HU216875B - Eljárás leusztrodukszin és az azt tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására - Google Patents

Eljárás leusztrodukszin és az azt tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU216875B
HU216875B HU9201005A HU9201005A HU216875B HU 216875 B HU216875 B HU 216875B HU 9201005 A HU9201005 A HU 9201005A HU 9201005 A HU9201005 A HU 9201005A HU 216875 B HU216875 B HU 216875B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
doublet
compounds
triplet
leustroducsin
culture
Prior art date
Application number
HU9201005A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT60521A (en
HU9201005D0 (en
Inventor
Ryuzo Enokita
Takeshi Kagasaki
Isao Kaneko
Takafumi Kohama
Keiichi Matsuda
Takemichi Nakamura
Original Assignee
Sankyo Co. Ltd.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sankyo Co. Ltd. filed Critical Sankyo Co. Ltd.
Publication of HU9201005D0 publication Critical patent/HU9201005D0/hu
Publication of HUT60521A publication Critical patent/HUT60521A/hu
Publication of HU216875B publication Critical patent/HU216875B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/547—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom
    • C07F9/655—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms
    • C07F9/6552—Heterocyclic compounds, e.g. containing phosphorus as a ring hetero atom having oxygen atoms, with or without sulfur, selenium, or tellurium atoms, as the only ring hetero atoms the oxygen atom being part of a six-membered ring
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/74—Synthetic polymeric materials
    • A61K31/80—Polymers containing hetero atoms not provided for in groups A61K31/755 - A61K31/795
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
    • C12P17/06—Oxygen as only ring hetero atoms containing a six-membered hetero ring, e.g. fluorescein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/886—Streptomyces
    • Y10S435/903—Streptomyces platensis

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Low-Molecular Organic Synthesis Reactions Using Catalysts (AREA)
  • Pyrane Compounds (AREA)

Abstract

A találmány tárgya eljárás (I) általánős képletű leűsztrődűkszin –ahől R jelentése 5-metil-hexanőil-őxi-csőpőrt, 6-metil-őktanőil-őxi-csőpőrt vagy 7-metil-őktanőil-őxi-csőpőrt – vagy ezek s inakelőállítására. A találmány szerinti eljárást az jellemzi, hőgy egy, aStreptőmyces nemzetségbe tartőzó leűsztrődűkszint termelőmikrőőrganizműst tenyésztik, és a tenyészetből legalább az egyikleűsztrődűkszint kiny rik. ŕ

Description

A találmány egy sor új vegyületet biztosít, melyeket Leusztrodukszin A-nak, Leusztrodukszin B-nek és Leusztrodukszin C-nek neveztünk el. Ezen vegyületek szerkezete az (I) általános képletnek felel meg. A találmány biztosít ezen vegyületek fermentációval történő előállítására szolgáló módszereket is, egy, a Streptomyces nemzetségbe tartozó mikroorganizmust használva, és különösen a Streptomyces platensis faj egy törzsét használva, mely szintén új, és részét képezi a találmánynak. A találmány vegyületei számos terápiás hatással rendelkeznek, és így a találmány biztosít a terápiához vagy profilaxishoz készítményeket és módszereket is ezen vegyületeket felhasználva.
A találmány leusztrodukszin-vegyületei olyan új vegyületek, melyek stimulálják a vérképző faktorok, mint például a granulocita telepstimuláló faktor (a továbbiakban „G-CSF”-nek rövidítjük) és a granulocita-makrofág telepstimuláló faktor (a továbbiakban „GM-CSF”nek rövidítjük) termelését; stimulálják az idegnövekedési faktor (a továbbiakban „NGF”-nek rövidítjük) termelését is; ezenkívül gombaellenes hatást mutatnak például a Tricophyton mentagrophytesszel szemben.
Számos vérképződési aktivitással rendelkező citokint, mint amilyenek a telepstimuláló faktorok (a továbbiakban „CSF”-nek rövidítjük), és számos glikoproteint (általánosan interleukinnek nevezett) készítettek eddig génmanipulációs technikával. Ezeket az anyagokat számos módon használták a klinikai gyakorlatban a rákkemoterápia és -radioterápia által általában okozott kedvezőtlen mellékhatások csökkentésére és a fertőzés gátlására. Ezen anyagok hatékonysága az utóbbi időben világossá vált [Br. J. Cancer 59, 2-5. (1989)].
Úgy találták, hogy ezen faktoroknak különböző módon az embereknek való adagolása tiszta gyógyszerészeti hatást eredményez, mely ezen faktorok terápiában való lehetséges használatához vezet. Azonban az a vélemény, hogy ezeket a faktorokat alapjában véve bizonyos típusú sejtek in vivő termelik (például limfociták, monociták, fibroblasztok, vaszkuláris endoteliális sejtek és stromasejtek) bonyolult szabályozó rendszeren keresztül, és hogy ezek homeosztatikus szerepet játszanak a különböző vérsejtek termelésében. Ennek megfelelően, ha ezeket a faktorokat a szabályozó rendszer kényes egyensúlyának figyelmen kívül hagyásával alkalmazzuk, számos mellékhatás figyelhető meg, melyeket ezen szabályozó rendszer megbomlott egyensúlya okoz. Az ilyen mellékhatások közé tartoznak az injekciózás helyén fellépő gyulladás, csontfájdalom, láz és remegés.
Másrészt pedig maguknak a vérképződési faktoroknak az adagolása helyett lehetséges bizonyos anyagok adagolása, melyekről ismert, hogy ezen vérképződési faktorok termelését stimulálják a testben. Például ismeretes, hogy az interleukin 1 (a továbbiakban IL-1-nek rövidítjük) és a tumor-nekrózisfaktor (a továbbiakban TNF-nek rövidítjük) a CSF termelődését tudják indukálni stb. különböző sejtekben. Ezek a faktorok azonban nem képesek mindig specifikus vérképződési faktor indukálójaként működni, mivel számos más biológiai működésük is van.
Az is ismeretes, hogy számos kis molekulatömegű immunoaktivátor, mint amilyenek a lipopoliszacharidok (a továbbiakban LPS-nek rövidítjük) és a muramildipeptidek (a továbbiakban MDP-nek rövidítjük) számos különböző típusú CSF-et képes termeltetni monociták és makrofágok aktiválásával. Azonban ismeretes, hogy a makrofágok aktiválása által okozott más fiziológiai hatások például monokinek, mint az IL-1 és TNF termelése is előfordul ezzel egy időben, mely számos mellékhatást eredményezhet, például lázat [Nippon Acta Radiologica 48, (4), 514. (1988)].
A fórból észterekről és a kalcium ionoforokról ismeretes, hogy szinergikusan indukálják a CSF termelését [Kohama et al.·, Experimental Hematology 16, 603-608. (1988)], azonban az is ismert, hogy nem csupán a vérképződési faktorok termelését stimulálják, hanem az összes szekretáló fehéijék termelését és szekrécióját is, ideértve olyan hormonokat, mint az inzulin [Y. Nishizuka: Science225, 1365.(1984)].
Bár a pontos mechanizmust még nem tisztázták, az az elképzelés, hogy a vérsejtek képződésében különböző típusú érett vérsejt jöhet létre a közös sejtprekurzorból, az úgynevezett vérképződési alapsejtekből, a különböző vérképződési faktorok működése következtében, és a sejt-sejt kölcsönhatások eredményeként. Megállapították, hogy az a hely, ahol normál felnőtt egyedben a vérsejtek képződnek, csupán a csontvelő belsejére korlátozódik, hogy a csontvelőben található stromasejteknek nevezett sejtek fontos szerepet játszanak a vérsejtek képződésében [Dexter et al. J. Cell. Physiol. 91, 335. (1977)], valamint a csontvelőben levő stromasejtek számos vérképződési faktort termelnek [Harigaya et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3477 (1985); Kohama et al. Experimental Hematology, 16, 603-608. (1988)].
Ezért, ha egy olyan anyag található, mely stimulálja a stromasejtek általi vérképződési faktorok termelődését, ez az anyag nem csupán nagyon fontos szerepet játszhat a vérképződési mechanizmus fiziológiás körülmények közötti működésének és a hematológiai betegségek patológiájának vizsgálatában, de jelentős lehet klinikai alkalmazása is.
A 329361 számú európai szabadalmi közzétételi irat leír bizonyos új 2-piranonszármazékokat, melyek hasonlítanak a találmány vegyületeihez, azzal az eltéréssel, hogy különböznek az „R” csoport természetében, melyet az alábbiakban határozunk meg. Azokat a korábban említett vegyületeket csupán mezőgazdasági biocideknek tüntetik fel és nem mutatják be a tudományos közleményekben, hogy a találmány vegyületeinek értékes és váratlan terápiás és profilaktikus aktivitásával rendelkező vegyületek. Bár a korábban említett vegyületeket, akárcsak a találmány vegyületeit, a Streptomyces platensis mikroorganizmus fajjal állítják elő, a korábbi dokumentumban leírt törzs úgy véljük, világosan különbözik a találmányban leírt törzstől.
Nagyon hasonló vegyületeket és mikroorganizmusokat alapjában véve azonos jellemzőkkel írnak le a Kokai Hai 2-186 számú japán szabadalmi bejelentésben, és ezeket hasonlóképpen világosan különbözőnek
HU 216 875 Β véljük a találmányban leírt vegyületektől és mikroorganizmustól.
A Journal of Antibiotics (Vol XLII No. 9. 1331. oldal) című folyóiratban egy új antitumorvegyület került leírásra, melyet a szerző „Phospholin”-nak nevezett, és melyet egy, a Streptomyces nemzetségbe tartozó mikroorganizmus termel. Ezt akkor újonnan izolálták. Azonban a mikroorganizmust egyértelműen Streptomyces hygroscopicusnak nevezték, és megkülönböztethető a Streptomyces platensistől, melyet a jelen találmányban alkalmazunk. Továbbá, bár a korábbi foszfolin, mint a jelen találmány vegyületei, rendelkezik aminocsoporttal és egy foszforcsoporttal, különböző a molekulaképlete, mely így egyértelműen megkülönböztethető.
A továbbiakban megadjuk a találmány rövid leírását.
A találmány célja olyan új foszforsavvegyületek sorozatának biztosítása, melyek számos gyógyszerészeti aktivitással rendelkeznek.
Úgy véljük, hogy a találmány vegyületei elsősorban a következő aktivitásokkal rendelkeznek: csökkentik a rákkemoterápia vagy -radioterápia következtében fellépő rákos reakciókat; védenek a fertőzésekkel szemben; aktiválják a makrofágokat, és így rákellenes hatásuk van; serkentik az agyi funkciókat; továbbá gombaellenes anyagként is működnek.
így a találmány biztosít egy (I) általános képletű vegyületet, ahol R jelentése 5-metil-hexanoil-oxi-csoport, 6-metil-oktanoil-oxi-csoport vagy 7-metil-oktanoil-oxi-csoport, és ezek sói. Ezeket a vegyületeket sorrendben „Leusztrodukszin A”-nak, „Leusztrodukszin B”-nek és „Leusztrodukszin C”-nek neveztük el.
A találmány biztosít egy, a leusztrodukszinok előállítására szolgáló módszert is, mely tartalmazza egy, a Streptomyces nemzetségbe tartozó leusztrodukszin-termelő mikroorganizmus tenyésztését, és legalább egy leusztrodukszin összegyűjtését a tenyészetből.
A találmány biztosít egy gyógyszerészeti készítményt is, mely tartalmaz legalább egy leusztrodukszint vagy ennek egy sóját egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval vagy oldószerrel összekeverve.
A találmány a továbbiakban még biztosít egy módszert a következők kezelésére vagy profilaxisára: a rákkemoterápia vagy -radioterápia következtében fellépő kedvezőtlen reakciók, fertőzések, rák, agyi diszfunkciók és gombás fertőzések. Ez a módszer tartalmazza legalább egy leusztrodukszin vagy ennek egy sója hatásos mennyiségének adagolását egy emlősnek, mely lehet ember, mely szenvedhet a leírtakban vagy érzékeny lehet ilyen reakciókra, fertőzésekre, rákra vagy zavarokra.
A következőkben megadjuk a találmány részletes leírását.
A találmány három leusztrodukszin-vegyülete a következő :
Leszutrodukszin A: (la) képlet; az (I) általános képletben
R=5-metil-hexanoil-oxi-csoport;
Leusztrodukszin B: (Ib) képlet; az (I) általános képletben
R=6-metil-oktanoil-oxi-csoport;
Leusztrodukszin C: (Ic) képlet; az (I) általános képletben
R=7-metil-oktanoil-oxi-csoport.
A fenti szerkezetekből egyértelmű, hogy a találmány leusztrodukszin-vegyületei számos aszimmetriás szénatomot és számos kettős kötést tartalmaznak. Ezért ezek különböző optikai és geometriai izomert képesek létrehozni. Bár ezek mindegyikét egy egyszerű molekuláris szerkezet képviseli, a találmány magában foglalja mind az egyedi izolált izomereket és a keverékeket, ideértve ezek racém alakjait is. Ahol sztereospecifikus szintézises technikák kerülnek alkalmazásra, vagy optikailag aktív vegyületek szerepelnek kiindulási anyagként, az egyedi izomereket közvetlenül lehet előállítani; másrészről, ha izomerek keverékét állítjuk elő, az egyedi izomereket hagyományos felbontási technikával lehet kinyerni.
A találmány leusztrodukszin-vegyületei a Streptomyces nemzetségbe tartozó leusztrodukszin-termelő mikroorganizmus tenyésztésével állítható elő, ezután pedig egy vagy több leusztrodukszin gyűjthető össze a tenyésztápközegből.
Különösen előnyben részesítjük a Streptomyces nemzetségbe tartozó, újonnan izolált mikroorganizmustörzs alkalmazását, melyről megállapítottuk, hogy a Streptomyces platensis fajhoz tartozik, és melyet SANK 60191nek jelöltünk (FERM BP-3288).
Ezt a mikroorganizmust a Budapesti Szerződés szerint a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technologynál, 1991. február 20-án deponáltunk a FERM BP-3288 katalógusszámon.
A Streptomyces platensis SANK 60 191 (FERM BP-3288) mikrobiológiai tulajdonságait a következőkben mutatjuk be.
1. Mikrobiológiai jellemzők
A Streptomyces platensis SANK 60 191 törzset 14 napig tenyésztettük 28 °C hőmérsékleten az összes ISP (International Streptomyces Project) által meghatározott tápagaron. A 14 napos tenyésztés után a mikroszkópos vizsgálatnál azt tapasztaltuk, hogy a törzs szubsztrátmicéliuma megnyúlt és jól elágazó, sárgásszürke vagy halványsárgás narancssárga színű volt. Azonban sem a Nocardioform sugárgombáknál megfigyelhető fragmentációt, sem cikcakkos megnyúlást nem észleltünk. A légmicélium elágazása egyszerű volt. A spóraláncok laza spirált képeztek, 10-50, vagy még több spóra alkotott egy láncot. A scanning elektronmikroszkópos megfigyelés azt mutatta, hogy a spórák felülete sima. A spórák tojásdad vagy ovális alakúak voltak, és méretük 0,5-0,6x0,6-1,3 pm. Légmicélium orvokét, szkleróciumot, hifa fragmentációt és különleges szerveket mint sporangiumot nem találtunk.
2. Különböző típusú tenyésztápközegeken adott tulajdonságok
Az 1. táblázat a mikroorganizmus 14 napig 28 °C hőmérsékleten különböző tenyésztápközegeken való tenyésztési tulajdonságait mutatja. A színeket a színskálaszámmal - melyet a „Guide to Color Standard”ben adnak meg; Nippon Shikisai Kenkyusho szerkesz3
HU 216 875 Β tette - jelöltük. A törzs nedvesedik, és színe feketére G: növekedés; AM: légmicélium; R: hátoldal, változik az idő múlásával. SP: oldható pigment; SC: Specifikus tulajdonság.
A táblázatban a következő rövidítéseket használjuk:
1. táblázat
Tápközeg A tulajdonság jele A SANK 60 191 törzs jellemzője
Szacharóz-nitrát agar G: jó, sima, halványsárgás narancssárga (2-9-9)
AM: jó, bársonyos, világos bamásszürke (2-7-8)
R: halványbama (2-8-9)
SP: nincs
Glükóz-aszparagin agar G: jó, sima, halványsárgás narancssárga (2-9-9)
AM: mérsékelt, bársonyos, fehér
R: halványbama (2-8-9)
SP: nincs
Glicerin-aszparagin agar (ISP 5) G: nagyon jó, sima, halványsárgás narancssárga (2-9-9)
AM: mérsékelt, bársonyos, bamásszürke (2-6-8)
R: halványsárgás világosbarna (4-8-9)
SP: nincs
Szervetlen só-keményítő agar (ISP 4) G: jó, sima, halványsárgás narancssárga (2-9-9)
AM: jó, bársonyos, bamásfehér (1-6-6)
R: bamásszürke (2-5-9)
SP: nincs
SC: a léghifák nedvesednek és színük feketére változik
Tirozinagar (ISP 7) G: nagyon jó, sima, halványsárgás narancssárga (2-9-9)
AM: jó, bársonyos, fehér, világos bamásszürke (2-7-8) foltok
R: halvány sárgásbarna (4-8-9)
SP: nincs
Nutrient agar (DIFCO) G: jó, sima, halványsárgás narancssárga (2-9-9)
AM: mérsékelt, bársonyos, fehér
R: halvány sárgásbarna (4-8-9)
AP: nincs
Élesztőkivonat-malátakivonat agar (ISP 2) G: nagyon jó, sima halványsárgás narancssárga (2-9-9)
AM: bőséges képződés, bársonyos, világos bamásfehér (1-7-6)
R: halvány sárgásbarna (6-7-9)
SP: nincs
SC: a léghifák nedvesednek és színük feketére változik
Zablisztagar (ISP 3) G: jó, sima, halványsárgás narancssárga (2-9-9)
AM: jó, bársonyos, sötét bamásszürke (1 -4-6)
R: sárgásbarna (4-6-9)
SP: nincs
Vízagar G: mérsékelt, sima, sárgásszürke (1-9-10)
AM: mérsékelt, bársonyos bamásszürke (2-5-8)
R: világos bamásszürke (2-7-8)
SP: nincs
Burgonyakivonat-répakivonat agar G: mérsékelt, sima, sárgásszürke (1-9-10)
AM: mérsékelt, bársonyos, bamásszürke (2-5-8)
R: világos bamásszürke (2-7-8)
SP: nincs
HU 216 875 Β
3. Fiziológiai tulajdonságok A SANK 60 191 törzs fiziológiai tulajdonságait a
2-21. napig terjedő megfigyelési időszak során, 28 °C hőmérsékleten a 2. táblázat mutatja
2. táblázat
Keményítőhidrolízis pozitív
Zselatinelfolyósítás negatív
Nitrátredukció negatív
A tej koagulálása negatív
A tej peptonizációja negatív
Melanoidpigment termelése
(1. tápközeg) negatív
(2. tápközeg) negatív
(3. tápközeg) negatív
Szubsztrátlebontás
Kazein negatív
Tirozin pozitív
Xantin pozitív
A szaporodás hőmérsékleti intervalluma (4 tápközeg): 9-35°C
Az optimális szaporodási hőmérséklet intervalluma (4 tápközeg): 20-26 °C
Nátrium-klorid-tolerancia 10%
*: tápközeg 1) Tripton-élesztőkivonat leves (ISP 1)
2) Pepton-élesztőkivonat-vas agar (ISP 6)
3) Tirozinagar (ISP 7)
4) Élcsztőkivonat-malátakivonat agar (ISP 2)
A SANK 60191 törzset 28 °C hőmérsékleten Pridham-Gottlieb-féle agaron (ISP 9) is tenyésztettük. A szénforrás-hasznosítást 14 napos tenyésztés után vizsgáltuk meg, az eredményeket a 3. táblázat mutatja.
3. táblázat
D-Glükóz + D-Fruktóz +
L-Arabinóz - L-Ramnóz -
D-Xilóz - Szacharóz +
Inozit + Raffmóz +
D-Mannit + Kontroll -
+ a hasznosítás pozitív - a hasznosítás negatív
4. Sejtes összetevők
A SANK 60191 törzs sejtfalát B. Becker et al. [Applied Microbiology, 12, 421-423. (1984)] módszerét alkalmazva vizsgáltuk. Mivel £Z.-diamino-pimelinsavat észleltünk, a sejtfal I-es típusúnak bizonyult. Továbbá a SANK 60191 törzs teljes sejtjének cukorkomponenseit Μ. P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71, 934. (1968)] módszerével vizsgáltuk. Nem észleltünk különleges mintázatot.
Ezen mikrobiológiai tulajdonságok alapján a törzs az Actinomycetesek Streptomyces nemzetségébe tartozónak bizonyult. Az ISP-ben E. B. Shirling és D. Gottlieb [International Journal of Systemic Bacteriology 18, 68-189. (1968); 18, 279-392. (1968); 19, 391-512. (1969); 22, 265—394. (1972)] által leírt törzsekkel és a más irodalmakban, mint például „The Actinomycetes, Vol 2” S. A. Waksman által leírt, a Bergey’s Mannual of Determinative Bacteriology, 8. kiadás (1974) (R. E. Buchanan and N. E. Gibbons szerk.), „Bergey”s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4 (1989)” és más, az utóbbi időből származó az Actinomycetesekről szóló irodalmakban szereplő törzsekkel összehasonlítva ez a törzs nagyon közelinek bizonyult a Streptomyces platensishez.
Továbbá folyadéktenyészetben, élesztő-dextróz tápközeget használva, a SANK 60191 törzs oldható pigmentet termelt, melynek színe élénk pirosasbama volt. 0,05 N vizes sósavat adva ehhez, ez a szín sárgára változott, és 0,05 N vizes nátrium-hidroxidot adva hozzá nem figyeltünk meg színváltozást.
A Streptomyces platensis pirosas vagy sárgás pigmentet termel élesztókivonat-malátakivonat agaron, zablisztagaron, szervetlen só-keményítő agaron és glicerinaszparagin agaron való tenyésztés után. Másrészt a SANK 60191 törzs alig termelte ezeket a pigmenteket, ami azt jelzi, hogy eltérés van ezen törzs és a Streptomyces platensis ismert törzsei között. Mivel azonban az új törzset és az ismert törzseket csupán az oldható pigmentek termelésében mutatkozó különbségek alapján lehet elkülöníteni, a SANK 60191 törzset a Streptomyces platensis egy új törzsének azonosítottuk.
Megállapítottuk, hogy a SANK 60191 törzs leusztrodukszint termel. Azonban, mint ismeretes, a gombák tulajdonságai általában, és különösen a sugárgombaszerű mikroorganizmusok tulajdonságai jelentősen eltérhetnek. Az ilyen gombák könnyen esnek át mutáción, akár természetes ok váltja ki, akár különböző mesterséges kezelések (például ultraibolya besugárzás, radioaktív besugárzás, kémiai kezelés stb.) hatására. Ennek megfelelően a találmány magában foglalja bármely olyan mikroorganizmus alkalmazását, mely a Streptomyces nemzetségbe sorolható be, és mely rendelkezik a SANK 60191 törzs jellegzetes leusztrodukszin-termelő képességével. Nem várható, hogy az új mikroorganizmus, a SANK 60191, egy kivételes eset, és a „SANK 60191” fogalom magában foglalja ezen törzs összes mutánsát, melyek rendelkeznek a SANK 60191 törzs jellegzetes leusztrodukszin-termelő képességével. Továbbá ezen mutánsok magukban foglalják a génsebészeti technikával, például a rekombinációval, transzdukcióval, transzformációval vagy hasonlókkal nyert mutánsokat. Az csupán egyszerű kísérletezés dolga, hogy az itt biztosított a leusztrodukszin tulajdonságaira vonatkozó információk alapján megállapítsák, hogy bármely adott törzs termeli-e ezeket a vegyületeket, vagy elegendő mennyiségben termeli-e azokat ahhoz, hogy potenciális kereskedelmi érdeklődésre tartson számot.
A fent leírt Streptomyces platensis új törzsén túl az is kiderült, hogy egy új törzs, nevezetesen a Streptomy5
HU 216 875 Β ces platensis SAM-0654 (a Fermentation Research Institute, Japán intézetnél a FERM BP-1668 katalógusszámon 1988. január 22-én deponálták) szintén termeli a találmány leusztrodukszin-vegyületeit. Erről az ismert törzsről teljes leírást adtak a 329361 számú Európai Szabadalomban, mely leírást a hivatkozás révén a találmányba építettünk.
A találmány leusztrodukszin-vegyületeit ezen gomba törzseinek olyan tápközegben való tenyésztésével lehet előállítani, melyeket hasonló mikroorganizmusokból való más fermentációs termékek termelésére használnak hagyományosan. Az ilyen tápközegek szükségszerűen tartalmaznak mikrobiológiailag asszimilálható szén- és nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat, ahogy ismeretes a tudomány e területén képzett szakemberek számára.
Az előnyben részesített szénforrások közé tartoznak: a glükóz, fruktóz, maltóz, szacharóz, mannit, glicerin, dextrin, zab, rozs, kukoricakeményítő, burgonyakeményítő, kukoricaliszt, szójababliszt, gyapotmagpogácsa, gyapotmagolaj, melasz, citromsav, borkősav és a hasonlók. Ezek a vegyületek magukban vagy bármely megfelelő kombinációban is használhatók. Általában az alkalmazott mennyiség a tápközeg mennyiségének 1-10 tömeg%-ig változik.
Az előnyben részesített nitrogénforrások általában olyan fehérjét tartalmazó anyagok, amilyeneket elterjedten a fermentációs eljárások során alkalmaznak. Az ilyen nitrogénforrásokra példa: a szójababliszt, búzakorpa, földimogyoróliszt, gyapotmagpogácsa, gyapotmagolaj, gyapotmagliszt, kazeinhidrolizátum, fermamin, halliszt, kukoricaáztató lé, pepton, húskivonat, élesztő, élesztőkivonat, malátakivonat, nátrium-nitrát, ammónium-nitrát, ammónium-szulfát és a hasonlók. Ezek a nitrogénforrások magukban vagy bármely megfelelő kombinációban alkalmazhatók. Általában előnyben részesítjük a tápközeg tömegéhez viszonyítva a 0,2-6 tömeg%-ban való alkalmazásukat.
A tápközeghez adható szervetlen tápsók olyan hagyományos sók, melyek biztosítani képesek a különböző mikroorganizmusok szaporodásához a különböző szükséges ionokat, mint például a nátrium-, ammónium-, kalcium-, foszfát-, szulfát-, klorid- és karbonátionokat. Továbbá a tápközegnek kis mennyiséget tartalmaznia kell az alapvető nyomelemekből, például a káliumból, kalciumból, kobaltból, mangánból, vasból és magnéziumból.
Ha a találmány eljárását folyékony tenyésztési technikával végezzük, előnyös egy habzásgátló anyag, mint például a szilikonolaj, növényi olaj vagy felületaktív anyag alkalmazása a tápközegben. A leusztrodukszinvegyületek termeléséhez a tápközeg pH-értéke a Streptomyces nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok tenyésztésekor, különösen a SANK 60 191 törzs tenyésztésekor előnyösen 5,0-8,0 értékek között változik, még előnyösebben 5,0-7,0 között.
A tenyésztést 9-37 °C hőmérsékleti intervallumban bármely hőmérsékleten végezhetjük. Azonban a törzs 20-35 °C hőmérsékleti intervallumban szaporodik jól, és ilyen hőmérsékletet részesítünk előnyben. Előnyösen
22-30 °C hőmérsékletet alkalmazunk a leusztrodukszinok termelésének optimalizálásához.
Ezek a vegyületek aerob tenyésztési körülmények között termelődnek és hagyományos aerob tenyésztési módszerek, mint például a szilárd fázisú tenyésztés, a rázatott kultúra és a levegőztető-keverő (szubmerz) tenyésztési módszerek alkalmazhatók. Kisléptékű tenyésztés esetén tipikusan néhány napig tartó, 28 °C hőmérsékleten való rázókultúrás tenyésztést alkalmazunk. Ilyen kislépétkű tenyésztési módszernél a tenyésztést egy vagy két szaporítási lépéssel indítjuk az oltótenyészet előállításához, például Erlenmeyer-lombikokban, melyeket a folyadék-áramlás szabályozására szolgáló terelőlemezhez rögzítjük. Az oltókultúra előállításhoz használt tápközeg előnyösen tartalmaz szénforrást is és nitrogénforrást is. Az ilyen kisléptékű tenyésztéshez az előnyben részesített lépések sorrendje a következő: Az oltótenyészetet tartalmazó lombikokat állandó hőmérsékletű inkubátorban rázatjuk 28 °C hőmérsékleten 3 napig vagy addig, amíg megfelelő szaporodást érünk el. Ezután az oltókultúrát egy másik oltó tápközegbe visszük át, vagy a termeltető tápközegbe. Ha köztes szaporítási fázist alkalmazunk, alapjában véve ugyanazt a módszert alkalmazzuk a szaporításhoz, és azonos mennyiséget oltunk a kapott köztes termékből a termeltető tápközegbe. A beoltott lombikot néhány napig rázatás mellett inkubálhatjuk, és az inkubáció befejezése után a lombik tartalma centrifugálható vagy szűrhető.
Nagyléptékű termelés esetén előnyösen egy keverővei és egy levegőztetőberendezéssel felszerelt, megfelelő fermentort alkalmazunk. Ez esetben a tápközeg a fermentorban készíthető el. A tápközeget előnyösen a hőmérséklet megfelelő szintre való emelésével sterilezzük, például 120-125 °C hőmérsékletre. Hűtés után a sterilezett tápközeg a korábban elkészített oltótenyészettel inokulálható. A tenyészet ezután keverés és levegőztetés mellett megfelelő hőmérsékleten, például 28 °C hőmérsékleten szaporodik. Ez a módszer alkalmas a találmány vegyületeinek nagy mennyiségben való kinyerésére.
A tenyésztési idő múlásával párhuzamosan változó termelt leusztrodukszinok mennyisége bármely megfelelő módszerrel nyomon követhető, melyek jól ismertek a fermentációs iparban, például HPLC-vel. Leggyakrabban a termelt leusztrodukszinok mennyisége 48-96 órás tenyésztési periódus alatt éri el a maximumot.
A tenyésztés befejezése után a tápleves folyadékrészében és a bakteriális sejtben maradó leusztrodukszinvegyületek hagyományos módszerekkel vonhatók ki és tisztíthatok, a leusztrodukszin-vegyületek fiziko-kémiai tulajdonságait felhasználva. Például a szűrletben vagy a felülúszóban jelen levő leusztrodukszin-vegyületek vízzel nem elegyedő szerves oldószerekkel, mint amilyen az etil-acetát, a kloroform, az etilén-klorid, a metilénklorid vagy a butanol (vagy bármely kettőnek vagy többnek a keveréke) vonható ki savas körülmények között. Ezután a hagyományos módszerekkel tisztítható. Bármely szennyeződés eltávolítható a fent említett oldószerek egyikével vagy több tagjával való kivonással is bázikus körülmények között. Ezután hagyományos
HU 216 875 Β módszerekkel lehet tisztítani. Másik lehetőségként a szennyeződések adszorpcióval távolíthatók el úgy, hogy a leusztrodukszin-vegyületeket tartalmazó folyadékot megfelelő adszorbens rétegen engedjük keresztül, vagy a leusztrodukszin-vegyületek adszorbeálhatók egy megfelelő adszorbensen, és ezután egy megfelelő eluenssel eluálhatók. Ilyen eluensek a vizes metanol, a vizes aceton vagy a vizes butanol. Az ilyen eljárásokban alkalmazható megfelelő adszorbensek közé tartoznak az aktív szén és az adszorbens gyanták, mint például az Amberlit XAD-4 (a Rohm és Haas termékének márkaneve) vagy a Diaion HP-10, HP-20, CHP-20, HP-5 (a Mitsubishi Chemical Industries Co. termékeinek márkanevei). A sejtekben levő leusztrodukszinok megfelelő oldószerrel vonhatók ki, például 50-90 térfogat%-os vizes acetonnal vagy vizes metanollal, melyet a szerves oldószer eltávolítása követ. Ezután a terméket hasonló, a szűrletnél fent leírt kivonási és tisztítási eljárásoknak vetjük alá.
Az így nyert leusztrodukszinok tovább tisztíthatok a jól ismert technikákkal, például adszorpciós oszlopkromatográfiával, olyan hordozót használva, mint például a szilikagélt vagy a magnézium-szilikagélt - például amit Florisil márkanév alatt árulnak; részleges oszlopkromatográfiával olyan adszorbenst használva, mint a Sephadex LH-20 (a Pharmacia egy termékének a márkaneve); vagy HPLC-vel normál fázisú vagy fordított fázisú oszlopot használva. Mint ismeretes, a tudomány e területén ezek az izolálási és tisztítási lépések magukban vagy bármely kombinációban is elvégezhetők, és ha kívánatos, megismételhetők a kívánt leusztrodukszinok izolálásához és tisztításához.
A találmány leusztrodukszinjai olyan új vegyületek, melyekről az irodalomban korábban nem tettek említést. Stimulálják a vérképződési faktorok, mint a G-CSF és a GM-CSF termelődését állatokban (mint például emberben, kutyában, macskában és nyúlban), és ezért hasznosak a rákkemoterápia és -radioterápia által okozott mellékhatások csökkentésére, védenek a fertőzésekkel szemben, és rákellenes hatást mutatnak a makrofágok aktiválásán keresztül. Továbbá várhatóan a leusztrodukszin-vegyületek hasznosak az agyi metabolizmus növelésében az NGF termelődésének stimulálása következtében. Ezenkívül hasznos gombaellenes anyagok, gombaellenes hatást mutatnak a Tricophyton mentagrophytesszel szemben.
A leusztrodukszinok vérképződési faktorok termelődésére kifejtett stimuláló hatását a találmánnyal összhangban, elvben, Rohama et al. [Experimental Hematology 16, 603-608. (1988)] módszerével lehet vizsgálni. Ebben a módszerben különböző vérképződési faktorokat termelő rendszert kombinálunk egy különböző vérképződési faktorokat vizsgáló rendszerrel. Például emberi csontvelő stromasejtekből származó KM-102 sejtek alkalmazhatók a különböző vérképződési faktorok termelésére. Azonban ehelyett bármely olyan sejt is alkalmazható, mely képes különböző vérképződési faktorokat termelni, például elsődleges tenyésztett csontvelő stromasejtek, vaszkuláris endoteliális sejtek, limfociták vagy makrofágok, melyek a csontvelőben találhatók. A vizsgálandó aktivitású vegyület tesztmintáját megfelelő koncentrációra hígítjuk, és a különböző vérképződési faktorokat termelő sejteket („HF-termelő sejtek”) tartalmazó tenyészrendszerhez adjuk. Megfelelő időtartam után, általában 24 óra elteltével, a tenyésztápközeg felülúszójának egy részét eltávolítjuk, és megfelelő koncentrációban hozzáadjuk olyan sejtek tenyészkultúrájához, melyek a különböző vérképződési faktoroktól függnek, például TF-1 sejtekhez és NFS-60 sejtekhez („HF-fiiggő sejtek). Bizonyos idő után a vérképződési faktorok mennyisége mérhető a HF-függő sejtek szaporodásának mérésén keresztül. így vizsgálható a vegyület különböző vérképződési faktorok termelését stimuláló képessége. A HF-függő sejtek szaporodása bármely hagyományos módszerrel meghatározható, például a sejtek tríciumtimidin beépítésének vizsgálatát, vagy az MTT [3(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolium-bromidj-vizsgálati módszert alkalmazva (Chemicon International Inc. USA). A különböző vérképződési faktorok vizsgálata bármely hagyományos módszerrel elvégezhető, mint például a telepképző módszerrel vagy az ELISA-módszerrel.
A találmány leusztrodukszin-vegyületei tartalmaznak mind savas csoportot (a foszforsavas csoport) és bázikus csoportot (az aminocsoport), így sókat tudnak képezni. Nincs különösebb megszorítás ezen savak természetére vonatkozóan, azzal a kikötéssel, hogy ahol terápiás alkalmazásra szánják, ott ezek gyógyszerészetileg elfogadhatók. Ahol nem terápiás alkalmazásra akarják felhasználni, például köztes terméknek más, lehetőleg még aktívabb vegyületek termelésében, ott még ezt a megszorítást sem alkalmazzák. A találmány vegyületei bázisokkal sókat tudnak képezni. Az ilyen sókra példák: az alkálifémekkel képzett sók, például a nátriummal, a káliummal vagy a lítiummal képzett sók, az alkáliföldfémekkel, mint például a báriummal vagy a kálciummal képzett sók, más fémekkel, például a magnéziummal vagy az alumíniummal képzett sók, szerves bázikus sók, például a diciklohexinaminnal képzett só, és bázikus aminosavakkal, mint például a lizinnel vagy az argininnel képzett sók. A találmány vegyületei savas addíciós sókat is képezhetnek. Az ilyen savas addíciós sók közé tartoznak: az ásványi savakkal, különösen a hidrogénhalogenidekkel (mint például a hidrogén-fluoriddal, a hidrogén-bromiddal, a hidrogén-jodiddal vagy a sósavval) képzett sók, a salétromsavval, perklórsavval, szénsavval, kénsavval vagy a foszforsavval, alacsonyabb alkilszulfonsavakkal képzett sók, mint például a metánszulfonsawal, a trifluoro-metánszulfonsavval, vagy az etánszulfonsawal, arilszulfonsavakkal képzett sók, mint például a benzolszulfonsawal vagy a p-toluolszulfonsawal, szerves karboxilsavakkal képzett sók, mint például az ecetsavval, fümársawal, borkősavval, oxálsavval, maleinsawal, almasavval, borostyánkősavval vagy a citromsavval, aminosavakkal képzett sók, mint például a glutaminsawal vagy az aszparaginsawal.
Ha ezeket a vegyületeket terápiás használatra szánják, adhatók magukban vagy egy alkalmas gyógyszerészeti formában, amely tartalmaz az aktív vegyületen túl
HU 216 875 Β egy vagy több hagyományos oldószert, hordozót, kötőanyagot vagy hatásjavítót. A formulázás természete természetesen a kívánt alkalmazási módtól függ. Azonban a szájon át való szedéshez a vegyületet előnyösen porként, granulátumként, tablettaként, kapszulaként vagy szirupként formulázzák. A parenterális alkalmazáshoz előnyösen injekcióként (mely lehet intravénás, intramuszkuláris vagy szubkután) vagy cseppként, vagy kúpként formulázzák. Ezek a készítmények ismert módszerekkel állíthatók elő a következő adalékok hozzáadásával: hordozók, kötők, eloszlatok, nedvesítők, stabilizálok, javítók, oldószerek, szuszpendálószerek, vagy burkolóanyagok. Bár a dózis függ a szimptómáktól és a beteg életkorától, a betegség vagy a rendellenesség természetétől és súlyosságától és az adagolás módjától, felnőtt embernek való orális adagolás esetén a találmány vegyületei általában napi 1 mg-1000 mg mennyiségben adhatók. A vegyületek adhatók egyszeri dózisban vagy osztott dózisokban, például naponta kétszer vagy háromszor.
A találmány vegyületeinek előállítását a következő nem korlátozó példákkal illusztráljuk a továbbiakban.
1. példa
A leusztrodukszin termelése és izolálása
1/A Tenyésztés
Egy platinakacsnyi Streptomyces platensis SANK 60191 spórával inokulálunk egy 500 ml-es terelőlemezzel felszerelt Erlenmeyer-lombikot, mely 100 ml korábban sterilezett tenyésztápközeget tartalmaz (ennek összetételét lentebb adjuk meg). A mikroorganizmust 3 napig 28 °C hőmérsékleten tenyésztettük 200 rpm (7 cm-es rotációs sugarú) fordulatszámon rotációs rázókészüléket használva.
Tenyésztápközeg:
oldható keményítő 30 g, nyers élesztő 10 g, szójababliszt 7 g, halliszt 5 g, kukoricaáztató lé 2 g, húskivonat 1 g, kalcium-karbonát 1 g, vízkiegészítés 1000 ml-re, pH=7,0 (sterilezés előtt).
Az oltókultúrához használt tenyésztápközeg 15 1 mennyiségét szétosztottuk 4 db 30 literes rozsdamentes acéljai fermentorba, és hőkezeléssel sterileztük (120 °C, 30 perc). Ezután a fent leírt módon elkészített oltókultúra 150 ml mennyiségét adtuk a fermentorokhoz. A keveréket 3 napig 28 °C hőmérsékleten tenyésztettük 15 1/perc levegőáramlási sebességű levegőztetéssel, keverés mellett. Az oxigénkoncentráció 5 ppm értéken való tartása érdekében a keverési sebességet automatikusan szabályoztuk 100-300 rpm fordulatszámú intervallumban.
1/B Izolálás
2,4 kg Celit 545-öt (a Johns and Manville Project Corporation USA egyik termékének márkaneve) adtuk a szűrés segítése céljából az 1/A lépésben fent leírt módon nyert tenyésztőfolyadék 60 1 mennyiségéhez, és a keveréket szűrtük. A tenyésztőfolyadék szűrése után 7,2 kg bakteriális sejtet kaptunk. A sejteket egyszer 30150 térfogat%-os vizes acetonnal extraháltuk és kétszer 20 1 80 térfogat%-os vizes acetonnal, minden alkalommal. Ezeket az extraktumokat összegyűjtöttük, és a szerves oldószert kidesztilláltuk forgó evaporátort használva. Megfelelő mennyiségű sósavat adtunk a maradékhoz pH-értékének 2,0 értékre való igazítása céljából, majd a keveréket kétszer extraháltuk minden alkalommal 10 1 etil-acetátot használva. A kivonatokat összegyűjtöttük, és 10 liter 1 vegyes%-os vizes nátrium-hidrogén-karbonát oldatát adtuk hozzá. Az aktív frakciók a vizes rétegbe kerültek át, és az etil-acetátos réteget eltávolítottuk. Ezt az etil-acetátos réteget ismét extraháltuk 5 liter 1 vegyes%-os nátrium-hidrogén-karbonát vizes oldatával. A nátrium-hidrogén-karbonátos oldatokat összegyűjtöttük, és a keverék pH-értékét 2,0-ra állítottuk sósavoldat hozzáadásával. Az oldatot kétszer extraháltuk minden alkalommal 10 1 etil acetátot alkalmazva. A szerves extraktumokat összegyűjtöttük, vízzel, majd nátrium-klorid telített vizes oldatával mostuk, ezután vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítottuk. Folyamatos metanol-hozzáadás mellett az oldatot csökkentett nyomás alatt evaporációval kondenzáltuk forgó evaporátort használva, míg 10 ml olajos anyagot kaptunk. Ezt az olajos anyagot feloldottuk 100 ml 60 térfogat%-os vizes metanolban, és a nyert oldatot Sep-Pak Vác 20 cc C18 Cartridges-en (a Waters Co. USA egy termékének márkaneve) adszorbeáltuk. A szennyeződéseket 30 ml 60 térfogat%-os vizes metanollal eluáltuk. A leusztrodukszin-vegyületeket ezután 15 ml 100%-os metanollal eluáltuk és az eluátumot kondenzáltuk, hogy 800 mg olajos anyagot nyeljünk. Ezt az olajos anyagot 10 ml metanolban oldottuk fel, és HPLC-nek vetettük alá. A 13. percnél és a 24. percnél csúcsot mutató frakciókat összegyűjtöttük és sorrendben „Nyers A frakciónak” és „Nyers B frakciónak” neveztük el. A kromatográfía körülményeit az alábbiakban mutatjuk be.
Preparatív folyadékkromatográfia:
oszlop: Radial-Pak 25x10 (Eaters, USA), eluálószolvens: 0,5% trietilamin-foszfát-puffert tartalmazó 50 térfogat%-os vizes acetonitril, pH=3,0, folyási sebesség: 9 ml/perc, hullámhossz: 230 nm.
Miután ezen csúcsok mindegyikét kondenzáltuk, a nyert frakciókat preparatív HPLC-nek vetettük alá. A Nyers A frakciót preparatív kromatográfíának vetettük alá, hogy az 56. perchez közeli csúcsot összegyűjtsük a következő körülmények között; ezután sótalanítottuk és Sep-Pak-ot használva kondenzáltuk, hogy 11,66 mg leusztrodukszin A-t nyerjünk.
Preparatív körülmények a Nyers A frakcióhoz:
oszlop: Cosmosil 5C 18-AR 20x250 mm (Nakaraitesque Inc.), eluálószolvens: 0,5% trietilamin-foszfát-puffert tartalmazó 42 térfogat%-os vizes acetonitril, pH=3,0, folyási sebesség: 9 ml/perc, hullámhossz: 230 nm.
A Nyers B frakciót preparatív kromatográfíának vetettük alá, hogy a 47. és az 51. perc körüli csúcsokat összegyűjtsük a következő feltételek között; ezután sótalanítottuk és Sep-Pak-ot használva kondenzáltuk,
HU 216 875 Β
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9) hogy 9,83 mg leusztrodukszin B-t és 5,22 mg leusztrodukszin C-t nyeljünk.
Preparatív körülmények a Nyers B frakcióhoz:
oszlop: Cosmosil 5C 18-AR 20x250 mm (Nakaraitesque Inc.), eluálószolvens: 0,5% trietilamin-foszfát-puffert tartalmazó 47 térfogat%-os vizes acetonitril, pH = 3,0, folyási sebesség: 9 ml/perc, hullámhossz: 230 nm.
Az így nyert leusztrodukszin-vegyületek a következő tulajdonságokkal rendelkeznek:
Leusztrodukszin A
1) Kémiai szerkezet: a fent bemutatott (la) képlet szerinti.
Természet: savas, zsíroldékony.
Szín: halványsárga olaj.
Molekulaképlet: C32H52O10NP.
Molekulatömeg: 641, FAB-MS-módszerrel meghatározva („FAB-MS”=Fast Atom Bombardment Mass Spectometry).
Ultraibolya abszorpciós spektrum: 234 nm (maximális abszorpciós metanolban).
Infravörös abszorpciós spektrum: az infravörös spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatta (folyadékfilm vmaxcm-'): 2933, 2867, 1728, 1464,1383,1248, 1176,1056, 969.
Ή magmágneses rezonanciaspektrum: a mágneses rezonanciaspektrumot (270 MHz) nehéz metanolban, belső standardként trimetil-szilént használva, az alábbiakban mutatjuk be:
7,08 (1H duplett a duplettekből, J=9,8 és 4,9 Hz);
6,21-6,35 (2H, multiplett);
6,06 (1H duplett a duplettekből, J= 15,6 és 6,1 Hz); 6,02 (1H duplett a duplettekből, J=9,8 és 1,4 Hz);
5.94 (1H duplett, J= 15,6 Hz);
5,46 (1H, multiplett);
5,31 (1H, multiplett);
5,10 (1H, duplett a duplettekből, J=6,1 és 4,4 Hz);
4.94 (1H, multiplett);
4,72 (1H, multiplett);
4,29 (1H, triplett a duplettekből, J= 10,1, 10,1 és
2,4 Hz);
2,93-3,15 (2H, multiplett);
2,50-2,71 (2H, multiplett);
2,25 (2H, triplett, J=7,6 Hz);
2,16 (1H, multiplett);
0,99-2,01 (18H, multiplett);
0,95 (3H, triplett, J=7,6 Hz);
0,89 (6H, duplett, J=6,8 Hz).
13C magmágneses rezonanciaspektrum (δ: ppm): a magmágneses rezonanciaspektrumot (270 MHz) nehéz metanolban, belső standardként trimetil-szilént használva, az alábbiakban mutatjuk be:
11,4 (kvartett),
22.9 (kvartett),
28.9 (duplett),
34,3 (triplett),
37,1 (triplett),
40,6 (duplett),
73.9 (duplett),
22.7 (triplett), 24,0 (triplett),
32.4 (triplett),
35.7 (triplett),
39.4 (triplett), 40,6 (triplett),
77.8 (singlett),
22,9 (kvartett),
24.7 (triplett),
33.1 (triplett),
36.1 (duplett),
39.5 (triplett),
64.7 (duplett),
78.5 (duplett),
82.3 (duplett), 121,1 (duplett), 123,7 (duplett),
124.3 (duplett), 127,7 (duplett), 135,3 (duplett),
137.3 (duplett), 138,2 (duplett), 152,7 (duplett),
166.3 (singlett), 175,0 (singlett).
10) Oldékonyság:
Oldódik alkoholban, mint például metanolban, etanolban vagy butanolban, valamint acetonban, kloroformban, etil-acetátban és dimetil-szulfoxidban; korlátozottan oldódik vízben; oldhatatlan hexánban.
11) Színreakciók:
Pozitív a kénsav, jód, ninhidrin és ammóniummolibdát-perklórsav-reakciókra.
12) HPLC:
szeparálóoszlop: Cosmosil 5C 18-AR (oszlopméret : 4,6 χ 250 mm a Nakaraitesque Inc. terméke), oldószer: 0,5% trietilamin-foszfát-puffert tartalmazó 45 térfogat%-os vizes acetonitril (pH=3,0), folyási sebesség: 1 ml/perc, hullámhossz: 230 nm, retenciós idő: 9,06 perc és 9,16 perc.
Leusztrodukszin B
1) Kémiai szerkezet: a fent bemutatott (lb) képlet szerinti.
2) Tulajdonság: savas és zsíroldékony.
3) Szín: halványsárga olaj.
4) Molekulaképlet: C34H56O|0NP.
5) Molekulatömeg: 669, FAB-MS-módszerrel meghatározva.
6) Ultraibolya abszorpciós spektrum: 234 nm (maximum abszorpció metanolban).
7) Infravörös abszorpciós spektrum: az infravörös abszorpciós spektrumot a következő abszorpciós maximumok mutatják (folyadékfilm v^cm-1): 2927, 2855, 1729,1463,1380,1250,1172,1056, 968.
8) Ή magmágneses rezonanciaspektrum: a magmágneses rezonanciaspektrumot (270 MHz) nehéz metanolban, belső standardként trimetil-szilánt használva, az alábbiakban mutatjuk be:
7,09 (1H duplett a duplettekből, J=9,8 és 4,9 Hz);
6,21-6,35 (2H, multiplett);
6,07 (1H, duplett a duplettekből, J= 15,6 és 6,1 Hz); 6,02 (1H, duplett a duplettekből, J=9,8 és 1,5 Hz);
5.94 (1H, duplett, J= 15,6 Hz);
5,46 (1H, multiplett);
5,31 (1H, multiplett);
5,10 (1H, duplett a duplettekből, J=6,1 és 4,4 Hz);
4.94 (1H, multiplett);
4,72 (1H, multiplett);
4,29 (1H, triplett a duplettekből, J=9,9, 9,9 és
2,6 Hz);
2,93-3,15 (2H, multiplett);
2,50-2,71 (2H, multiplett);
2,27 (2H, triplett, J=7,3 Hz);
2,17 (1H, multiplett);
1,00-2,01 (22H, multiplett);
0,95 (3H, triplett, J=7,5 Hz);
0,87 (3H, triplett, J=6,8 Hz);
0,86 (3H, duplett, J=6,6 Hz).
9) 13C magmágneses rezonanciaspektrum (δ: ppm): a magmágneses rezonanciaspektrumot (270 MHz)
HU 216 875 Β nehéz metanolban és belső standardként trimetilszilánt használva az alábbiakban mutatjuk be:
11.4 (kvartett), 11,7 (kvartett), 19,6 (kvartett),
22.7 (triplett), 24,7 (triplett), 26,4 (triplett),
27,6 (triplett), 30,6 (triplett), 32,4 (triplett),
33,1 (triplett), 34,1 (triplett), 35,5 (triplett),
35.5 (duplett), 36,1 (duplett), 37,1 (triplett),
37,3 (triplett), 39,4 (triplett), 40,6 (duplett),
40.6 (triplett), 64,7 (duplett), 73,9 (duplett),
77.8 (singlett), 78,5 (duplett), 82,3 (duplett),
121,0 (duplett), 123,7 (duplett), 124,3 (duplett), 127,7 (duplett), 135,2 (duplett), 152,7 (duplett), 166,4 (singlett), 175,1 (singlett).
10) Oldékonyság:
Oldódik alkoholokban, mint például metanolban, etanolban, vagy butanolban, valamint acetonban, kloroformban, etil-acetátban és dimetil-szulfoxidban; korlátozottan oldódik vízben és oldhatatlan hexánban.
11) Színreakció:
Pozitív a kénsav, jód, ninhidrin és ammónium-molibdát-perklórsav reakciókra.
12) HPLC:
szeparálóoszlop: Cosmosil 5C 18-AR (oszlopméret : 4,6 χ 250 mm, Nakaraitesque Inc. terméke), szolvens: 0,5% trietilamin-foszfát-puffert tartalmazó 45 térfogat%-os vizes acetonitril (pH=3,0), folyási sebesség: 1 ml/perc, hullámhossz: 230 nm, retenciós idő: 20,62 perc és 20,87 perc.
Leusztrodukszin C
1) Kémiai szerkezet: a fent bemutatott (Ic) képlet szerinti.
2) Tulajdonság: savas és zsíroldékony.
3) Szín: halványsárga olaj.
4) Molekulaképlet: C34H56Oi0NP.
5) Molekulatömeg: 669 FAB-MS-módszerrel meghatározva.
6) Ultraibolya abszorpciós spektrum: 234 nm (maximum abszorpció metanolban).
7) Infravörös abszorpciós spektrum: az infravörös spektrum a következő abszorpciós maximumokat mutatja (folyadékfilm vmaxcm-’): 2930, 2856, 1728, 1464, 1382,1252, 1172,1056,968.
8) Ή magmágneses rezonanciaspektrum: a mágneses rezonanciaspektrumot (270 MHz) nehéz metanolban, belső standardként trimetil-szilánt használva, az alábbiakban mutatjuk be:
7,08 (1H, duplett a duplettekből, J=9,8 és 4,9 Hz);
6,21-6,35 (2H, multiplett);
6,07 (1H, duplett a duplettekből, J= 15,6 és 6,1 Hz); 6,02 (1H, duplett a duplettekből, J=9,8 és 1,5 Hz);
5.94 (1H, duplett, J= 15,6 Hz);
5,46 (1H, multiplett);
5,31 (1H, multiplett);
5,10 (1H, duplett a duplettekből, J=6,1 és 4,9 Hz);
4.94 (1H, multiplett);
4,72 (1H, multiplett);
4,28 (1H, triplett a duplettekből, J=10,l, 10,1 és 2,4 Hz);
2,93-3,15 (2H, multiplett);
2,50-2,71 (2H, multiplett);
2,27 (2H, triplett, J=7,3 Hz);
2,16 (1H, multiplett);
I, 00-2,01 (22H, multiplett);
0,95 (3H, triplett, J=7,3 Hz);
0,88 (6H, duplett, J=6,3 Hz).
9) l3C magmágneses rezonanciaspektrum (δ: ppm): a magmágneses rezonanciaspektrumot (270 MHz) nehéz metanolban, belső standardként trimetil-szilánt használva, az alábbiakban mutatjuk be:
II, 4 (kvartett), 22,7 (triplett), 23,1 (kvartett),
23.1 (kvartett), 24,7 (triplett), 26,2 (triplett),
28.2 (triplett), 29,1 (duplett), 30,4 (triplett),
32.4 (triplett), 33,1 (triplett), 34,2 (triplett),
35.4 (triplett), 36,1 (duplett), 37,1 (triplett),
39.4 (triplett), 40,0 (triplett), 40,6 (duplett),
40,6 (triplett), 64,6 (duplett), 73,9 (duplett),
77,8 (singlett), 78,4 (duplett), 82,3 (duplett),
121.1 (duplett), 123,7 (duplett), 124,3 (duplett), 127,7 (duplett), 135,2 (duplett), 137,3 (duplett),
138.2 (duplett), 152,7 (duplett), 166,4 (singlett), 175,0 (singlett).
10) Oldékonyság:
Oldódik alkoholban, mint például metanolban, etanolban, vagy butanolban, valamint acetonban, kloroformban, etil-acetátban és dimetil-szulfoxidban; korlátozottan oldódik vízben; oldhatatlan hexánban.
11) Színreakciók:
Pozitív a kénsav, jód-ninhidrin és ammóniummolibdát-perklórsav reakciókra.
12) HPLC:
szeparálóoszlop: Cosmosil 5C 18-AR (oszlopméret : 4,6 χ 250 mm, a Nakaraitesque Inc. terméke), szolvens: 0,5% trietilamin-foszfát-puffert tartalmazó 45 térfogat%-os vizes acetonitril (pH=3,0), folyási sebesség: 1 ml/perc, hullámhossz: 230 nm, retenciós idő: 21,90 perc és 22,19 perc.
Biológiai aktivitás
A következő tesztpéldákban részletesebb magyarázatot adunk a találmány vegyületeinek hatásairól.
1. tesztpélda
A GM-CSF-termelés stimulálása
A találmány vegyületeinek GM-CSF-termelésre kifejtett stimuláló hatását lényegében a Kohama et al. [Experimental Hematology 16, 603-608. (1988)] és a Kitamura et al. [Journal of Cellular Physiology 140, 323-334. (1989)] módszereit kombinálva határoztuk meg. Részletesebben, a GM-CSF-termelésre hivatott humán csontvelő stromasejtekből származó KM-102 sejteket megfelelő koncentrációjúra hígított tesztmintával („a GM-CSF-termelő rendszer”) kevertük össze. 24 óráig tartó inkubálás után a tenyészoldat felülúszójának egy részét hozzá adtuk a GM-CSF-függő humán TF-1 sejtek tenyészrendszeréhez. 48 és 72 óra közötti idő eltelte után a GM-CSF mennyiségét mértük a TF-1 sejtek (a „GM-CSF vizsgálati rendszer”) szaporodásán keresztül,
HU 216 875 Β hogy megkapjuk a GM-CSF-termelés stimulálásának mértékét. A TF-1 sejtek szaporodását trícium-timidin pulzálójelöléssel határoztuk meg 4 órán keresztül. Hasonló eredményeket nyertünk a TF-1 sejtek szaporodásának MMT kittel (Chemicon International Inc. USA) és a GM-CSF ELISA kittel (Genzyme Inc. USA) való mérésével. Azt, hogy a GM-CSF-termelést indukáló rendszer normálisan működött-e vagy sem, rekombináns interleukin 1β (IÁ-^:Genzyme, Inc. USA) vizsgáltuk meg. Az IÁ -1 β dózisfüggő módon 1-100 egység per ml tartományban indukálta a GM-CSF-termelést, és maximálisan az indukált GM-CSF-termelés 10-20-szorosa volt az IÁI nélküli termelésnek. Ez azt mutatja, hogy a kísérleti rendszer normálisan funkcionált.
Miután a KM-102 sejtekhez a leusztrodukszin A-t, B-t vagy C-t bizonyos koncentrációban hozzáadtuk, úgy találtuk, hogy a GM-CSF-termelést dózisíüggő módon minden hozzáadás indukálta. Maximálisan a termelt GM-CSF mennyisége 10-20-szorosa volt a hozzáadás nélkül termelt mennyiségnek. Az ED50-értékeket sorrendben, 180 + 50, 50+15 és 50 + 15 ng/ml-nek találtuk a Leusztrodukszin A, B és C esetében.
2. tesztpélda
A G-CSF-termelés stimulálása
A G-CSF termelés stimulálását olyan rendszerben vizsgáltuk, amilyenben az 1. tesztpéldában alkalmazott GM-CSF vizsgálati rendszert egy G-CSF vizsgálati rendszerrel helyettesítettük, ahogy azt Shirafüji et al. [Experimental Hematology 17, 116-119. (1989)] leírta. Részletesebben, a G-CSF termelésre hivatott humán csontvelő-stromasejtekből származó KM-102 sejteket hozzáadtuk egy megfelelő koncentrációjúra hígított leusztrodukszin-oldathoz (a „G-CSF termelő rendszer”). 24 órás inkubáció után a tenyészoldat felülúszójának egy részét hozzáadtuk a G-CSF-függő NFS-60 sejtek tenyészrendszeréhez. 24-48 óra közötti idő eltelte után a G-CSF mennyiségét az NFS-60 sejtek („G-CSF vizsgálati rendszer”) szaporodásából határoztuk meg, hogy megkapjuk a G-CSF termelés stimulálásának mértékét. Az NFS-60 sejtek szaporodását trícium-timidin pulzusjelöléssel határoztuk meg 4 órán keresztül. Hasonló eredményeket kaptunk az NFS-60 sejtek szaporodásának MTT kittel való vizsgálatakor, és a G-CSF ELISA kittel [Motojima et al.: Journal of Immunological Methods 118, 187-192. (1989)] való vizsgálatakor. Azt, hogy a G-CSF termelést indukáló rendszer normálisan funkcionált-e vagy sem, rekombináns interleukin 1β (IÁ— 1 β: Genzyme Inc. USA) módszerrel határoztuk meg. Az IÁ-Ιβ dózisfiiggő módon indukálta a G-CSF termelést 1-100 egység/ml tartományban, és maximálisan az indukált G-CSF termelés 10-20-szorosa volt az IÁ-1 β nélküli termelésnek. Ez a kísérleti rendszer normális működését mutatta.
A leusztrodukszin A, B és C KM-102 sejtekhez bizonyos koncentrációban való hozzáadása után úgy találtuk, hogy a G-CSF termelés indukálása dózisfüggő volt. Maximálisan a termelt G-CSF 10-20-szorosa volt a hozzáadás nélkül termelt anyag mennyiségének. Az ED50-értékeket sorrendben 200 + 50, 50+15 és
50+15 ng/ml-nek találtuk a leusztrodukszin A, B és C esetében.
3. tesztpélda
Az NGF-termelés stimulálása
Furukawa et al. arról számoltak be, hogy az egérkötőszövetből származó fibroblasztképző L-M sejtek viszonylag óriási mennyiségű NGF-et termelnek és szekretálnak. A katekolaminok serkentik ezt a termelést és a kiválasztást [J. Bioi. Chem. 261, 6039-6047. (1986)]. Megvizsgáltuk, hogy vajon a leusztrodukszinok stimulálják-e az NGF-termelést és -szekréciót, vagy sem.
Az L-M sejteket 0,5% peptont tartalmazó 199-es tápközegben tenyésztettük. A 24 üregű tenyészlemez minden üregébe 5 χ 104 L-M sejtet inokuláltunk és egy CO2-inkubátorban tenyésztettük (37 °C, 5% CO2) összefolyásig. A tenyésztőfolyadékot eltávolítottuk és a sejteket egyszer 0,5% szarvasmarha-szérumalbumint (Sigma) tartalmazó 199-es tápközeggel mostuk. A 0,5% szarvasmarha-szérumalbumint tartalmazó 199-es tápközeghez bizonyos koncentrációban a leusztrodukszinok egyikét adtuk hozzá, majd ezzel az eleggyel kezeltük az L-M sejteket. Ezután az L-M sejteket CO2-inkubátorban tenyésztettük 24 órán keresztül. A tenyésztőfolyadék összegyűjtése után megvizsgáltuk a folyadék NGFtartalmát.
Az NGF-et immunovizsgálattal határoztuk meg [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3513-3516. (1983)]. Egy 96 üregű polisztirénlemez minden üregébe 75 μΐ antiegér β NGF antitest (Boehringer) oldatot (0,3 pg/ml, pH=9,6) adagoltunk, és egy óráig szobahőmérsékleten hagytuk állni. Az antitest eltávolítása után az összes üreget egy mosóoldattal mostuk háromszor. A standard βΝΟΡ (Wako Pure Chem. Ind.) vagy a standard oldat 50 μΐ mennyiségét adtuk az üregekbe, és az elegyet 6-8 óráig állni hagytuk szobahőmérsékleten. Ezután a standard 3NGF-et vagy a standard oldatot eltávolítottuk, és az összes üreget háromszor mostuk. Jelölt anti^NGF monoklonális antitest (Boehringer) oldat (100 mU/ml, pH=7,0) 50 μΐ mennyiségét adtuk az üregekbe, és az oldatot 15-18 óráig hagytuk állni 4 °C hőmérsékleten. Az idő elteltével az enzimjelölt antitesteket eltávolítottuk, és az összes üreget háromszor mostuk. Ezután klorofenol^-D-galaktozid (Boehringer) oldat (1 mg per ml, pH=7,3) 100 μΐ mennyiségét adtuk minden üregbe. Miután megfelelő szín alakult ki (2-3 óra után, szobahőmérsékleten) az abszorbanciát meghatároztuk 570 nm hullámhosszon. Az NGF mennyiségét a standard görbéből számítottuk ki és ezt viszonyítottuk %-ként a leusztrodukszinos kezelés nélküli sejtek által termelt és szekretált NGF mennyiségéhez.
Az összes leusztrodukszin stimulálja az NGF-termelést, dózisfüggő formában. 5 pg/ml leusztrodukszin kétszer több NGF-termelést indukált a kezelés nélküli sejtek által termelt mennyiséghez képest.
4. tesztpélda
Gombaellenes aktivitás
A leusztrodukszinok állat patogén gombák elleni gombaellenes hatásának vizsgálata céljából az aktivi11
HU 216 875 Β tást Tricophyton mentagrophytes ellen teszteltük. Az összes leusztrodukszin esetén gátlási zónát figyeltünk meg az 1 pg/kororrg koncentrációnál.
5. tesztpélda
Akut toxicitás
A hagyományos eljárásnak megfelelően az akut toxicitást 5 ddY egéren (hímek) teszteltük. 0,2 mg/kg dózisú leusztrodukszin A interperitoneális adagolása után nem figyeltünk meg toxicitást az 5 napos időtartam alatt. Hasonlóan nem észleltünk toxicitást a leusztrodukszin B és a leusztrodukszin C, és ezek rokon származékainak alkalmazása esetén sem.
A fent leírtak alapján nyilvánvaló, hogy a leusztrodukszin A, B és C stimulálják a vérképződési faktorok, mint például a granulocita telepstimuláló faktor és a granulocita makrofág telepstimuláló faktor termelését. Ennek megfelelően a leusztrodukszinok hasznosak terápiás anyagokként a rákkemoterápia és -radioterápia által okozott mellékhatások csökkentésében. Védelmet biztosítanak a fertőzésekkel szemben és rákellenes hatásúak a makrofágok aktiválásán keresztül. Továbbá a leusztrodukszinok hasznosak az agyi metabolizmus növelésében az NGF-termelés stimulálása révén. Továbbá a leusztrodukszinok hasznosak gombaellenes anyagként is, amit a Tricophyton mentagrophyces elleni gombaellenes hatásuk is bizonyít.

Claims (7)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás (I) általános képletű leusztrodukszin - ahol R jelentése 5-metil-hexanoil-oxi-csoport, 6-metil-oktanoil-oxi-csoport vagy 7-metil-oktanoil-oxi-csoport vagy ezek sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy egy, a Streptomyces nemzetségbe tartozó leusztrodukszint termelő mikroorganizmust tenyésztünk, és a tenyészetből legalább az egyik leusztrodukszint kinyeijük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (la) képletű vegyületet állítjuk elő.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (Ib) képletű vegyületet állítjuk elő.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az (le) képletű vegyületet állítjuk elő.
  5. 5. Az 1-4. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Streptomyces platensis faj egy olyan törzsét alkalmazzuk, mely leusztrodukszint termel.
  6. 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként a Streptomyces platensis SANK 60 191 (FERM BP-3288) törzset alkalmazzuk.
  7. 7. Eljárás gyógyszerészeti készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1-6. igénypontok bármelyike szerint előállított (I) általános képletű leusztrodukszint - ahol R jelentése az 1. igénypontban megadott - vagy ennek sóját legalább egy gyógyszerészetileg elfogadható hordozóval vagy hígítóval szokásos adagolási formává alakítunk.
HU9201005A 1991-03-27 1992-03-25 Eljárás leusztrodukszin és az azt tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására HU216875B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP6308791 1991-03-27

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9201005D0 HU9201005D0 (en) 1992-06-29
HUT60521A HUT60521A (en) 1992-09-28
HU216875B true HU216875B (hu) 1999-09-28

Family

ID=13219198

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9201005A HU216875B (hu) 1991-03-27 1992-03-25 Eljárás leusztrodukszin és az azt tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására

Country Status (23)

Country Link
US (2) US5334587A (hu)
EP (1) EP0506463B1 (hu)
JP (1) JPH05123179A (hu)
KR (1) KR0145680B1 (hu)
CN (1) CN1058294C (hu)
AT (1) ATE134640T1 (hu)
AU (1) AU649116B2 (hu)
CA (1) CA2064126A1 (hu)
CZ (1) CZ279299B6 (hu)
DE (1) DE69208494T2 (hu)
DK (1) DK0506463T3 (hu)
ES (1) ES2086651T3 (hu)
FI (1) FI101978B (hu)
GR (1) GR3019996T3 (hu)
HK (1) HK117696A (hu)
HU (1) HU216875B (hu)
IE (1) IE74389B1 (hu)
IL (1) IL101394A (hu)
IS (1) IS1604B (hu)
NO (1) NO304600B1 (hu)
NZ (1) NZ242155A (hu)
RU (1) RU2082760C1 (hu)
TW (1) TW212182B (hu)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU649116B2 (en) * 1991-03-27 1994-05-12 Sankyo Company Limited New compounds, named the "Leustroducins", their preparation and their therapeutic uses
ATE166058T1 (de) * 1993-04-23 1998-05-15 Sankyo Co Neue verbindung, leustroducsin h, ihre herstellung und therapeutische verwendung
DE69626624T2 (de) * 1995-10-17 2003-11-27 Daiichi Suntory Pharma Co Medikamente gegen trhombocytopenie
US9861346B2 (en) 2003-07-14 2018-01-09 W. L. Gore & Associates, Inc. Patent foramen ovale (PFO) closure device with linearly elongating petals
KR20070064414A (ko) * 2003-09-17 2007-06-20 이코스 코포레이션 세포 증식 제어를 위한 ｃｈｋ1 억제제의 용도
US9005242B2 (en) 2007-04-05 2015-04-14 W.L. Gore & Associates, Inc. Septal closure device with centering mechanism
US20130165967A1 (en) 2008-03-07 2013-06-27 W.L. Gore & Associates, Inc. Heart occlusion devices
US8956389B2 (en) 2009-06-22 2015-02-17 W. L. Gore & Associates, Inc. Sealing device and delivery system
US20120029556A1 (en) 2009-06-22 2012-02-02 Masters Steven J Sealing device and delivery system
US10828019B2 (en) 2013-01-18 2020-11-10 W.L. Gore & Associates, Inc. Sealing device and delivery system
US9808230B2 (en) 2014-06-06 2017-11-07 W. L. Gore & Associates, Inc. Sealing device and delivery system
CN116396359A (zh) * 2020-02-17 2023-07-07 中国医学科学院医药生物技术研究所 一组具有抗病毒活性的肽类化合物奥米克欣a族化合物及其应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3592925A (en) * 1969-04-21 1971-07-13 American Cyanamid Co Antibiotics ah272alpha2 and ah272beta2 and process for producing same
US3907779A (en) * 1974-05-20 1975-09-23 Upjohn Co 5,6 Dihydro-5-azathymidine and derivatives
AU574713B2 (en) * 1983-09-12 1988-07-14 Warner-Lambert Company Cl-1957a antibiotic compound and its production
US4575500A (en) * 1984-03-26 1986-03-11 Merck & Co., Inc. Antifungal substances and process for their production
JPH02186A (ja) * 1987-05-07 1990-01-05 Sumitomo Chem Co Ltd 新規化合物およびそれを有効成分とする農工業用殺菌剤
ATE131169T1 (de) * 1988-02-13 1995-12-15 Suntory Ltd 2-pyranon-derivat und verfahren zu dessen herstellung.
JP2865302B2 (ja) * 1988-02-13 1999-03-08 サントリー株式会社 ２―ピラノン誘導体及びその製造法並びにそれを含む抗菌剤
AU649116B2 (en) * 1991-03-27 1994-05-12 Sankyo Company Limited New compounds, named the "Leustroducins", their preparation and their therapeutic uses

Also Published As

Publication number Publication date
US5334587A (en) 1994-08-02
IE74389B1 (en) 1997-07-30
CZ279299B6 (cs) 1995-04-12
CZ91592A3 (en) 1993-04-14
IS3829A (is) 1992-09-28
KR920018215A (ko) 1992-10-21
FI101978B1 (fi) 1998-09-30
HUT60521A (en) 1992-09-28
ATE134640T1 (de) 1996-03-15
NO304600B1 (no) 1999-01-18
AU649116B2 (en) 1994-05-12
HU9201005D0 (en) 1992-06-29
FI101978B (fi) 1998-09-30
JPH05123179A (ja) 1993-05-21
CN1058294C (zh) 2000-11-08
EP0506463A3 (en) 1993-01-13
DK0506463T3 (da) 1996-06-10
HK117696A (en) 1996-07-12
CA2064126A1 (en) 1992-09-28
CN1066292A (zh) 1992-11-18
GR3019996T3 (en) 1996-08-31
NZ242155A (en) 1993-09-27
FI921339A0 (fi) 1992-03-26
IE920965A1 (en) 1992-10-07
TW212182B (hu) 1993-09-01
RU2082760C1 (ru) 1997-06-27
AU1312392A (en) 1992-10-01
US5443972A (en) 1995-08-22
FI921339A (fi) 1992-09-28
KR0145680B1 (ko) 1998-08-01
IL101394A (en) 1996-05-14
NO921158D0 (no) 1992-03-25
ES2086651T3 (es) 1996-07-01
DE69208494T2 (de) 1996-10-24
EP0506463B1 (en) 1996-02-28
IS1604B (is) 1996-10-18
IL101394A0 (en) 1992-11-15
EP0506463A2 (en) 1992-09-30
DE69208494D1 (de) 1996-04-04
NO921158L (no) 1992-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4990448A (en) Bu-4061T
US5443972A (en) Process to prepare leustroducsins
US5071957A (en) Antibiotic BU-4061T
KR0135600B1 (ko) 항암 항생물질 mi43-37f11, 그 제조방법 및 그 용도
EP0274873A2 (en) Antibiotic A10255 complex and factors, process, microorganisms for its production
EP0350623A2 (en) BU-3420T antitumor antibiotic
KR880002688B1 (ko) 항생물질의 제조방법
US4792522A (en) Rigolettone antitumor complex
JP5038572B2 (ja) シクリポスチン類、その製造方法およびその使用方法
HU214702B (hu) Polihidroxi-ciklopentán-származékok, eljárás az előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények
US6432978B1 (en) SF2809-I,II,III,IV,V and VI substances exhibiting chymase-inhibiting activities
RU2221870C2 (ru) Мумбайстатин, способ его получения и его применение в качестве фармацевтического препарата
WO2009119710A1 (ja) 新規抗生物質sf2876物質、その製造法および医薬組成物
JP3830964B2 (ja) 海洋放線菌から単離した新規なチオデプシペプチド
US6756402B2 (en) Cyclipostins, process for their preparation and use thereof
EP0721957B1 (en) Compound ge3
JP2971204B2 (ja) 新規物質ｗｋ−２９５５およびその製造法
JP2000159765A (ja) 新規抗細菌化合物
JPH08208690A (ja) ペプチド化合物
JP2008074710A (ja) 新規ａ−９７０６５類物質
JPH09286779A (ja) 新規化合物レブラスタチン
JPH06135982A (ja) 新規生理活性物質ｈｒ０４
WO2004046368A1 (ja) 新規抗生物質ムラミノミシン(Muraminomicin)
JP2002241394A (ja) 新規カプラマイシン類縁体
JPS6236355A (ja) 新規ピロリン化合物

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee