噬诱导活性得到保持。该化合物本身可以被修饰使得本领域技术人员已知的常用载
本发明还涉及从钩藤种中分离的其他四环羟吲哚生物碱，包括但不限于作为用于治疗可以受益于自噬作用的疾病的自噬诱导物的柯诺辛碱(结构式II)和柯诺辛碱B(结构式III)：
Figure BDA0000383856070000041
在另一个方面，本发明的特征在于一种包含有效量的用于治疗可以受益于自噬作用的疾病的诱发自噬的化合物的药物组合物,其中所述化合物是选自包括下列的组的至少一种化合物：
Figure BDA0000383856070000042
结构式IV或结构式V的化合物,其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R11、R12和R13各自独立地选自氢、羟基、卤素、C1-6烷基和C1-6卤代烷基;R7和R8各自独立地选自甲氧基和羟基;R9和R10各自独立地选自氢、羟基、卤素、C1-6烷基。
本发明包括已知能够治疗可以受益于自噬诱导的疾病的一种或多种其它治疗剂，诸如本领域中已知的化疗剂；或可以增强结构式(I-V)的化合物的自噬诱导活性的化合物。本发明还包括一种或多种药学上可接受的载体、溶剂、赋形剂、佐剂和/或前药。
本发明的第二方面涉及用于通过将治疗有效量的本发明的药物组合物施用于需要的受试者来治疗可以受益于自噬的诱导的疾病的方法。在此方面的一个实施方案中，所述疾病由神经系统中尤其是神经元细胞间的异常蛋白聚集和/或沉积引起。在另一个实施方案中，所述疾病是癌症，其中自噬的诱导会抑制细胞生长或去除由活性氧物质造成的细胞器损害，诸如线粒体或肿瘤细胞，并且自噬靶标是癌性细胞或肿瘤细胞。在此方面的另一个实施方案中，该方法还包括施用一种或多种已知治疗受益于自噬的诱导的疾病的其他治疗剂。
本发明的第三个方面涉及一种使用结构式(I-V)的化合物制备用于治疗可以受益于自噬作用增强的疾病的药物组合物的方法。
附图说明
图1:异钩藤碱(IsoRhy)的化学结构(图1A)；对由0-25μM IsoRhy诱导24小时的不同的神经元细胞系--包括N2a(图1B)、PC12(图1C)和SH-SY5Y(图1D)--中的自噬标志物LC3-II的表达水平的Western印迹分析;GFP信号(图1E)的荧光图像和每个细胞GFP-LC3斑点的数目(图1F)。
图2:对由25μM IsoRhy和/或30μM溶酶体抑制剂氯喹(CQ)诱导12小时的N2a细胞中的自噬标志物LC3-II的表达水平的Western印迹分析(图2A),和不同处理组中LC3-II表达与β-肌动蛋白的比率(图2B);不同处理组(包括持续24小时的5mM3-MA、30μM CQ和/或25μM IsoRhy)中GFP信号的荧光图像(图2C)和每个细胞GFP-LC3斑点的数目(图2D)；不同处理组(包括持续24小时的25μMIsoRhy和/或30μM CQ)中来自含有串联荧光mRFT-GFP-LC3(Tf-LC3)构建体的N2a细胞的GFP和/或RFP信号的双荧光图像(图2E)和每个细胞的GFP-LC3和RFP-LC3斑点的数目(图2F)。
图3:Western印迹显示在从E17胚胎小鼠分离并用0-50μM IsoRhy诱导的原代小鼠皮质神经元中的自噬标志物LC3-II的表达水平(图3A);用50μM IsoRhy诱导24小时的小鼠胚胎原代皮质神经元中的GFP信号的荧光图像(图3B)和每个细胞GFP-LC3斑点的数目(图3C)。
图4:不同的处理组中对L3果蝇（Drosophila）幼虫脂肪体的溶酶体红色荧光探针（LysoTracker red）染色6小时的荧光图像(图4A);不同处理组中每个视野的溶酶体红色荧光探针阳性样点的数目(图4B)。
图5:N2a细胞中WTα-syn(图5A)、突变体α-syn A30T(图5B)和A53P(图5C)、GFP对照(图5D)、用25μM IsoRhy或5mM3-MA和30μM CQ处理的N2a细胞中WTα-syn（图5E）的表达水平的Western印迹分析；以及不同处理组中的WTα-syn与对照相比的表达水平(图5F)；用于可视化IsoRhy对α-syn寡聚体的降解的基于双分子荧光互补的细胞模型的示意图(图5G),和不同的处理组中GFP信号的比较(图5H);高分子量α-syn寡聚体物质的western印迹分析(图5I);在不同的处理组中在N2a细胞中共表达的α-syn寡聚体-和synphilin-1-GFP信号的荧光图像(图5J)，以及具有与聚集体(aggresome)形成的百分比成比例的GFP信号的细胞的百分比(图5K)。
图6：对由胚胎干细胞分化的人DA神经元的针对α-syn表达的HA-染色和酪氨酸羟化酶(TH)染色的双重荧光图像(图6A);分化的DA神经元中WT和A53Tα-syn两者表达水平的western印迹分析(图6B)。
图7:对用25μM IsoRhy或0.2μM雷帕霉素处理6小时的N2a细胞中的磷酸化mTOR(p-mTOR)或其底物P70S6K(p-P70S6K)的表达水平的Western印迹分析(图7A);对采用非靶向或苄氯素(Beclin)1-特异性siRNA处理然后用IsoRhy处理的N2a细胞中的苄氯素1表达的Western印迹分析(图7B)。
图8:对用不同的羟吲哚生物碱异钩藤碱(IsoRhy)(图8A)、柯诺辛碱(Cory)(图8B)和柯诺辛碱B(Cory B)(图8C)处理12小时的N2a细胞中的LC3II表达水平的Western印迹分析。
缩写
α-syn:α-突触核蛋白;
BiFC:双分子荧光互补
CQ:氯喹;
DA:多巴胺能的;
GFP:增强型绿色荧光蛋白;
HA:透明质酸
IsoRhy:异钩藤碱;
3-MA:3-甲基安非他明;
(MAP)LC3:微管相关蛋白1轻链3;
mTOR:雷帕霉素的哺乳动物靶标;
PD:帕金森病;
Tf-LC3:串联荧光LC3
RFU:相对荧光单位
RFP:红色荧光蛋白
定义
“一”和“所述”当在本文中使用时包括“至少一个”和“一个或多个”，除非另外说明。因此，当提及例如“药理学可接受的载体”时，除了单种载体外，还包括两种或多种载体的混合物，等等。
术语“聚集倾向蛋白”和“自噬底物”可互换使用，是指易于聚集和沉积并且它们的聚集是致病的胞浆蛋白。例子包括，但不限于α-突触核蛋白、亨廷顿蛋白(Huntingtin)、tau、SOD1和PMP22以及它们的突变体和变异体形式。
术语“自噬”是指巨自噬，除非另外说明，是涉及细胞自身组分的降解的分解代谢过程；所述细胞自身组分诸如长寿命蛋白、蛋白聚集物、细胞器、细胞膜、细胞器膜和其他细胞组分。自噬的机制可能包括：(i)围绕细胞的被靶向区域形成膜，将内容物与胞质的其余部分分开，(ii)得到的囊泡与溶酶体融合，随后降解囊泡内容物。术语自噬还可以指这样的机制中的一种，通过所述机制饥饿的细胞将营养物从非必要的过程重新分配给更必要的过程。此外，例如，自噬可以抑制一些疾病的进展，并且针对由细胞内病原体导致的感染具有保护作用。
受益于自噬诱导的疾病是可以通过本文公开的发明治疗的疾病。所述疾病包括聚集倾向障碍，其代表与异常蛋白聚集物相关或由异常蛋白聚集物导致的任何疾病、功能障碍或病症，并且可通过本发明经由自噬的诱导通过异常蛋白聚集物的降解而得到治疗，所述异常蛋白聚集物不能被生物体中的天然自噬过程破坏。例如，所述疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、眼咽肌营养不良、朊病毒病、家族致命性失眠症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩、额颞叶痴呆症、进行性核上性麻痹、x-连锁的脊髓延髓肌萎缩和神经元核内透明包涵体病(neuronal intranuclear hyaline inclusion disease)。所述疾病还包括癌症，例如，其中自噬的诱导将抑制细胞生长和分裂、减少诱变、去除被活性氧物质损害的线粒体和其他细胞器或杀死形成的肿瘤细胞的任何癌症。它们可以是慢性疾病，所述慢性疾病是指持续的和持久的疾病、医学病症或缓慢发展的疾病。可以通过本发明治疗的疾病还包括，但不限于，心血管病症、自体免疫疾病、代谢性疾病、错构瘤综合征、遗传性肌肉障碍和肌痛。
术语“诱发自噬的化合物”是指诱导细胞中的自噬作用的化合物。术语诱发自噬的化合物,当在本文中使用时，包括本文公开的化合物，以及其变体、异构体、代谢物或衍生物。
术语“药学上可接受的载体”是指本领域技术人员已知的适合于特定的给药模式的任何载体。例如，载体可以包括可与本发明的化合物配伍的一种或多种溶剂、分散介质、稀释剂、佐剂、赋形剂、媒介物、涂层、抗细菌剂、抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等。另外，结构式(I-V)的化合物或其盐和衍生物可以与不削弱所需作用的其他活性物质、或与补充所需作用的物质、或具有另外作用的物质混合。诱发自噬的化合物可以作为组合物中唯一的药学活性成分配制，或可以与其他活性成分组合。
短语“治疗有效量”是指足以对个体显示益处或临床意义的本发明的化合物的量。本领域技术人员将会理解，给药的实际量或剂量以及给药时程将取决于被治疗的疾病的性质和严重性、被治疗的受试者的年龄和一般状况以及给药方式等等。
具体实施方式
本发明涉及结构式(I-V)的化合物：
Figure BDA0000383856070000091
的新治疗应用，所述化合物起自噬诱导物作用。具体地，结构式(I-V)的化合物是神经元细胞的强效自噬诱导物。
本发明还提供了可用于诱导自噬的方法和组合物，其包含治疗有效量的结构式(I-V)的化合物，及其药学上可接受的盐。结构式(I)的化合物还是mTOR不依赖性的和苄氯素1依赖性的自噬诱导物，其能够促进自噬作用中自噬体的成熟以降解有聚集倾向的异常蛋白。在一个实施方案中，本发明的化合物和含有本发明的化合物的组合物能够穿过血脑屏障以诱导自噬，从而降解神经系统的细胞/组织中的蛋白聚集物。在此实施方案中，神经系统的细胞/组织选自包括但不限于下列的组：皮质神经元、海马神经元、酪氨酸羟化酶阳性神经元、胶质细胞。在一个实施方案中，可以通过由本发明的化合物和组合物诱导的自噬降解的异常蛋白包括但不限于：α-syn、亨廷顿蛋白、tau、SOD1、PMP22、共济失调蛋白(ataxin)、synphilin1以及它们的变体和突变形式，以及导致疾病的任何其他聚集倾向蛋白。在优选的实施方案中，本发明能够降解α-syn单体的野生型和突变体形式、α-syn寡聚体的野生型和突变体形式以及α-syn和synphilin-1聚集体的野生型和突变体形式。
在一个实施方案中，结构式(I-V)的化合物是从钩藤种分离的四环羟吲哚生物碱；或可以通过化学方法合成。在另一个实施方案中，结构式(I)的化合物是异钩藤碱(IsoRhy),结构式(II)的化合物是柯诺辛碱；结构式(III)的化合物是柯诺辛碱B。
