JP4287593B2 - ムンバイスタチン、その製造法およびその医薬としての使用 - Google Patents
ムンバイスタチン、その製造法およびその医薬としての使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4287593B2 JP4287593B2 JP2000556048A JP2000556048A JP4287593B2 JP 4287593 B2 JP4287593 B2 JP 4287593B2 JP 2000556048 A JP2000556048 A JP 2000556048A JP 2000556048 A JP2000556048 A JP 2000556048A JP 4287593 B2 JP4287593 B2 JP 4287593B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- mumbaistatin
- lactone
- mumbai
- statin
- pharmaceutically acceptable
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P1/00—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes
- C12P1/04—Preparation of compounds or compositions, not provided for in groups C12P3/00 - C12P39/00, by using microorganisms or enzymes by using bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/465—Streptomyces
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/886—Streptomyces
Description
【０００１】
【技術分野】
本発明は、微生物ＨＩＬ−008003（ＤＳＭ 11641）の培養によって得られるムンバイスタチン（Mumbaistatin）と命名された化合物、その医薬的に許容される塩および誘導体に関する。ムンバイスタチンはグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害剤であり、糖尿病の治療に使用される。本発明は、さらに、ムンバイスタチンの製造方法、微生物ＨＩＬ−008003（ＤＳＭ 11641）、ムンバイスタチンおよびその医薬的に許容される塩および誘導体の医薬としての使用、特に糖尿病の治療におけるそれらの使用、ならびに、ムンバイスタチンまたはその医薬的に許容される塩もしくは誘導体からなる医薬組成物に関する。
【０００２】
【背景技術】
肝臓のグルコース排出率の増加が糖尿病の一般的な特徴である。特にインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）における空腹時血漿グルコースレベルは肝臓のグルコース排出と強い相関がある。肝臓におけるグルコースの産生には、糖の新生とグリコーゲンの分解の２つの経路がある。両経路の最終工程はいずれも、血中のグルコースレベルの恒常的調節における鍵酵素、ミクロソームのグルコース−６−ホスファターゼによって触媒される。この酵素のレベルも、糖尿病の実験的および病理学的条件の両者で上昇することが知られている。したがって、この酵素系への干渉は肝臓のグルコース産生を低下させるはずである。
【０００３】
肝臓のグルコース−６−ホスファターゼは、少なくとも３つの機能活性、すなわち、グルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼ（Ｔ１）、グルコース−６−ホスフェートホスホヒドロラーゼおよびホスフェート／ピロホスフェートトランスロカーゼ（Ｔ２）からなる多重成分系である。グルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼは、網様体（endoplasmic reticulum）（ＥＲ）の管腔内へのグルコース−６−ホスフェートの輸送を容易にする。その活性部位がＥＲの管腔表面にあるホスホヒドロラーゼはグルコース−６−ホスフェートを加水分解して、管腔内にグルコースとリン酸塩を放出する。ホスフェートのエフラックスはホスフェート／ピロホスフェートトランスロカーゼによって促進されるが、グルコースのエフラックスの正確な機構はまだ明らかではない。
【０００４】
グルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの高度な基質特異性から、これは糖尿病の治療における薬理学的関与のための標的になる可能性が考えられる。すなわち、生理学的に存在する糖ホスフェートの中でグルコース−６−ホスフェートのみがこのトランスロカーゼによって輸送される。逆にこのホスファターゼは非特異的で、種々の有機リン酸エステルを加水分解することが知られている。
【０００５】
グルコース−６−ホスファターゼの一連の非特異的な阻害剤は文献に記載され、たとえば、フロリジン（J. Biol. Chem. 242, 1955-1960, 1967）、５,５′−ジチオ-ビス−２−ニトロ安息香酸（Biochem. Biophys. Res. Commun. 48, 694-699, 1972）、２,２′−ジイソチオシアナトスチルベンおよび２−イソチオシアナト−２′−アセトキシスチルベン（J. Biol. Chem. 255, 1113-1119, 1980）がある。最初に治療的に利用されたグルコース−６−ホスファターゼ系の阻害剤は、欧州特許出願ＥＰ-Ａ-587 087およびＥＰ-Ａ-587 088に提案されている。国際特許出願ＷＯ 98／47888に記載されているコダイスタチンＡ、Ｂ、ＣおよびＤは微生物起源の最初のグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害剤である。
【０００６】
今回異なる微生物起源から、ムンバイスタチンと命名されたグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの高い阻害活性を有する新規な化合物が得られた。したがって、本発明は、分子式Ｃ28Ｈ20Ｏ12を有し、下記に示した物理化学的およびスペクトル的性質の１つ以上、例えば図９の1Ｈ ＮＭＲスペクトルに示した1Ｈ ＮＭＲスペクトル分析データおよび図１０の13Ｃ ＮＭＲスペクトルに示した13Ｃ ＮＭＲスペクトル分析データを特徴とする、ムンバイスタチンと命名された化合物およびそのすべての立体異性体および互変異性体型ならびにその医薬的に許容される塩および誘導体たとえばそのエステル、エーテルおよび自明な化学的均等物に関する。
【０００７】
ムンバイスタチンはキノンクラスの化合物に属するこれまで報告されていない新規な構造を有する。その分子式を検索のキーに用いたChemical Abstractの文献検索によって、ムンバイスタチンは新規な化合物であることが確立された。他の化合物でムンバイスタチンの構造的特徴を示すものはなかった。
【０００８】
ムンバイスタチンは、培養菌番号ＨＩＬ−008003もしくは培養菌番号Ｙ−9645974（以下ＨＩＬ−008003という）と呼ばれる微生物の培養によって得られる。ムンバイスタチンの産生に用いられた微生物は、インド、MaharashtraのAmboli付近におけるHiranyakeshiの河床から収集した土壌のサンプルから単離された。微生物ＨＩＬ−008003は、Streptomyces litmocidiniとして同定されている。この微生物は、1997年７月４日にGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（ＤＳＭＺ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，Mascheroder Weg 1b, D-38124, Braunschweig, Germany に寄託され、受入番号ＤＳＭ 11641を与えられた。
【０００９】
したがって、本発明はさらに、ストレプトマイセス種ＨＩＬ−008003、その突然変異体および変異体からムンバイスタチンと命名された新規な化合物ならびにその医薬的に許容される塩および誘導体を製造する方法を提供する。上記方法は培養菌番号ＨＩＬ−008003、その突然変異体または変異体を１種または２種以上の炭素源および１種または２種以上の窒素源ならびに任意の栄養無機塩および／または微量元素を含有する栄養培地中好気条件下に培養し、ついで上記化合物を単離し、ついで慣用方法により精製することからなる。
【００１０】
栄養培地は好ましくは炭素源、窒素源ならびに栄養無機塩および任意の微量元素を含有する。炭素源はたとえばデンプン、グルコース、スクロース、デキストリン、フルクトース、糖蜜、グリセロール、ラクトースまたはガラクトースであり、好ましくはグルコースである。窒素源はたとえば、大豆ミール、ピーナッツミール、酵母エキス、牛肉エキス、ペプトン、トリプトン、モルトエキス、コーンスティープリカー、ゼラチンまたはカサミノ酸であり、好ましくは、大豆ミールおよびコーンスティープリカーである。栄養無機塩および微量元素はたとえばリン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化コバルト、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、硝酸カリウム、硫酸アンモニウムまたは硫酸マグネシウムであり、好ましくは塩化コバルトおよび炭酸カルシウムである。
【００１１】
培養菌番号ＨＩＬ−008003の培養は通常、２５〜３０℃の温度、６.０〜８.０のｐＨで行われる。好ましくは培養菌番号ＨＩＬ−008003は２７℃（±１℃）およびｐＨ７.０で培養される。
