SK11202003A3

SK11202003A3 - Použitie tiolutín-dioxidu a jeho derivátov na prípravu liečiva, spôsob jeho prípravy pomocou mikroorganizmu a mikroorganizmus Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834

Info

Publication number: SK11202003A3
Application number: SK1120-2003A
Authority: SK
Inventors: Claudia Eder; Michael Kurz; Joachim Wink
Original assignee: Aventis Pharma Deutschland Gmbh
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2002-02-23
Publication date: 2004-02-03
Also published as: NO20033964D0; KR20040025902A; DE60213219D1; US20020193418A1; WO2002072089A3; ZA200306474B; EE200300430A; IL157792A0; WO2002072089A2; ATE333276T1; NO20033964L; HRP20030714A2; US20050059725A1; EP1372640A2; BR0207884A; PL363374A1; JP2004521927A; CA2439853A1; YU68403A; AU2002250997B2

Description

Oblasť techniky

Predložený vynález sa týka použitia tiolutin-dioxidu a jeho derivátov na prípravu liečiva na liečenie porúch CNS, spôsobu jeho prípravy fermentáciou pomocou mikroorganizmu Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834, a mikroorganizmu Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834.

Doterajší stav techniky

Tiolutín je známa prirodzená zlúčenina, ktorá je komerčne dostupná (Apin Chemicals, Veľká Británia; CMS Špeciality Chemicals, Veľká Británia; Ubichem plc, Veľká Británia). Tiolutin-dioxid je tiež známa zlúčenina. Jeden známy spôsob prípravy tiolutin-dioxidu spočíva v oxidácii tiolutínu pomocou kyseliny m-chlórperbenzoovej (výťažok 30%), ako je opísané v Schachtner a kol., J. Heterocycl. Chem., 1999, str. 161 až 175.

O tiolutín-dioxide už je skôr opísané, že vykazuje liečivé vlastnosti. Dokument WO 99/12543 opisuje použitie tiolutin-dioxidu ako antineoplastického činidla a dokument WO 96/32396 opisuje použitie tiolutin-dioxidu ako antibakteriálneho a ar.timykotického činidla.

Podstata vynálezu

Teraz sa prekvapujúco zistilo, že je tiolutín-dioxid účinným inhibítorom neurolyzínu. Neurolyzín náleží k rodine mecaloproteáz obsahujúcich zinok. Pravdepodobne hrá úlohu pri fyziologickej inaktivácii neurotenzínu, endogénneho antipsychotického činidla. Tiolutín-dioxid inhibuje inaktiváciu neurotenzínu neurolyzinom a je preto použiteľný pri liečení neurodegeneratívnych ochorení, ako je Parkinsonova a Alzheimerova choroba. Tiolutin-dioxid je tiež selektívny a to v tom zmysle, že neblokuje iné metaloproteázy obsahujúce zinok, ako sú enkefalináza alebo angiotenzín konvertujúci enzýmy.

Tiež sa zistilo, že mikroorganizmus Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834, je schopný vytvárať tiolutín-dioxid. v relatívne vysokom výťažku.

Predložený vynález sa v súlade s tým týka použitia zlúčeniny všeobecného vzorca I

R2

v ktorom sú symboly

Rl,

R2 a R3 nezávisle zvolené zo skupiny zahŕňajúcej atóm vodíka, alkylové skupiny a acylové skupiny, a ich fyziologicky prijateľných solí na prípravu liečiva na liečenie porúch CNS.

Výhodné sú zlúčeniny všeobecného vzorca I, v ktorom Rl znamená acylovú skupinu, R2 znamená atóm vodíka alebo/a R3 znamená alkylovú skupinu; a ich fyziologicky prijateľné soli.

Acylové skupiny môžu v zlúčeninách všeobecného vzorca I obsahovať 2 až 10 uhlíkových atómov, výhodne 2 až 6 uhlíkových atómov a môžu byť priame alebo rozvetvené, nasýtené alebo raz alebo dvakrát nenasýtené.

Acylová skupina s 2 uhlíkovými atómami napríklad označuje acetylovú skupinu.

Príklady nasýtených, nerozvetvených acylových skupín sú zvyšky kyseliny octovej, kyseliny propiónovej, kyseliny maslovej, kyseliny Valérovej, kyseliny kaprónovej, kyseliny enantovej, kyseliny kaprylovej, kyseliny pelargónovej a kyseliny kaprinovej.

Príklady nerozvetvených acylových skupín, ktoré sú raz nenasýtené, sú zvyšky od kyseliny akrylovej a kyseliny krotčncvej.

Príkladom nerozvetvenej acylovej skupiny, ktorá je dvojnásobne nenasýtená je zvyšok kyseliny sorbovej.

Alkylové skupiny môžu v zlúčeninách všeobecného vzcrza I obsahovať 1 až 6 uhlíkových atómov a môžu byť priame alecc rozvetvené. Ďalej alkylové skupiny zahŕňajú nasýtené, a tiež zak nenasýtené skupiny, tieto nenasýtené skupiny obsahujú jednu alebo dve dvojité väzby. Príklady alkylových skupín obsahujúcich 1 až 6 uhlíkových atómov sú metylová skupina, etylová skupina, propylová skupina, butylová skupina, pentylová skupina a nexylová skupina, n-izoméry všetkých týchto skupín, izopropylová skupina, izobutylová skupina, 1-metylbutylová skupina, izopentylzvá skupina, neopentylová skupina, 2,2-dimetylbutylová skupina, 2-metylpentylová skupina, 3-metylpentylová skupina a izznexylová s kupina.

Nenasýtenými alkylovými skupinami sú napríklad alkenylové skupiny, ako je vinylová skupina, 1-propenylová skupina, 2-propenylová skupina (= alylová skupina), 2-butenylová skupina,

3-butenylová skupina, 2-metyl-2-butenylová skupina, 3-m.etyl-2-butenylová skupina, 5-hexenylová skupina alebo 1,3-pencadienylová skupina.

Podľa jedného uskutočnenia sa predložený vynález týka použitia zlúčeniny vzorca II

alebo jej fyziologicky prijateľnej soli na prípravu liečiva na liečenie porúch CNS.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sú použiteľné pri liečení porúch spôsobených nadnormálnymi hladinami cirkulujúceho neurolyzínu. K poruchám CNS, ktoré je možné liečiť zlúčeninami všeobecného vzorca I patria psychotické poruchy, ako je schizofrénia a neurodegeneratívne ochorenia, ako je Alzheimerova a Parkinsonova choroba.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I je možné získať fermentáciou pomocou mikroorganizmu Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834 alebo jedným z jeho variantov alebo mutáciou za vhodných podmienok, izoláciou aspoň jednej zlúčeniny a konverziou posledne uvedenej, ak je to vhodné, na fyziologicky prijateľnú soľ, derivát alebo fyziologicky prijateľnú soľ derivátu.

Predložený vynález sa v súlade s tým týka spôsobu prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca I, ktorý zahŕňa kultiváciu mikroorganizmu Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834, alebo jeho mutácií alebo variantov, vo vodnom živnom médiu, izoláciou a purifikáciou aspoň jednej výslednej zlúčeniny a prípadne konverziou na fyziologicky prijateľnú soľ, derivát alebo fyziologicky prijateľnú soľ derivátu.

Okrem produkcie tiolutín-dioxidu mikroorganizmus Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834 produkuje za podmienok opísanej fermentácie tiež tiolutín. Získaný tiolutín je možné izolovať a previesť na tiolutín-dioxid spôsobmi, ktoré sú odborníkovi známe .

Alternatívny spôsob prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa predloženého vynálezu v súlade s tým zahŕňa kultiváciu mikroorganizmu Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834, alebo jehc> mutácie alebo varianty vo vodnom živnom médiu, izoláciu a purifikáciu tiolutinu, konverziu tiolutinu na aspoň jednu výslednú zlúčeninu a prípadne ďalšiu konverziu na fyziologicky prijateľnú soľ, derivát alebo fyziologicky prijateľnú soľ derivátu.