在一个实施方案中，可以通过本发明的化合物和组合物治疗的疾病是那些受益于自噬诱导的疾病。例如：由聚集倾向蛋白的异常聚集和/或沉积导致的聚集倾向疾病，其中自噬作用促进蛋白聚集的清除。这些聚集倾向疾病包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、眼咽肌营养不良、朊病毒病、家族致命性失眠症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩、额颞叶痴呆症、进行性核上性麻痹、x-连锁的脊髓延髓肌萎缩和神经元核内透明包涵体病。
在另一个实施方案中，所述疾病还包括癌症,其中自噬的诱导将抑制异常细胞生长和分裂、减少诱变、去除被活性氧物质损害的线粒体和其他细胞器或杀死形成的肿瘤细胞。癌症可以包括但不限于乳腺、肝、前列腺、胃、结肠、胃肠道、胰、皮肤、头、颈、咽喉、膀胱、眼、食道、肺、肾或大脑的癌症。
在第三个实施方案中，受益于自噬的疾病可以是慢性疾病，所述慢性疾病是指持续的和持久的疾病、医学病症或缓慢发展的疾病。在第三个实施方案中，所述疾病还包括心血管病症、自体免疫疾病、代谢性疾病、错构瘤综合征、遗传性肌肉障碍和肌痛。受益于自噬的疾病的实例公开在WO2010/129681和US2010/0267704中,这些专利申请的公开内容通过引用整体地合并于本文中。此外，其中病原体或病原体蛋白被自噬体降解并转移至溶酶体进行降解的感染对采用自噬诱导物的治疗是易感的。例如，结核病、A族链球菌感染和病毒感染(例如，I型单纯疱疹病毒)可根据本发明进行治疗。
本发明的化合物和组合物可以单独地给药或与一种或多种已知治疗可以受益于自噬的疾病的其他治疗剂（诸如雷帕霉素）或与可以增强结构式(I-V)的化合物的自噬诱导活性的化合物联合给药。在一些实施方案中，其中在治疗的疾病是癌症的情况下，本发明可以结合本领域中已知的化疗药给药。可以与本发明结合使用的化疗药的实例描述在US2011/0014303中,该专利申请的公开内容通过引用整体地合并于本文中。此外，本发明的化合物能够辅以各种癌症抗原或聚集倾向蛋白的单克隆抗体，使得自噬诱导性质针对癌症细胞或发生异常蛋白聚集和/或沉积的细胞。
在另一个实施方案中，本发明的组合物另外地包含药学上可接受的载体、赋形剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员已知的其他适合于对活生物体给药的物质。此类物质应当是无毒的、不干扰或不损害本发明的化合物的效力。所述物质可以具有另一种作用或补充本发明的化合物的自噬诱导活性。可以充当药学上可接受的载体的物质的一些实例包括，但不限于，糖类诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；西黄蓍胶粉;麦芽;明胶;滑石;克列莫佛;Solutol;赋形剂诸如可可脂和栓剂蜡;油类诸如花生油、棉籽油;红花油;芝麻油;橄榄油;玉米油和大豆油;二醇类;诸如丙二醇;酯类诸如油酸乙酯和十二酸乙酯;琼脂;缓冲剂诸如氢氧化镁和氢氧化铝;海藻酸;无致热原水;等渗盐水;林格氏溶液;乙醇,和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒的可配伍的润滑剂诸如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、增甜剂、调味剂和芳香剂，根据本领域技术人员的判断，防腐剂和抗氧化剂也可以存在于组合物中。
本发明的治疗受益于自噬的疾病的方法包括：将治疗有效量的本发明的化合物或含有本发明的化合物的组合物施用于需要其的受试者，其中所述受试者是动物，包括人。本发明的方法还包括施用一种或多种治疗剂以及本发明的化合物或组合物。本发明的组合物的给药模式包括局部、胃肠外、静脉内、动脉内、皮下、肌内、颅内、眶内、经眼(ophthalmical)、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、通过气溶胶、通过栓剂、或通过口服递送。所述组合物可以独立地或如果必要与其他组合物联合给药。所述组合物也可以以不同的形式诸如乳膏、凝胶剂、洗剂、溶液剂、固体、片剂、胶囊剂、散剂、糊剂、气溶胶等制备，这取决于所需的给药方式。
另外，对于本领域普通技术人员来说最明显的是疗程，诸如，每天给予规定持续天数的含有本发明的化合物的组合物的剂量，将主要由被治疗的病症的性质和程度、给药的形式、途径和部位以及被治疗的个体来确定。适合的病症可以通过常规的技术来确定。
本发明还通过下面的工作实施例来说明，这些工作实施例不应当被解释为是进一步限定。尽管工作实施例仅依赖于通过IsoRhy清除α-突触核蛋白及其变体，但所述工作实施例意在证明降解聚集倾向蛋白的自噬诱导能力，要理解的是要求保护的本发明也可以清除其他聚集倾向蛋白。
实施例
在下面的实施例中，使用下面的材料；提供了各种材料的商业来源。下面还给出了各种实验方案的细节：
