JP5038572B2 - シクリポスチン類、その製造方法およびその使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、ストレプトマイセス属の種 HAG 004107 (DSM 13381) の培養により得られるシクリポスチン類と呼ばれる新規な化合物、およびその生理的に許容される塩および化学的等価物に関する。本発明はさらに、シクリポスチン類の製造方法、微生物ストレプトマイセス属の種 HAG 004107 (DSM 13381)、シクリポスチン類およびその生理的に許容される塩および化学的等価物の、医薬として、特にリパーゼの阻害剤としての使用、およびシクリポスチン類またはその生理的に許容される塩または化学的等価物を含む医薬調製物に関する。
【0002】
リパーゼ阻害剤で特に有利に処置できる疾患は糖疾患すなわち糖尿病である。糖尿病は慢性代謝異常のために上昇した血糖濃度を特徴とする状態である。この代謝異常はインスリン欠乏または低下したインスリン作用に基づいている。不足したインスリン作用は、血中に吸収されたグルコースを体細胞が利用するのを不完全にする。このため、またタンパク質からのグルコースの新生(糖新生)のために、血中グルコースレベルが上昇する。さらに、脂肪組織中でのインスリン作用が低下した場合に、グルカゴンのようなインスリン拮抗性ホルモンは上昇した脂肪分解、従って高まった血中脂肪酸濃度を生じさせる。ケトアシドーシス、すなわち増加したケトン体(酢酸、β−ヒドロキシ酪酸、アセトン)の形成が起こる。急性状態では、生化学的調節不全の程度は生命を脅かし、処置しないと糖尿病性昏睡に至り、最終的には急速な死に至る。糖尿病は最も頻発するヒトの慢性代謝異常であり、そして3%を超える人口までもが糖尿病性または前糖尿病性の素因を有するので、重大な脅威にさらされていると推測される。従って、糖尿病の処置または治癒のための薬剤が要求されている。
【0003】
糖尿病はインスリンの投与により処置され、成人発症型糖尿病、いわゆるインスリン非依存型(NIDDM)またはII型の糖尿病では、スルホニル尿素が最初に投与される。スルホニル尿素の作用原理は、ホルモン欠乏またはインスリン抵抗性を補償するために膵臓のβ−細胞のインスリン分泌を急増させることである。しかしながら、状態が進行すると、インスリンも使用する必要がある。インスリンの作用は下記のようにまとめることができる。このペプチドホルモンは血中グルコース濃度を低下させ、そして同化作用過程の上昇と同時に異化作用過程の阻害を生じさせる:
・ それは体細胞中でのグルコース輸送を増加させ、
・ それは肝臓中および筋肉中でのグリコーゲン形成を増加させ、
・ それは脂肪分解を阻害し、
・ それは脂肪組織中への脂肪酸の吸収を増加させ、そして
・ それは体細胞中へのアミノ酸の吸収およびタンパク質合成を増加させる。
【0004】
インスリンの最も強い効果の一つは脂肪分解を阻害することである。II型糖尿病の場合、この脂肪分解の調節はもはや有効でなく、そして血中遊離脂肪酸レベルの上昇が生じる。血中遊離脂肪酸は肝臓中での糖新生を刺激し、骨格筋中でのグルコースの利用を減少させる。脂肪分解、すなわち、いわゆるホルモン感受性リパーゼ(HSL)(これは脂肪細胞中に存在しており、そしてリン酸化カスケードによってインスリンで阻害される)による脂肪酸の放出がコントロールされる。従ってインスリン作用を刺激し、そして血中脂質レベルを低下させることのできる阻害剤、すなわちHSLの阻害剤が望ましいであろう。このような薬剤は、脂質代謝をコントロールするためにII型糖尿病を処置するのに適しているが、他の貯蔵障害に適用することも可能であろう。これらの理由で、HSLおよび他のリパーゼの新規な阻害剤が至急に必要であり、従って追求されている。
【0005】
本発明者らは驚くべきことに、微生物株ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 が、極めて低い濃度においてさえも、ホルモン感受性リパーゼを阻害する高度に活性な新規リパーゼ阻害剤を形成しうることを見出した。これらの新規な天然化合物は、二重環系(二環)および置換された炭素鎖からなり、そしてリパーゼを特異的に阻害する有機リン酸エステルである。この環構造は、R. Neumann & H. H. Peter により Experientia, 第43巻, 1235-1237頁, 1987 にアセチルコリンエステラーゼ阻害剤 CGA 134 736 として―炭素鎖の代わりにメチル基だけを有する―最初に記載され、そしてのちにシクロポスチンと命名された同じ化合物が T. Kurokawa らにより J. Antibiotics, 46, 1315-1318,1993 に記載された。この構造的に関連する化合物は選択的リパーゼ阻害特性を有しない。これまで公知の物質は、不満足な作用レベル、高い毒性および/または望ましくない副作用として示される欠点を有する。
【0006】
従って本発明は、式I
【化2】
[式中、
R1は
1. 直鎖状、分枝状、飽和または不飽和の炭素環式またはヘテロ環式であってもよい2〜30個の炭素原子を有する炭素鎖であり、この炭素鎖は場合により
1.1 −OH、
1.2 =O、
1.3 −O−C1〜C6−アルキル(アルキルは線状または分枝状である)、
1.4 −O−C2〜C6−アルケニル(アルケニルは線状または分枝状である)、
1.5 −C1〜C6−アルキル(アルキルは線状または分枝状である)、
1.6 −アリール、
1.7 −C1〜C6−アルキルベンゼン、
1.8 −ジフェニル、
1.9 −NH−C1〜C6−アルキル(アルキルは線状または分枝状である)、
【0007】
1.10 −NH−C2〜C6−アルケニル(アルケニルは線状または分枝状である)、
1.11 −NH2、
1.12 =S、
1.13 −S−C1〜C6−アルキル(アルキルは線状または分枝状である)、
1.14 −S−C2〜C6−アルケニル(アルケニルは線状または分枝状である)、
1.15 ハロゲン、
で一置換または二置換されており、
ここで、置換基 1.1〜1.15 もさらに置換されていてもよく、または
2. −[−アリール−(CH2)n]m( −[−アリール−(CH2)n]m は非置換であるか、または 1.1〜1.15 に記載したように一置換または二置換されており、nおよびmは互いに独立して、0、1、2または3の整数である)であり;
【0008】
R2は
1. C1〜C6−アルキル(アルキルは非置換であるか、または 1.1〜1.15 に記載したように一置換または二置換されている)、
2. C2〜C6−アルケニル(アルケニルは非置換であるか、または 1.1〜1.15 に記載したように一置換または二置換されている)、または
3. C2〜C6−アルキニル(アルキニルは非置換であるか、または 1.1〜1.15 に記載したように一置換または二置換されている)であり、
Eはリン(P)または硫黄(S)原子であり、
X1、X2およびX3は互いに独立して、
1. −O−、
2. −NH−、
3. −N=、
4. −S−、または
5. −CH2−、および−CHR2である]
の化合物、それらの全ての立体化学的形態およびこれらの形態の任意の比率の混合物、およびそれらの生理的に許容される塩および化学的等価物に関する。
【0009】
R1は好ましくは6〜24個の炭素原子、極めて好ましくは10〜18個の炭素原子の鎖長を有する。この鎖は、飽和、例えば−アルキル(アルキルは線状でも分枝状でもよい)、または不飽和、例えば−アルケニルまたは−アルキニル(アルケニルまたはアルキニルは線状でも分枝状でもよい)であってよい。R1は非置換であるか、または上記のように基 1.1〜1.15 で同様または別様に一置換または二置換されていてもよい。炭素原子8′〜16′上の置換基が好ましく、10′〜14′位が特に好ましい。置換基 1.1〜1.15 も、さらにアルコール、アルデヒド、アセタール、ケタール、エーテル、カルボキシル、エステル、アミノ、ニトリル、ニトロ、オキシム、オキシエーテルおよびハロゲンから選択される1個またはそれ以上の基で置換されていてもよい。
【0010】
2〜30個の炭素原子を有するカルボン酸炭素鎖は、1個またはそれ以上、好ましくは1個、2個または3個の環系を有する2〜30個の炭素原子を有する鎖であり、これは好ましくはそれぞれの場合に4個、5個、6個または7個の炭素原子からなる。この環は単環式、二環式または三環式、好ましくは単環式であってよく、そして炭素鎖の最初、中央および/または末端に位置していてよい。炭素環は脂肪族または芳香族の性質のものであってよい。その例は:置換されたジフェニルまたはアルキルベンゼンである。
【0011】
2〜30個の炭素原子を有するヘテロ環式炭素鎖は、少なくとも1個の炭素原子がO、SまたはNのようなヘテロ原子で置き換えられた1個またはそれ以上、好ましくは1〜3個の環系を有する2〜30個の炭素原子からなる鎖である。これらの環は単環式、二環式または三環式、好ましくは単環式であってよく、そして炭素鎖の最初、中央および/または末端に存在していてよい。これらは好ましくは4員、5員、6員または7員の環であってよく、これらの環は脂肪族または芳香族の性質のものである。その例は:置換されているかまたは非置換のアルキルピペリジンである。
【0012】
アリールは、6〜14個、好ましくは6〜10個の炭素原子を有する芳香族の環または環系、例えば場合により置換されたアルキルフェノールまたはアルキルナフトールである。
ハロゲンは塩素、臭素、フッ素またはプゾイドハライド、例えばシアニド(ニトリル)である。
【0013】
−C1〜C6−アルキルは、1個、2個、3個、4個、5個または6個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状のアルキル、例えばメチル、エチル、i−プロピル、tert−ブチルおよびヘキシルである。
−C2〜C6−アルケニルは、2個、3個、4個、5個または6個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状のアルケニル、例えばアリル、クロチルおよびペンテニルである。
−C2〜C6−アルキニルは、2個、3個、4個、5個または6個の炭素原子を有する直鎖状または分枝状のアルキニル、例えばプロピニル、ブチニルおよびペンチニルである。
【0014】
R1は好ましくは
1. −(CH2)15CH3、
2. −(CH2)13CH(CH3)2、
3. −(CH2)11CH(OH)(CH2)3CH3、
4. −(CH2)11CH(OH)CH2CH(CH3)2、
5. −(CH2)12CH(OH)(CH2)2CH3、
6. −(CH2)13CH(OH)CH2CH3、
7. −(CH2)14CH(OH)CH3、
8. −(CH2)15CH2(OH)、
9. −(CH2)16CH3、または
10.0 −(CH2)13C=OCH2CH3、
11.0 −(CH2)12C=OCH2CH2CH3、
12.0 −(CH2)11C=OCH2CH2CH2CH3、
13.0 −(CH2)13CH3、
14.0 −(CH2)11CH(CH3)2、
15.0 −(CH2)14CH3または
16.0 −(CH2)12CH(CH3)2
である。
R2は好ましくはC1〜C6−アルキル、特にメチル、エチルまたはプロピルである。
【0015】
本発明の好ましい化合物を以下に示す:
式IIのシクリポスチンA:
【化3】
【0016】
式IIAのシクリポスチンA2:
【化4】
【0017】
式IIIのシクリポスチンB:
【化5】
【0018】
式IVのシクリポスチンC:
【化6】
【0019】
式VのシクリポスチンD:
【化7】
【0020】
式VIのシクリポスチンE:
【化8】
【0021】
式VIIのシクリポスチンF:
【化9】
【0022】
式VIIIのシクリポスチンG:
【化10】
【0023】
式IXのシクリポスチンH:
【化11】
【0024】
式XのシクリポスチンN:
【化12】
【0025】
式XIのシクリポスチンP:
【化13】
【0026】
式XIAのシクリポスチンP2:
【化14】
【0027】
式XIIのシクリポスチンQ:
【化15】
【0028】
式XIIIのシクリポスチンR:
【化16】
【0029】
式XIIIAのシクリポスチンR2:
【化17】
【0030】
式XIVのシクリポスチンS:
【化18】
【0031】
式XVのシクリポスチンT:
【化19】
【0032】
式XVAのシクリポスチンT2:
【化20】
それらの全ての立体化学的形態およびこれらの形態の任意の比率の混合物、およびそれらの生理的に許容される塩および化学的等価物。
【0033】
上記の式においてNMRスペクトルのための炭素原子の番号付けの方法は下記のとおりである:
【化21】
【0034】
環系はそれ自体で2個の不斉置換された原子、すなわち炭素原子3およびリン原子を有する。両方の原子はRまたはS立体配置で存在することができる。驚くべきことに、菌株ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 は、それぞれの場合に式Iの化合物の多数の立体異性体を形成できること、すなわちこの菌株は、原子C3およびPが互いに独立して、RまたはS立体配置をとることのできる化合物を合成できることが見出された。炭素(3)においてR立体配置にあり、そしてリンにおいてS立体配置にある空間的形態を有する異性体は、ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 の培養物中に増加した量で生成する。式IA:
【化22】
しかしながら、加えて、他の立体配置、例えば(R,R)、(S,S)または(S,R)を有するシクリポスチン類も形成され、これらも驚くべきことに著しいリパーゼ阻害作用を有する。
【0035】
式Iの化合物またはその生理的に許容される塩または化学的等価物は、微生物ストレプトマイセス属の種 HAG 004107,DSM 13381、またはその変種または突然変異体の一つを、培地中で好適な条件下に、1種またはそれ以上の式Iの化合物が培地中に蓄積するまで発酵させ、次いで該化合物を培地から単離し、場合により該化合物を化学的等価物または生理的に許容される塩に変換することにより製造することができる。
【0036】
本発明に係るシクリポスチン類は放線菌目の種、好ましくはストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 により生成させることができる。ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 はアイボリー色の菌糸体(RAL 1014)を有し、そしてストレプトマイセス科に特有の分生胞子柄を特徴とする。
【0037】
単離物は、ブダペスト条約の規則に従って Deutsche Samlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg 1B, D 38124 Braunschweig, Germany に、2000年3月16日に次の番号で寄託された:ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381。
【0038】
菌株ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 の代わりに、本発明に係るシクリポスチン類の1種またはそれ以上の化合物を合成するその突然変異体および変種を用いることもできる。このような突然変異体は本来公知の方法で、例えば物理的手段、例えば紫外線またはX線での照射によるか、または化学的突然変異誘発物質、例えばメタンスルホン酸エチル(EMS)、2−ヒドロキシ−4−メトキシ−ベンゾフェノン(MOB)または N−メチル−N′−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(MNNG)により生成させることができる。
【0039】
従って本発明は、微生物ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381、またはその変種または突然変異体の一つを、培地中で好適な条件下に、1種またはそれ以上の式Iの化合物が培地中に蓄積するまで発酵させ、次いで該化合物を培地から単離し、場合により該化合物を化学的等価物または生理的に許容される塩に変換することを含むことを特徴する、式Iの化合物またはその生理的に許容される塩の製造方法に関する。
【0040】
好ましくは、菌株ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381、その突然変異体および/または変種を、炭素源および窒素源および慣用の無機塩を含む栄養溶液(培地とも呼ばれる)中で、新規シクリポスチン類が培地中に蓄積するまで発酵させ、次いでこれらのシクリポスチン類を培地から単離し、場合により個々の活性成分に分離する。
【0041】
発酵は好ましくは好気性条件で行われ;発酵は18〜35℃の温度およびpH6〜8において特に良好に進行する。
本発明に係る方法は、実験室的規模(ミリリットルからリットルの範囲)および工業的規模(立方メートル規模)での発酵に用いることができる。全てのパーセントは、別に述べない限り重量に関する。液体の場合の混合比は、他の詳細が与えられていなければ体積に関する。
【0042】
好気性発酵に適する好ましい炭素源は、同化可能な炭水化物および糖アルコール、例えばグルコース、ラクトース、スクロースまたはD−マンニトール、および炭水化物含有天然産物、例えばオートフレーク、ダイズ粉および麦芽エキスである。可能な窒素含有栄養物は:アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質、およびそれらの分解生成物、例えばペプトンまたはトリプトン、さらに肉エキス、酵母エキス、粉砕種子、例えばトウモロコシ、小麦、マメ、ダイズまたはワタの粉砕種子、アルコール製造、肉ミールまたは酵母エキスの蒸留残留物であるが、アンモニウム塩および硝酸塩でもある。栄養溶液が含有しうる無機塩は、例えばアルカリ金属またはアルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバルトおよびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩である。
【0043】
本発明に係る式II〜XVAのシクリポスチン類の形成は、約0.1〜5%、好ましくは0.3〜3%のオートフレークおよび微量元素を含有する培地中で特に良好に進行する。パーセントの詳細は、それぞれの場合に培地全体の重量に対する。
式VIII〜XVAのシクリポスチン類の好ましい形成は、約0.1〜5%、好ましくは0.3〜2%のグリセロール、および0.2〜5%、好ましくは0.5〜3%のダイズミール、および0.05〜1.0g/L、好ましくは0.1〜1.0g/Lの塩化ナトリウムを含有する栄養溶液中で特に容易に行うことができる。
【0044】
培地中でストレプトマイセス属の種 HAG 004107,DSM 13381 はシクリポスチン類の混合物を形成する。培地の組成に応じて、本発明に係るシクリポスチン類の1種またはそれ以上の定量的な量を変動させることができる。さらに、培地組成により、シクリポスチン類の1種またはその代わりに数種が全く製造されないように、または微生物の検出限界より低い量で製造されるように、個々のシクリポスチン類の合成をコントロールすることが可能である。
培養物は好ましくは検出可能なシクリポスチンを含有する。シクリポスチンAまたはPまたはP2が好ましく形成される。
【0045】
シクリポスチンA〜T2(式II〜XVA の化合物)に加えて、他の関連する化合物がストレプトマイセス属の種 HAG 004107,DSM 13381 の培地中で形成され、これらは変更された基R1およびR2によって式II〜XVAで示す化合物とは異なっている。トランケートされている(truncated)か、またはさらに分枝した基R1を有するシクリポスチン類が、より少ない量で検出された。これらの二次成分の酸化(ヒドロキシル化)生成物も、ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 の培養物中に検出できる。
【0046】
微生物の培養は好気性で、すなわち例えば振盪フラスコまたは発酵槽中で浸漬して振盪または撹拌しながら、適切ならば空気または酸素を導入して行われる。培養は約18〜35℃、好ましくは約25〜32℃、特に26〜30℃の温度範囲内で行われる。pH範囲は6〜8、好ましくは6.5〜7.8であるべきである。微生物をこれらの条件下で、一般的に24〜300時間、好ましくは30〜90時間の期間培養する。
【0047】
有利には、培養は多数の段階で行われ、すなわち最初に液体培地中で一つまたはそれ以上の前培養物を製造し、これを次いで実際の製造培地、主培地中に例えば1:10の体積比で接種する。前培養物は、例えば、菌糸体を栄養溶液中に接種し、これを約36〜120時間、好ましくは48〜96時間成長させることにより得られる。菌糸体は、例えば菌株を固体または液体栄養培地、例えば麦芽/酵母/寒天培地またはオートフレーク/寒天培地で約3〜40日間、好ましくは4〜10日間成長させることにより得ることができる。
【0048】
発酵の経過は、培養物のpHまたは菌糸体の体積により、そしてクロマトグラフィー法、例えば薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィーによるか、または生物学的活性の試験によりモニターすることができる。本発明に係るシクリポスチン類は菌糸体中に存在し、より少ない部分は培養物濾液中にも存在する。以下に記載する単離方法は、本発明に係るシクリポスチン類の精製、好ましくはシクリポスチンAおよびPの精製に役立つ。
【0049】
培地からの本発明に係るシクリポスチン類の単離および/または精製は、これらの天然物質の化学的、物理的および生物学的特性を考慮して、公知の方法により行われる。培地中または個々の単離段階のシクリポスチン濃度を試験するためには、例えばシリカゲル上で溶離剤として塩化メチレン/酢酸エチルまたはクロロホルム/メタノール混合物(例えば量比98:1)を用いる薄層クロマトグラフィー、またはHPLCを使用することができる。薄層クロマトグラフィー分離の場合の検出は、例えばモリブデートリン酸またはI2蒸気のような着色試薬により行うことができ、形成された物質の量を好都合には検量溶液と比較する。
【0050】
本発明に係るシクリポスチン類を単離するために、菌糸体を最初に慣用の方法により培地から分離し、次いで有機溶剤(これは場合により水と混和性である)を用いて細胞塊からシクリポスチン類を抽出する。有機溶剤相は本発明に係るシクリポスチン類を含有しており;これらを場合により真空濃縮し、以下に記載するようにさらに精製する。
【0051】
培養物濾液を場合により菌糸体抽出物の濃縮物と一緒にし、好適な水混和性有機溶剤、例えば n−ブタノールまたは酢酸エチルで抽出する。続いて分離した有機相を場合により真空濃縮し、最初の体積の1/30の水/メタノールに溶解する。
【0052】
本発明に係るシクリポスチン類の1種またはそれ以上のさらなる精製は、好適な材料でのクロマトグラフィーにより、好ましくは例えばモレキュラーシーブ、シリカゲル、アルミナのような順相支持体、イオン交換体または吸着剤樹脂、または逆層(逆転相、RP)で行われる。これらのクロマトグラフィー法によりシクリポスチン類を分離する。シクリポスチン類のクロマトグラフィーは有機溶剤を用いて、または水溶液および有機溶液の混合物を用いて行われる。
【0053】
水溶液または有機溶液の混合物は、10〜100%の溶剤、好ましくは60〜90%の溶剤の濃度の全ての水混和性有機溶剤、好ましくはメタノール、プロパノールおよびアセトニトリル、またはその代わりに有機溶剤と混和性である全ての緩衝水溶液を意味すると理解される。用いられる緩衝剤は上記で示したのと同じである。
【0054】
それらの異なる極性に基づくシクリポスチン類の分離は、逆相クロマトグラフィーを用いて、例えば MCI (登録商標)(Mitsubisi, Japan からの吸着剤樹脂)または Amberlite XAD (登録商標)(TOSOHAAS)、他の疎水性材料、例えば RP-8 または RP-18 相で行われる。さらに分離は標準相クロマトグラフィーを用いて、例えばシリカゲル、アルミナなどで行うことができる。
【0055】
シクリポスチン類のクロマトグラフィーは、緩衝水溶液または酸性化水溶液、または水溶液とアルコールまたは他の水混和性有機溶剤との混合物を用いて行われる。用いられる有機溶剤は、好ましくはプロパノールおよびアセトニトリルである。
【0056】
緩衝水溶液または酸性化水溶液は、例えば、水、1mM〜0.5Mの濃度のリン酸塩緩衝剤、酢酸アンモニウム、クエン酸塩緩衝剤、および好ましくは0.01〜3%、特に0.1%のギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸または当業者に公知の全ての市販の酸を意味すると理解される。
【0057】
クロマトグラフィーは、100%水性緩衝剤から始めて100%溶剤で終わる勾配を用いて行われ;好ましくは50〜100%の2−プロパノールまたはアセトニトリルの線形勾配で操作する。
その代わりに、ゲルクロマトグラフィーまたは疎水性相でのクロマトグラフィーを行うこともできる。
【0058】
ゲルクロマトグラフィーはポリアクリルアミドまたは混合重合体ゲル、例えば Biogel-P 2 (登録商標)、Fractogel TSK HW 40 (登録商標)(Merck, Germany または Toso Haas, USA)または Sephadex (登録商標)(Pharmacia, Uppsala, Sweden)で行われる。
上記のクロマトグラフィーの順序は逆にすることができる。
【0059】
シクリポスチン類のための他の極めて効果的な精製段階は結晶化である。シクリポスチン類は有機溶剤中の溶液から、および水と有機溶剤との混合物から結晶化する。結晶化は本来公知の方法で、例えば飽和シクリポスチン溶液の濃縮または冷却により行われる。
本発明に係るシクリポスチン類は固体および液体の状態、および4〜8、特に5〜7のpH範囲の溶液中で安定であり、従って慣用の医薬調製物中に導入することができる。
【0060】
本発明はさらに、式Iの化合物の自明の化学的等価物を含み、これらの等価物は僅かな化学的相違を有し、すなわち同じ活性を有するか、または温和な条件下で本発明に係る化合物に変換できるものである。上記の等価物としては、例えば本発明に係る化合物のエステルおよびエーテル、および酸化、還元および水素化生成物が挙げられる。
エステル、およびエーテル誘導体、酸化生成物、水素化生成物および還元生成物は、文献、例えば“Advanced Organic Synthesis", 第4版, J. March, John Wiley & Sons., 1992 に記載の方法により製造することができる。
【0061】
本発明は式I〜XVAの化合物の全ての立体異性体形態を含む。式I〜XVAの化合物に含まれる不斉中心は、全て互いに独立して、S立体配置またはR立体配置を有することができる。本発明は全ての可能なエナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびに2種またはそれ以上の立体異性体形態の任意の比率の混合物、例えばエナンチオマーおよび/またはジアステレオマーの混合物を含む。従って本発明は、左旋性および右旋性の対掌体の両方としてエナンチオマー的に純粋な形態のエナンチオマー、ラセミ体の形態および2種のエナンチオマーの任意の比率の混合物の形態のRおよびS立体配置に関する。シス/トランス異性が存在する場合、本発明はシス形態およびトランス形態の両方、およびこれらの形態の任意の比率の混合物に関する。
【0062】
それらの価値ある薬理学的特性のために、本発明に係る化合物はヒトの医学および/または獣医学における医薬として使用するのに適している。これらはリパーゼを阻害し、そして脂質代謝の障害に原因がある代謝異常の処置に好ましい特性を有する。本発明に係る式Iの化合物は、脂肪細胞中のアロステリック酵素であるホルモン感受性リパーゼHSL(これはインスリンにより阻害され、そして脂肪細胞中の脂肪の分解、従って血流中への脂肪成分の移動の原因となる)に対する驚くべき阻害作用を有する。従ってこの酵素の阻害は、本発明に係る化合物のインスリン様作用に相当し、この作用は最終的には血中の遊離脂肪酸および血糖の減少を生じさせる。従ってこれらの化合物は、インスリン非依存型糖尿病、糖尿病性症候群および膵臓の直接的損傷におけるような代謝不全に使用することができる。
【0063】
従って本発明は、本発明に係るシクロポスチンおよび/またはその化学的等価物の1種またはそれ以上を含有する医薬調製物に関する。好適な賦形剤または担体材料との混合物として使用することが好ましい。ヒトに使用できる担体材料は、薬理学的に許容される全ての担体材料および/または賦形剤である。
【0064】
本発明はさらに、本発明の化合物の少なくとも1種を、製薬上好適であり生理的に許容される担体、および適切ならば他の好適な活性化合物、添加剤または賦形剤を用いて、好適な投与形態にすることを含むことを特徴とする、本発明に係る医薬の製造方法に関する。
【0065】
本発明に係る医薬は一般的に経口的、局所的または非経口的に投与されるが、直腸内投与も原則として可能である。好ましい固体または液体の医薬調製物形態は、例えば粒剤、粉剤、被覆錠剤、(マイクロ)カプセル、坐剤、シロップ剤、乳剤、懸濁液、エアゾール、ドロップまたはアンプル形態の注射溶液、および活性化合物の放出が遅延された調製物であり、これらの調製物には担体および添加剤および/または賦形剤、例えば崩壊剤、被覆剤、膨潤剤、滑剤または潤滑剤、矯味矯臭剤、甘味料または可溶化剤が普通に用いられる。挙げることのできる頻用される担体または賦形剤は、例えば炭酸マグネシウム、二酸化チタン、乳糖、マンニトールおよび他の糖類、タルク、乳タンパク質、ゼラチン、澱粉、ビタミン類、セルロースおよびその誘導体、動物油または植物油、ポリエチレングリコールおよび溶剤、例えば滅菌水、アルコール、グリセロールおよび多価アルコールである。
【0066】
適切ならば、放出を遅延させるか、または放出をより長期間にわたって延長させるために、例えば粒子形態の活性化合物を被覆するか、または好適な重合体、ワックスなどに埋め込むことにより、用量単位を経口投与のためにマイクロカプセル封入することができる。
【0067】
医薬調製物を製造し、そして用量単位で投与することが好ましく、各単位は活性成分として本発明に係るシクリポスチン類および/またはその化学的誘導体の1種またはそれ以上の化合物の特定用量を含有する。固体の用量単位、例えば錠剤、カプセルおよび坐剤の場合、この用量は、1日当たり約200mgまでであってよいが、好ましくは約0.1〜100mgであってよく、そしてアンプル形態の注射溶液の場合は約200mgまでであってよいが、好ましくは約0.1〜100mgであってよい。
【0068】
投与すべき日用量は哺乳類の体重、年齢、性別および状態に依存する。しかしながら事情によっては、より高いかより低い日用量も適切であろう。日用量の投与は個々の用量単位の形態または多数のより少ない日用量で1回投与するか、または分割した用量を特定間隔で反復投与することによって行われる。
【0069】
本発明はまた、本発明に係るシクリポスチン類および/またはそれらの化学的誘導体の1種またはそれ以上を含有する医薬調製物に関する。好適な賦形剤または担体材料と混合して使用することが好ましい。ヒトの場合、用いられる担体材料は全ての薬理学的に許容される担体材料および/または賦形剤であってよい。
本発明に係る式Iの化合物の作用を下記の酵素試験系について試験した。
【0070】
酵素の調製:
部分精製HSLの調製:
未処理の雄ラット(ウィスター系、220〜250g)の精巣上体脂肪細胞から、出版された手法(例えば S. Nilsson et al., Anal. Biochem. 158, 1986, 399-407; G. Fredrikson et al., J. Biol. Chem. 256, 1981, 6311-6320; H. Tornquist et al., J. Biol. Chem. 251, 1976, 813-819)によりコラゲナーゼ処理することにより、単離ラット脂肪細胞を得る。10匹のラットからの脂肪細胞を、それぞれの場合に50mlの均質化緩衝液(25ml Tris/HCl、pH7.4、0.25Mスクロース、1mM EDTA、1mM DTT、10μg/mlのロイペプチン、10μg/mlのアンチパイン、20μg/mlのペプスタチン)で浮遊させることにより3回洗浄し、最後に10mlの均質化緩衝液に吸収させる。脂肪細胞をテフロン−イン−ガラス製ホモジナイザー(Braun-Melsungen)中で1500rpmおよび15℃で10ストロークにより均質化する。この均質化物を遠心する(Sorvall SM24 管、5000rpm、10分、4℃)。上にある脂肪層とペレットの間の下層を除去し、遠心を繰り返す。これから得られた下層を再び遠心する(Sorvall SM24 管、20000rpm、45分、4℃)。下層を除去し、1gのヘパリン−セファロース(Pharmacia-Biotech、CL-6B、25ml Tris/HCl、pH7.4、150mM NaClで5回洗浄)で処理する。4℃で60分間のインキュベーション(15分間隔で振盪)ののち、バッチを遠心する(Sorvall SM24 管、3000rpm、10分、4℃)。上澄み液を酢酸の添加によりpH5.2にし、4℃で30分間インキュベートする。沈殿物を遠心(Sorvall SS34 管、12000rpm、10分、4℃)により集め、2.5mlの20mM Tris/HCl、pH7.0、1mM EDTA、65mM NaCl、13%のスクロース、1mM DTT、10μg/mlのロイペプチン/ペプスタチン/アンチパインに懸濁させる。この懸濁液を25ml Tris/HCl、pH7.4、50%のグリセロール、1mM DTT、10μg/mlのロイペプチン、ペプスタチン、アンチパインに対して4℃で一夜透析し、次いでヒドロキシアパタイトカラム(1mlの懸濁液当たり0.1g、10mMリン酸カリウム、pH7.0、30%のグリセロール、1mM DTTで平衡化)にかける。カラムを4体積の平衡化緩衝液で20〜30ml/hの流速で洗浄する。HSLを、0.5Mリン酸カリウムを含む1体積の平衡化緩衝液で溶離し、次いで透析し(上記参照)、4℃での限外濾過(Amicon Diaflo PM 10 Filter)により5〜10倍に濃縮する。この部分精製HSLは −70℃で4〜6週間貯蔵できる。
【0071】
アッセイ:
基質を調製するため、25〜50μCiの[3H]トリオレイルグリセロール(トルエン中)、6.8μMolの未標識トリオレイルグリセロールおよび0.6mgのリン脂質(ホスファチジルコリン/ホスファチジルイノシトール3:1w/v)を混合し、N2により乾燥し、次いで2mlの0.1M KPi(pH7.0)中に超音波処理(Branson 250、マイクロチップス、セッティング1〜2、1分間隔で2×1分間)により吸収させる。1mlのKPiを添加し、新たに超音波処理(氷上で30秒間隔で4×30秒間)したのち、1mlの20%BSA(ウシ血清アルブミン)(KPi中)を加える(トリオレイルグリセロールの最終濃度1.7mM)。反応させるため、100μlの基質溶液を100μlのHSL溶液(上記のように調製したHSL、20mM KPi、pH7.0、1mM EDTA、1mM DTT、0.02%BSA、20μg/mlのペプスタチン、10μg/mlのロイペプチンに希釈)にピペットで加え、37℃で30分間インキュベートする。3.25mlのメタノール/クロロホルム/ヘプタン(10:9:7)および1.05mlの0.1M K2CO3、0.1Mホウ酸(pH10.5)を加えたのち、バッチをよく混合し、最後に遠心する(800×g、20分間)。相分離したのち、1当量の上相(1ml)を除去し、放射能を液体シンチレーション測定により決定する。
【0072】
評価:
基質を4つの独立したバッチで慣用法により試験する。試験物質によるHSLの酵素活性の阻害を、非阻害コントロール反応との比較により決定する。IC50値の計算を、試験物質の少なくとも10種の濃度を用いて阻害曲線により行う。データを解析するために、GRAPHIT ソフトウェアパッケージ、Elsevier-BIOSOFTを用いる。
【0073】
この試験において、化合物は下記の作用を示した:
シクリポスチンA、P、P2およびRは、ラット脂肪細胞中での脂肪分解をIC50=〜0.2μMで阻害し、基質としてトリオレイルグリセロールを用いてヒトホルモン感受性リパーゼ(HSL)を:IC50=〜0.07〜0.5μMで阻害する。基質としてNBD(4−クロロ−7−ニトロベンゾ−2−オキサ−1,3−ジアゾール)を用いると、ラットからのHSLを4nM〜10nMの濃度で阻害する。
【0074】
シクリポスチン類はホルモン感受性リパーゼ(HSL)およびラット抽出物のモノアシルグリセロールリパーゼの両方をマイクロモル以下の濃度で阻害する。
本発明を下記の実施例においてさらに説明する。パーセントは重量に関する。液体の場合の混合比は、他の詳細が与えられていないならば体積に関する。
【0075】
【実施例】
実施例1
ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 のグリセロール培養物の製造
300mlの滅菌三角フラスコに入れた100mlの栄養溶液(麦芽エキス2.0%、酵母エキス0.2%、グルコース1.0%、(NH4)2HPO4 0.05%、pH6.0)を、菌株ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 で接種し、回転振盪装置上で28℃および180rpmで7日間インキュベートする。次いで1.5mlのこの培養物を1.5mlの99%濃度のグリセロールで希釈し、−20℃で貯蔵する。
【0076】
実施例2
三角フラスコ中でのストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 の前培養物の製造
次の栄養溶液:15g/Lのグルコース、15g/Lのダイズ粉、5g/Lのコーンスティープ、2g/LのCaCO3および5g/LのNaClを入れた300mlの滅菌三角フラスコを、傾斜試験管(同じ栄養溶液であるが2%の寒天を含む)で成長させた培養物または1mlのグリセロール培養物(実施例1参照)で接種し、振盪装置上で180rpmおよび28℃でインキュベートする。同じ栄養溶液の48〜96時間経過した浸漬培養物(約10%の接種量)が10〜200Lの発酵槽の接種のために充分である。
【0077】
実施例3
三角フラスコ中でのストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381 の培養物の製造
100mlの下記の栄養溶液:
20g/Lのイヌ用オートフレーク
2.5mlの微量元素溶液
を入れた300mlの滅菌三角フラスコを10%の接種量の前培養物(実施例2)で接種し、振盪装置上で180rpmおよび28℃でインキュベートする。この培養物は2日後に、シクリポスチン類を得るため、または発酵槽を接種するために使用できる。微量元素溶液は下記の組成を有する:
3g/LのCaCl2×2H2O;
1g/Lのクエン酸鉄(III) ;
0.2g/LのMnSO4×H2O;
0.1g/LのZnCl2;
0.025g/LのCuSO4×5H2O;
0.02g/Lのテトラホウ酸Na;
0.004g/LのCoCl2×6H2O;
0.01g/Lのモリブデン酸Na。
【0078】
実施例4
式II〜IXのシクリポスチン類の製造
200Lの発酵槽を、90リットルの栄養溶液を用いて下記の条件下で操作する:
この栄養溶液を30分間加熱滅菌し、冷却したのち、その5%の体積を実施例3により得た接種材料で接種する。
【0079】
消泡剤を添加しないで発酵を行う。約40〜76時間後に生産最大に達する。
【0080】
実施例5
シクリポスチンXおよびXVAの製造
200Lの発酵槽を下記の条件下で下記成分100Lを充填して操作する:
泡形成抑制剤を添加しないで発酵を行う。約48時間後に生産最大に達する。
【0081】
実施例6
ストレプトマイセス属の種 HAG 004107,DSM 13381 の培養液からのシクリポスチン混合物の単離
ストレプトマイセス属の種 HAG 004107,DSM 13381 の発酵が完結したのち、実施例4により得られた発酵槽からの100リットルの培養ブロスを、約2%の濾過助剤(例えば Celite (登録商標))を加えて濾過し、細胞塊(10リットル)を40リットルのメタノールで抽出する。活性化合物を含有するメタノール性溶液を濾過により菌糸体から遊離させ、真空濃縮する。この濃縮物を、7リットルの分取用 MCL GEL, CHP20P (登録商標) カラムにかける。水からプロパン−2−オールまでの勾配を用いて溶離を行う。カラムの流れ(毎時20リットル)を画分(各10リットル)として集め、シクリポスチン類を含有する画分(19〜21)をそれぞれの場合に真空濃縮する。これらの画分をHPLCにより調査する(実施例7参照)。画分19はシクリポスチンA〜Eおよびそれらの異性体を含有しており、画分20はシクリポスチンFおよびその異性体を含有しており、画分21は阻害剤であるシクリポスチンN、P、P2、Q、R、SおよびT、およびそれらの異性体を含有している。
【0082】
実施例7
シクリポスチン類のHPLC分析
シクリポスチン類の高速液体クロマトグラフィー(HPLC)分析を、HP 1100 (登録商標) ユニットで YMC Pack Pro C18 (登録商標)カラム[AS-303、250×4.6mm、S−5μm、120Å]を用いて行う。流量は1ml/分、カラム温度は40℃である。0.05%トリフルオロ酢酸からアセトニトリルまでの勾配を用いる。11分後に100%アセトニトリルにし、次いでカラムを一定して(アイソクラクチックに)この溶剤でさらに溶離する。検出を210nmでの紫外線吸収の測定により行う。この手順を用いると、シクリポスチン類は下記の保持時間を有する:
シクリポスチンA 12.7分、
シクリポスチンA2 12.6分、
シクリポスチンF 13.2分、
シクリポスチンN 15.9分、
シクリポスチンP 17.7分、
シクリポスチンP2 17.3分、
シクリポスチンQ 18.3分、
シクリポスチンR 16.7分、
シクリポスチンR2 16.4分、
シクリポスチンS 18.5分、
シクリポスチンT 19.1分および
シクリポスチンT2 18.7分。
【0083】
実施例8
純粋なシクリポスチンAおよびA2の製造
実施例6により得た画分19を真空濃縮し、水/メタノール(1:1)に溶解した1gの濃縮物を Nucleoprep 100-5 C18 AB (登録商標) カラム」(21×250mm)にかける。0.01%トリフルオロ酢酸中の50%アセトニトリルから100%アセトニトリルまでの勾配を用いて溶離を行う。流量は50ml/分である。カラムの流れを210nmでの光吸収の測定およびリパーゼ阻害特性の試験によりチェックする。それぞれ60mlの画分を採取する。シクリポスチンAは画分34および35に、シクリポスチンA2は画分41〜44に存在している。これらの画分をそれぞれの場合に一緒にし、真空濃縮し、SP 250/10 Nucleosil 100-5 C18 HD (登録商標) カラムで連続的に分離する。選択した勾配は0.01%トリフルオロ酢酸中の50%〜66%アセトニトリルであり、この溶液のpHを1滴の水酸化アンモニウム溶液で4.0に調節した。純粋な化合物を含有する画分をそれぞれの場合に一緒にし、凍結乾燥した。これらは5.4mgの純粋なシクリポスチンAをワックス様物質として与え、3mgのシクリポスチンA2を油状物として与えた。
【0084】
実施例9
シクリポスチンAの特性決定
外観:中性、無色、ワックス様の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
UV極大:メタノール中228nm。
IRバンド:1752および1671cm-1 。
ニトロベンジルアルコール/LiClマトリックスを用いた高解像FAB質量分析法により、次の分子量を認める:467.2757amu、これはシクリポスチンA−Liの実験式C23H41O7PLiに相当する。これから、シクリポスチンAの実験式はC23H41O7Pとなり、分子量:460である。電子スプレー質量分析法の陽イオン化方式(ESI、+)により、416amuで(M+H)+ に相当するピーク;さらに221amuでC7H10O6Pに相当する特徴的なピークを認める。ESI陰イオン化方式では459amu(M−H)-、337amu(C16H34O5P)および219amu(C7H8O6P)を認める。アルコール基の位置を決定するため、N−メチル−N−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを用いて誘導体化を行い、電子イオン化質量分析法を用いて試料を調査する。トリメチルシリル誘導体は質量554amuの
【化23】
となる。シリル化ヒドロキシル基の位置は497amu(α−開裂)および159amu(α−開裂)における強いイオンによって示される。
NMRシグナル:表1参照。
【0085】
【表1】
【0086】
実施例10
シクリポスチンBの特性決定
実施例8でシクリポスチンAについて記載したように、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンBを単離し、実施例9のように特性決定する。
外観:中性、無色、ワックス様の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
UV極大:メタノール中228nm。
電子スプレー質量分析法の陽イオン化方式(ESI、+)により、461amuで(M+H)+ に相当するピーク;さらに221amuでC7H10O6Pに相当する特徴的なピークを認める。ESI陰イオン化方式では459amu(M−H)- 、337amu(C16H34O5P)および219amu(C7H8O6P)を認める。アルコール基の位置を決定するため、N−メチル−N−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを用いて誘導体化を行い、電子イオン化質量分析法により試料を調査する。トリメチルシリル誘導体は質量554amuの
【化24】
となる。シリル化ヒドロキシル基の位置は511amu(α−開裂)および145amu(α−開裂)における強いイオンによって示される。
シクリポスチンBの実験式:C23H41O7P、分子量:460。
【0087】
実施例11
シクリポスチンCの特性決定
実施例8でシクリポスチンAについて記載したように、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンCを単離し、実施例9のように特性決定する。
外観:中性、無色、ワックス様の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
UV極大:メタノール中228nm。
電子スプレー質量分析法の陽イオン化方式(ESI、+)により、461amuで(M+H)+ に相当するピーク;さらに221amuでC7H10O6Pに相当する特徴的なピークを認める。ESI陰イオン化方式では459amu(M−H)- 、337amu(C16H34O5P)および219amu(C7H8O6P)を認める。アルコール基の位置を決定するため、N−メチル−N−トリメチルシリルトリフルオロアセトアミドを用いて誘導体化を行い、電子イオン化質量分析法を用いて試料を調査する。トリメチルシリル誘導体は質量554の
【化25】
となる。シリル化ヒドロキシル基の位置は525amu(α−開裂)および131amu(α−開裂)における強いイオンによって示される。
シクリポスチンCの実験式:C23H41O7P、分子量:460。
【0088】
実施例12
シクリポスチンFの特性決定
実施例6により得た画分20を実施例8に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンFを単離し、実施例9のように特性決定する。
反応時間:13.2分。
外観:中性、無色、ワックス様の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
UV極大:メタノール中228nm。
電子スプレー質量分析法の陽イオン化方式(ESI、+)により、459amuで(M+H)+ に相当するピーク;さらに221amuでC7H10O6Pに相当する特徴的なピークを認める。ESI陰イオン化方式では457.6amu(M−H)- 、336amu(C16H32O5P)および219amu(C7H8O6P)を認める。
シクリポスチンFの実験式:C23H39O7P、分子量:458。
【0089】
実施例13
シクリポスチンPの特性決定
実施例5および6により得た画分21を実施例8に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンPを単離し(210mg)、実施例9のように特性決定する。
210mgを3mlのプロパン−2−オールおよび13mlのアセトニトリルに溶解し、8mlの水を加えることによりシクリポスチンFを結晶化させた。濾別し、冷アセトニトリルで洗浄したのち、最終重量135mgのシクリポスチンを得た。融点58〜59℃。
保持時間:17.7分。
外観:中性、無色、ワックス様の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
UV極大:メタノール中228nm。
IRバンド:2917、2852、1753、1671、1471、1214、996および832cm-1。
ニトロベンジルアルコールマトリックスを用いた高解像FAB質量分析法により、次の分子量を認める:445.2717amu、これはシクリポスチンPに対する(M+H)+ のC23H42O6Pに相当する。これから、シクリポスチンPの実験式はC23H41O6Pとなり、分子量:444である。
電子スプレー質量分析法の陽イオン化方式(ESI、+)により、445amuで(M+H)+ に相当するピーク;さらに221amuでC7H10O6Pに相当する特徴的なピークを認める。ESI陰イオン化方式では443amu(M−H)- 、321amu(C16H34O4P)および219amu(C7H8O6P)を認める。
【化26】
NMRデータを表2に示す。
【0090】
【表2】
【0091】
実施例14
シクリポスチンP2の特性決定
実施例5および6により得た画分21を実施例8に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンP2を単離し(130mg)、実施例9のように特性決定する。
保持時間:17.1分。
外観:中性、無色、油状物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
UV極大:メタノール中228nm。
ニトロベンジルアルコールマトリックスを用いた高解像FAB質量分析法により、次の分子量を認める:445.2721amu、これはシクリポスチンPに対する(M+H)+ のC23H42O6Pに相当する。これから、シクリポスチンP2の実験式はC23H41O6Pとなり、分子量:444である。電子スプレー質量分析法の陽イオン化方式(ESI、+)により、445amuで(M+H)+ に相当するピーク;さらに221amuでC7H10O6Pに相当する特徴的なピークを認める。ESI陰イオン化方式では443amu(M−H)- 、321amu(C16H34O4P)および219amu(C7H8O6P)を認める。
【化27】
シクリポスチンP2のNMRデータを表3に示す。
【0092】
【表3】
【0093】
実施例15
シクリポスチンNの取得および特性決定
実施例5および6により得た画分21を実施例8に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンNを単離し(2mg)、実施例9のように特性決定する。
保持時間:15.9分。
外観:中性、無色、油状物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
UV極大:メタノール中228nm。
高解像質量分析法[空格子点]FAB条件により、417.2405でC21H38O6P(理論値:417.2406)の実験式に相当する準分子イオン(M+H)を観測した。ESI+ 方式における特徴的な断片:221amu。
【0094】
【表4】
【0095】
実施例16
シクリポスチンRの取得および特性決定
実施例5および6により得た画分21を実施例8に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンRを単離し(8mg)、実施例9のように特性決定する。
保持時間:16.7分。
外観:中性、無色、結晶性物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
UV極大:メタノール中228nm。
高解像質量分析法[空格子点]FAB条件により、431.2561でC22H4 0O6P(理論値:431.2562)の実験式に相当する準分子イオン(M+H)を観測した。ESI+ 方式における特徴的な断片:221amu。
【0096】
【表5】
【0097】
実施例17
シクリポスチンR2の取得および特性決定
実施例5および6により得た画分21を実施例8に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンR2を単離し(8mg)、実施例9のように特性決定する。
保持時間:16.4分。
外観:中性、無色、油状物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
UV極大:メタノール中228nm。
高解像質量分析法[空格子点]FAB条件により、431.2564でC22H40O6P(理論値:431.2562)の実験式に相当する準分子イオン(M+H)を観測した。ESI+ 方式における特徴的な断片:221amu。
【0098】
【表6】
【0099】
実施例18
シクリポスチンSの取得および特性決定
実施例5および6により得た画分21を実施例8に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンSを単離し(0.7mg)、実施例9のように特性決定する。
保持時間:18.5分。
外観:中性、無色、固体の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
UV極大:メタノール中228nm。
高解像質量分析法[空格子点]FAB条件により、459.2883でC24H44O6P(理論値:459.2575)の実験式に相当する準分子イオン(M+H)を観測した。ESI+ 方式における特徴的な断片:235amu。
【0100】
【表7】
【0101】
実施例19
シクリポスチンTの取得および特性決定
実施例5および6により得た画分21を実施例8に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンTを単離し(5mg)、実施例9のように特性決定する。
保持時間:19.1分。
外観:中性、無色、固体の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
UV極大:メタノール中228nm。
高解像質量分析法[空格子点]FAB条件により、473.3030でC25H46O6P(理論値:473.3032)の実験式に相当する準分子イオン(M+H)を観測した。ESI+ 方式における特徴的な断片:249amu。
【0102】
【表8】
【0103】
実施例20
シクリポスチンT2の取得および特性決定
実施例5および6により得た画分21を実施例8に記載したように分離し、クロマトグラフィー段階を多数回繰り返してシクリポスチンT2を単離し(4mg)、実施例9のように特性決定する。
保持時間:18.7分。
外観:中性、無色、固体の物質であり、酸素含有有機溶剤に可溶であるが、水および石油エーテルには僅かしか溶解しない。
UV極大:メタノール中228nm。
高解像質量分析法[空格子点]FAB条件により、473.3035でC25H46O6P(理論値:473.3032)の実験式に相当する準分子イオン(M+H)を観測した。ESI+ 方式における特徴的な断片:249amu。
【0104】
【表9】
【0105】
実施例21
ホルモン感受性リパーゼ(HSL)の阻害
ラットからのホルモン感受性リパーゼは、基質としてトリオレイルグリセロールを用いて下記の濃度(IC50)で阻害される。
シクリポスチンA 20nM、
シクリポスチンN 450nM、
シクリポスチンP 30nM、
シクリポスチンP2 40nM、
シクリポスチンR 10nM、
シクリポスチンR2 220nM、
シクリポスチンS 20nM、
シクリポスチンT 200nM、
シクリポスチンT2 60nM。
Claims (14)
- 式I
R1は
1.飽和の直鎖状、分枝状、または不飽和の直鎖状、分枝状の2〜30個の炭素原子を有する炭素鎖であり、この炭素鎖は場合により
1.1 −OH、
1.2 =O、
1.3 −O−C1〜C6−アルキル(アルキルは線状または分枝状である)、
1.4 −O−C2〜C6−アルケニル(アルケニルは線状または分枝状である)、
1.5 −C1〜C6−アルキル(アルキルは線状または分枝状である)、
1.6 −アリール、
1.7 −C1〜C6−アルキルベンゼン、
1.8 −ジフェニル、
1.9 −NH−C1〜C6−アルキル(アルキルは線状または分枝状である)、
1.10 −NH−C2〜C6−アルケニル(アルケニルは線状または分枝状である)、
1.11 −NH2、
1.12 =S、
1.13 −S−C1〜C6−アルキル(アルキルは線状または分枝状である)、
1.14 −S−C2〜C6−アルケニル(アルケニルは線状または分枝状である)、
1.15 ハロゲン、
で一置換または二置換されており、
R2は
1.0 C1〜C6−アルキル(アルキルは非置換であるか、または1.1〜1.15に記載したように一置換または二置換されている)、
2.0 C2〜C6−アルケニル(アルケニルは非置換であるか、または1.1〜1.15に記載したように一置換または二置換されている)、または
3.0 C2〜C6−アルキニル(アルキニルは非置換であるか、または1.1〜1.15に記載したように一置換または二置換されている)であり、
Eはリン(P)または硫黄(S)原子であり、
X1、X2およびX3は互いに独立して、
1.0 −O−、
2.0 −NH−、
3.0 −N=、
4.0 −S−、または
5.0 −CH2−および−CHR2である]
の化合物、その全ての立体化学的形態およびこれらの形態の任意な比率の混合物、またはその生理的に許容される塩。 - R1が飽和の直鎖状、分枝状、または不飽和の直鎖状、分枝状の10〜18個の炭素原子を有する炭素鎖であり、この炭素鎖が非置換であるか、または1.1〜1.15に記載したように一置換または二置換されていることを特徴とする、請求項1に記載の式Iの化合物またはその生理的に許容される塩。
- R1が
1.0 −(CH2)15CH3、
2.0 −(CH2)13CH(CH3)2、
3.0 −(CH2)11CH(OH)(CH2)3CH3、
4.0 −(CH2)11CH(OH)CH2CH(CH3)2、
5.0 −(CH2)12CH(OH)(CH2)2CH3、
6.0 −(CH2)13CH(OH)CH2CH3、
7.0 −(CH2)14CH(OH)CH3、
8.0 −(CH2)15CH2(OH)、
9.0 −(CH2)16CH3、
10.0 −(CH2)13C=OCH2CH3、
11.0 −(CH2)12C=OCH2CH2CH3、
12.0 −(CH2)11C=OCH2CH2CH2CH3、
13.0 −(CH2)13CH3、
14.0 −(CH2)11CH(CH3)2、
15.0 −(CH2)14CH3または
16.0 −(CH2)12CH(CH3)2
であることを特徴とする、請求項1または2に記載の式Iの化合物またはその生理的に許容される塩。 - R2がC1〜C6−アルキルであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の式Iの化合物またはその生理的に許容される塩。
- R2が−CH3、−CH2CH3または−CH2CH2CH3であることを特徴とする、請求項4に記載の式Iの化合物またはその生理的に許容される塩。
- 微生物ストレプトマイセス属の種 HAG 004107,DSM 13381、またはその変種もしくは突然変異体の一つを、培地中で好適な条件下に、1種またはそれ以上の式Iの化合物が培地中に蓄積するまで発酵させ、次いで該化合物を培地から単離し、場合により該化合物を化学的等価物または生理的に許容される塩に変換することにより製造しうる、請求項1〜5のいずれかに記載の式Iの化合物またはその生理的に許容される塩。
- 微生物ストレプトマイセス属の種 HAG 004107, DSM 13381、またはその変種もしくは突然変異体の一つを、培地中で好適な条件下に、1種またはそれ以上の式Iの化合物が培地中に蓄積するまで発酵させ、次いで該化合物を培地から単離し、場合により該化合物を化学的等価物または生理的に許容される塩に変換することを含むことを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の式Iの化合物またはその生理的に許容される塩の製造方法。
- 発酵を好気性条件下に18〜35℃の温度およびpH6〜8において行うことを特徴とする、請求項7に記載の方法。
- 医薬として使用するための、請求項1〜6のいずれかに記載の式Iの化合物またはその生理的に許容される塩。
- リパーゼ阻害用の医薬として使用するための、請求項1〜6のいずれかに記載の式Iの化合物またはその生理的に許容される塩。
- 抗糖尿病剤として使用するための、請求項1〜6のいずれかに記載の式Iの化合物またはその生理的に許容される塩。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の少なくとも1種の式Iの化合物またはその生理的に許容される塩を含む医薬調製物。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の少なくとも1種の式Iの化合物またはその許容される塩を、好適な賦形剤および/または担体を用いて好適な投与形態にすることを含むことを特徴とする、請求項12に記載の医薬調製物の製造方法。
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