Mikroorganizmus Nocardiopsis species ST 100692 sa uložil dňa

13. novembra 2000 za podmienok budapeštianskej zmluvy u Sammlung von Mikroorganismen u Zellkulturen (Nemeckej mikroorganizmov a bunkových kultúr, Mascheroder weg lb,

Braunschweig, pod číslom DSM

Taxonomické vyšetrenie mikroorganizmu Nocardiopsis species

ST 100692, DSM 13834, pomocou analýzy mastných kyselín za použitia plynnej chromatografie ukázalo, že charakteristickými kyselinami sú: 14:0 izo, 15:0 anteizo, 15:0 izo, 16:0, 16:0 izo,

17:0, 17:0 izo, 17:0 anteizo a 18:0. Kolónia je farby chrómovo žltej, vytvára biele vzdušné mycélium, najmä na médiu ISP 2 (kvasnicový slad) a ISP 3 (ovsená kaša).

Namiesto kmeňa DSM 13834 je možné tiež použiť jeho mutácie a varianty, ak syntetizujú zlúčeniny podľa vynálezu. Tiene mutácie je možné vytvárať známymi spôsobmi pomocou fyzikálnych prostriedkov, napríklad ožarovania, ako je napríklad etyl-metánsulfonát (EMS), 2-hydroxy-4-metoxybenzofenón (MOD) alebo N-mezyl-N'-nitro-N-nitroguanidin (MNNG).

Vyhľadávanie mutácií a variantov, ktoré produkujú zlúčeniny podľa vynálezu je možné uskutočňovať stanovovaním biologickej aktivity účinných látok, ktoré sa hromadia v kultivačnom 'bujóne, napríklad pomocou testovania inhibičného účinku proti neurolyzínu spôsobom opísaným ďalej.

Vhodné a výhodné sú, ako zdroje uhlíka na aeróbnu fermentáciu, asimilovatelné uhľovodíky a cukrové alkoholy, ako je glukóza, laktóza alebo D-manitol, a prirodzené produkty obsahujúce uhľovodany, ako je napríklad sladový výťažok. Vhodnými zdrojmi dusíka sú aminokyseliny, peptidy a proteíny a ich produkty, ako sú peptóny alebo tryptóny, rovnako ako mäsové extrakty, bavlníka, mleté semená, napríklad kukurice, pšenice, destilačné rezíduá z produkcie alkoholu, mäsové múčky alebo kvasinkové extrakty, tiež však amóniové soli a nitráty.

Anorganickými sólami, ktoré môže živný roztok obsahovať, sú na príklad chloridy, uhličitany, sírany alebo fosforečnany alkylických kovov alebo kovov alkalických zemín, železa, zinku, kobaltu a mangánu.

Tvorba tiolutín-dioxidu sa obzvlášť dobre dosiahne v živnom médiu, ktoré obsahuje asi 0,5 až 5% glukózy, výhodne i až 2%, 0,5 až 5% sójovej múky, výhodne 1 až 2%, 0,1 až 1,5% kukuričného výluhu (kvapalného), výhodne 0,3 až 0,8%, 0,05 až 1,0% uhličitanu vápenatého, výhodne 0,1 až 0,5% a 0,005 až 1% chloridu sodného, výhodne 0,3 až 0,8, v každom prípade vztiahnuté na hmotnosť celého živného roztoku.

Kultivácia prebieha aeróbne, to znamená napríklad ponorená pomocou pretrepávania alebo miešania v pretrepávacich bankách alebo fermentoroch, kde je to vhodné so zavádzaním vzduchu alebo kyslíka. Fermentáciu je možné napríklad uskutočňovať vc fľaškách so širokým hrdlom alebo bankách s okrúhlym dnom rozličných objemov, v sklenených fermentoroch alebo nádržiach z nehrdzavejúcej ocele. Je možné ich uskutočňovať v teplotnom rozsahu predstavujúcom asi 20 až 35°C, výhodne asi pri 25 až 30°C. Hodnota pH by sa mala pohybovať v rozsahu 4 a 10, výhodne v rozsahu 6 až 8. Mikroorganizmy sa za týchto podmienok všeobecne kultivujú po čas pohybujúci sa od 20 do 200 hodín, výhodne 24 až 150 hodín.

Kultivácia sa výhodne uskutočňuje v niekoľkých stupňoch, to znamená na začiatku sa v kvapalnom živnom médiu vytvorí jedna alebo viac predkultúr, tie sa potom prenesú do aktuálneho produkčného média, to znamená hlavnej kultivácie, napríklao v obj . pomere 1:10. Predkultúra sa napríklad získa prenosom sporulovaného mycélia do živného roztoku a jeho ponechaním rásť počas asi 20 až 120 hodín, výhodne 24 až 90 hodín. Sporulované mycéíium je možné napríklad získať ponechaním kmeňa rásť počas 1 až 40 dní, výhodne 5 až 12 dní, na pevnom alebo kvapalnom živnom médiu, napríklad kvasnicovom sladovom agare alebo zemiakovo-dexerózovom agare.

Postup fermentácie a tvorby zlúčenín podľa vynálezu je možné sledovať spôsobmi odbornému pracovníkovi známymi, ako napríklad testovaním biologickej aktivity pomocou bioanalýz alebo chromatografickými metódami, ako je tenkovrstvová chromatografia (TLC) alebo kvapalinová chromatografia s vysokou rozlišovacou schopnosťou (HPLC).

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa môžu vyskytovať axo v mycéliu, tak v kultivačnom filtráte, avšak hlavné množstve sa obvykle nachádza v biomase (mycéliu). Preto je vhodné separovať posledne menované od predtým menovaného, pomocou filtrácie alebo odstreďovania. Filtrát sa extrahuje rozpúšťadlom nemiešajúcim sa s vodou, ako je 1-butanol, etylacetát, chloroform alebc podobne. Mycélium sa vhodne extrahuje metanolom alebo acetónom, avšak je možné použiť tiež skôr uvedené rozpúšťadlá nemiešajúce sa s vodou .

Extrakciu je možné uskutočňovať v širokom rozsahu hodnôt pH, vhodné je však pracovať s neutrálnym prostredím, výhodne v rozsahu pH 4 a pH 8. Organické extrakty je možné napríklad koncentrovať vo vákuu a sušiť.

Jedným purifikačným spôsobom je chromatografia na adsorpčných živiciach, ako na Diaion® HP-20 (Mitsubishi Casei., Tokio), na Amberlite® XAD7 (Rohm and Haas, USA) a na Amberchrom® CG (Toso Haas, Philadelphia, USA). Vhodné sú tiež mnohé nosiče s reverznou fázou, napríklad RP18, ktoré sa stali všeobecne známymi napríklad v rámci vysokotlakovéj kvapalinovej chrcmatografie (HPLC).

Zlúčeniny všeobecného vzorca I je možné izolovať a ourifikovať analogicky k spôsobom opísaným skôr alebo inými spôsobmi, ktoré sú odborníkovi známe.

Deriváty tiolutín-dioxidu sú skôr uvedeným všeobecným vzorcom tiež pokryté. Tieto deriváty majú rovnaké účinky alebo sa za miernych podmienok prevedú na zlúčeniny vykazujúce rovnaké účinky ako tiolutín-dioxid. Deriváty je možné pripraviť spôsobmi odborníkovi dobre známymi. Príklady spôsobov prípravy niektorých z derivátov tiolutín-dioxidu všeobecného vzorca I sú uvedené ďalej .

1) (Exocyklickú) acetylovú skupinu tiolutín-dioxidu je možné odštiepiť kyselinou alebo zásadou, ako je opísané v literatúre, napr. v Protective Groups in Organic Synthesis,

3. vydanie, T. Greene & P. Wuts, John Wiley & Scr.s, 1999, str. 553 až 555.

2) Voľnú aminoskupinu tiolutín-dioxidu je možné alkylcvať napríklad pomocou redukčnej alkylácie, ako je opísané v Advanced Organic Chemistry, 4. vydanie, J. March, Jol.r. Wiley & Sons, 1992, str. 898 až 900.

3) Aminoskupinu tiolutín-dioxidu je možné acylovať napríklad pomocou chloridov alebo anhydridov kyselín, štandardnými spôsobmi odborníkovi v odbore známymi,

K ďalším derivátom zlúčenín všeobecného vzorca I patria tie zlúčeniny, ktoré sú výsledkom redukcie aspoň jednej dvojitej väzby zlúčeninv všeobecného vzorca I, ako je tiolutín-dioxid, spôsobmi opísanými v literatúre, napríklad v P.N. Rylander, Hydrogenation Methods, Academic Press, New York (1985ý, kapitola 2, alebo dehydrohalogenáciou spôsobmi opísanými v H.O. House in Modern Synthetic Reactions, W.A. Benjymin, ľne., New

York (1972), str. 446 až 452.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu je možné previesť na farmaceuticky prijateľné soli. Soli je možné pripraviť štandardnými spôsobmi odborníkovi v odbore známymi.

Fyziologicky prijateľné soli zlúčenín všeobecného vzorca I znamenajú ako organické, tak anorganické soli týchto zlúčenín, ako je opísané v Remington's Pharmaceutical Sciences (17. vydanie, str. 1418 (1985)). Soli, ako sú sodné a draselné soli, je možné napríklad pripraviť podrobením zlúčenín podľa vynálezu pôsobeniu vhodných sodných alebo draselných zásad.

Ďalším uskutočnením predloženého vynálezu je použitie proliečiv zlúčeniny všeobecného vzorca I. Také proliečivo sa môže in vivo metabolizovať na zlúčeninu všeobecného vzorca I, ako je tiolutín-dioxid. Tieto proliečivá môžu byť samotné účinné alebo nie.

Zlúčeniny všeobecného vzorca I sa môžu vyskytovať v rôznych polymorfných formách, napríklad ako amorfné a kryštalické polymorfr.é formy. Všetky polymorfné formy zlúčenín všeobecného vzorca I spadajú do rámca predloženého vynálezu a sú ďalším uskutočnením vynálezu.

Zlúčeniny podľa predloženého vynálezu a ich farmaceutický

prij ateľné	soli a deriváty	je	možné	podávať zvieratám,	výhodne
cicavcom a	najmä ľuďom, ako	liečivo	samotné alebo v	zmesiach
s inou zlúčeninou.
Vhodné	farmaceutické	kompozície	v súlade s tým	obsahuj ú

účinné množstvo jednej alebo viacerých zlúčenín všeobecného vzorca I alebo II alebo, ich farmaceuticky prijateľných solí, spolu s farmaceutický prijateľným nosičom.

Zlúčeniny podľa vynálezu je možné podávať orálne, intramuskulárne, intravenózne alebo inými spôsobmi podávania. Farmaceutické kompozície, ktoré obsahujú tieto zlúčeniny alebo ich far maceuticky prijateľnú sol alebo derivát, prípadne s ďalšími farmaceutický účinnými látkami, je možné pripraviť zmiešaním účinných zlúčenín s jednou alebo viacerými farmakologicky prijateľnými pomocnými látkami alebo/a excipientmi. Zmes je možné potom previesť do vhodnej farmaceutickej formy, ako sú tablety, potiahnuté tablety, kapsuly, granuly, prášky, emulzie, suspenzie, alebo roztoky.

Príklady pomocných látok alebo/a excipientov, ktoré ~e možné uviesť, sú plnivá, emulgačné ochuťovadlá, farbiace činidlá laktóza, mastenec, agar-agar, parenterálne podávanie sú vhodn činidlá, lubrikanty, maskovacie a pufrovacie látky, tragakant, polyglykoly, etanol a voda. Na š a výhodné suspenzie alebo roztoky vo vode. Je tiež možné podávať účinné látky samocné, bez nosičov alebo riedidiel, vo vhodnej forme, napríklad v kapsulách .

Spôsob prípravy vhodného liečiva zahŕňa konverziu aspoň jednej zlúčeniny podľa predloženého vynálezu s farmaceutický vhodným a fyziologicky prijateľným nosičom a, ak je to vhodné, ďalšími účinnými látkami, prísadami alebo pomocnými látkami do vhodnej dávkovej formy.

Ako je obvyklé, závisia galenický prípravok a spôsco podávania, ako aj dávkové rozsahy, ktoré sú vhodné v konkrétnom prípade, od ošetrovaného druhu a stavu príslušného stavu alebo ochorenia, a je možné ich optimalizovať spôsobmi v odbore známymi. Pri použití pevných dávkových foriem, napr. tabliet alebo kapsúl je možné podávať až 500 mg, výhodne 0,1 až 250 mg denne. Pri parenterálnom podávaní je možné podávať až 300 mg, výr.odne 0,5 až 150 mg za deň.

Nasledujúce príklady uskutočnenia vynálezu majú slúžiť na ďalšie dokreslenie predloženého vynálezu, bez toho aby však v nejakom smere obmedzovali rozsah predloženého vynálezu. ¹

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Príprava suspenzie spór produkčného kmeňa Nocardiopsis species DSM 13834

100 ml živného roztoku (4 g/1 kvasnicového extraktu, 15 g/1 rozpustného škrobu, 1 g/1 K₂HPO₄, 0,5 g/1 MgSO₄ x 7 H₂O v 1000 ml vody, s hodnotou pH pred sterilizáciou 7,0) v sterilnej Erlenmeyerovej banke s objemom 300 ml sa naočkuje kmeňom Nocardiopsis species DSM 13834 a inkubuje sa pri 28°C a 180 rpm (otázkach za minútu) na rotačnej trepačke počas 5 dní. Následne sa 1,5 ml tejto kultúry zriedi 1,5 ml 99% glycerínu a uchováva pri -20°C.

Príklad 2

Príprava kultivácie alebo predkultivácie produkčné?.: kmeňa v Erlenmeyerovej banke

Sterilná Erlenmeyerova banka obsahujúca 100 ml nasledujúceho živného roztoku: 15 g/1 sójovej múky, 15 g/1 glukózy, 5 g/1 kvapalného kukuričného výluhu, 5 g/1 NaCl a 2 g/1 CaCO₅ sa naočkuje kultúrou vypestovanou v šikmej skúmavke (rovnaký živný roztok, avšak s 2% agaru) alebo 1 ml glycerínovej kultúry (pozri príklad

1) a inkubuje sa na trepačke pri 180 rpm a 25°C. Maximálna produkcia tiolutín-dioxidu sa dosiahne po asi 96 hodinách. Ponorená kultúra stará 72 hodín (pripravená spôsobom opísaným pre urepanú kultúru, avšak s nasledujúcim médiom: 15 g/1 glukózy, 15 g/1 sójovej múky, 5 g/1 kukuričného výluhu, 2 g/1 CaCCý a 5 g 1 NaCl, pH 7,5) stačí na naočkovanie 10 a 1001 fermentorov inokulom vo výške asi 5%.

Pracuje sa s fermentorom s objemom 200 1 za nasledujúcich

Príklad 3

Produkcia tiolutín-dioxidu podmienok

Živné médium:

Inkubačný čas:

sójová múka	15 g/1
glukóza	15 g/1
kukuričný výluh	5 g/1
NaCl	5 g/1
CaCO₃	2 g/1
pH 7,2 (pred sterilizáciou)
60 až 80 hodín

28°C

Inkubačná teplota:

Rýchlosť miešania:

rpm

Prevzdušňovanie:

150 1/min

Penenie sa potláča opakovaným pridaním niekoľkých málo kvapiek 1 až 2 ml etanolového polyolového roztoku. Produkčné maximum sa dosiahne po 69 hodinách.

Príklad 4

Izolácia tiolutín-dioxidu

1 kultivačného roztoku získaného v príklade 3 sa lyofilizujú a lyofilizát sa následne extrahuje metanolom (2 až 31). Metanolový extrakt sa zredukuje vo vákuu a zriedi vodou s obsahom metanolu vo výške 10%. Zriedený extrakt sa vloží na stĺpec s kapacitou 1 1 naplnený adsorpčnou živicou CHP-20P. Elúcia sa uskutočňuje s gradientom rozpúšťadla od vody k acetonitrilu. Prietok stĺpcom (30 ml/min) sa uskutočňuje po frakciách s objemom 30 ml a zhromažďujú sa frakcie obsahujúce požadovanú zlúčeninu, koncentrujú sa vo vákuu a lyofilizujú sa, čím vznikne asi 30 mg žltohnedého prášku. Výsledný prášok sa = 21 mm orilu v média .'uje po rakciách

1,8 mg ;oín-divloží na stĺpec naplnený LUNA® 10 uC18(2) (šírka x výška x 250 mm) a eluuje sa gradientom od 10 do 60% acetoni 0,1% amóniumacetát/voda. Rýchlosť prietoku elučného predstavuje 25 ml/min a výtok zo stĺpca sa zhromažd frakciách s objemom 25 ml. Tiolutin-dioxid sa nájde vo ž; 15 a 16. Lyofilizáciou uvedených frakcií sa získa tiolutín-dioxidu s čistotou > 95%.

Fyzikálno-chemické a spektroskopické vlastnosti tiel; oxidu je možné nasledovne zhrnúť:

Molekulový	vzorec:	C_sH₈N₂O₄S₂
Molekulová	hmotnosť:	260,3
UV maxima:		230, 302, 388 nm
1H- a 13-C	NMR:	pozri tabuľka 1

Tabuľka 1

1H- a 13-C NMR: Chemické posuny tiolutín-dioxidu v DMSO p:

300K

	1H	13C
1	2, 10	22, 51
2	-	170,46
3	10, 65
4	-	123,01
5		164,27
6	3, 10	27,85
7	-	145,48
8	-	114,05
9	7,55-	109,58

Príklad 5 vo for’c výške

Tiolutin-dioxid ako inhibitor neurolyzínu

Uskutočnila sa analýza na CyBio pipetovacom systéme máte 384-jamkovej dosky vo výslednom analyzačnom objeme μΐ.

Stručne: 4 μΐ príslušne zriedených mikrobiálnych extraktov (zriedenie v 50 mmol Tris pufre s pH 7,5) sa rozmiestnilo na testovacie dosky (Greiner, biele dosky s 384 ní zkocio j emovými jamkami). Potom sa do každej jamky pridali 4 μΐ neurolyzínu (vopred zriedeného 1:5, 360 ng proteínu) . Po 10 minútach preinkubácie vzoriek a enzýmu pri izbovej teplote sa vyvolala reakcia pridaním 8 μΐ substrátu (Mcc-Pro-Leu-gly-D-Lyz (Dnp)-OH, CALBIOCHEM) v Tris pufre. Výsledná testovacia koncentrácia substrátu predstavovala 4 μπιοί.

Dáta sa najskôr korigovali vzhľadom na slepé vzorky. Potom, po odpočítaní hodnôt v časovom bode nula od príslušných hodnôt po 30 minútach, sa inhĺbičná aktivita vzorky vyjadrila akt

100 - (čistá intenzita zlúčeniny/čistá intenzita kontroly) x 100 (%)

Každá testovacia doska obsahovala primeraný počet pozitívnych kontrol a slepých vzoriek (pufor namiesto enzýmu).

Stanovila sa hodnota IC₅₀ tiolutín-dioxidu vo výške 0, 6 μιηο 1.

V⁵ Ζ/Ά-- r J

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I

R2 v ktorom sú symboly

Rl, R2 a R3 nezávisle zvolené zo skupiny zahŕňajúcej atóm vodíka, alkylovej skupiny a acylovej skupiny, a ich fyziologicky prijateľných solí a derivátov na prípravu liečiva na liečenie porúch CNS.
2. Použitie zlúčeniny všeobecného vzorca I podľa náreku 1, v ktorej Rl znamená acylovú skupinu, R2 znamená atóm vco.ika a R3 znamená alkylovú skupinu.
3. Použitie podľa nároku 1, pri ktorom je zlúčeninou tiolutin-dioxid vzorca II

II) ·
4. Spôsob prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca I, vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje mikroorganizmus

Nocar16 diopsis species ST 100692, DSM 13834, alebo jeho mutácie alebo varianty, v aeróbnych podmienkach v živnom médiu obsahujúcom zdroje uhlika a dusika, pokiaľ nie je v živnom médiu obsiahnutá aspoň jedna zlúčenina všeobecného vzorca I, zlúčenina sa izoluje a purifikuje.
5. Spôsob prípravy zlúčeniny všeobecného vzorca I, vyznačujúci sa tým, že sa kultivuje mikroorganizmus Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834, alebo jeho mutácie alebo varianty, v aeróbnych podmienkach v živnom médiu obsahujúcom zdroje uhlíka a dusíka, pokiaľ nie je v živnom médiu ccsiahnutý tiolutín, tiolutín sa izoluje a prevedie na aspoň jednu zlúčeninu všeobecného vzorca I.
6. Spôsob podľa nároku 4 alebo nároku 5, vyznačujúci sa t ý m, že sa ďalej uvedená zlúčenina všeobecného vzorca I prevedie na fyziologicky prijateľnú soľ, derivát alebo fyziologicky prijateľnú soľ derivátu.
7. Nocardiopsis species ST 100692, DSM 13834.