试剂和抗体.异钩藤碱(APC-164)购自Aktin Chemicals。3-MA(M9281)和氯喹(C6628)购自Sigma-Aldrich。雷帕霉素(R5000)购自LC Laboratories。溶酶体红色荧光探针DND-99(L-7528)、山羊抗小鼠(626520)和山羊抗兔(G21234)二抗购自Invitrogen。抗-β-肌动蛋白(sc-47778)、抗-GFP(sc-8334)和抗酪氨酸羟化酶(sc-14007)抗体购自Santa Cruz Biotechnology。抗-LC3(2775)、抗-磷酸化-mTOR(5536)、抗-磷酸化-p70S6K(9234)、抗-(3738)抗体购自Cell Signaling Technology。抗-α-syn抗体(610786)购自BD Transduction Laboratories。速食果蝇食品(instantDrosophila food)(173212)购自Carolina Biological Supply Company。
细胞系和细胞培养.N2a和SH-SY5Y细胞在补充了10%FBS的DMEM中培养。PC12细胞在补充了10%FBS(10099141,Invitrogen)和5%马血清(16050122,Invitrogen)的DMEM(12800017,Invitrogen)中生长。使用800μg/ml G418(10131027,Invitrogen)选择组成型表达GFP-LC3的N2a细胞，并将其在200μg/mlG418中培养。
原代神经元培养.切除E17胚胎小鼠脑并将皮层置于装有预冷EBSS的有盖培养皿中，小心地去除脑膜。将组织在5ml消化溶液(含有0.5mM EDTA(E6758,Sigma)、0.5mg/ml木瓜蛋白酶(3120,Worthington Biochem)和4mg/ml L-半胱氨酸(C7880,Sigma)的EBSS)中在37℃消化15分钟。将组织吸出至1ml消化溶液中并与3ml消化抑制溶液(含有5mg/ml BSA(A2153,Sigma)、5mg/ml胰蛋白酶抑制剂(T9253,Sigma)和10μg/ml DNase(DN25,Sigma)的EBSS)混合。将混合的组织溶液充分混合以分离细胞，然后通过70μm滤器转移至50ml试管中。细胞通过离心收集并将其重新悬浮在接种培养基(含有10%FBS和10%马血清的DMEM)中。将细胞以用于成像的低密度(1×105细胞/12孔板的每孔)或用于生化分析的高密度(3×106细胞/6孔板的每孔)接种在多聚-D-赖氨酸处理的平板上。4小时后，移除接种培养基并且更换以补充了B-27补充剂(0080085SA,Invitrogen)的神经基础培养基(neuorbasal medium)(21103049,Invitrogen)。培养后2天，加入5μM Ara-C(C6645,Sigma)。24小时后更换一半培养基。通过每3天一次用新鲜培养基更换旧培养基的一半来为培养物提供营养。保持培养物至少1周以用于神经元成熟。
干细胞分化成多巴胺能神经元.依照以前描述的实验方案并做微小改变，将人胚胎干细胞(ES)分化成多巴胺能神经元。开始，将ES细胞用分散酶(17105041,Invitrogen)消化，并分解成较小的簇以形成胚胎体。第二天，将未分化的漂浮的ES细胞聚集物转移至新的烧瓶中。将该细胞维持在DMEM/F12培养基(11320082,Invitrogen)中，每天更换一半培养基持续3天。在第4天，通过离心收集ES细胞聚集物并将其重新悬浮在补充了10%FBS的NSM(含有1%N2补充剂(17502048,Invitrogen)、1μg/ml肝素(H3149,Sigma)、200μM NEAA(11140050,Invitrogen)和2mM L-谷氨酰胺(25030081,Invitrogen)的DMEM/F12)中。将胚胎干细胞转移至新瓶中，并隔一天更换培养基。3天后，将细胞聚集物转移至6孔板中。第二天，将含有FBS的培养基用含有20ng/ml FGF8(PHG0184,Invitrogen)和100ng/ml SHH(PMC2095,Invitrogen)的NSM更换，每隔一天更换培养基。5天后，通过用P1000移液管轻轻吹吸使皿中的集落脱附。通过离心收集细胞，并将其重新悬浮在含有50ng/ml FGF8、100ng/ml SHH、2%B27、200μM NEAA的NSM中并转移至新瓶中。每隔一天更换培养基。6天后，收集神经球并将其在200μl accutase(A1110501,Invitrogen)/胰蛋白酶(25300062,Invitrogen)(1:1)中消化3分钟。通过添加200μl胰蛋白酶抑制剂(R007100,Invitrogen)终止消化，并将细胞重新悬浮在NDM(含有1%N2补充剂和2%B27补充剂(17504044,Invitrogen)的神经基础培养基)中，并接种在层粘连蛋白(23017015,Invitrogen)包被的盖玻片上。第二天，将补充了20ng/ml BDNF(10908010,Invitrogen)、50ng/mlGDNF(PHC7045,Invitrogen)、50ng/ml FGF8、100ng/ml SHH、2%B27、200μMAA、1μM cAMP(A9501,Sigma)、1μg/ml层粘连蛋白和1ng/ml TGFβ3(PHG9305,Invitrogen)的1ml NDM添加至每孔，并且每隔一天更换培养基持续10天。通过酪氨酸羟化酶染色确认多巴胺能神经元的成功分化。
质粒和转染.TfLC3质粒由T.Yoshimori(Osaka University,Japan)博士馈赠。GNS和SGC质粒由Pamela J.McLean(Harvard Medical School,U.S.A.)博士赠送。使用lipofectamine2000(11668019,Invitrogen)按照制造商的实验方案用质粒转染细胞。
非变性和变性PAGE以及Western印迹分析.将待在变性条件下进行电泳的样品用RIPA裂解缓冲液(150mM NaCl、50mM Tris-HCl、0.35%脱氧胆酸钠、1mMEDTA、1%NP40、1mM PMSF、5μg/ml抑肽酶、5μg/ml亮抑酶肽)裂解。依
免疫染色.细胞用PBS中的3.7%多聚甲醛固定，用针对TH(2792,Cell SignalingTechnology)或HA(2367,Cell Signaling Technology)的抗体和荧光团-缀合的二抗(Cy3-缀合的山羊抗兔(078-15-061,KPL)或Cy5-缀合的山羊抗小鼠(072-15-18-18,KPL))免疫标记,并且用FluorSave试剂(345789,Calbiochem)封固。使用共聚焦显微镜记录荧光。
细胞成像和斑点计数.细胞在3.7%多聚甲醛(158127,Sigma)中固定10分钟，并用FluorSave试剂封固。使用荧光显微镜或共聚焦显微镜记录细胞图像。如前所述对细胞中GFP或RFP斑点数目进行计数。简言之，人工计数每个细胞中的GFP-LC3或RFP-LC3斑点，并且随机选择至少50个细胞用于每组中的计数。给出的数据来自至少3个独立实验中的一个代表性实验。
果蝇培养和药物饲养.以补充了干酵母的标准玉米面培养基在25℃饲养果蝇。IsoRhy和雷帕霉素先溶解在DMSO中，然后在水中稀释至所需的浓度。含有药物的水加入速食果蝇食品中，并充分混合。作为对照，相同量的DMSO也与速食果蝇食品混合。对于处理，将L3幼虫或成年蝇转移至含药物的培养基中并且温育以指定的时间。
溶酶体荧光探针染色和自噬结构的定量分析.在解剖显微镜下使用精细镊切开L3幼虫，并且将其倒置使得脂肪体暴露于温育溶液。幼虫尸体用100nM在PBS中的溶酶体红色荧光探针在室温下染色5分钟。温育后，幼虫尸体在PBS中漂洗一次，并转移至其上有一滴封固剂的载玻片上。切下脂肪体(每只动物一个主叶)，并弃去剩余的组织。然后用盖玻片覆盖脂肪体叶，并且立即在标准荧光显微镜下观察。按照前述的实验方案并稍微修改进行溶酶体荧光探针-阳性样点的定量分析。获得来自每组3只独立动物的至少6个脂肪体叶。从至少20个随机选择的荧光图像视野中定量溶酶体荧光探针-阳性样点的数目(4700μm2/视野)。
实施例I:IsoRhy诱导神经元细胞系中的自噬
已经表明在神经元细胞中自噬的诱导要比在非神经元细胞中自噬的诱导困难得多。为了确认IsoRhy(其化学结构显示在图1A中)的神经元自噬诱导活性，小鼠神经母细胞瘤N2a、大鼠嗜铬细胞瘤PC12和人神经母细胞瘤SH-SY5Y用不同浓度的IsoRhy处理24小时，并将细胞溶胞产物进行LC3-II(其是自噬特异性标志物)表达的western印迹分析。显示IsoRhy以剂量依赖方式增加N2a、PC12和SH-SY5Y细胞中的LC3-II水平，LC3-I水平不受影响(图1B-D)。
此外，建立恒定表达GFP-LC3(标准自噬标志物蛋白)的神经母细胞瘤细胞系N2a。在共聚焦显微镜下观察经IsoRhy处理后GFP-LC3斑点的形成。数据表示为来自三个独立实验中的一个代表实验的均值±SEM。(*p<0.05,***p<0.001，单因素ANOVA用于多重比较，图基检验(Tukey’s test)作为事后检验)。数据表明IsoRhy在N2a GFP-LC3细胞中诱导大量GFP-LC3斑点形成(图1E,F)。
在IRY的存在下多种神经元细胞系中LC3-II表达水平升高和N2a细胞中大量GFP-LC3斑点形成证明IRY是神经元中的强效自噬诱导物。
为了确认IsoRhy对自噬标志物的增强是由于自噬的诱导而非阻断自噬体成熟导致，N2a细胞用25μM IsoRhy或30μM溶酶体抑制剂CQ和IsoRhy处理12小时。使细胞溶胞产物进行western印迹分析。数据表示为来自三个独立实验的均值±SEM(***p<0.001,用于多重比较的单因素ANOVA，图基检验作为事后检验)。在IsoRhy和CQ共处理组中LC3-II水平和GFP-LC3斑点的数目大大高于CQ-单独处理组(图2A-D)。同时，5mM自噬抑制剂3-MA处理24小时消除了IsoRhy对GFP-LC3斑点形成的诱导(图2C、D)。细胞固定在4%多聚甲醛中并在共聚焦显微镜下分析。数据表示为来自三个独立实验中的一个代表实验的均值±SEM。(***p<0.001，单因素ANOVA用于多重比较，图基检验作为事后检验)。3-MA消除GFP-LC3斑点形成提示IsoRhy对LC3-II和GFP-LC3斑点形成的增强是其诱导自噬的能力所导致的。因此，IsoRhy确实是神经元细胞中的自噬诱导物。