【００１２】
ＨＩＬ−008003の培養は、好ましくは約４０〜７０時間、本発明のムンバイスタチンの至適収率が得られるまで実施される。発酵は約４０〜４８時間、液内培養条件下に、たとえば振盪フラスコ中および実験室用のファーメンター中で行うのが特に好ましい。所望によりファーメンター中に、Desmophen（登録商標、ポリプロピレンオキシド）を消泡剤として使用することもできる。発酵の進行およびムンバイスタチンの形成は、マイクロタイタープレート中、非処理の Triton X-100（登録商標）分解ラット肝ミクロソームにおけるグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害を室温で、Methods in Enzymology 174, 58-67, 1989 に記載の方法をわずかに改変して比色法により測定して検出することができる。得られた培養ブロス中、ムンバイスタチンは主として培養ろ液中に存在し、したがって培養ろ液を水非混和性溶媒たとえば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルムまたはブタノールによりｐＨ５〜８で抽出して回収するか、またはポリマー樹脂たとえば、Diaion HP-20（登録商標、Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japan）、AmberliteXAD（登録商標、Rohm and Haas Industries, USA）、活性炭もしくはイオン交換クロマトグラフィーを用いてｐＨ５〜８で疎水性相互作用クロマトグラフィーによって回収する。好ましい方法は Diaion HP-20（登録商標）上への吸着ついでその化合物の、溶出剤、たとえば水、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ-プロパノール、イソプロパノールまたはそれらの組み合わせを用いる脱着である。活性な溶出液を濃縮し、凍結乾燥すると粗製の化合物が得られる。
【００１３】
粗製の物質は以下の技術のいずれかを用いてさらに精製することができる。すなわち、静止相としてアルミナもしくはシリカゲル、溶出液として酢酸エチル、クロロホルム、メタノールもしくはそれらの組み合わせを用いる正常相クロマトグラフィー；静止相としてＲＰ−１８とも呼ばれるジメチルオクタデシルシリルシリカゲルもしくはＲＰ−８とも呼ばれるジメチルオクチルシリルシリカゲルのような逆相シリカゲル、溶出液として水、緩衝液たとえばリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ２〜８）および有機溶媒たとえばメタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフランもしくはそれらの組み合わせを用いる逆相クロマトグラフィー；溶媒たとえばメタノール、クロロホルム、アセトン、酢酸エチルもしくはそれらの組み合わせ中においてSephadex（登録商標）LH-20（Pharmacia Chemical Industries, Sweden）、TSKgel Toyopearl（登録商標）HW-40F(TosoHaas, Tosoh Corporation, Japan）、水中においてSephadex（登録商標）G-10およびG-25のような樹脂を用いるゲル浸透クロマトグラフィー；水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ-プロパノール、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、メチレンクロリド、クロロホルム、酢酸エチル、石油エーテル、ベンゼンおよびトルエンのような２種以上の溶媒から作成した二相性の溶出系を用いる向流クロマトグラフィーを使用することができる。これらの技術は、繰り返し、または別の技術と組み合わせて使用できる。好ましい方法は Toyopearl（登録商標）上でのクロマトグラフィーついで改良シリカゲル（RP-18）上での逆相クロマトグラフィーである。
【００１４】
化合物ムンバイスタチンは、医薬的に許容される塩および誘導体、たとえばエステルおよびエーテルならびに他の自明の化学的均等物に変換することが可能であり、これらはすべて本発明の範囲に包含される。本発明はまた、それら自体は医薬としての使用に適当ではないが、医薬的に許容される塩および誘導体の製造における中間体として使用できるすべてのムンバイスタチンの塩および誘導体も包含する。本発明は、すべての立体異性型および互変異性型のムンバイスタチンならびにその塩および誘導体を包含する。塩および誘導体は、本技術分野の熟練者には既知の標準操作を用いて製造することができる。たとえば、ナトリウムおよびカリウム塩のような塩は、ムンバイスタチンを適当なナトリウムおよびカリウム塩基で処理して製造することができる。エステルはムンバイスタチンをカルボン酸とジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下に反応させるか、またはその化合物をアシル化剤たとえば酸クロリドで処理して製造することができる。エステルを製造する他の方法は文献たとえば J. March, Advanced OrganicSynthesis, ４版，John Wiley & Sons, 1992 に記載されている。
【００１５】
本発明に含まれるムンバイスタチンのエステルには、分子内エステルすなわちラクトンが包含される。本発明の主題としてとくに取り上げられる化合物は、Ｌ970860と命名された化合物ならびにその医薬的に許容される塩および誘導体のすべての立体異性型および互変異性型である。化合物Ｌ970860 は、ムンバイスタチンのトルフルオロ酢酸処理により得られる。それは分子式Ｃ28Ｈ18Ｏ11を有し、下記に示した物理化学的およびスペクトル的性質の1つ以上、例えば、図７の1Ｈ ＮＭＲスペクトルに示した1Ｈ ＮＭＲスペクトル分析データおよび図８の13Ｃ ＮＭＲスペクトルに示した13Ｃ ＮＭＲスペクトル分析データを特徴とする。Ｌ970860を与えるムンバイスタチンのラクトン化は、ムンバイスタチンの単離または精製に使用することができる。
【００１６】
エーテルは、たとえばムンバイスタチンから、塩基性条件下におけるアルキル化剤との反応によって製造することができる。エーテルの他の製造方法は、文献たとえば、J. March, Advanced Organic Synthesis, ４版，John Wiley & Sons, 1992 に記載されている。
【００１７】
ムンバイスタチンは、ラット肝ミクロソームのグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼを強力に阻害する。薬理学試験で得られた結果を、以下に示す。すなわち、ムンバイスタチンならびにその医薬的に許容される塩および誘導体は、医薬の活性成分としてとくに糖尿病の治療に有用であり、さらに一般的にはグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの活性の上昇により引き起こされるかもしくはそれに伴う状態、またはグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼ活性の低下が意図される状態の治療または予防に有用である。ムンバイスタチンならびにその医薬的に許容される塩および誘導体は、動物、好ましくは哺乳動物、とくにヒトに、それ自体で、他の医薬と混合して、および経口または非経口的投与が可能な医薬組成物として投与することができる。したがって、本発明はまた、医薬として使用するためのムンバイスタチンならびにその医薬的に許容される塩および誘導体、およびグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼ活性を低下させるための医薬、とくに糖尿病の治療用医薬の製造におけるムンバイスタチンならびにその医薬的に許容される塩および誘導体の使用に関する。本発明はさらに、ムンバイスタチンおよび／または１種もしくは２種以上のその医薬的に許容される塩および／またはその誘導体の有効量を医薬的に許容される担体とともに含有する医薬組成物に関する。
【００１８】
ムンバイスタチンは、経口的に、筋肉内に、静脈内に、または他の投与様式で投与することができる。ムンバイスタチンまたはその医薬的に許容される塩もしくは誘導体を含有する医薬組成物は、単独でまたは配合して、この化合物を１種または２種以上の医薬的に許容される賦形剤および／または補助剤、たとえば充填剤、乳化剤、滑沢剤、遮蔽フレーバー、着色剤または緩衝物質と混合し、この混合物を適当な医薬剤形たとえば錠剤、コート錠、カプセルまたは経口または非経口投与に適当な懸濁剤もしくは溶液に変換することにより製造することができる。
【００１９】
上述の補助剤および／または賦形剤の例としては、デンプン、トラガントゴム、ラクトース、タルク、寒天、ポリグリコール、エタノールおよび水を挙げることができる。水への懸濁剤または溶液が、非経口投与には適当であり、好ましい。活性物質はそのまま、ビヒクルまたは希釈剤を使用しないで適当な剤形、たとえばカプセルとして投与することも可能である。ムンバイスタチンまたはその医薬的に許容される塩もしくは誘導体からなる医薬組成物にはまた、他の医薬活性成分を添加してもよい。
【００２０】
慣例的に、特定の場合に適当な公定処方および投与方法ならびに用量範囲は、治療される種およびそれぞれの症状または疾患の状態に依存し、本技術分野で知られている方法を用いて至適化される。
【００２１】
医薬的に活性な成分の場合とは別に、誘導体の製造の場合の中間体として、ムンバイスタチンならびにその塩および誘導体はまた、診断の目的たとえばインビトロ診断において、およびグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害を追求する研究目的での生化学的研究において、補助剤としても使用することができる。
