CN1058294C - 路斯绰达克星化合物的制备方法 - Google Patents

路斯绰达克星化合物的制备方法 Download PDF

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Abstract

我们命名为“路斯绰达克星”的新化合物及其盐，该化合物具有式(I)：
式中R代表5-甲基己酰氧基、6-甲基辛酰氧基或7-甲基辛酰氧基，它们可以通过使用链霉菌属微生物、特别是Streptomyces Platen sis种的菌株例如菌株SANK 60191(FERM BP-3288)发酵制备。这些化合物可用于治疗或预防；癌症化疗或放疗所引起的副反应；感染；癌症；脑机能障碍；以及真菌感染。

Description

路斯绰达克星化合物的制备方法
本发明提供了一系列新的化合物，我们称之为“路斯绰达克星A”、“路斯绰达克星B”和“路斯绰达克星C”。这些化合物具有下文中所示的式(I)。本发明还提供了通过使用链霉菌属微生物，特别是Streptomyces platensis发酵制备这些化合物的方法，这是一种新的菌株，它也构成了本发明的一部分。本发明的化合物具有各种治疗作用。因此，本发明也提供了使用这些化合物治疗或预防的组合物及方法。
本发明的路斯绰达克星是新化合物，它们能够刺激生血因子例如粒细胞菌落刺激因子(下文缩写为“G-CSF”)和粒细胞—巨噬细胞菌落刺激因子(下文缩写为“GM-CSF”)产生；它们还能刺激神经生长因子(下文缩写为“NGF”)产生；而且，它们具有抗真菌作用，例如抗Tricophyton mentagrophytes。
各种细胞激动素(cytokines)具有生血活性，例如克隆刺激因子(下文缩写为“CSF”)，并且到目前为止通过基因操作技术已经制备了几种糖蛋白(一般命名为“白细胞介素”)。这些物质在临床上已经以各种途径被用于降低通常因癌症化疗和放疗所引起的有害副作用并阻断感染。这些物质的效力目前已经变得清楚了〔Br.J.Cancer 59，2-5(1989)〕。
已经发现通过各种途径给人服用这些因子本身导致了明显的药理学作用，这样就使得在治疗中使用这些因子成为可能。但是，我们认为这些因子实际上是由某些种类的细胞(例如淋巴细胞、单核细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞和基质细胞)通过复杂的调节系统体内产生的，并且它们在各种血细胞的产生中具有自身稳定作用。因此，如果不考虑该调节机理的灵敏的平衡而服用这些因子，就会发现几种因调节机理失调所引起的副作用；这些副作用的例子包括在注射部位有炎症、骨痛、发烧和发冷。
相反，代替服用这些生血因子本身的可能是服用某些已知能够在体内刺激这些生血因子产生的物质。例如，已知白细胞介素1(下文缩写为IL-1)和肿瘤坏死因子(下文缩写为TNF)可以通过各种细胞诱导CSF等产生。但是，这些因子不能总是作为生血因子的特异性诱导剂，因为它们还具有许多其他的生物学活性。
我们还知道，各种低分子量免疫激活剂，例如脂多糖(下文缩写为LPS)和胞壁酰二肽(下文缩写为MDP)可以通过激活单核细胞和巨噬细胞产生各种CSF′s。但是由于激活巨噬细胞引起的其他生理学作用是已知的，例如与此时产生了单分裂(monokines)如IL-1和TNF，它们会导致各种副作用，例如发烧〔NipponActa Radiologica 48，(4)，514(1988)〕。
已知佛波醇酯和钙离子载体协同诱导CSF产生〔Kohama等人：Experimental Hematology 16，603-608(1988)〕，但是我们还知道它们不仅仅刺激生血因子产生，而且还刺激全分泌蛋白包括激素如胰岛素产生及分泌〔Y.Nishizuka：Science 225，1365(1984)〕。
尽管精确的机理目前还不清楚，但是可以认为在血细胞形成中，各种成熟的血细胞可以通过各种生血因子的作用以及通过细胞与细胞的相互作用从普通的、被称作生血干细胞的细胞前体中产生。已经确定形成正常成熟血细胞的部位仅仅限于骨髓内，那些存在于骨髓中被称作基质细胞的细胞在血细胞的形成中具有重要作用〔Dexter等人：J.Cell.Physiol.91，335(1977)〕，而且骨髓中的基质细胞产生各种生血因子〔Harigaya等人：Proc.Natl.Acad.Sci.USA82，3477(1985)；Kohama等人：ExperimantalHematology 16，603-608(1988)〕。
因此，如果能够发现可以通过基质细胞刺激生血因子产生的物质，那么该物质就不仅仅在分析生理条件下生血机理的作用和血液病的病理学中具有重要作用，而且还可以考虑它临床使用。
欧洲专利公开号329361公开了某些新的2-吡喃酮衍生物，它们与本发明的化合物类似，只是基团“R”的性质不同，其定义如下。那些现有技术的化合物也只是被描述为用作农业杀虫剂，而且在公开的技术中没有表明它们具有本发明化合物的有价值的和出人意料的治疗和预防活性。尽管现有技术的化合物与本发明化合物一样通过微生物Streptomyces platensis产生，但是可以确信现有文献中所述的菌株明显不同于本发明所述的。
在日本专利公开Kokai Hei 2-86中描述了基本上具有同样所公开效用的非常相似的化合物和微生物，它们也同样被认为明显不同于本发明所公开的化合物和微生物。
Journal of Antibiotics(第XLII卷，第9号，第1331页)公开了一种新的抗肿瘤化合物，作者称之为“二乙氧膦酰硫胆碱”，它是由链霉菌属微生物产生的，然后将其重新分离。但是，该微生物被明显地描述为Streptomyceshygroscopicus，并且它与本发明使用的Streptomycesplatensis不同，而且，尽管现有技术的二乙氧膦酰硫胆碱与本发明的化合物一样同时具有一个氨基和一个磷基，但是它具有不同的分子式，因此明显不同。
因此本发明的一个目的是提供一系列具有各种药理学活性的新的磷酸化合物。
特别是可以确信，本发明的化合物具有以下活性：它们降低因癌症化疗或放疗导致的副反应；它们具有抗感染的保护作用；它们能激活巨噬细胞并因此具有抗癌作用；它们能改善大脑的功能；此外，它们可作为抗真菌剂。
因此，本发明提供了式(I)化合物及其盐：式中R代表5-甲基己酰氧基、6-甲基辛酰氧基或7-甲基辛酰氧基。这些化合物分别被我们命名为“路斯绰达克星A”、“路斯绰达克星B”和“路斯绰达克星C”。
本发明还提供了制备路斯绰达克星的方法，该方法包括培养产生路斯绰达克星的链霉菌属微生物，并且从该培养物物中收集至少一种路斯绰达克星。
本发明还提供了含有至少一种与可药用载体或稀释剂混合的路斯绰达克星或其盐的药物组合物。
本发明进一步提供了治疗和预防下述疾病的方法：因癌症化疗或放射治疗所导致的副反应、感染、癌症、脑机能障碍和真菌感染，该方法包括给患有这些反应、感染、癌症或机能障碍或者对这些疾病敏感的哺乳动物(可以是人)服用有效量的至少一种路斯绰达克星或其盐。
本发明的三种路斯绰达克星如下：
        路斯绰达克星A：
Figure C9210312600081
R为5-甲基己酰氧基。
路斯绰达克星B：R是6-甲基辛酰氧基。
路斯绰达克星C：R是7-甲基辛酰氧基。
从上面的式中可以明显看出，本发明的路斯绰达克星含有若干不对称碳原子和几个双键。因此它们可以形成各种旋光异构体和几何异构体。尽管这些异构体在本文中都用一个单一分子式表示，但是本发明仍包括每一个独立的异构体、分离的异构体和混合物，包括其外消旋物。当使用立体有择合成技术或者使用旋光活性化合物作为起始材料时，可以直接制备各个异构体；相反，如果制备异构体的混合物，可以通过常规的拆分技术获得各个异构体。
通过培养产生路斯绰达克星的链霉菌属微生物可以制备本发明的路斯绰达克星，然后从培养基中收集一种或多种路斯绰达克星。
特别是，我们特别优选使用一种新分离的链霉菌属菌株作微生物，我们已经确定该菌株属于Streptomyces platensis，并且我们称之为SANK 60191(CCTCC No：M 92007)。
该微生物于1992年3月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No：M 92007。
Streptomyces platensis SANK60191(CCTCC No：M 92007)详细的微生物性质如下。1.形态学特征
将Streptomyces platensis SANK 60191于28℃在ISP(International StreptomycesProject)规定的每种琼脂培养基上培养14天。培养14天后，在显微镜下观测，发现该菌株的底物菌丝体充分伸长并分支，颜色变为淡黄灰色或淡黄橙色。可是在诺卡(Nocardioform)放线菌中既没有观察到可观测的分裂，又没有观察到可观测的之字形伸长。气生菌丝体的分支是简单的。孢子链是松散的螺旋形，10至50个或更多的孢子形成一条链。用扫描显微镜观测表明孢子的表面结构是光滑的。孢子是卵圆形的或椭园形的，其大小为0.5-0.6×0.6-1.3μm。没有发现旋转的气生菌丝体、菌核、菌丝分裂和特殊器官，例如孢子囊。2.在各种培养基上的性质
表1表明了在28℃下微生物在各种培养基上培养14天后的性质。以Nippon Shikisai Kenkyusho编著的“颜色标准指南(Guide to Color Standard)”所给出的颜色指示数表示颜色。随着时间的推移菌株变得潮湿，而且其颜色变成黑色。
在表中使用了下列缩写：
G：生长；AM：气生菌丝体；R：反向；SP：可溶色素；
SC：具体特征。
               表1培养基        项目    SANK 60191的性质蔗糖-         G：     良好，光滑，淡黄橙色硝酸盐                (2-9-9)琼脂          AM：    良好，柔软光滑，带淡褐色的灰色
                  (2-7-8)
          R：     淡棕色(2-8-9)
          SP：    没有形成葡萄糖-       G：     良好，光滑，淡黄橙色
                  (2-9-9)天冬酰胺琼脂  AM：    中等，柔软光滑，白色
          R：     淡棕色(2-8-9)
          SP：    没有形成甘油-            G：     非常好，光滑，淡黄橙色天冬酰胺                 (2-9-9)琼脂             AM：    中等，柔软光滑，带褐色的灰色(ISP5)                   (2-6-8)
             R：     淡黄色淡棕色(4-8-9)
             SP：    没有形成无机盐-          G：     良好，光滑，淡黄橙色淀粉琼脂                 (2-9-9)(ISP4)           AM：    良好，柔软光滑，带褐色的白色
                     (1-6-6)
             R：     带褐色的灰色(2-5-9)
             SP：    没有形成
             SC：    气生菌丝变得潮湿并且它们的颜色变
                     成黑色酪氨酸           G：     非常好，光滑，淡黄橙色琼脂                     (2-9-9)(ISP7)           AM：    良好，柔软光滑，白色，带淡褐色的
                     灰色(2-7-8)斑点
             R：     淡黄棕色(4-8-9)
             SP：    没有形成营养琼脂         G：     良好，光滑，淡黄橙色(DIFCO)                  (2-9-9)
             AM：    中等，柔软光滑，白色
             R：     淡黄棕色(4-8-9)
             SP：    没有形成酵母提取物-       G：     非常好，光滑，淡黄橙色麦芽提取物                (2-9-9)琼脂              AM：    充分形成，柔软光滑，带淡褐色的白(ISP2)                    色(1-7-6)
              R：     淡黄棕色(6-7-9)
              SP：    没有形成
              SC：    气生菌丝变得潮湿并且它们变成黑色燕麦琼脂          G：     良好，光滑，淡黄橙色(ISP3)                    (2-9-9)
              AM：    良好，柔软光滑，深棕灰色
                      (1-4-6)
              R：     黄棕色(4-6-9)
              SP：    没有形成水琼脂            G：     中等，光滑，黄灰色(1-9-10)
              AM：    中等，柔软光滑，棕灰色
                      (2-5-8)
              R：     淡棕灰色(2-7-8)
              SP：    没有形成土豆提取物-       G：     中等，光滑，黄灰色(1-9-10)胡萝卜提取物      AM：    中等，柔软光滑，棕灰色
                      (2-5-8)
              R：     淡棕灰色(2-7-8)
              SP：    没有形成3.生理学性质
在28℃开始培养后2-21天内所观察的菌株SANK60191的生理学性质表示在表2中。
                  表2淀粉水解                                      阳性明胶液化                                      阴性硝酸盐还原                                    阴性牛奶凝固                                      阴性牛奶胨化                                      阴性黑素样色素产生
(培养基1)*                               阴性
(培养基2)                                 阴性
(培养基3)                                 阴性底物分解
酪蛋白                                    阴性
酪氨酸                                    阳性
黄嘌呤                                    阳性生长的温度范围(培养基4)                       9-35℃生长的最适温度(培养基4)                       20-26℃氯化钠耐受性                                  10％*：培养基1.胰胨—酵母提取物肉汤(ISP1)；
     2.胨—酵母提取物铁琼脂(ISP6)；
     3.酪氨酸琼脂(ISP7)；
     4.酵母提取物—麦芽提取物琼脂(ISP2)。
在28℃用Pridham-Gottlieb琼脂(ISP9)作培养基对菌株SANK 60191进行培养。培养14天后所观测的碳源利用模型示于表3。
                 表3
D-葡萄糖        +        D-果糖           +
L-阿拉伯糖      -        L-鼠李糖         -
D-木糖          -        蔗糖             +
肌醇            +        蜜三糖           +
D-甘露糖        +        对照             -
  +利用阳性；
  -利用阴性。4.细胞成分
按照B.Becker等人的方法〔Applied Microbiology，12，421-423(1987)〕对菌株SANK 60191的细胞壁进行分析。由于检测到了LL-二氨基庚二酸，所以可以证实细胞壁是I型。按照M.P.Lechevalier的方法〔Journal of Laboratory & Clinical Medicine，71，934(1968)〕对菌株SANK 60191的全细胞糖成分进行进一步分析。没有发现特殊的型式。
由这些微生物学性质可以证实该菌株属于放线菌的链霉菌属。
与E.B.Shirling和D.Gottlieb在ISP中所述的菌株〔International Journal of SystematicBacteriology 18，68-189(1968)；18.279-392(1968)；19，391-512(1969)；22，265-394(1972)〕和其他文献〔例如S.A.Waksman的“The Actinomycetes，第2卷”；R.E.Buchanan出版的“Bergey′s Manual ofDeterminative Bacteriology，第8版(1974)”和N.E.Gibbons的“Bergey′s Manual ofSystematic Bacteriology，第4卷(1989)”〕中所述的菌株以及目前其他有关放线菌的文献所述的菌株相比，该菌株可以被认为非常类似于Streptomyces plantensis。
进一步，用酵母—葡聚糖培养基液体培养后，菌株SANK60191产生了鲜江棕色的可溶性色素。加入0.05N盐酸水溶液，其颜色变成黄色，而加入0.05N氢氧化钠水溶液，颜色没有改变。
在酵母提取物—麦芽提取物琼脂，燕麦琼脂、无机盐—淀粉琼脂和甘油—天冬氨酸琼脂培养基上培养后，Streptomycesplatensis产生微红的或淡黄的色素。相反，菌株SANK60191几乎不产生任何这些色素，这说明该菌株与已知菌株Streptomyces platensis不同。因此，尽管该新菌株与已知菌株仅仅能够依靠产生可溶性色素的不同来区分，SANK60191仍然被认为是一种新的Streptomyces platensis菌株。
已经确认菌株SANK 60191能产生路斯绰达克星但是，正如众所周知的，通常真菌的性质，特别是放线菌微生物的性质可以显著改变，并且这些真菌可以很容易地通过自然原因以及作为人工方法诱导(例如紫外辐射、放射辐射、化学处理等)的结果进行突变。因此，本发明包括使用能够归类于链霉菌属的任何微生物，该微生物与菌株SANK 60191同样具有能产生路斯绰达克星的特性。我们并不希望该新型微生物——菌株SANK 60191是特殊的，因此所用术语“SANK 60191”包括该菌株的所有突变体，它们与菌株SANK 60191同样具有能产生路斯绰达克星的特性。而且，这些突变体包括通过基因工程技术例如重组、转导或转化等方法获得的那些突变体。根据本文所提供的有关路斯绰达克星的资料，测定是否任何所给出的菌株都能产生这些化合物或者产生足够量的这些化合物，以提供可能令人感兴趣的市售菌株只是一个简单的实验问题。
除了上面所述的新的Streptomyces platensis菌株之外，我们还发现已知菌株，即Streptomyces platensisSAM-0654(1988年1月22日保藏于日本的Fermentation Research Institute，保藏号为FERMBP-1668)也能产生本发明的路斯绰达克星。在EP329361中详细描述了该已知菌株，该专利引入本文作为参考。
本发明的路斯绰达克星可以通过在培养基中培养这些真菌菌株制备，该培养基通常用于从相似的微生物产生其他发酵产物。正如本领域专业人员所熟知的，该培养基必需含有微生物学可吸收的碳源、氮源和无机盐。
优选的碳源的例子包括：葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖、甘油、环糊精、燕麦、黑麦、玉米淀粉、土豆淀粉、玉米粉、大豆粉、棉子饼、棉子油、糖蜜、柠檬酸和酒石酸等。这些化合物可以单独使用，也可以以任何合适的混合物形式使用。一般其用量占培养基重量的1-10％。
优选的氮源通常是含蛋白的物质，例如通常用于发酵方法中的物质。这些氮源的例子包括：大豆粉、麦麸、花生粉、棉子饼、棉子油、棉子粉、酪蛋白水解产物、fermamine、鱼粉、玉米浸渍液、胨、肉提取物、酵母、酵母提取物、麦芽提取物、硝酸钠、硝酸铵和硫酸铵等。这些氮源可以单独使用，也可以以任何合适的混合物形式使用。通常我们优选使用的氮源浓度是占培养基重量的0.2-6％。
可掺入培养基中的营养无机盐是常规的盐，它们能为微生物的生长提供各种所需的离子，例如钠、铵、钙、磷酸根、硫酸根、氯离子和碳酸根离子。另外，该培养基应该含有最少量的主要微量元素，例如钾、钙、钴、锰、铁和镁。
当采用液体培养技术进行本发明的方法时，最好在培养基中使用抗泡沫剂，例如硅酮油、植物油或表面活性剂。通过培养链霉菌属微生物特别是菌株SANK 60191产生路斯绰达克星的培养基的pH值优选为5.0-8.0，更优选为5.0-7.0。
可以在9℃-37℃的任何温度下进行培养。但是在20-35℃温度下生长进行得最好，并且该温度是优选的。优选22-30℃温度以使路斯绰达克星的产生最佳化。
这些化合物是在有氧培养条件下产生的，并且可以使用常规的有氧培养方法，例如固体培养，振摇培养和充气搅拌(浸入)培养方法。在小规模培养的情况下，通常使用在28℃振摇培养几天的方法。在这种小规模培养方法中可以从1或2步增殖开始培养，在例如装有档板(作为液体流动调节器)的埃伦美厄烧瓶中产生种子培养物。用于种子培养步骤的培养基优选的是同时含有碳源和氮源。对于这种小规模培养，随后的操作优选将种子培养瓶于28℃在恒温孵化器中振摇3天，或者振摇至实现充分生长。然后将生长的种子培养物转移至第二种子培养基中或者转移至生产培养基中。当使用中间生长相时，对于生长使用基本相同的方法，并且将等分的所得中间产物接种于生产培养基中。在振摇的条件下将接种瓶培养几天，并且在培养完成后将瓶中的内含物离心或者过滤。
在大规模生产的情况下，优选使用装有搅拌器和充气装置的合适的发酵器。在这种情况下，可以在发酵器中制备营养培养基。该培养基最好通过将温度升至合适的温度例如120℃-125℃灭菌、冷却后，可以用预先制备的种子培养物接种已灭菌的培养基。然后在合适的温度例如28℃下，在搅拌及充气条件下进行培养。该方法适用于获得大量的本发明化合物。
随着培养时间的延长，所产生的路斯绰达克星的量的变化可以通过正如发酵领域众所周知的任何合适的方法例如高效液相色谱法监测。最通常的是在培养48-96小时后所产生的路斯绰达克星的量达到最大值。
培养完成后，可以通过常规方法，利用路斯绰达克星的物理化学性质萃取和提纯保留在培养基液体的液体部分中和保留在细菌细胞中的路斯绰达克星。例如，可以用与水互溶的有机溶剂例如乙酸乙酯、氯仿、氯化乙烯、二氯甲烷或丁醇(或者使用任何这些溶剂的两种或多种的混合物)，在酸性条件下，萃取存在于滤液或存在于上清液中的路斯绰达克星；萃取后可以通过常规方法提纯。也可以通过使用一种或多种上述溶剂在碱性条件下萃取除去任何杂质，然后按照常规方法进行纯化。或者，可以通过将含有路斯绰达克星的液体通过合适的吸附层吸附除去杂质，也可以将路斯绰达克星吸附在合适的吸附剂上，然后用合适的洗脱剂例如含水甲醇、含水丙酮或含水丁醇将它洗脱。可用于这些方法的合适的吸附剂的例子包括活性碳和吸附树脂，例如AmberliteXAD-4(Rohm & Haas的一种产品的商品名)或DiaionHP-10、HP-20、CHP-20、HP-50(Mitsubishi化学工业公司产品的商品名)。通过用合适的溶剂例如50-90％(体积)含水丙酮或含水甲醇萃取，然后除去有机溶剂，可以得到存在于细胞中的路斯绰达克星；然后用与上述处理滤液的相似的过程对该产品进行萃取和纯化。
按照众所周知的技术，还可以进一步纯化所得到的路斯绰达克星，例如：使用载体例如硅胶或镁硅胶如以商品名“Florisil”出售的载体进行吸附柱色谱法；使用吸附剂如Sephadex LH-20(Pharmacia产品的商品名)进行分配柱色谱法；或者使用正常相或反相柱进行高效液相色谱法。正如本领域众所周知的，这些分离和纯化方法可以单独进行，也可以以任何合适的形式结合进行，并且如果需要的话，可以重复分离和纯化所需的路斯绰达克星。
本发明的路斯绰达克星是目前文献中尚未报导的新化合物。它们在哺乳动物(例如人、狗、猫和兔子)中刺激生血因子如G-CSF和GM-CSF产生，因此它们适于用作为降低因癌症化疗或放射治疗所引起的副作用的治疗剂；它们还可以防止感染并通过激活巨噬细胞而具有抗癌作用。另外，可以预见路斯绰达克星适用于通过刺激NGF的产生改善脑代谢。它们进一步适于用作抗真菌剂，并且已经证实了其抗tricophyton metagrophytes的抗真菌作用。
本发明路斯绰达克星刺激生血因子产生的能力原则上可以通过Kohama等人的方法〔Experimental Hematology16，603-608(1988)〕测定。在此方法中，将各种生血因子的产生系统和各种生血因子的测定系统结合。例如来源于人骨髓基质细胞的KM-102细胞可用于产生各种生血因子。但是可以用能够产生各种生血因子的任何细胞代替，例如一级培养的骨髓基质细胞、血管上皮细胞、淋巴细胞或存在于骨髓中的巨噬细胞。将可评估其活性的化合物的试验样品稀释成合适的浓度，并加入含有产生各种生血因子的细胞(“产生HF的细胞”)的培养系统。经过合适的时间，通常为24小时后，取出部分培养基的上清液，以适当的浓度将其加至依赖于各种生血因子的细胞例如TF-1细胞和NFS-60细胞(“HF依赖性细胞”)的培养系统中。一段时间后，可以通过测量HF依赖性细胞的生长测定生血因子的量，因此可以测定该化合物刺激各种生血因子产生的能力。HF依赖性细胞的生长可以通过任何常规方法测定，例如通过细胞掺入氚—胸苷或者使用MTT〔3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓溴化物〕分析法(Chemicon International Inc.，USA)测定。各种生血因子的测定可以通过任何常规方法例如形成克隆的方法或ELISA方法进行。
本发明的路斯绰达克星同时含有一个酸性基团(磷酸基)和一个碱性基团(氨基)，因此它可以形成盐。如果打算将这些盐用于治疗用途时它们是可药用的，那么对这些盐的性质没有特殊限制。如果打算将它们用于非治疗目的，例如作为制备其他可能更具活性的化合物的中间体时，甚至于不使用这种限制。本发明化合物可以与碱形成盐。这些盐的例子包括：碱金属如钠、钾或锂的盐；碱土金属如钡或钙的盐；其他金属如镁或铝的盐；有机碱盐，如二环己胺的盐；以及碱式氨基酸如赖氨酸或精氨酸的盐。本发明化合物也可以形成酸式盐。这些酸式盐的例子包括：无机酸，特别是氢卤酸(如氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸或盐酸)、硝酸、高氯酸、碳酸、硫酸或磷酸的盐；低级烷基磺酸如甲磺酸、三氟甲磺酸或乙磺酸的盐；芳基磺酸如苯磺酸或对甲苯磺酸的盐；有机羧酸如乙酸、富马酸、酒石酸、草酸、马来酸、苹果酸、琥珀酸或柠檬酸的盐；以及氨基酸如谷氨酸和天冬氨酸的盐。
当打算将这些这化合物用于治疗应用时，它们可以单独服用，也可以以合适的药物制剂形式服用，该药物制剂除含有活性化合物之外还含有一种或多种常用的稀释剂、载体、赋形剂或辅剂。当然，该制剂的性质将取决于服用的途径。但是，对于口服途径，该化合物优选配制成粉剂、颗粒、片剂、胶囊或糖浆。对于非肠道用药，该化合物优选配制成注射剂(可以是静脉、肌内或皮下注射剂)或者配制成滴剂或栓剂。这些制剂可以按照已知方法通过加入象赋形剂、粘结剂、崩解剂、润滑剂、稳定剂、矫味剂、加溶剂、悬浮剂或涂敷剂这样的添加剂制备。尽管剂量可以根据患者的症状与年龄、疾病的性质和严重程度以及服用途径和方式而改变，但是对于成年患者口服本发明化合物一般日服用剂量是1mg-1000mg。该化合物可以以单一剂量形式服用，也可以以分剂量形式服用，例如每天2-3次。
通过下面的非限制性实施例将进一步详述本发明化合物的制备。
                实施例1
          路斯绰达克星的培养与分离1(A)培养
将1铂环量的Streptomyces platensis SANK60191的孢子接种于装有挡板并含有100ml预先灭菌的培养基(具有下述组合物)的埃伦美厄烧瓶中，并在28℃和200rpm的转速(7cm的旋转半径)下用旋转振动器将该微生物培养3天。
培养基：
    可溶性淀粉                           30克
    生酵母                               10克
    大豆粉                               7克
    鱼粉                                 5克
    玉米浸渍液                           2克
    肉提取物                             1克
    碳酸钙                               1克
    加水至                               1000毫升
               pH＝7(灭菌前)
将15升与种子培养所用培养基相同的培养基分别装入4个30升的不锈钢jal发酵罐中，并将其在120℃下加热30分钟灭菌。然后加入按上述方法制备的150ml种子培养液。在以15升/分钟气流速度充气并搅拌的条件下将该混合物在28℃培养3天。为了保持液体中氧浓度为5ppm，搅拌速度可以在100-300rpm范围内自动调节。1(B)分离
将2.4公斤硅藻土545(美国Johns & ManvilleProject Corporation产品的商品名)作为填料助剂加入到按照上面1(A)中所述方法制备的60升培养液中。将培养液混合物过滤后得到7.2公斤细菌细胞。将细胞用30升50％(v/v)含水丙酮萃取一次，并且每次用20升80％(v/v)含水丙酮萃取两次。合并这些提取物，使用旋转蒸发器蒸掉有机溶剂。将足量的盐酸水溶液加至残余物中以其pH调至2.0，然后每次用1升乙酸乙酯将此混合物萃取两次。合并提取物，向其中加入10升1％(w/v)的碳酸氢钠水溶液。活性部分转入水层，并将乙酸乙酯层除去。用5升1％(w/v)碳酸氢钠水溶液再次萃取乙酸乙酯层。将碳酸氢钠溶液合并，通过加入盐酸水溶液将其pH调至2.0。每次用10升乙酸乙酯将该溶液萃取两次。合并有机提取物，用水洗涤，然后用饱和氯化钠水溶液洗涤，在无水硫酸钠上干燥。然后在连续加入甲醇过程中，使用旋转蒸发器减压浓缩该溶液，得到10ml油状物质。将此油状物溶于100ml 60％(v/v)含水甲醇中，并将所得溶液吸附于Sep-Pak Vac20cc C13萃取柱(Cartridges)(美国Waters公司产品的商品名)上。用30ml 60％(v/v)冷水甲醇将杂质洗脱。然后用15ml100％甲醇将路斯绰达克星洗脱，浓缩洗脱液，得到800mg油状物质。将此油状物质溶于10ml甲醇中，进行高效液相色谱。收集接近13分钟和24分钟的峰所示的馏分，并分别称之为“粗馏分A”和“粗馏分B”。色谱所用的条件如下。
制备液相色谱：
柱：Radial-Pak 25×10(Waters，USA)
洗脱剂：50％(体积)含水乙腈，含有0.5％三乙胺——磷
        酸盐缓冲液，pH 3.0
流速：9毫升/分钟
波长：230纳米
当所有这些峰浓缩后，将所得馏分进行制备高效液相色谱。在下述条件下将粗馏分A进行制备色谱，以收集接近56分钟的峰；然后使用Sep-Pak将其脱盐并浓缩，得到11.66mg路斯绰达克星A。粗馏分A的制备条件：
柱：Cosmosil 5C 18-AR 20×250mm
    (Nakaraitesque Inc.)
洗脱剂：42％(v/v)含有乙腈，含0.5％三乙胺—磷酸
        盐缓冲液，pH 3.0
流速：9毫升/分钟
波长：230纳米
在下述条件下将粗馏分B进行制备色谱以收集接近47分钟和51分钟的峰；然后使用Sep-Pak将其脱盐并浓缩，得到9.83mg路斯绰达克星B和5.22mg路斯绰达克星C。粗馏分B的制备条件：
柱：Cosmosil 5C 18-AR 20×250mm
    (Nakaraitesque Inc.)
洗脱剂：47％(v/v)含水乙腈，含有0.5％三乙胺——
        磷酸盐缓冲液，PH 3.0
流速：9毫升/分钟
波长：230纳米
所得到的路斯绰达克星具有以下性质：
        路斯绰达克星A：1)化学结构：式(Ia)，如上所示。2)性质：酸性并且为脂溶性。3)颜色：淡黄色油。4)分子式：C32H52O10NP。5)分子量：641，使用FAB-MS方法(“FAB-MS”是快速原子轰击质谱)测定。6)紫外吸收谱：234纳米(在甲醇中的最大吸收)。7)红外吸收谱：红外谱显示了下列吸收最大值(液体膜，νmaxCm-1)：2933，2867，1728，1464，1383，1248，1176，1056，969。8)1H核磁共振谱：在重甲醇中，使用三甲基硅烷作为内标的核磁共振谱(270MHz)表示如下：
708(1H，双双峰，J＝9.8和4.9Hz)；
6.21-6.35(2H，多峰)；
6.06(1H，双双峰，J＝15.6和6.1Hz)；
6.02(1H，双双峰，J＝9.8和1.4Hz)；
5.94(1H，双峰，J＝15.6Hz)；
(5.46(1H，多峰)；
5.31(1H，多峰)；
5.10(1H，双双峰，J＝6.1和4.4Hz)；
4.94(1H，多峰)；
4.72(1H，多峰)；
4.29(1H，三双峰，J＝10.1，10.1和2.4Hz)；
2.93-3.15(2H，多峰)；
2.50-2.71(2H，多峰)；
2.25(2H，三峰，J＝7.6Hz)；
2.16(1H，多峰)；
0.99-2.01(18H，多峰)；
0.95(3H，三峰，J＝7.6Hz)；
0.89(6H，双峰，J＝6.8Hz)。9)13C-核磁共振谱：(δ：ppm)：在重甲醇中，使用三甲基硅烷作为内标的核磁共振谱(270MHz)表示如下：11.4(四峰)，22.7(三峰)，22.9(四峰)，22.9(四峰)，24.0(三峰)，24.7(三峰)，28.9(双峰)，32.4(三峰)，33.1(三峰)，34.3(三峰)，35.7(三峰)，36.1(双峰)，37.1(三峰)，39.4(三峰)，39.5(三峰)，40.6(双峰)，40.6(三峰)，64.7(双峰)，73.9(双峰)，77.8(单峰)，78.5(双峰)，82.3(双峰)，121.1(双峰)，123.7(双峰)，124.3(双峰)，127.7(双峰)，135.3(双峰)，137.3(双峰)，138.2(双峰)，152.7(双峰)，166.3(单峰)，175.0(单峰)。10)溶解性：
溶于醇，例如甲醇、乙醇或丁醇；溶于丙酮、氯仿、乙酸乙酯和二甲基亚砜；有限地溶于水；不溶于己烷。11)颜色反应：
对硫酸、碘、茚三酮和钼酸铵—高氯酸反应呈阳性。12)高效液相色谱：
分离柱：Cosmosil 5C18-AR(柱尺寸：4.6×250
        mm，Nakaraitesque Inc.的产品)
溶剂：45％(v/v)含水乙腈，含0.5％三乙胺—磷酸盐
      缓冲液(pH3)
流速：1毫升/分钟
波长：230纳米
保留时间：9.06分钟和9.16分钟。
             路斯绰达克星B：
1)化学结构：式(Ib)，如上所示。
2)性质：酸性并且为脂溶性。
3)颜色：淡黄色油。
4)分子式：C34H55O10NP。
5)分子量：669，通过FAB-MS方法测定。
6)紫外吸收谱：234纳米(在甲醇中的最大吸收)。
7)红外吸收谱：红外谱显示了以下最大吸收值(液体膜，
              νmax cm-1)；2927、2855、
              1729、1463、1380、1250、
              1172、1056、968。
8)1H-核磁共振谱：在重甲醇中以三甲基硅烷作内标的核磁共振谱(270MKz)表示如下：
7.09(1H，双双峰，J＝9.8和4.9Hz)；
6.21-6.35(2H，多峰)；
6.07(1H，双双峰，J＝15.6和6.1Hz)；
6.02(1H，双双峰，J＝9.8和1.5Hz)；
5.94(1H，双峰，J＝15.6Hz)；
5.46(1H，多峰)；
5.31(1H，多峰)；
5.10(1H，双双峰，J＝6.1和4.4Hz)；
4.94(1H，多峰)；
4.72(1H，多峰)；
4.29(1H，三双峰，J＝9.9、9.9和2.6Hz)；
2.93-3.15(2H，多峰)；
2.50-2.71(2H，多峰)；
2.27(2H，三峰，J＝7.3Hz)；
2.17(1H，多峰)；
1.00-2.01(22H，多峰)；
0.95(3H，三峰，J＝7.5Hz)；
0.87(3H，三峰，J＝6.8Hz)；
0.86(3H，双峰，J＝6.6Hz)。
9)13C-核磁共振谱：(δ：ppm)：在重甲醇中以三甲基硅烷作为内标的核磁共振谱(270MKz)表示如下：
11.4(四峰)，11.7(四峰)，19.6(四峰)，
22.7(三峰)，24.7(三峰)，26.4(三峰)，27.6(三峰)，30.6(三峰)，32.4(三峰)，33.1(三峰)，34.1(三峰)，35.5(三峰)，35.5(双峰)，36.1(双峰)，37.1(三峰)，37.3(三峰)，39.4(三峰)，40.6(双峰)，40.6(三峰)，64.7(双峰)，73.9(双峰)，77.8(单峰)，78.5(双峰)，82.3(双峰)，121.0(双峰)，123.7(双峰)，124.3(双峰)，127.7(双峰)，135.2(双峰)，137.4(双峰)，138.2(双峰)，152.7(双峰)，166.4(单峰)，175.1(单峰)。
10)溶解性：
溶于醇，例如甲醇、乙醇或丁醇；溶于丙酮、氯仿、乙酸乙酯和二甲基亚砜；在水中的溶解度有限；不溶于己烷。
11)颜色反应：
对硫酸、碘、茚三酮和铂酸铵—高氯酸反应呈阳性。
12)高效液相色谱：
分离柱：Cosmosil 5C 18-AR(柱尺寸：4.6×
        250mm，Nakaraitesque Inc.的产品)
溶剂：45％(v/v)含水乙腈，含有0.5％三乙胺—磷酸
      盐缓冲液(PH3)
流速：1毫升/分钟
波长：230纳米
保留时间：20.62分钟和20.87分钟。
        路斯绰达克星C：1)化学结构：式(Ic)，如上所示。2)性质：酸性并且为脂溶性。3)颜色：淡黄色油。4)分子式：C34H56O10NP。5)分子量：669，通过FAB-MS方法测定。6)紫外吸收谱：234纳米(在甲醇中的最大吸收)。7)红外吸收谱：红外谱显示了以下最大吸收值(液体膜，νmax cm-1)：2930、2856、1728、1464、1382、1252、1172、1056、968。8)1H-核磁共振谱：在重甲醇中以三甲基硅烷作为内标的核磁共振谱(270MHz)，表示如下：7.08(1H，双双峰，J＝9.8和4.9Hz)；6.21-6.35(2H，多峰)；6.07(1H，双双峰，J＝15.6和6.1Hz)；6.02(1H，双双峰，J＝9.8和1.5Hz)；5.94(1H，双峰，J＝15.6Hz)；5.46(1H，多峰)；5.31(1H，多峰)；5.10(1H，双双峰，J＝6.1和4.9Hz)；4.94(1H，多峰)；4.72(1H，多峰)；4.28(1H，三双峰，J＝10.1、10.1和2.4
Hz)；
2.93-3.15(2H，多峰)；
2.50-2.71(2H，多峰)；
2.27(2H，三峰，J＝7.3Hz)；
2.16(1H，多峰)；
1.00-2.01(22H，多峰)；
0.95(3H，三峰，J＝7.3Hz)；
0.88(6H，双峰，J＝6.3Hz)。
9)13C-核磁共振谱：(δ：ppm)：在重甲醇中以三甲
  基硅烷作为内标的核磁共振谱(270MHz)，表示如下：11.4(四峰)，22.7(三峰)，23.1(四峰)，23.1(四峰)，24.7(三峰)，26.2(三峰)，28.2(三峰)，29.1(双峰)，30.4(三峰)，32.4(三峰)，33.1(三峰)，34.2(三峰)，35.4(三峰)，36.1(双峰)，37.1(三峰)，39.4(三峰)，40.0(三峰)，40.6(双峰)，40.6(三峰)，64.6(双峰)，73.9(双峰)，77.8(单峰)，78.4(双峰)，82.3(双峰)，121.1(双峰)，123.7(双峰)，124.3(双峰)，127.7(双峰)，135.2(双峰)，137.3(双峰)，138.2(双峰)，152.7(双峰)，166.4(单峰)，175.0(单峰)。
10)溶解性：
溶于醇，例如甲醇、乙醇或丁醇；溶于丙酮、氯仿、乙酸乙酯和二甲基亚砜；有限地溶于水中；不溶于己烷。
11)颜色反应：
对硫酸、碘、茚三酮和铂酸铵—高氯酸反应呈阳性。
12)高效液相色谱：
分离柱：Cosmosil 5C 18-AR(柱尺寸：4.6×250
        mm，Nakaraitesque Inc.的产品)
溶剂：45％(v/v)含水乙腈，含0.5％三乙胺—磷酸盐
      缓冲液(pH3)
流速：1毫升/分钟
波长：230纳米
保留时间：21.90分钟和22.19分钟。
                  生物活性
下面的试验例将更详细地解释本发明化合物的作用。
                试验例1刺激GM-CSF产生：
原则上使用Kohama等人〔Experimental Hematology16，603-608(1988)〕和Kitamura等人〔Journal of Cellular Physiology 140，323-334(1989)〕结合的方法进行本发明化合物刺激GM-CSF产生的测定。更详细的是，将来源于人骨髓基质细胞、能够产生GM-CSF的KM-102细胞与稀释至合适浓度的试验样品溶液(“产生GM-CSF的体系”)混合。培养24小时后，取出部分培养物上清液并加至GM-CSF依赖性人TF-1细胞培养系统中。在48-72小时后，通过TF-1细胞(“GM-CSF分析系统)的生长测量GM-CSF的量，以获得刺激GM-CSF产生的量。通过氚代胸苷脉冲标记4小时测定TF-1细胞的生长。使用一种MTT盒(Chemicon International Inc.USA)测定TF-1细胞的生长以及使用一种ELISA盒(Genzyme Inc.USA)测定GM-CSF的方法也得到相似的结果。通过重组白细胞介素1β的方法(IL-1β：Genzyme Inc.USA)测定是否GM-CSF产生能导致系统正常运行。在1-100单位/毫升范围内IL-1β诱导的GM-CSF产生是以剂量依赖方式，在最大值所诱导的GM-CSF的产生是没有IL-1β时产生的10-20倍，这说明实验系统正常运行。
当以一定浓度向KM-102细胞中分别加入路斯绰达克星A、B或C后，发现GM-CSF产生是以剂量依赖方式被诱导的。在最大值所产生的GM-CSF的量是未添加路斯绰达克星时产生量的10-20倍。路斯绰达克星A、B和C的ED50值分别为180+50、50+15和50+15ng/ml。
         试验例2刺激G-CSF产生
通过一个系统测定刺激G-CSF产生，在该系统中用于试验例1的GM-CSF测定系统由G-CSF测定系统〔如Shirafuji等人所述：Experimental Hematology 17，116-119(1989)〕代替。更详细的是，将来源于人骨髓基质细胞，能够产生G-CSF的KM-102细胞加到稀释至合适浓度的路斯绰达克星溶液(“产生G-CSF的系统”)中。培养24小时后，取出部分培养物上清液，加至G-CSF依赖性NFS-60细胞培养系统中。24-48小时后，从NFS-60细胞的生长(“G-CSF测定系统”)测量G-CSF的量，以测量刺激G-CSF生长。通过氚代胸苷脉冲标记4小时测定NFS-60细胞的生长。通过一种MTT盒测定NFS-60细胞的生长以及通过一种ELISA盒测定G-CSF〔Motojima等人：Journalof Immunological Methods 118，187-192(1989)〕的方法也得到了相似的结果。通过重组白细胞介素1β的方法(IL-1β：Genzyme Inc.USA)测定是否G-CSF产生能导致系统正常运行。在1-100单位/毫升范围内IL-1β诱导的GM-CSF产生是以剂量依赖方式，在最大值所诱导的G-CSF产生是没有IL-1β时的10至20倍，这说明实验系统正常运行。
当以一定浓度向KM-102细胞中分别加入路斯绰达克星A、B和C后，发现G-CSF产生是以剂量依赖方式被诱导的。在最大值所产生的G-CSF的量是未加路斯绰达克星时产生量的10-20倍。路斯绰达克星A、B和C的ED50值分别为200+50、50+15和50+15ng/ml。
            试验例3刺激NGF产生
Furukawa等人报导从鼠连接组织获得的形成成纤维细胞的L-M细胞产生并分泌较大量的NGF，并且报导儿茶酚胺刺激这种产生与分泌〔J.Biol.Chem.261，6039-6047(1986)〕。我们测定了是否有路斯绰达克星刺激NGF产生与分泌。
用含0.5％胨的199培养基培养L-M细胞。在24孔培养板的每个孔内接种5×104C-M细胞，并在CO2孵化器中(37℃， 5％CO2)培养至融合。移出培养液，用含0.5％牛血清白蛋白(Sigma)的199培养基将细胞洗涤一次。将一定浓度的一种路斯绰达克星加至含0.5％牛血清白蛋白的199培养基中，然后用该混合物处理L-M细胞。然后在CO2孵化器中将L-M细胞培养24小时。收集培养液后，测定培养液中的NGF。
通过酶免疫分析法〔Proc.Natl.Acad.Sci.USA80，3513-3516(1983)〕测定NGF。向聚苯乙烯96孔板的每个孔中注入75μl抗鼠β-NGF抗体(Boehringer)溶液(0.3μg/ml，pH 9.6)，将其在室温下静置1小时。除去抗体后，用洗液将所有的孔洗涤三次。向每个孔中注入50μl标准βNGF(Wako Pure Chem.Ind.)或者标准溶液，在室温将该混合物静置6-8小时。到达此时间后，除去标准βNGF或标准溶液，将所有孔洗涤三次。将50μl标记过的抗βNGF单克隆抗体(Boehringer)溶液(100mu/ml，pH 7.0)注入每个孔中，在4℃将此溶液静置15-18小时。到达此时间后，除去酶标记的抗体，将所有孔洗涤三次。然后将100μl氯苯酚-β-D-半乳糖苷(Boehringer)溶液(1mg/ml，pH7.3)注入每个孔中。当呈现合适的颜色后(室温2-3小时后)，测定570纳米处的吸光度。由标准曲线计算NGF的量，并以百分数表示该量与未用路斯绰达克星处理的细胞产生和分泌的NGF的量的关系。
我们发现所有的路斯绰达克星都以剂量依赖方式刺激NGF产生。与不用路斯绰达克星处理的细胞中相比，在5μ/ml的各种路斯绰达克星的诱导是其NGF产生的2倍或更多倍。
         试验例4抗真菌活性
为了测定路斯绰达克星抗动物真菌病原的抗真菌活性，对其抗Tricophyton mentagrophytes的活性进行试验。对于每种路斯绰达克星，当其浓度为1μg/盘时都发现了抑制环。
            试验例5急毒性
按照常规方法在5只ddY鼠(雄性)上进行急毒性试验。在以0.2mg/kg的路斯绰达克星A剂量腹膜内给药后，在5天内没有发现毒性。同样，在施用路斯绰达克星B、路斯绰达克星C及其有关衍生物后也未发现毒性。
从上面所报导的结果可以明显看出，路斯绰达克星A、B和C刺激生血因子例如粒细胞克隆刺激因子和粒细胞巨噬细胞克隆刺激因子产生。因此，路斯绰达克星适于用作治疗剂以减少因癌症化疗和放疗引起的副作用。它们还起到抗感染的保护作用，并且通过激活巨噬细胞具有抗癌作用。另外，路斯绰达克星适于通过刺激NGF产生改善脑代替。正如其抗Tricophytonmentagrophytes的抗真菌作用所表示的，路斯绰达克星进一步适于用作抗真菌剂。

Claims (4)

1.制备式(I)的路斯绰达克星或其盐的方法：(式中R代表5-甲基己酰氧基、6-甲基辛酰氧基或7-甲基辛酰氧基)，该方法包括培养产生路斯绰达克星的保藏号为CCTCC No：M 92007的Streptomyces Platensis SANK 60191菌株，并从培养物中收集至少一种路斯绰达克星。
2.按照权利要求1的方法，其中所述化合物具有式(Ia)：
3.按照权利要求1的方法，其中所述化合物具有式(Ib)：
4.按照权利要求1的方法，其中所述化合物具有式(Ic)：
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