由Kimura等人基于串联荧光mRFP-GFP-LC3(Tf-LC3)构建体建立的系统用来研究自噬体成熟过程。在溶酶体中在酸性/蛋白水解条件下mRFP比GFP更稳定。因此，仅红色的斑点表明自噬性溶酶体的正常成熟。相反，GFP和RFP斑点的共定位表明自噬体和溶酶体之间的融合受损或溶酶体功能受到破坏。在此，利用此系统并建立了在IsoRhy处理后的N2a细胞中GFP和mRFP荧光变化的图谱。细胞固定在4%多聚甲醛中并在共聚焦显微镜下分析。在IsoRhy处理24小时后，IsoRhy诱导大量GFP和mRFP斑点形成。然而，与mRFP斑点相比，GFP斑点的数目少得多，表明有效的自噬体-溶酶体成熟和降解。在用CQ处理的细胞中，由于溶酶体抑制，存在相似的GFP和mRFP斑点积累。在用CQ和IsoRhy两者处理的细胞中，GFP和mRFP斑点的数目甚至多于CQ-单独组，但GFP和mRFP斑点数目非常相似(图2E、F)。观察结果进一步确认IsoRhy对GFP-和RFP-LC3-II斑点表达的增强是经由神经元细胞中的自噬诱导通量而非抑制LC3-II的溶酶体降解来实现的。结果表示为来自三个独立重复实验中的一个代表实验的均值±SEM(**p<0.01比较各组中GFP和RFP斑点之间的差异，两因素ANOVA用于多重比较，Bonferroni检验作为事后检验)。
实施例II:IsoRhy诱导原代小鼠皮质神经元中的自噬
为了进一步确认IsoRhy对原代神经元的促自噬作用，在本研究中使用从E17胚胎ICR小鼠中分离的小鼠原代皮质神经元。原代神经元用不同浓度的IsoRhy处理24小时，通过Western印迹分析检查自噬标志物GFP-LC3表达。神经元固定在4%多聚甲醛中并在共聚焦显微镜下分析。对每个GFP阳性神经元中的GFP-LC3斑点数目计数并且对每组中至少20个神经元进行计数。数据表示为来自三个独立实验中的一个代表实验的均值±SEM(***p<0.001,学生t检验)。
同样,在小鼠原代皮质神经元中观察到IsoRhy所致的LC3-II的剂量依赖性增加(图3A)。在用GFP-LC3构建体转染的神经元中，IsoRhy诱导GFP斑点的大量形成(图3B、C)。这些数据表明IsoRhy也是原代神经元中的强效自噬诱导物。
实施例III:IsoRhy诱导体内自噬。
作为幼虫的主要营养物储存器官，脂肪体天生对营养物缺乏敏感，并且在自噬刺激后引起强劲的自噬爆发。在脂肪体中在营养物充足条件下溶酶体活性的基础水平很低；然而，响应于脂肪体中的自噬诱导的自噬性溶酶体的扩大和酸化可以使用溶酶体(lysotropic)染料溶酶体红色荧光探针来可视化。产卵96小时后，收集L3果蝇幼虫并且饲以0.2mg/ml IsoRhy6小时，然后分离脂肪体用于溶酶体红色荧光探针染色。作为阳性对照，L3幼虫饲以5μM雷帕霉素24小时或饥饿3小时以诱导自噬作用。以与雷帕霉素处理或饥饿相似的模式，IsoRhy诱导L3幼虫脂肪体中的溶酶体红色荧光探针-阳性斑点形成(图4)。此外，IsoRhy-诱导的斑点形成被自噬抑制剂3-MA阻断。这些数据表明IsoRhy诱导果蝇L3幼虫的脂肪体中的自噬作用。因此，IsoRhy在体内和体外均表现为强效自噬诱导物。数据表示为来自三个独立实验中的一个代表实验的均值±SEM。(***p<0.001,单因素ANOVA用于多重比较，图基检验作为事后检验)。
实施例IV:IsoRhy经由自噬诱导促进对N2a细胞中瞬时过表达的α-syn物质的清除。
自噬已经被提议作为通过促进α-syn的清除对抗突触核蛋白病（synucleinopathy）的有前途的治疗策略。在三个不同的细胞模型中检查IsoRhy诱导的对α-syn的自噬-依赖性清除。过表达WT和α-syn突变体(A53T和A30P)的N2a细胞和作为阴性对照的具有GFP的N2a细胞接受IsoRhy处理24小时。IsoRhy以剂量依赖方式减少WT和突变型α-syn水平(图5A-C),但不减少GFP水平(图5D)。IsoRhy诱导的对α-syn的清除被确认为依赖于自噬-溶酶体途径，因为5mM自噬抑制剂3-MA和30μM CQ处理消除了IsoRhy的促清除活性(图5E、F)。数据表示为来自三个独立实验的均值±SEM(*p<0.05,单因素ANOVA用于多重比较，图基检验作为事后检验)。
第二，使用基于双分子荧光互补(BiFC)的细胞模型(其能够使α-syn寡聚体可视化)测试IsoRhy对α-syn寡聚体清除的作用。GFP的两个无荧光片段——GFP-N末端片段和GFP-C末端片段——与α-syn蛋白融合;两个片段的相互作用重建荧光团(图5G)。荧光信号的存在表明α-syn寡聚体在细胞内的形成。使用假转染细胞作为空白以选通（gate）荧光阳性细胞，并且强于101RFU的信号被认为是阳性α-syn寡聚体形成。细胞用25μM IsoRhy和/或5mM3-MA处理24小时，并且收获用于流式细胞仪分析。IsoRhy促进α-syn寡聚体的降解，如减小的荧光强度(图5H、I)和具有高分子量α-syn物质的细胞的百分比(图5J)所证明,而此作用被3-MA阻止。数据表示为来自三个独立实验的均值±SEM(***p<0.001,单因素ANOVA用于多重比较，图基检验作为事后检验)。
α-syn和synphilin-1在N2a细胞中共表达以模拟聚集体形成，并且用25μMIsoRhy或5mM3-MA处理48小时。细胞固定在4%多聚甲醛中并在荧光显微镜下分析。IsoRhy大幅度减少α-syn/synphilin-1聚集体的数目，如在IsoRhy处理中所观察到的荧光强度的大幅降低所见(图5K、L)。在3-MA的存在下对IsoRhy清除各种形式的α-syn和α-syn/synphilin-1聚集体的抑制进一步验证了这种清除经由自噬途径。数据表示为来自三个独立实验的均值±SEM(***p<0.001,单因素ANOVA用于多重比较，图基检验作为事后检验)。
实施例IV的结果表明由IsoRhy诱导的自噬能够降解神经元细胞中的WT和突变形式的α-syn两者以及syn/synphilin-1聚集体，并且因此证实了IsoRhy在治疗聚集倾向障碍中的有用性。
实施例V:IsoRhy促进从胚胎干细胞分化的人多巴胺能神经元中α-sym的降解。
多巴胺能神经元是PD患者的大脑中最受影响的细胞，并且α-syn在中枢神经细胞中的过表达导致从小鼠至秀丽隐杆线虫(C.elegans)的多种生物体中的多巴胺能神经元变性。在图5中显示IsoRhy在瞬时过表达α-syn的N2a细胞中经由诱导自噬促进α-syn蛋白降解。通过使用慢病毒引入相应的质粒建立组成型表达WT和A53Tα-syn-HA的人胚胎干细胞系。然后将干细胞分化成DA神经元。分化的DA神经元通过酪氨酸羟化酶(TH)染色确认，并且α-syn的表达通过HA染色确认。HA染色图像中的大量颗粒是典型的α-syn聚集物(图6A)。白色箭头指示细胞中的α-syn聚集物。如所预期的，IsoRhy处理大幅度减少分化的DA神经元中的WT和A53Tα-syn水平(图6B)。由IsoRhy促进的自噬作用降解了PD患者中的人DA神经元(α-syn在该处积累)中的α-syn及其突变体。
实施例VI:IsoRhy以mTOR-非依赖性但苄氯素-1-依赖性的方式诱导神经元细胞中的自噬。
为了阐明IsoRhy作用的分子机制，首先检查了经典的自噬控制途径，mTOR途径。然而，磷酸化mTOR及其底物P70S6K均不受IsoRhy处理的影响，尽管磷酸化mTOR和pP70S6K被雷帕霉素大幅度抑制(图7A)。还测试了被报道参与自噬作用的激活的几种其他途径，包括AKT、AMPK、MEK/ERK、JNK和ER应激途径，以及钙信号传导途径(数据未显示)。然而，上面提到的途径中没有一个被IsoRhy处理改变。苄氯素-1是自噬激活中的关键因子，并且已经表明上调的苄氯素-1直接诱导自噬。为了理解苄氯素-1在神经元细胞中IsoRhy-诱导的自噬中的作用，在苄氯素-1的存在下或通过RNA干扰消耗而不存在苄氯素-1的条件下检查了IsoRhy的作用。数据揭示IsoRhy不影响苄氯素-1的表达，但苄氯素-1siRNA处理完全阻断了IsoRhy-诱导的自噬(图7B)。这些数据表明IsoRhy在神经元细胞中以mTOR-非依赖性但苄氯素-1-依赖性方式诱导自噬。
实施例VII:四环羟吲哚生物碱诱导神经元细胞中的自噬。
为了比较羟吲哚生物碱对自噬诱导的活性，检查了用异钩藤碱(IsoRhy)(图8A)、柯诺辛碱(Cory)(图8B)和柯诺辛碱B(Cory B)(图8C)处理12小时后N2a细胞中LC3II表达水平。数据揭示Isorhy、Cory和Cory B显著地激活N2a细胞中的自噬作用，证明四环羟吲哚生物碱是优异的自噬诱导物。
结果
基于工作实施例，证明IsoRhy的促自噬活性在神经元细胞中是高度灵敏的。其在宽范围的神经元细胞系(N2a、SH-SY5Y和PC12)以及原代神经元培养物中诱导大量的自噬，如增加的LC3-II/肌动蛋白比率和GFP-LC3斑点形成所证实。尽管公知α-syn可以被蛋白酶体、巨自噬和伴侣分子介导的自噬(CMA)降解，但仅有两个自噬途径能够降解α-syn。更具体地，已经报道突变型α-syn会抑制CMA并且仅巨自噬可以降解突变型α-syn。工作实施例显示IsoRhy在不同的人DA细胞中特异性地增强巨自噬，并且显著地降解WT、突变型α–突触核蛋白单体，α–突触核蛋白寡聚体以及α–突触核蛋白/synphilin-1聚集体，这在以前的化学自噬诱导物如雷帕霉素、海藻糖和17-AAG中未被证明。经证实的IsoRhy的mTOR非依赖性自噬诱导作用也意味着用本发明治疗受益于自噬的疾病消除了与mTOR途径相关的任何副作用或并发症。
最后，果蝇幼虫已经证明可用于探究体内自噬的分子机制以及生理学功能。因此，IsoRhy能够诱导果蝇L3幼虫脂肪体中的自噬，这一证据证明了其体内自噬诱导能力。
工业应用性
本发明公开了包含IsoRhy和四环羟吲哚生物碱(它们在体内和在体内均在神经元中不依赖于mTOR诱导自噬以降解蛋白聚集物)的新组合物，以及其在治疗可以受益于自噬诱导的疾病并且没有mTOR相关的并发症中的应用。
如果需要，本文讨论的不同功能可以以不同的次序和/或彼此同时地进行。此外，如果需要，上述功能中的一种或多种可以是任选的或可以合并在一起。
尽管前述发明已经关于各种实施方案和实施例进行了描述，但要理解的是其他实施方案包括在本发明的范围内，本发明的范围体现在下面的权利要求及其等效形式中。此外，上面的具体实施例应被理解为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开内容的其余内容。在不进一步详细说明的情况下，要相信本领域技术人员可以基于本文的描述利用本发明达到其最全面的程度。本文引用的所有出版物的整体内容在此通过引用并入。

Claims (20)

1.一种用于诱导自噬以治疗能够受益于自噬诱导的疾病的组合物，其包含治疗有效量的结构式(I-V)的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0000396534160000011
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R11、R12和R13各自独立地选自氢、羟基、卤素、C1-6烷基和C1-6卤代烷基;