【００２２】
【実施例】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、その範囲を限定するものではない。
略号：ＭｅＯＨ メタノール；ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド；ＴＦＡ トリフルオロ酢酸。
【００２３】
実施例１
土壌からの培養菌ＨＩＬ−008003の単離
(ａ) 栄養単離培地の組成
コーンスターチ １０.０ｇ
カゼイン １.０ｇ
ペプトン １.０ｇ
酵母エキス １.０ｇ
Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ
寒天粉末 １３.０ｇ
鉱物質除去水 １.０ litre
ｐＨ ７.５
【００２４】
(ｂ) 土壌のプレーティングおよび単離
２５０mlのエルレンマイヤーフラスコに、インド、MaharashtraのAmboli付近におけるHiranyakeshiの河床から収集した土壌１０ｇを取り、これに滅菌した鉱物質除去水９０mlを加えて、２時間ロータリーシェーカー上で振盪した（２２０rpm）。上述の土壌懸濁液をついで１０から１０-5までの段階に系列希釈した。最後の希釈液から、１mlの懸濁液を滅菌ガラスペトリ皿（直径１５cm）の中央に置き、抗菌剤としてアンフォテリシンＢ ２５μg／mlを補充した上記単離メジウム約５０mlを注いだ。このメジウムは注加する前に４５℃に冷却し、プレートを完全に回転させた。土壌懸濁液およびメジウムの混合物を、放置して沈積させ、２８℃（±１℃）で７日間インキュベートした。ペトリプレートを周期的に観察して、微生物培養菌ＨＩＬ−008003（培養菌Ｙ−9645974）を増殖する微生物中から単離した。
【００２５】
実施例２
培養菌ＨＩＬ−008003 の維持
培養菌ＨＩＬ-008003 は以下のメジウム上で維持した。
モルトエキス １０.０ｇ
酵母エキス ４.０ｇ
グルコース ４.０ｇ
寒天粉末 １３.０ｇ
鉱物質除去水 １.０litre
ｐＨ ７.０
上述の成分を加熱して完全に溶解したのちに、それを試験管に分配し、ついで１２１℃で２０分間滅菌した。ついで試験管を冷却し、傾斜した位置で放置して固化させた。傾斜寒天を、針金ループにより、増殖した培養菌ＨＩＬ−008003を画線培養し、良好な増殖が観察されるまで２８℃（±１℃）でインキュベートした。よく増殖した培養菌は冷蔵庫内に８℃で保存した。
【００２６】
実施例３
振盪フラスコ中における培養菌ＨＩＬ−008003の発酵
種メジウムの組成
グルコース １５.０ｇ
大豆ミール １５.０ｇ
コーンスティープリカー ５.０ｇ
ＮaＣl ５.０ｇ
ＣaＣＯ3 ２.０ｇ
鉱物質除去水 １.０litre
ｐＨ ７.０
上記種メジウムを５００mlのエルレンマイヤーフラスコ中に８０ml量ずつ分配し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。フラスコを室温に冷却し、ついで各フラスコに、実施例２に上述したよく増殖した培養菌ループ１杯を接種し、ロータリーシェーカー上２７℃（±１℃）で７２時間、種培養菌が得られるまで２４０rpmで振盪した。
【００２７】
製造メジウムの組成
グルコース ２０.０ｇ
大豆ミール １０.０ｇ
ＣaＣＯ3 ０.２ｇ
塩化コバルト ０.００１ｇ
鉱物質除去水 １.０litre
ｐＨ ７.０
製造メジウムを５００mlのエルレンマイヤーフラスコ中に６０ml量ずつ分配し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。フラスコを室温に冷却し、ついで上述の種培養菌（１％v/v）を接種した。発酵はロータリーシェーカー上温度 ２７℃（±１℃）で４０〜４８時間、２４０rpmで実施した。
【００２８】
ムンバイスタチンの産生は、グルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害を測定してモニターした。収穫後、培養ブロスを遠心分離し、ムンバイスタチンを培養ろ液から単離し、実施例５に記載するようにして精製した。
【００２９】
実施例４
ファーメンター中における培養菌ＨＩＬ−008003の発酵
段階１：振盪フラスコ中種培養菌の調製
実施例３の種メジウムを１Ｌのエルレンマイヤーフラスコ中に１６０ml量ずつ分配し、２０分間オートクレーブ処理した。これらのフラスコ中で実施例３に記載したように種培養菌を増殖させた。
【００３０】
段階２：ファーメンターにおける種培養菌の調製
実施例３に記載したように、１００ＬのMarubishiファーメンター中８０Ｌの種メジウムをインシトゥで１２１℃において２０分間滅菌し、２７℃±１℃に冷却し、上述の種培養菌４.５Ｌを接種した。
発酵は以下のパラメーターで実施した。
温度 ２７℃（±０.５℃）
撹拌 ８０rpm
通気 ５０lpm
収穫時間 ２４時間
【００３１】
段階３：大規模発酵
１０００ＬのMarubishiファーメンター中で、実施例３に記載の７００Ｌの製造メジウムを、消泡剤としてのDesmophen（登録商標、ポリプロピレンオキシド）１５０mlとともにインシトゥにおいて１２１℃で４５分間滅菌し、２７℃±１℃に冷却し、段階２からの種培養菌７５Ｌを接種した。
発酵は以下のパラメーターで実施した。
温度 ２７℃（±０.５℃）
撹拌 ５０rpm
通気 ４５０lpm
収穫時間 ４０〜４４時間
化合物の産生はグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害を測定してモニターした。発酵を停止したときの培養ブロスのｐＨは６.０〜７.０であった。収穫後、培養ブロスを遠心分離し、以下の実施例５に記載するように、グルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼ阻害剤、ムンバイスタチンを培養ろ液から単離した。
【００３２】
実施例５
ムンバイスタチンの単離および精製
約１０００Ｌの培養ブロスを収穫し、菌糸体（１２kg）から遠心分離によって分離した。所望の化合物、ムンバイスタチンは主として培養ろ液中に存在することが見いだされた。培養ろ液（７３０Ｌ）をDiaion（登録商標）ＨＰ−２０（２８Ｌ，３〜４％v/v）のカラムを通過させた。カラムを鉱物質除去水（２５０Ｌ）で完全に洗浄し、ついで水中ＭｅＯＨの段階勾配によって溶出した。すなわち、溶出は１０％ＭｅＯＨ（１２０Ｌ）および４０％ＭｅＯＨ（３００Ｌ）で行った。１５Ｌサイズで分画を収集した。４０％ＭｅＯＨで得られた活性な溶出液（１５×１６Ｌ）を合わせて、１０〜１００mmHgの減圧下、３５℃で濃縮し、凍結乾燥すると、ＩＣ50 ５μg／mlを示す２４０ｇの活性な粗製物質が生成した。
【００３３】
粗製の物質（２４０ｇ）を第二のＨＰ−２０カラムを通過させた。このカラムを鉱物質除去水（１５０Ｌ）で完全に洗浄し、ついで水中ＭｅＯＨの段階勾配によって溶出した。すなわち、溶出は２０％ＭｅＯＨ（８０Ｌ）および４０％ＭｅＯＨ（１００Ｌ）で行った。それぞれ１０Ｌサイズおよび２Ｌサイズで分画を収集した。４０％ＭｅＯＨで得られた活性な溶出液（２×３０Ｌ）を合わせて、１０〜１００mmHgの減圧下、３５℃で濃縮し、凍結乾燥すると、ＩＣ50 １μg／mlを示す２０ｇの濃縮された物質が生成した。
【００３４】
このようにして得られた濃縮物質を、様々な基質対ゲル比で Sephadex（登録商標）ＬＨ−２０上、２連続ゲル浸透クロマトグラフィーによって精製した。すなわち、上述の濃縮された物質を、各５ｇの４ロットとして別個に、４cm×１２０cmのガラスカラム中に充填したSephadex（登録商標）ＬＨ−２０（１.５Ｌ）を通過させた。移動相は水とし、流速は２.５ml／分に維持した。２５mlサイズで分画を収集した。活性な溶出液は０.１％ＴＦＡ水溶液〜ＣＨ3ＣＮの勾配を用い、２０分間、流速１ml／分でLichrocart（登録商標）１００ ＲＰ−１８（２５０mm×４mm）カラム上ＨＰＬＣによってモニターし、２７０nmで検出した。所望の成分を含む活性溶出液をプールし、１０〜１００mmHgの減圧下３５℃で濃縮し、凍結乾燥すると、ＩＣ50 ０.１〜０.３μｇ／mlを示す高度に濃縮された物質１ｇが得られた。
【００３５】
上記物質はさらにそれぞれ５００mgの２ロットをガラスカラム（２.５cm×１１０cm）中に充填したSephadex（登録商標）ＬＨ−２０に通過させて精製した。移動相は水とし、流速は０.５ml／分に維持した。６mlサイズで分画を収集した。分画をＨＰＬＣ（条件は上述）に基づいてプールした。所望の化合物を含む活性分画をプールし、１０〜１００mmHgの減圧下３５℃で濃縮して、凍結乾燥すると、ＩＣ50 ０.０６μg／mlを示す半純粋な化合物１６０mgが得られた。
【００３６】
最後に半純粋な物質をEurosphere（登録商標）１００ Ｃ１８、１０μ（２５０×１６mm）カラム上、分取ＨＰＬＣによって、水中５％メタノール〜水中40％メタノール勾配を用い、３０分で精製した。流速は６ml／分に維持し、純粋なムンバイスタチンを得るため検出は２７０nmで行った（７０mg）。
【００３７】
ムンバイスタチンは、質的に劣った1Ｈ ＮＭＲおよび13Ｃ ＮＭＲスペクトルを与えた。したがって、親化合物、ムンバイスタチンの特性解析は最初は実施例６に記載の方法を用いてムンバイスタチンのＴＦＡによる処理で得られたラクトン、Ｌ970860のスペクトル解析に基づいて行われた。
【００３８】
実施例６
ラクトン、Ｌ970860の製造
メタノール（５ml）に溶解したムンバイスタチン７０mgに０.１％ＴＦＡ（５０ml）を加え、反応混合物を５０℃で１時間加熱した。ついで混合物を１０〜１００mmHgの減圧下３５℃で蒸発乾固した。このようにして得られた反応生成物を分取ＨＰＬＣによりEurosphere（登録商標）１００ Ｃ１８、１０μ（２５０mm×１６mm）カラム上、０.１％ＴＦＡ中３０％ＣＨ3ＣＮ〜０.１％ＴＦＡ中８０％ＣＨ3ＣＮの勾配を用い、流速は６ml／分、２０分で精製して、純粋なＬ970860を得るために検出は２７０nmで行った（５５mg）。