R7和R8各自独立地选自甲氧基和羟基;
R9和R10各自独立地选自氢、羟基、卤素、C1-6烷基并且其中所述化合物足够小以通过哺乳动物大脑的血脑屏障。
2.根据权利要求1所述的组合物,其中所述化合物是从钩藤种分离的四环羟吲哚生物碱或通过化学合成。
3.根据权利要求1所述的组合物,其中所述疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、眼咽肌营养不良、朊病毒病、家族致命性失眠症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩、额颞叶痴呆症、进行性核上性麻痹、x-连锁的脊髓延髓肌萎缩、神经元核内透明包涵体病和癌症,以及它们的其他相关症状和/或病症。
4.权利要求1所述的组合物,其中所述组合物降解神经元中或神经元间的异常蛋白聚集物，并且所述异常蛋白聚集物包括α-突触核蛋白、亨廷顿蛋白、tau、SOD1、PMP22或它们的变体和突变形式的聚集物。
5.权利要求2所述的组合物,其中所述四环羟吲哚生物碱包括异钩藤碱(结构式I)、柯诺辛碱式II)和柯诺辛碱B(结构式III)。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述α-突触核蛋白包括野生型和突变型α-突触核蛋白单体、野生型和突变型α-突触核蛋白寡聚体以及野生型和突变型α-突触核蛋白/synphilin-1聚集体。
7.根据权利要求1所述的组合物,其中所述组合物联合一种或多种治疗能够受益于自噬诱导的疾病或增强结构式(I-V)的化合物的自噬诱导活性的其他治疗剂施用。
8.权利要求1所述的组合物,其中所述组合物还包含以下的一种或多种：药学上可接受的载体、溶剂、赋形剂、佐剂、前药和治疗能够受益于自噬诱导的疾病或增强所述化合物的自噬诱导活性的其他治疗剂。
9.权利要求1所述的组合物，其中所述组合物经由口服给药、静脉内注射、静脉内输注、腹膜内注射、肌内注射和/或皮下注射施用至需要其的受试者。
10.根据权利要求1所述的组合物,其中所述组合物为包括溶液剂、固体、片剂、胶囊剂、散剂、糊剂和气溶胶的形式。
11.一种诱导自噬以治疗能够受益于自噬诱导的疾病的方法，其包括将药物组合物施用于需要其的受试者，所述药物组合物包含治疗有效量的结构式(I-V)的化合物或其药学上可接受的盐:
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R11、R12和R13各自独立地选自氢、羟基、卤素、C1-6烷基和C1-6卤代烷基;
R7和R8各自独立地选自甲氧基和羟基;
R9和R10各自独立地选自氢、羟基、卤素、C1-6烷基并且其中所述化合物足够小以通过哺乳动物大脑的血脑屏障。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述组合物还包含以下的一种或多种：药学上可接受的载体、溶剂、赋形剂、佐剂、前药和治疗能够受益于自噬诱导的疾病或增强所述化合物的自噬诱导活性的其他治疗剂。
13.根据权利要求11所述的方法,其中所述方法还包括将一种或多种治疗能够受益于自噬诱导的疾病或增强结构式(I-V)的化合物的自噬诱导活性的其他治疗剂施用于需要其的受试者。
14.根据权利要求11所述的方法,其中所述施用包括经由口服给药、静脉内注射、静脉内输注、腹膜内注射、肌内注射和/或皮下注射将所述药物组合物施用于所述需要其的受试者。
15.根据权利要求11所述的方法,其中所述化合物是从钩藤种分离的四环羟吲哚生物碱或通过化学合成。
16.根据权利要求11所述的方法,其中所述疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化、亨廷顿病、脊髓小脑性共济失调、眼咽肌营养不良、朊病毒病、家族致命性失眠症、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩、额颞叶痴呆症、进行性核上性麻痹、x-连锁的脊髓延髓肌萎缩、神经元核内透明包涵体病和癌症,以及它们的其他相关症状和/或病症。
17.根据权利要求15所述的方法,其中所述四环羟吲哚生物碱包括异钩藤碱(结构式I)、柯诺辛碱(结构式II)和柯诺辛碱B(结构式III)。
18.根据权利要求11所述的方法,其中所述组合物为包括溶液剂、固体、片剂、胶囊剂、散剂、糊剂和气溶胶的形式。
19.一种制备在治疗能够受益于自噬诱导的疾病中用于自噬诱导的药物组合物的方法，所述方法包括在制备在治疗能够受益于自噬诱导的疾病中用于自噬诱导的药物组合物中由结构式(I-V)的化合物或其药学上可接受的盐形成所述组合物：
Figure FDA0000396534160000041
其中R1、R2、R3、R4、R5、R6、R11、R12和R13各自独立地选自氢、羟基、卤素、C1-6烷基和C1-6卤代烷基;
R7和R8各自独立地选自甲氧基和羟基;
R9和R10各自独立地选自氢、羟基、卤素、C1-6烷基，并且所述化合物是mTOR-非依赖性和苄氯素1-依赖性自噬诱导物，以降解神经元中或神经元间的异常蛋白聚集物且能够促进自噬性溶酶体成熟过程。
20.权利要求19所述的方法，其中所述化合物是从钩藤种分离的四环羟吲哚生物碱或通过化学合成。
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