【００３９】
ムンバイスタチンおよびそのラクトンＬ970860の物理化学的な性質およびスペクトル的性質を表１にまとめる。化合物のスペクトル分析データは図２、３および５〜１０に示す。図１〜４はＨＰＬＣクロマトグラムを示す。個々の図の内容は表１に指示する。
【００４０】
【表１】
【００４１】
ムンバイスタチンおよびそのラクトンＬ970860の薬理学的特性
ムンバイスタチンはラット肝ミクロソームのグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの活性を、ＩＣ50約２５nMで強力に阻害する。これに反し、ムンバイスタチンは、界面活性剤で破壊したミクロソーム中のホスファターゼ活性をＩＣ50約＞１００μＭで阻害し、トランスロカーゼへの高度の特異性が指示される。さらに、ムンバイスタチンは、ホスフェート／ピロホスフェートトランスロカーゼの活性には影響しなかった。ムンバイスタチンはグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの可逆性競合的阻害剤である。
【００４２】
ムンバイスタチンはさらに、単離ラット肝細胞において、グルコースの排出に対する作用を評価した。それは、フルクトース誘発糖新生およびグルカゴン誘発グリコーゲンの加水分解をそれぞれ、約０.３μＭおよび０.６μＭのＩＣ50値で阻害する。
【００４３】
Ｌ970860は、ラット肝ミクロソームのグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの活性を、約１.８μＭのＩＣ50で阻害する。
【００４４】
【表２】
【００４５】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ムンバイスタチンの高速液体クロマトグラフィーにおける溶出を示す図である。
【図２】 ムンバイスタチンのＵＶ吸収を示す図である。
【図３】 ムンバイスタチンのＩＲ（Ｂｒ）を示す図である。
【図４】 Ｌ970860の高速液体クロマトグラフィーにおける溶出を示す図である。
【図５】 Ｌ970860のＵＶ吸収を示す図である。
【図６】 Ｌ970860のＩＲ（Ｂｒ）を示す図である。
【図７】 Ｌ970860の1Ｈ ＮＭＲ(３００MHz，Ｄ4−ＤＭＳＯ)を示す図である。
【図８】 Ｌ970860の13Ｃ ＮＭＲ(７５MHz，Ｄ6−ＤＭＳＯ)を示す図である。
【図９】 ムンバイスタチンの1Ｈ ＮＭＲ(６００MHz，Ｄ4−ＭｅＯＨ，２７℃)を示す図である。
【図１０】 ムンバイスタチン13Ｃ ＮＭＲ(１５０MHz，Ｄ4−ＭｅＯＨ，２７℃)を示す図である。
【技術分野】
本発明は、微生物ＨＩＬ−008003（ＤＳＭ 11641）の培養によって得られるムンバイスタチン（Mumbaistatin）と命名された化合物、その医薬的に許容される塩および誘導体に関する。ムンバイスタチンはグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害剤であり、糖尿病の治療に使用される。本発明は、さらに、ムンバイスタチンの製造方法、微生物ＨＩＬ−008003（ＤＳＭ 11641）、ムンバイスタチンおよびその医薬的に許容される塩および誘導体の医薬としての使用、特に糖尿病の治療におけるそれらの使用、ならびに、ムンバイスタチンまたはその医薬的に許容される塩もしくは誘導体からなる医薬組成物に関する。
【０００２】
【背景技術】
肝臓のグルコース排出率の増加が糖尿病の一般的な特徴である。特にインスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ）における空腹時血漿グルコースレベルは肝臓のグルコース排出と強い相関がある。肝臓におけるグルコースの産生には、糖の新生とグリコーゲンの分解の２つの経路がある。両経路の最終工程はいずれも、血中のグルコースレベルの恒常的調節における鍵酵素、ミクロソームのグルコース−６−ホスファターゼによって触媒される。この酵素のレベルも、糖尿病の実験的および病理学的条件の両者で上昇することが知られている。したがって、この酵素系への干渉は肝臓のグルコース産生を低下させるはずである。
【０００３】
肝臓のグルコース−６−ホスファターゼは、少なくとも３つの機能活性、すなわち、グルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼ（Ｔ１）、グルコース−６−ホスフェートホスホヒドロラーゼおよびホスフェート／ピロホスフェートトランスロカーゼ（Ｔ２）からなる多重成分系である。グルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼは、網様体（endoplasmic reticulum）（ＥＲ）の管腔内へのグルコース−６−ホスフェートの輸送を容易にする。その活性部位がＥＲの管腔表面にあるホスホヒドロラーゼはグルコース−６−ホスフェートを加水分解して、管腔内にグルコースとリン酸塩を放出する。ホスフェートのエフラックスはホスフェート／ピロホスフェートトランスロカーゼによって促進されるが、グルコースのエフラックスの正確な機構はまだ明らかではない。
【０００４】
グルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの高度な基質特異性から、これは糖尿病の治療における薬理学的関与のための標的になる可能性が考えられる。すなわち、生理学的に存在する糖ホスフェートの中でグルコース−６−ホスフェートのみがこのトランスロカーゼによって輸送される。逆にこのホスファターゼは非特異的で、種々の有機リン酸エステルを加水分解することが知られている。
【０００５】
グルコース−６−ホスファターゼの一連の非特異的な阻害剤は文献に記載され、たとえば、フロリジン（J. Biol. Chem. 242, 1955-1960, 1967）、５,５′−ジチオ-ビス−２−ニトロ安息香酸（Biochem. Biophys. Res. Commun. 48, 694-699, 1972）、２,２′−ジイソチオシアナトスチルベンおよび２−イソチオシアナト−２′−アセトキシスチルベン（J. Biol. Chem. 255, 1113-1119, 1980）がある。最初に治療的に利用されたグルコース−６−ホスファターゼ系の阻害剤は、欧州特許出願ＥＰ-Ａ-587 087およびＥＰ-Ａ-587 088に提案されている。国際特許出願ＷＯ 98／47888に記載されているコダイスタチンＡ、Ｂ、ＣおよびＤは微生物起源の最初のグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害剤である。
【０００６】
今回異なる微生物起源から、ムンバイスタチンと命名されたグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの高い阻害活性を有する新規な化合物が得られた。したがって、本発明は、分子式Ｃ28Ｈ20Ｏ12を有し、下記に示した物理化学的およびスペクトル的性質の１つ以上、例えば図９の1Ｈ ＮＭＲスペクトルに示した1Ｈ ＮＭＲスペクトル分析データおよび図１０の13Ｃ ＮＭＲスペクトルに示した13Ｃ ＮＭＲスペクトル分析データを特徴とする、ムンバイスタチンと命名された化合物およびそのすべての立体異性体および互変異性体型ならびにその医薬的に許容される塩および誘導体たとえばそのエステル、エーテルおよび自明な化学的均等物に関する。
【０００７】
ムンバイスタチンはキノンクラスの化合物に属するこれまで報告されていない新規な構造を有する。その分子式を検索のキーに用いたChemical Abstractの文献検索によって、ムンバイスタチンは新規な化合物であることが確立された。他の化合物でムンバイスタチンの構造的特徴を示すものはなかった。
【０００８】
ムンバイスタチンは、培養菌番号ＨＩＬ−008003もしくは培養菌番号Ｙ−9645974（以下ＨＩＬ−008003という）と呼ばれる微生物の培養によって得られる。ムンバイスタチンの産生に用いられた微生物は、インド、MaharashtraのAmboli付近におけるHiranyakeshiの河床から収集した土壌のサンプルから単離された。微生物ＨＩＬ−008003は、Streptomyces litmocidiniとして同定されている。この微生物は、1997年７月４日にGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures（ＤＳＭＺ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，Mascheroder Weg 1b, D-38124, Braunschweig, Germany に寄託され、受入番号ＤＳＭ 11641を与えられた。
【０００９】
したがって、本発明はさらに、ストレプトマイセス種ＨＩＬ−008003、その突然変異体および変異体からムンバイスタチンと命名された新規な化合物ならびにその医薬的に許容される塩および誘導体を製造する方法を提供する。上記方法は培養菌番号ＨＩＬ−008003、その突然変異体または変異体を１種または２種以上の炭素源および１種または２種以上の窒素源ならびに任意の栄養無機塩および／または微量元素を含有する栄養培地中好気条件下に培養し、ついで上記化合物を単離し、ついで慣用方法により精製することからなる。
【００１０】
栄養培地は好ましくは炭素源、窒素源ならびに栄養無機塩および任意の微量元素を含有する。炭素源はたとえばデンプン、グルコース、スクロース、デキストリン、フルクトース、糖蜜、グリセロール、ラクトースまたはガラクトースであり、好ましくはグルコースである。窒素源はたとえば、大豆ミール、ピーナッツミール、酵母エキス、牛肉エキス、ペプトン、トリプトン、モルトエキス、コーンスティープリカー、ゼラチンまたはカサミノ酸であり、好ましくは、大豆ミールおよびコーンスティープリカーである。栄養無機塩および微量元素はたとえばリン酸水素ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、塩化コバルト、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、硝酸カリウム、硫酸アンモニウムまたは硫酸マグネシウムであり、好ましくは塩化コバルトおよび炭酸カルシウムである。
【００１１】
培養菌番号ＨＩＬ−008003の培養は通常、２５〜３０℃の温度、６.０〜８.０のｐＨで行われる。好ましくは培養菌番号ＨＩＬ−008003は２７℃（±１℃）およびｐＨ７.０で培養される。
【００１２】
ＨＩＬ−008003の培養は、好ましくは約４０〜７０時間、本発明のムンバイスタチンの至適収率が得られるまで実施される。発酵は約４０〜４８時間、液内培養条件下に、たとえば振盪フラスコ中および実験室用のファーメンター中で行うのが特に好ましい。所望によりファーメンター中に、Desmophen（登録商標、ポリプロピレンオキシド）を消泡剤として使用することもできる。発酵の進行およびムンバイスタチンの形成は、マイクロタイタープレート中、非処理の Triton X-100（登録商標）分解ラット肝ミクロソームにおけるグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害を室温で、Methods in Enzymology 174, 58-67, 1989 に記載の方法をわずかに改変して比色法により測定して検出することができる。得られた培養ブロス中、ムンバイスタチンは主として培養ろ液中に存在し、したがって培養ろ液を水非混和性溶媒たとえば酢酸エチル、ジクロロメタン、クロロホルムまたはブタノールによりｐＨ５〜８で抽出して回収するか、またはポリマー樹脂たとえば、Diaion HP-20（登録商標、Mitsubishi Chemical Industries Limited, Japan）、AmberliteXAD（登録商標、Rohm and Haas Industries, USA）、活性炭もしくはイオン交換クロマトグラフィーを用いてｐＨ５〜８で疎水性相互作用クロマトグラフィーによって回収する。好ましい方法は Diaion HP-20（登録商標）上への吸着ついでその化合物の、溶出剤、たとえば水、メタノール、アセトン、アセトニトリル、ｎ-プロパノール、イソプロパノールまたはそれらの組み合わせを用いる脱着である。活性な溶出液を濃縮し、凍結乾燥すると粗製の化合物が得られる。
【００１３】
粗製の物質は以下の技術のいずれかを用いてさらに精製することができる。すなわち、静止相としてアルミナもしくはシリカゲル、溶出液として酢酸エチル、クロロホルム、メタノールもしくはそれらの組み合わせを用いる正常相クロマトグラフィー；静止相としてＲＰ−１８とも呼ばれるジメチルオクタデシルシリルシリカゲルもしくはＲＰ−８とも呼ばれるジメチルオクチルシリルシリカゲルのような逆相シリカゲル、溶出液として水、緩衝液たとえばリン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩緩衝液（ｐＨ２〜８）および有機溶媒たとえばメタノール、アセトニトリル、アセトン、テトラヒドロフランもしくはそれらの組み合わせを用いる逆相クロマトグラフィー；溶媒たとえばメタノール、クロロホルム、アセトン、酢酸エチルもしくはそれらの組み合わせ中においてSephadex（登録商標）LH-20（Pharmacia Chemical Industries, Sweden）、TSKgel Toyopearl（登録商標）HW-40F(TosoHaas, Tosoh Corporation, Japan）、水中においてSephadex（登録商標）G-10およびG-25のような樹脂を用いるゲル浸透クロマトグラフィー；水、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ-プロパノール、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、メチレンクロリド、クロロホルム、酢酸エチル、石油エーテル、ベンゼンおよびトルエンのような２種以上の溶媒から作成した二相性の溶出系を用いる向流クロマトグラフィーを使用することができる。これらの技術は、繰り返し、または別の技術と組み合わせて使用できる。好ましい方法は Toyopearl（登録商標）上でのクロマトグラフィーついで改良シリカゲル（RP-18）上での逆相クロマトグラフィーである。
【００１４】
化合物ムンバイスタチンは、医薬的に許容される塩および誘導体、たとえばエステルおよびエーテルならびに他の自明の化学的均等物に変換することが可能であり、これらはすべて本発明の範囲に包含される。本発明はまた、それら自体は医薬としての使用に適当ではないが、医薬的に許容される塩および誘導体の製造における中間体として使用できるすべてのムンバイスタチンの塩および誘導体も包含する。本発明は、すべての立体異性型および互変異性型のムンバイスタチンならびにその塩および誘導体を包含する。塩および誘導体は、本技術分野の熟練者には既知の標準操作を用いて製造することができる。たとえば、ナトリウムおよびカリウム塩のような塩は、ムンバイスタチンを適当なナトリウムおよびカリウム塩基で処理して製造することができる。エステルはムンバイスタチンをカルボン酸とジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）の存在下に反応させるか、またはその化合物をアシル化剤たとえば酸クロリドで処理して製造することができる。エステルを製造する他の方法は文献たとえば J. March, Advanced OrganicSynthesis, ４版，John Wiley & Sons, 1992 に記載されている。
【００１５】
本発明に含まれるムンバイスタチンのエステルには、分子内エステルすなわちラクトンが包含される。本発明の主題としてとくに取り上げられる化合物は、Ｌ970860と命名された化合物ならびにその医薬的に許容される塩および誘導体のすべての立体異性型および互変異性型である。化合物Ｌ970860 は、ムンバイスタチンのトルフルオロ酢酸処理により得られる。それは分子式Ｃ28Ｈ18Ｏ11を有し、下記に示した物理化学的およびスペクトル的性質の1つ以上、例えば、図７の1Ｈ ＮＭＲスペクトルに示した1Ｈ ＮＭＲスペクトル分析データおよび図８の13Ｃ ＮＭＲスペクトルに示した13Ｃ ＮＭＲスペクトル分析データを特徴とする。Ｌ970860を与えるムンバイスタチンのラクトン化は、ムンバイスタチンの単離または精製に使用することができる。
【００１６】
エーテルは、たとえばムンバイスタチンから、塩基性条件下におけるアルキル化剤との反応によって製造することができる。エーテルの他の製造方法は、文献たとえば、J. March, Advanced Organic Synthesis, ４版，John Wiley & Sons, 1992 に記載されている。
【００１７】
ムンバイスタチンは、ラット肝ミクロソームのグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼを強力に阻害する。薬理学試験で得られた結果を、以下に示す。すなわち、ムンバイスタチンならびにその医薬的に許容される塩および誘導体は、医薬の活性成分としてとくに糖尿病の治療に有用であり、さらに一般的にはグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの活性の上昇により引き起こされるかもしくはそれに伴う状態、またはグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼ活性の低下が意図される状態の治療または予防に有用である。ムンバイスタチンならびにその医薬的に許容される塩および誘導体は、動物、好ましくは哺乳動物、とくにヒトに、それ自体で、他の医薬と混合して、および経口または非経口的投与が可能な医薬組成物として投与することができる。したがって、本発明はまた、医薬として使用するためのムンバイスタチンならびにその医薬的に許容される塩および誘導体、およびグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼ活性を低下させるための医薬、とくに糖尿病の治療用医薬の製造におけるムンバイスタチンならびにその医薬的に許容される塩および誘導体の使用に関する。本発明はさらに、ムンバイスタチンおよび／または１種もしくは２種以上のその医薬的に許容される塩および／またはその誘導体の有効量を医薬的に許容される担体とともに含有する医薬組成物に関する。
【００１８】
ムンバイスタチンは、経口的に、筋肉内に、静脈内に、または他の投与様式で投与することができる。ムンバイスタチンまたはその医薬的に許容される塩もしくは誘導体を含有する医薬組成物は、単独でまたは配合して、この化合物を１種または２種以上の医薬的に許容される賦形剤および／または補助剤、たとえば充填剤、乳化剤、滑沢剤、遮蔽フレーバー、着色剤または緩衝物質と混合し、この混合物を適当な医薬剤形たとえば錠剤、コート錠、カプセルまたは経口または非経口投与に適当な懸濁剤もしくは溶液に変換することにより製造することができる。
【００１９】
上述の補助剤および／または賦形剤の例としては、デンプン、トラガントゴム、ラクトース、タルク、寒天、ポリグリコール、エタノールおよび水を挙げることができる。水への懸濁剤または溶液が、非経口投与には適当であり、好ましい。活性物質はそのまま、ビヒクルまたは希釈剤を使用しないで適当な剤形、たとえばカプセルとして投与することも可能である。ムンバイスタチンまたはその医薬的に許容される塩もしくは誘導体からなる医薬組成物にはまた、他の医薬活性成分を添加してもよい。
【００２０】
慣例的に、特定の場合に適当な公定処方および投与方法ならびに用量範囲は、治療される種およびそれぞれの症状または疾患の状態に依存し、本技術分野で知られている方法を用いて至適化される。
【００２１】
医薬的に活性な成分の場合とは別に、誘導体の製造の場合の中間体として、ムンバイスタチンならびにその塩および誘導体はまた、診断の目的たとえばインビトロ診断において、およびグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害を追求する研究目的での生化学的研究において、補助剤としても使用することができる。
【００２２】
【実施例】
以下の実施例は、本発明を例示するものであり、その範囲を限定するものではない。
略号：ＭｅＯＨ メタノール；ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド；ＴＦＡ トリフルオロ酢酸。
【００２３】
実施例１
土壌からの培養菌ＨＩＬ−008003の単離
(ａ) 栄養単離培地の組成
コーンスターチ １０.０ｇ
カゼイン １.０ｇ
ペプトン １.０ｇ
酵母エキス １.０ｇ
Ｋ2ＨＰＯ4 ０.５ｇ
寒天粉末 １３.０ｇ
鉱物質除去水 １.０ litre
ｐＨ ７.５
【００２４】
(ｂ) 土壌のプレーティングおよび単離
２５０mlのエルレンマイヤーフラスコに、インド、MaharashtraのAmboli付近におけるHiranyakeshiの河床から収集した土壌１０ｇを取り、これに滅菌した鉱物質除去水９０mlを加えて、２時間ロータリーシェーカー上で振盪した（２２０rpm）。上述の土壌懸濁液をついで１０から１０-5までの段階に系列希釈した。最後の希釈液から、１mlの懸濁液を滅菌ガラスペトリ皿（直径１５cm）の中央に置き、抗菌剤としてアンフォテリシンＢ ２５μg／mlを補充した上記単離メジウム約５０mlを注いだ。このメジウムは注加する前に４５℃に冷却し、プレートを完全に回転させた。土壌懸濁液およびメジウムの混合物を、放置して沈積させ、２８℃（±１℃）で７日間インキュベートした。ペトリプレートを周期的に観察して、微生物培養菌ＨＩＬ−008003（培養菌Ｙ−9645974）を増殖する微生物中から単離した。
【００２５】
実施例２
培養菌ＨＩＬ−008003 の維持
培養菌ＨＩＬ-008003 は以下のメジウム上で維持した。
モルトエキス １０.０ｇ
酵母エキス ４.０ｇ
グルコース ４.０ｇ
寒天粉末 １３.０ｇ
鉱物質除去水 １.０litre
ｐＨ ７.０
上述の成分を加熱して完全に溶解したのちに、それを試験管に分配し、ついで１２１℃で２０分間滅菌した。ついで試験管を冷却し、傾斜した位置で放置して固化させた。傾斜寒天を、針金ループにより、増殖した培養菌ＨＩＬ−008003を画線培養し、良好な増殖が観察されるまで２８℃（±１℃）でインキュベートした。よく増殖した培養菌は冷蔵庫内に８℃で保存した。
【００２６】
実施例３
振盪フラスコ中における培養菌ＨＩＬ−008003の発酵
種メジウムの組成
グルコース １５.０ｇ
大豆ミール １５.０ｇ
コーンスティープリカー ５.０ｇ
ＮaＣl ５.０ｇ
ＣaＣＯ3 ２.０ｇ
鉱物質除去水 １.０litre
ｐＨ ７.０
上記種メジウムを５００mlのエルレンマイヤーフラスコ中に８０ml量ずつ分配し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。フラスコを室温に冷却し、ついで各フラスコに、実施例２に上述したよく増殖した培養菌ループ１杯を接種し、ロータリーシェーカー上２７℃（±１℃）で７２時間、種培養菌が得られるまで２４０rpmで振盪した。
【００２７】
製造メジウムの組成
グルコース ２０.０ｇ
大豆ミール １０.０ｇ
ＣaＣＯ3 ０.２ｇ
塩化コバルト ０.００１ｇ
鉱物質除去水 １.０litre
ｐＨ ７.０
製造メジウムを５００mlのエルレンマイヤーフラスコ中に６０ml量ずつ分配し、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理した。フラスコを室温に冷却し、ついで上述の種培養菌（１％v/v）を接種した。発酵はロータリーシェーカー上温度 ２７℃（±１℃）で４０〜４８時間、２４０rpmで実施した。
【００２８】
ムンバイスタチンの産生は、グルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害を測定してモニターした。収穫後、培養ブロスを遠心分離し、ムンバイスタチンを培養ろ液から単離し、実施例５に記載するようにして精製した。
【００２９】
実施例４
ファーメンター中における培養菌ＨＩＬ−008003の発酵
段階１：振盪フラスコ中種培養菌の調製
実施例３の種メジウムを１Ｌのエルレンマイヤーフラスコ中に１６０ml量ずつ分配し、２０分間オートクレーブ処理した。これらのフラスコ中で実施例３に記載したように種培養菌を増殖させた。
【００３０】
段階２：ファーメンターにおける種培養菌の調製
実施例３に記載したように、１００ＬのMarubishiファーメンター中８０Ｌの種メジウムをインシトゥで１２１℃において２０分間滅菌し、２７℃±１℃に冷却し、上述の種培養菌４.５Ｌを接種した。
発酵は以下のパラメーターで実施した。
温度 ２７℃（±０.５℃）
撹拌 ８０rpm
通気 ５０lpm
収穫時間 ２４時間
【００３１】
段階３：大規模発酵
１０００ＬのMarubishiファーメンター中で、実施例３に記載の７００Ｌの製造メジウムを、消泡剤としてのDesmophen（登録商標、ポリプロピレンオキシド）１５０mlとともにインシトゥにおいて１２１℃で４５分間滅菌し、２７℃±１℃に冷却し、段階２からの種培養菌７５Ｌを接種した。
発酵は以下のパラメーターで実施した。
温度 ２７℃（±０.５℃）
撹拌 ５０rpm
通気 ４５０lpm
収穫時間 ４０〜４４時間
化合物の産生はグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害を測定してモニターした。発酵を停止したときの培養ブロスのｐＨは６.０〜７.０であった。収穫後、培養ブロスを遠心分離し、以下の実施例５に記載するように、グルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼ阻害剤、ムンバイスタチンを培養ろ液から単離した。
【００３２】
実施例５
ムンバイスタチンの単離および精製
約１０００Ｌの培養ブロスを収穫し、菌糸体（１２kg）から遠心分離によって分離した。所望の化合物、ムンバイスタチンは主として培養ろ液中に存在することが見いだされた。培養ろ液（７３０Ｌ）をDiaion（登録商標）ＨＰ−２０（２８Ｌ，３〜４％v/v）のカラムを通過させた。カラムを鉱物質除去水（２５０Ｌ）で完全に洗浄し、ついで水中ＭｅＯＨの段階勾配によって溶出した。すなわち、溶出は１０％ＭｅＯＨ（１２０Ｌ）および４０％ＭｅＯＨ（３００Ｌ）で行った。１５Ｌサイズで分画を収集した。４０％ＭｅＯＨで得られた活性な溶出液（１５×１６Ｌ）を合わせて、１０〜１００mmHgの減圧下、３５℃で濃縮し、凍結乾燥すると、ＩＣ50 ５μg／mlを示す２４０ｇの活性な粗製物質が生成した。
【００３３】
粗製の物質（２４０ｇ）を第二のＨＰ−２０カラムを通過させた。このカラムを鉱物質除去水（１５０Ｌ）で完全に洗浄し、ついで水中ＭｅＯＨの段階勾配によって溶出した。すなわち、溶出は２０％ＭｅＯＨ（８０Ｌ）および４０％ＭｅＯＨ（１００Ｌ）で行った。それぞれ１０Ｌサイズおよび２Ｌサイズで分画を収集した。４０％ＭｅＯＨで得られた活性な溶出液（２×３０Ｌ）を合わせて、１０〜１００mmHgの減圧下、３５℃で濃縮し、凍結乾燥すると、ＩＣ50 １μg／mlを示す２０ｇの濃縮された物質が生成した。
【００３４】
このようにして得られた濃縮物質を、様々な基質対ゲル比で Sephadex（登録商標）ＬＨ−２０上、２連続ゲル浸透クロマトグラフィーによって精製した。すなわち、上述の濃縮された物質を、各５ｇの４ロットとして別個に、４cm×１２０cmのガラスカラム中に充填したSephadex（登録商標）ＬＨ−２０（１.５Ｌ）を通過させた。移動相は水とし、流速は２.５ml／分に維持した。２５mlサイズで分画を収集した。活性な溶出液は０.１％ＴＦＡ水溶液〜ＣＨ3ＣＮの勾配を用い、２０分間、流速１ml／分でLichrocart（登録商標）１００ ＲＰ−１８（２５０mm×４mm）カラム上ＨＰＬＣによってモニターし、２７０nmで検出した。所望の成分を含む活性溶出液をプールし、１０〜１００mmHgの減圧下３５℃で濃縮し、凍結乾燥すると、ＩＣ50 ０.１〜０.３μｇ／mlを示す高度に濃縮された物質１ｇが得られた。
【００３５】
上記物質はさらにそれぞれ５００mgの２ロットをガラスカラム（２.５cm×１１０cm）中に充填したSephadex（登録商標）ＬＨ−２０に通過させて精製した。移動相は水とし、流速は０.５ml／分に維持した。６mlサイズで分画を収集した。分画をＨＰＬＣ（条件は上述）に基づいてプールした。所望の化合物を含む活性分画をプールし、１０〜１００mmHgの減圧下３５℃で濃縮して、凍結乾燥すると、ＩＣ50 ０.０６μg／mlを示す半純粋な化合物１６０mgが得られた。
【００３６】
最後に半純粋な物質をEurosphere（登録商標）１００ Ｃ１８、１０μ（２５０×１６mm）カラム上、分取ＨＰＬＣによって、水中５％メタノール〜水中40％メタノール勾配を用い、３０分で精製した。流速は６ml／分に維持し、純粋なムンバイスタチンを得るため検出は２７０nmで行った（７０mg）。
【００３７】
ムンバイスタチンは、質的に劣った1Ｈ ＮＭＲおよび13Ｃ ＮＭＲスペクトルを与えた。したがって、親化合物、ムンバイスタチンの特性解析は最初は実施例６に記載の方法を用いてムンバイスタチンのＴＦＡによる処理で得られたラクトン、Ｌ970860のスペクトル解析に基づいて行われた。
【００３８】
実施例６
ラクトン、Ｌ970860の製造
メタノール（５ml）に溶解したムンバイスタチン７０mgに０.１％ＴＦＡ（５０ml）を加え、反応混合物を５０℃で１時間加熱した。ついで混合物を１０〜１００mmHgの減圧下３５℃で蒸発乾固した。このようにして得られた反応生成物を分取ＨＰＬＣによりEurosphere（登録商標）１００ Ｃ１８、１０μ（２５０mm×１６mm）カラム上、０.１％ＴＦＡ中３０％ＣＨ3ＣＮ〜０.１％ＴＦＡ中８０％ＣＨ3ＣＮの勾配を用い、流速は６ml／分、２０分で精製して、純粋なＬ970860を得るために検出は２７０nmで行った（５５mg）。
【００３９】
ムンバイスタチンおよびそのラクトンＬ970860の物理化学的な性質およびスペクトル的性質を表１にまとめる。化合物のスペクトル分析データは図２、３および５〜１０に示す。図１〜４はＨＰＬＣクロマトグラムを示す。個々の図の内容は表１に指示する。
【００４０】
【表１】
ムンバイスタチンおよびそのラクトンＬ970860の薬理学的特性
ムンバイスタチンはラット肝ミクロソームのグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの活性を、ＩＣ50約２５nMで強力に阻害する。これに反し、ムンバイスタチンは、界面活性剤で破壊したミクロソーム中のホスファターゼ活性をＩＣ50約＞１００μＭで阻害し、トランスロカーゼへの高度の特異性が指示される。さらに、ムンバイスタチンは、ホスフェート／ピロホスフェートトランスロカーゼの活性には影響しなかった。ムンバイスタチンはグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの可逆性競合的阻害剤である。
【００４２】
ムンバイスタチンはさらに、単離ラット肝細胞において、グルコースの排出に対する作用を評価した。それは、フルクトース誘発糖新生およびグルカゴン誘発グリコーゲンの加水分解をそれぞれ、約０.３μＭおよび０.６μＭのＩＣ50値で阻害する。
【００４３】
Ｌ970860は、ラット肝ミクロソームのグルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの活性を、約１.８μＭのＩＣ50で阻害する。
【００４４】
【表２】
【表３】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ムンバイスタチンの高速液体クロマトグラフィーにおける溶出を示す図である。
【図２】 ムンバイスタチンのＵＶ吸収を示す図である。
【図３】 ムンバイスタチンのＩＲ（Ｂｒ）を示す図である。
【図４】 Ｌ970860の高速液体クロマトグラフィーにおける溶出を示す図である。
【図５】 Ｌ970860のＵＶ吸収を示す図である。
【図６】 Ｌ970860のＩＲ（Ｂｒ）を示す図である。
【図７】 Ｌ970860の1Ｈ ＮＭＲ(３００MHz，Ｄ4−ＤＭＳＯ)を示す図である。
【図８】 Ｌ970860の13Ｃ ＮＭＲ(７５MHz，Ｄ6−ＤＭＳＯ)を示す図である。
【図９】 ムンバイスタチンの1Ｈ ＮＭＲ(６００MHz，Ｄ4−ＭｅＯＨ，２７℃)を示す図である。
【図１０】 ムンバイスタチン13Ｃ ＮＭＲ(１５０MHz，Ｄ4−ＭｅＯＨ，２７℃)を示す図である。
Claims (10)
- その1Ｈ ＮＭＲスペクトル（図９）およびその13Ｃ ＮＭＲスペクトル（図10）によって特徴づけられる分子式Ｃ28Ｈ20Ｏ12の化合物のすべての立体異性体および互変異性体型におけるムンバイスタチン、またはその医薬的に許容される塩。
- 炭素源および窒素源を含有する栄養培地中、好気条件下における微生物ストレプトマイセス種ＨＩＬ−008003（ＤＳＭ 11641）の培養、その後の慣用方法による単離および精製により得られる、分子式Ｃ28Ｈ20Ｏ12の化合物のすべての立体異性体および互変異性体型における、請求項１記載のムンバイスタチンまたはその医薬的に許容される塩。
- その1Ｈ ＮＭＲスペクトル（図７）およびその13Ｃ ＮＭＲスペクトル（図８）によって特徴づけられる分子式Ｃ28Ｈ18Ｏ11の化合物のすべての立体異性体および互変異性体型におけるラクトンＬ970860、またはその医薬的に許容される塩。
- 請求項１または２記載のムンバイスタチンもしくは請求項３記載のラクトンＬ970860、またはそれらの塩の製造方法において、炭素源および窒素源を含有する栄養培地中、好気条件下における微生物ストレプトマイセス種ＨＩＬ−008003（ＤＳＭ 11641）の培養、その後の慣用方法によるムンバイスタチンの単離および精製からなる方法。
- ストレプトマイセス種ＨＩＬ−008003（ＤＳＭ 11641）。
- 医薬として使用するための請求項１または２記載のムンバイスタチンもしくは請求項３記載のラクトンＬ970860またはそれらの医薬的に許容される塩。
- 請求項１または２記載のムンバイスタチンもしくは請求項３記載のラクトンＬ970860またはそれらの医薬的に許容される塩の有効量および医薬的に許容される担体からなる医薬組成物。
- グルコース−６−ホスフェートトランスロカーゼの阻害剤として使用するための請求項１または２記載のムンバイスタチンもしくは請求項３記載のラクトンＬ970860またはそれらの医薬的に許容される塩。
- 糖尿病の治療において使用するための請求項１または２記載のムンバイスタチンもしくは請求項３記載のラクトンＬ970860またはそれらの医薬的に許容される塩。
- 前記ラクトンＬ970860またはそれらの塩への変換をさらに含む、請求項４記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98111636 | 1998-06-24 | ||
| EP98111636.1 | 1998-06-24 | ||
| PCT/EP1999/004127 WO1999067408A1 (en) | 1998-06-24 | 1999-06-15 | Mumbaistatin, a process for its production and its use as a pharmaceutical |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002518057A JP2002518057A (ja) | 2002-06-25 |
| JP4287593B2 true JP4287593B2 (ja) | 2009-07-01 |
Family
ID=8232164
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000556048A Expired - Fee Related JP4287593B2 (ja) | 1998-06-24 | 1999-06-15 | ムンバイスタチン、その製造法およびその医薬としての使用 |
Country Status (17)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6297043B1 (ja) |
| EP (1) | EP1090136B1 (ja) |
| JP (1) | JP4287593B2 (ja) |
| KR (1) | KR20010071564A (ja) |
| CN (1) | CN1306580A (ja) |
| AR (1) | AR020328A1 (ja) |
| AT (1) | ATE328103T1 (ja) |
| AU (1) | AU750509B2 (ja) |
| BR (1) | BR9912200A (ja) |
| CA (1) | CA2336135A1 (ja) |
| DE (1) | DE69931633T2 (ja) |
| HU (1) | HUP0102370A3 (ja) |
| ID (1) | ID27411A (ja) |
| PL (1) | PL345192A1 (ja) |
| RU (1) | RU2221870C2 (ja) |
| TR (1) | TR200003570T2 (ja) |
| WO (1) | WO1999067408A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EE200200216A (et) * | 1999-10-25 | 2003-06-16 | Aventis Pharma Deutschland Gmbh | Aromaatsed diketoderivaadid, nende valmistamismeetodid ja farmatseutiline kompositsioon |
| US7659102B2 (en) | 2001-02-21 | 2010-02-09 | Verenium Corporation | Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| JP2004533220A (ja) | 2001-02-21 | 2004-11-04 | ディヴァーサ コーポレイション | αアミラーゼ活性を有する酵素及びその使用方法 |
| WO2004042006A2 (en) | 2002-10-31 | 2004-05-21 | Diversa Corporation | Amylases, nucleic acids encoding them and methods for making and using them |
| JP6465299B2 (ja) * | 2015-05-29 | 2019-02-06 | 株式会社山田養蜂場本社 | 蜂蜜画分 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3905942A (en) | 1973-06-22 | 1975-09-16 | Gen Electric | Method for making polyetherimides and products produced thereby |
| DE2429648A1 (de) * | 1973-06-22 | 1975-01-16 | Gen Electric | Verfahren zum herstellen von polyaetherimiden |
-
1999
- 1999-06-15 WO PCT/EP1999/004127 patent/WO1999067408A1/en not_active Application Discontinuation
- 1999-06-15 BR BR9912200-6A patent/BR9912200A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-06-15 EP EP99927987A patent/EP1090136B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-15 CA CA002336135A patent/CA2336135A1/en not_active Abandoned
- 1999-06-15 CN CN99807685A patent/CN1306580A/zh active Pending
- 1999-06-15 PL PL99345192A patent/PL345192A1/xx unknown
- 1999-06-15 TR TR2000/03570T patent/TR200003570T2/xx unknown
- 1999-06-15 KR KR1020007014590A patent/KR20010071564A/ko not_active Application Discontinuation
- 1999-06-15 AT AT99927987T patent/ATE328103T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-06-15 ID IDW20002718A patent/ID27411A/id unknown
- 1999-06-15 AU AU45137/99A patent/AU750509B2/en not_active Ceased
- 1999-06-15 RU RU2001102052/13A patent/RU2221870C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-06-15 HU HU0102370A patent/HUP0102370A3/hu unknown
- 1999-06-15 DE DE69931633T patent/DE69931633T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-06-15 JP JP2000556048A patent/JP4287593B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-22 AR ARP990102990A patent/AR020328A1/es unknown
- 1999-06-23 US US09/338,601 patent/US6297043B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6297043B1 (en) | 2001-10-02 |
| ID27411A (id) | 2001-04-05 |
| AR020328A1 (es) | 2002-05-08 |
| BR9912200A (pt) | 2001-11-20 |
| HUP0102370A3 (en) | 2003-10-28 |
| EP1090136B1 (en) | 2006-05-31 |
| ATE328103T1 (de) | 2006-06-15 |
| KR20010071564A (ko) | 2001-07-28 |
| RU2221870C2 (ru) | 2004-01-20 |
| WO1999067408A1 (en) | 1999-12-29 |
| TR200003570T2 (tr) | 2001-04-20 |
| CN1306580A (zh) | 2001-08-01 |
| HUP0102370A2 (hu) | 2001-10-28 |
| PL345192A1 (en) | 2001-12-03 |
| AU4513799A (en) | 2000-01-10 |
| AU750509B2 (en) | 2002-07-18 |
| DE69931633D1 (de) | 2006-07-06 |
| CA2336135A1 (en) | 1999-12-29 |
| JP2002518057A (ja) | 2002-06-25 |
| DE69931633T2 (de) | 2007-05-10 |
| EP1090136A1 (en) | 2001-04-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1274698B1 (en) | Percyquinnin, a process for its production and its use as a pharmaceutical | |
| JPH0764872B2 (ja) | Ｆｒ９０１２２８物質およびその製造法 | |
| KR940000759B1 (ko) | 신규 글리코펩티드계 항생물질의 제조방법 | |
| JP4287593B2 (ja) | ムンバイスタチン、その製造法およびその医薬としての使用 | |
| JP5038572B2 (ja) | シクリポスチン類、その製造方法およびその使用方法 | |
| JPH0256443A (ja) | ストレプトミセス属の菌種からの新規なアングサイクリノンおよびその製法 | |
| EP1129208B1 (en) | Vancoresmycin, a process for its production and its use as a pharmaceutical | |
| US5100921A (en) | Angucyclinones from streptomycetes, a process for the preparation thereof, and the use thereof | |
| JPH11501626A (ja) | 抗腫瘍イソクマリン類 | |
| EP0818464B1 (en) | Methylsulfomycin l, a process for its production and its use | |
| JP3993643B2 (ja) | コダイスタチンａ、ｂ、ｃおよびｄ、これらの化合物の製法および使用 | |
| WO1999055896A1 (en) | A new glucose-6-phosphate translocase inhibitor l 970885 from an actinomycete sp., and chemical derivatives thereof, a process for the preparation and their use as pharmaceuticals | |
| MXPA00011165A (es) | Mumbaistatin, un proceso para su produccion y su empleo como un producto farmaceutico | |
| JPH05155888A (ja) | 新規な抗生物質およびそれらの製造 | |
| WO1999055895A1 (en) | A new glucose-6-phosphate translocase inhibitor l 970871 from an actinomycete sp., and chemical derivatives thereof, a process for the preparation and their use as pharmaceuticals | |
| US5430050A (en) | Hispidospermidin | |
| US7060821B2 (en) | Osteoclast differentiation inhibitors | |
| CA2008628C (en) | Substance uct-1003 and process for producing the same | |
| MXPA99009355A (en) | Kodaistatins a, b, c and d, a process for their production and their use | |
| CZ20004841A3 (cs) | Mumbaistatin, způsob jeho přípravy a použití mumbaistatinu jako léčiva |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060609 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20081118 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090128 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090303 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090327 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120403 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120403 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130403 Year of fee payment: 4 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |