FI101978B

FI101978B - Menetelmä leustroduksiinien valmistamiseksi

Info

Publication number: FI101978B
Application number: FI921339A
Authority: FI
Inventors: Takafumi Kohama; Isao Kaneko; Takemichi Nakamura; Keiichi Matsuda; Takeshi Kagasaki; Ryuzo Enokita
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1991-03-27
Filing date: 1992-03-26
Publication date: 1998-09-30
Also published as: JPH05123179A; ATE134640T1; RU2082760C1; IE74389B1; TW212182B; IL101394A; CN1058294C; FI101978B1; IE920965A1; FI921339A; CN1066292A; ES2086651T3; DK0506463T3; EP0506463B1; EP0506463A3; AU649116B2; AU1312392A; US5334587A; FI921339A0; KR0145680B1

Description

101978

Menetelmä leustroduksiinien valmistamiseksi Förfarande för framställning av leustroduksiner 5

Keksinnön tausta 10 Esillä olevalla keksinnöllä saadaan aikaan joukko uusia yhdisteitä, joille on annettu nimeksi "Leustroduksiini A", ’’Leustroduksiini B" ja "Leustroduksiini C". Näillä yhdisteillä on kaava (I), joka esitetään myöhemmin. Keksinnöllä saadaan myös aikaan menetelmiä näiden yhdisteiden valmistamiseksi käymisellä käyttämällä Streotornvces platensis 15 -lajin mikro-organismia, ja varsinkin Streotornvces platensis -kantaa, joka myös on uusi ja myös muodostaa osan tätä keksintöä. Keksinnön mukaisilla yhdisteillä on erilaisia terapeuttisia vaikutuksia, ja siten keksinnössä saadaan myös aikaan koostumuksia ja menetelmiä hoitoon tai ennaltaehkäisyyn käyttämällä näitä yhdisteitä.

20

Esillä olevan keksinnön mukaiset leustroduksiinit ovat uusia yhdisteitä, jotka edesauttavat tekijöitä, jotka vaikuttavat verenmuodostukseen, kuten jyvässolujen kasvupesäkettä stimuloiva tekijä (tämän jälkeen lyhennettynä "G-CSF") ja jyvässolu-makrofagin kasvupesäkettä stimuloiva 25 tekijä (tämän jälkeen lyhennettynä "GM-CSF"); ne edesauttavat myös ‘ hermokasvutekijän tuottoa (tämän jälkeen lyhennettynä "NGF"); lisäksi niillä on sienen vastainen vaikutus, esim. Tricophvton nientä grophvteiä vastaan.

30 Erilaisia solun jakautumiseen vaikuttavia aineita, jotka vaikuttavat verenmuodostukseen, kuten kasvupesäkkeitä stimuloivat tekijät (tämän .. jälkeen lyhennettynä "CSF"), ja useat erilaiset glykoproteiinit (yleen sä nimitetään "interleukiineiksi") on tähän asti valmistettu geeni-manipulointitekniikoilla. Näitä aineita on käytetty kliinisesti eri 35 lailla haitallisten sivuvaikutusten vähentämiseksi, joita yleensä aiheuttaa syövän kemiallinen hoito ja sädehoito sekä infektioiden estämiseksi. Näiden aineiden vaikutus on viime aikoina selvinnyt [Br. J.

Cancer 59, 2 - 5 (1989) ] .

2 101978

On havaittu, että näiden tekijöiden annostelu itsessään ihmisille erilaisten reittien kautta johtaa selviin farmakologisiin vaikutuksiin, jotka johtavat näiden tekijöiden mahdolliseen käyttöön terapiassa. Uskotaan kuitenkin, että tietynlaiset solut (esim. lymfosyytit, mono-5 syytit, sidekudosemosolut, verisuonien sisäkettosolut ja peruskudos-solut) olennaisesti muodostavat nämä tekijät jji vivo monimutkaisella säätöjärjestelmällä, ja että ne ottavat osaa elimistön sisäiseen tasapainoon erilaisten verisolujen tuotannossa. Siksi, jos näitä tekijöitä annostellaan ottamatta huomioon tämän säätömekanismin erinomaista tasa-10 painoa, useita sivuvaikutuksia voidaan havaita, joihin voi olla syynä tämän säätömekanismin epätasapaino; esimerkkejä näistä sivuvaikutuksista ovat tulehdus ruiskutuspaikassa, luukipu, kuume ja kankeus.

Toisaalta, sen sijasta, että verenmuodostukseen vaikuttavia tekijöitä 15 annosteltaisiin itsessään, saattaa olla mahdollista annostella useita aineita, joiden tiedetään stimuloivan näiden verenmuodostukseen vaikuttavien tekijöiden tuottoa kehossa. Tiedetään esimerkiksi, että inter-leukiini 1 (tämän jälkeen lyhennettynä IL-1) ja kudoskuolematekijä (TNF) voi saada aikaan erilaisten solujen CSF:n jne. tuotannon. Nämä 20 tekijät eivät kuitenkaan aina kykene toimimaan erityisinä verenmuodostukseen vaikuttavina käynnistäjinä, koska niillä on myös erilaisia muita biologisia vaikutuksia.

Tiedetään myös, että erilaiset matalamolekyylipainoiset immuunikäynnis-25 täjät, kuten lipopolysakkariidit (tämän jälkeen lyhennettynä LPS) ja muramyylidipeptidit (tämän jälkeen lyhennettynä MDP) kykenevät tuottamaan erilaisia CSF-lajeja aktivoimalla monosyytit ja makrofagit. Tiedetään kuitenkin, että muita fysiologisia vaikutuksia, joita makrofagien aktivoituminen aiheuttaa, esim. monokiinien kuten IL-1 ja TNF tuottami-30 nen, tapahtuu samanaikaisesti, mikä saattaa johtaa erilaisiin sivuvai-: kutuksiin, kuten kuumeeseen [Nippon Acta Radiologica 48, (4), 514 (1988)] .

Forboliesterien ja kalsiumjonoforien tiedetään saavan aikaan CSF:n tuo-35 tannon synergistisesti [Kohana et ai.: Experimental Hematology 16, 603 - 608 (1988)], tiedetään kuitenkin, että ne eivät ainoastaan stimu- 101978 3 loi verenmuodostukseen vaikuttavia tekijöitä vaan myös stimuloivat kaikkien eritysproteiinien tuottoa ja eritystä yleisesti, mukaanlukien hormoonien kuten insuliinien [Y. Nishizuka: Science 225. 1365 (1984)].

5 Vaikka täsmällistä mekanismia ei ole vielä selvitetty, uskotaan, että verisolujen muodostuksessa, erilaisia kypsiä verisoluja voi muodostua yleisistä solujen edeltäjistä, joita kutsutaan verenmuodostuksen varsi-soluiksi, erilaisiin verenmuodostukseen vaikuttaviin tekijöihin vaikuttamalla ja solujen vuorovaikutuksella. On osoitettu, että kohta, 10 jossa verisolut muodostuvat normaalissa aikuisessa rajoittuu ainoastaan luuytimen sisäpuolelle, että soluilla, joita sanotaan peruskudossoluik-si ja jotka ovat luuytimessä on suuri merkitys varsisolujen muodostuksessa [Dexter et ai.: J. Cell. Physiol. 91, 335 (1977)], ja että luuytimessä olevat peruskudossolut tuottavat erilaisia verenmuodostukseen 15 vaikuttavia tekijöitä [Harigaya et ai— Proc. Natl. Acad. Sei. USA £2, 3477 (1985); Kohama et ai.: Experimental Hematology i6, 603 - 608 (1988)].

Siksi, jos voidaan löytää aine, joka stimuloi verenmuodostustekijöiden 20 tuottoa peruskudossoluissa, tällä aineella ei ainoastaan olisi hyvin suurta merkitystä, kun analysoidaan verenmuodostuksen vaikutusmekanismia fysiologisissa olosuhteissa ja veriopillisten tautien patologiassa, vaan sillä saattaa myös olla huomattavaa kliinistä käyttöä.

25 Euroopan patenttijulkaisu nro 329 361 esittää tiettyjä uusia 2-pyrano-nin johdannaisia, jotka muistuttavat esillä olevan keksinnön mukaisia yhdisteitä paitsi, että niiden R-ryhmä on erilainen, joka määritellään myöhemmin. Näitä tekniikan tason yhdisteitä sanotaan ainostaan maanviljelyssä käytettäviksi biosideiksi ja ei ole esitetty julkaisuissa, että 30 niillä olisi arvokasta ja odottamatonta esillä olevan keksinnön mukais-- i ten yhdisteiden kaltaisia terapeuttisia ja ennalta ehkäiseviä vaikutuk sia. Vaikka tuotetaan tekniikan tason yhdisteitä, kuten myös esillä olevan keksinnön mukaisia yhdisteitä, lajin Strentornvces platensis mikro-organismilla, tekniikan tasossa kuvatun kannan uskotaan selvästi 35 eroavan siitä, joka kuvataan seuraavassa.

4 101978

Hyvin samantapaisia yhdisteitä ja niiden mikro-organismeja, joilla on olennaisesti sama esitetty käyttö, on kuvattu japanilaisessa patenttihakemuksessa Kokai Hei 2-186, ja näiden uskotaan myös selvästi eroavan tässä esitetyistä yhdisteistä ja mikro-organismeista.

5

The Journal of Antibiotics, Voi. XLII, No. 9, s. 1331 esittää uuden kasvaimen vastaisen yhdisteen, jota kirjoittajat kutsuvat "fosfo-liiniksi", ja joka tuotetaan suvun Streotornvces mikro-organismilla, joka äskettäin eristettiin, mikro-organismin sanotaan kuitenkin selväsit) ti olevan Streotornvces hvgroscooicus ja se eroaa mikro-organismista Streotornvces platensis. jota käytetään esillä olevassa keksinnössä. Lisäksi, vaikka tekniikan tason fosfoliinilla, kuten esillä olevan keksinnön mukaisilla yhdisteillä, molemmilla on aminoryhmä ja fosfori-ryhmä, sillä on erilainen molekyylikaava ja se on siten selvästi eri-15 lainen.

Keksinnön lvhvt kuvaus

Siksi tämän keksinnön kohteena on saada aikaan joukko uusia fosfori-20 hapon yhdisteitä, joilla on erilaisia farmakologisia vaikutuksia.

Varsinkin uskotaan, että esillä olevan keksinnön mukaisilla yhdisteillä on seuraavat vaikutukset: ne vähentävät syövän kemiallisen hoidon tai sädehoidon tuloksena olevia haitallisia reaktioita; ne suojaavat infek-25 tioita vastaan; ne aktivoivat makrofageja ja niillä on siten syövän vastainen vaikutus; ne parantavat aivotoimintaa; ja lisäksi ne vaikuttavat sienen vastaisina aineina.

Siten esillä oleva keksintö saa aikaan kaavan (I) mukaisia yhdisteitä: 30 101978 5 HO^ //°

Ho' OH

HjN\/vnA/ kJ

ΙόΗ j (X) 15 jossa R on 5-metyyliheksanoyylioksiryhmä, 6-metyy1ioktanoyy1ioksiryhmä tai 7-metyylioktanoyylioksiryhmä ja niiden suolat. Näitä yhdisteitä nimitämme "leustroduksiini A", "leustroduksiini B" ja "leustroduksiini C" .

20

Keksinnössä saadaan myös aikaan menetelmä leustroduksiinien valmistamiseksi, joka käsittää leustroduksiinia tuottavan mikro-organismin Strep-tomvces platensis viljelemisen ja ainakin ykden leustroduksiinin keräämisen viljelmästä.

25

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus

Esillä olevan keksinnön mukaiset kolme leustroduksiinia ovat seuraavat: 30 101978 6

Leustroduksiini A; ΗΟχ //°

HOy '"'f OH

^OH T /CH3

^ OCOCHjCHjCHjCH

nch3 (la) R on 5-metyyliheksanoyylioksi

Leustroduksiini B:

O

HO^ //

*/N OH

^OH T /CH2CH3 ^ OCOCH2CH2CH2CH2CHs sch3 O^Y^^CHj (Ib) R on 6-metyylioktanoyylioksi

Leustroduksiini C:

O

H°\ //

HO/P^0 OH

HJN\yv^vA/ kY

|%H T /CH3 J OCOCH2CH2CH2CH2CH2CH.

r CH3 O^V^CHa (le)

0aJ

R on 7-metyylioktanoyylioksi 101978 7

Edellä olevista kaavoista on selvää, että esillä olevan keksinnön mukaiset leustroduksiinit sisältävät joukon asymmetrisiä hiiliatomeja ja useita kaksoissidoksia. Ne voivat siksi muodostaa erilaisia optisia ja geometrisia isomeerejä. Vaikka nämä kaikki esitetään tässä yhdellä 5 ainoalla molekyylikaavalla, esillä olevaan keksintöön kuuluvat sekä yksittäiset, eristetyt isomeerit että niiden seokset, mukaanlukien niiden rasemaatit. Kun käytetään stereospesifisiä synteesitekniikoita tai optisesti aktiiveja yhdisteitä lähtöaineina, yksittäisiä isomeerejä voidaan valmistaa suoraan; toisaalta jos valmistetaan isomeerien seos, 10 yksittäiset isomeerit voidaan erottaa tavanomaisilla erotteluteknii-koilla.

Esillä olevan keksinnön mukaiset leustroduksiinit voidaan valmistaa viljelemällä Streptomvces platensis -lajin leustroduksiinia tuottavaa 15 mikro-organismia, ja sitten keräämällä yksi tai useampi leustroduksiini viljelyvällaineesta.

Varsinkin pidämme erityisen edullisena käyttää mikro-organismina äskettäin eristettyä suvun Streptomvces kantaa, jonka olemme todenneet kuu-20 luvan lajiin Streptomvces platensis ja jonka olemme merkinneet SANK 60191 (FERM BP-3288).

Tämä mikro-organismi tallennettiin Budapest Treaty:n (Budapestin sopimuksen) mukaisesti laitoksessa Fermentation Research Institute, Agency 25 of Industial Science and Technology, 20. helmikuuta 1991 talletusnume-rolla FERM BP-3288.

Streptomvces platensis SANK 60191 mikrobiologisten ominaisuuksien yksityiskohdat (FERM BP-3288) esitetään seuraavassa.

30 1. Morfologiset ominaisuudet

Streptomvces platensis SANK 60191 viljeltiin 14 päivää lämpötilassa 28°C jokaisessa agar-väliaineessa, jonka määrittelee ISP (International 35 Streptomyces Project). Tutkimalla mikroskoopilla 14 päivän viljelyn jälkeen, havaittiin, että tämän lajin sienihuovastoalusta piteni ja 8 101978 levisi hyvin ja värjääntyi keltaisen harmaaksi tai vaalean keltaisen oranssiksi. Ei kuitenkaan havaittu fragmentointia tai sik-sak-pidenty-mistä kuten havaitaan Nocardioformin actinomyceteissä. Ilmassa elävän huovaston leviäminen oli yksinkertaista. Huokosketjut olivat muodoltaan 5 irrallisen spiraalimaisia ja 10-50 tai useampi huokonen muodosti ketjun. Tutkimalla pyyhkäisyelektronimikroskoopilla näkyi, että huokosten pintarakenne oli tasainen. Huokoset olivat munanmuotoisia tai soikeita (ovaaleja) ja kooltaan 0,5-0,6 x 0,6-1,3 /im. Ilmassa elävän huovaston pyörteitä, rihmastopahkoja, huovaston fragmentointia ja erityisiä eli-10 miä, kuten itiöpesäkkeitä ei voitu havaita.

2. Erilaisten viljelvväliaineiden ominaisuuksia

Taulukko 1 esittää mikro-organismin ominaisuuksia 14 päivän viljelyn 15 jälkeen lämpötilassa 28°C erilaisilla viljelyväliaineilla. Värit ilmoitetaan värinumeroilla "Guide to Color Standardin" mukaisesti, jonka on julkaisut Nippon Shikisai Kenkyusho. Tämä laji kostuu ja sen väri muuttuu mustaksi ajan mukaan.

20 Taulukossa käytetään seuraavia lyhenteitä: G kasvu AH ilmassa elävä huovasto R päinvastainen 25 SP liukeneva pigmentti SC erityinen luonne 101978 9

Taulukko 1 Väliaine Ominaisuus SANK 60191:n ominaisuus 5 .....................................................................

Sakkaroosi- G: Hyvä, tasainen, vaalean nitraatti keltaisen oranssi (2-9-9) agari 10 AM: Hyvä, samettinen, vaalean ruskean harmaa (2-7-8) R: Vaalean ruskea (2-8-9) 15 SP: Ei muodostunut

Glukoosi- G: Hyvä, tasainen, vaalean 20 asparagiini keltaisen oranssi (2-9-9) agari AM: Kohtuullinen, samettinen, valkoinen 25 R: Vaalean ruskea (2-8-9) SP: Ei muodostunut 30 10 101978

Glyseroli- G: Erittäin hyvä, tasainen, vaalean 5 asparagiini keltaisen oranssi (2-9-9) agari (ISP 5) AM: Kohtuullinen, samettinen, ruskean harmaa (2-6- 8) 10 R: Vaalean keltaisen vaalean ruskea (4-8-9) SP: Ei muodostunut 15 .......................................................-.....-.......

Epäorgaaninen G: Hyvä, tasainen, vaalean suolatärkkelys keltaisen oranssi (2-9-9) agari 20 (ISP 4) AM: Hyvä, samettinen, ruskean valkoinen (1-6-6) R: Ruskean harmaa (2-5-9) 25 SP: Ei muodostunut SC: Ilmassa elävä huovasto kostuu ja niiden väri muuttuu mustaksi 30 .....................................................................

IX

101978

Tyroslini G: Erittäin hyvä, tasainen, vaalean agari (ISP 7) keltaisen oranssi (2-9-9) 5 AM: Hyvä, samettinen, valkoinen, vaalean ruskean harmaita (2-7-8) täpliä R: Vaalean keltaisen ruskea (4-8-9) 10 SP: Ei muodostunut

Ravintoaine- G: Hyvä, tasainen, vaalean keltaisen 15 agari oranssi (2-9-9) (DIFCO) AM: Kohtuullinen, samettinen, valkoinen R: Vaalean keltaisen ruskea (4-8-9) 20 SP: Ei muodostunut

Hiivauute- G: Erittäin hyvä, tasainen, vaalean * 25 mallasuute keltaisen oranssi (2-9-9) agari (ISP 2) AM: Runsas muodostus, samettinen, vaalean ruskean valkoinen (1-7-6) 30 R: Vaalean keltaisen ruskea (6-7-9) SP: Ei muodostusta SC: Ilmassa elävä huovasto kostuu 35 ja niiden väri muuttuu mustaksi 101978 12

Kaurajauho- G: Hyvä, tasainen, vaalean keltaisen agari oranssi (2-9-9) 5 (ISP 3) AM: Hyvä, samettinen, tumman ruskean harmaa (1-4-6) R: Keltaisen ruskea (4-6-9) 10 SP: Ei muodostunut

Vesiagari G: Kohtuullinen, tasainen, keltaisen 15 harmaa (1-9-10) AM: Kohtuullinen, samettinen, ruskean harmaa (2 - 5-8) 20 R: Vaalean ruskean harmaa (2-7-8) SP: Ei muodostunut 25 Perunauute- G: Kohtuullinen, tasainen, keltaisen porkkanauute harmaa (1-9-10) agari AM: Kohtuullinen, samettinen, ruskean harmaa (2-5-8) 30 R: Vaalean ruskean harmaa (2-7-8) SP: Ei muodostusta 35 .....................................................................

101978 13 3. Fysiologiset ominaisuudet SANK 60191 -kannan fysiologiset ominaisuudet havaittuna päivästä 2 päivään 21 viljelyn alkamisesta lämpötilassa 28°C on esitetty taulu-5 kossa 2.

Taulukko 2 10 Tärkkelyksen hydrolyysi Positiivinen

Gelatiinin sulatus Negatiivinen

Nitraattien pelkistys Negatiivinen

Maidon koagulointi Negatiivinen

Maidon peptonisointi Negatiivinen 15 Melanoidipigmentin tuotto (Väliaine 1) * Negatiivinen (Väliaine 2) Negatiivinen (Väliaine 3) Negatiivinen

Substraatin hajoaminen 20 Kaseiini Negatiivinen

Tyrosiini Positiivinen

Ksantiini Positiivinen

Kasvun lämpötila-alue (Väliaine 4) 9-35 °C

Kasvun optimaalinen lämpötila (Väliaine 4) 20 - 26 °C

25 Natriumkloridin sieto 10 % * : Väliaine 1; Tryptoni-hiivauuteliemi (ISP 1) 2; Peptoni-hiivauutteen rauta-agari (ISP 6) 30 3; Tyrosiiniagari (ISP 7) 4; Hiivauute-mallasuute agari (ISP 2) SANK 60191 -kantaa viljeltiin myös lämpötilassa 28°C käyttämällä Pridham-Gottlieb agaria (ISP 9) viljelyväliaineena. Hiililähteiden 35 hyväksikäyttökuvio, joka havaittiin 14 päivää viljelyn jälkeen on esi-. tetty taulukossa 3.

14 101978

Taulukko 3 D-Glukoosi + fi-Fruktoosi + 5 L-Arabinoosi - L-Ramnoosi D-Ksyloosi - Sakkaroosi +

Inositol + Raffinoosi + D-Mannitooli + Kontrolli 10 + Hyväksikäyttö positiivinen;

Hyväksikäyttö negatiivinen.

4, Solun komponentit 15 SANK 60191 -kannan solun seinät analysoitiin menetelmällä, jonka on kuvannut B. Becker e_t aj: [Applied Microbiology, 12, 421 - 423 (1984)].

Koska LL-diaminopimeliinihappoa havaittiin, solun seinät vahvistettiin olevan tyyppiä I. Lisäksi SANK 60191 -kannan koko solun sokerikomponen-20 tit analysoitiin menetelmällä M. P. Lechevalier [Journal of Laboratory & Clinical Medicine, ΐχ, 934 (1968)]. Erityistä kuviota ei havaittu.

Näistä mikrobiologisista ominaisuuksista, tämän kannan vahvistettiin kuuluvan Actinomyceteksen Streptomyces-sukuun. Vertaamalla kantoihin, 25 joita on kuvattu ISPissä E. B. Shirling and D. Gottlieb [International Journal of Systematic Bacteriology 18, 68 - 189 (1968); 18;, 279 - 392 (1968); 19, 391 - 512 (1969); 22, 265 - 394 (1972)], ja kantoihin, joita on kuvattu muussa kirjallisuudessa kuten "The Actinomycetes, Voi.

2", S. A. Waksman, "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology", 30 8. painos (1974) julkaissut R. E. Buchanan ja N. E. Gibbons, "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4 (1989)", ja muussa tämänhetkisessä kirjallisuudessa, joka koskee Actinomyceteksejä, tämän kannan todettiin olevan hyvin läheinen Streptomvces platensikselle. 1

Lisäksi, nestemäisen viljelyn jälkeen käyttämällä hiiva-dekstroosi-väliainetta kanta SANK 60191 tuotti liukenevaa pigmenttiä, jolla on 101978 15 raikkaan punaisen ruskea väri. Lisäämällä 0,05 N vesipitoista kloori-vetyhappoa sen väri muuttui keltaiseksi ja lisäämällä 0,05 N vesipitoista natriumhydroksidia ei havaittu mitään muutosta.

5 Streptomvces nlatensis tuottaa punaisen sävyistä tai keltaisen sävyistä pigmenttiä viljelyn jälkeen hiivauute-mallasuute-agarissa, kauraryyni-agarissa, epäorgaanisissa suoloissa - tfirkkelysagarissa ja glyserooli-asparagiini-agari-väliaineissa. Toisaalta kanta SANK 60191 tuskin tuotti mitään näitä pigmenttejä, joka on osoituksena siitä, että tämän 10 lajin ja tunnettujen Streptomvces platensis -lajien välillä on ero.

Koska kuitenkin uuden kannan ja tunnettujen kantojen välillä ainoastaan oli se ero, että niiden liukenevien pigmenttien tuotto oli erilainen, SANK 60191 tunnistettiin olevan uusi Streptomvces platensis -kanta.

15 On saatu selville, että kanta SANK 60191 tuottaa leustroduksiineja. Kuitenkin, kuten hyvin tiedetään, sienien ominaisuudet yleisesti ottaen, ja varsinkin Actinomycetes-mikro-organismit, voivat vaihdella huomattavasti ja sellaiset sienet voivat helposti läpikäydä mutaation sekä luonnollisista syistä että keinotekoisesti (esim. ultravioletti-20 säteily, radioaktiivinen säteily, kemiallinen käsittely, jne.). Siksi esillä oleva keksintö esittää minkä vain mikro-organismin käytön, joka voidaan luokitella sukuun Streptomvces ja jolla on sama ominainen kyky kuin kannalla SANK 60191 tuottaa leustroduksiineja. Uuden mikro-or-. ganismin, kannan SANK 60191, ei odoteta olevan poikkeuksellinen ja 25 termiä "SANK 60191" käytetään siten, että siihen sisältyy tämän kannan kaikki mutantit, joilla on sama ominainen kyky kuin kannalla SANK 60191 tuottaa leustroduksiineja. Lisäksi näihin mutantteihin kuuluvat ne, jotka saadaan tavanomaisilla geenitekniikoilla, esim. rekombinaatio, transduktio, transformaatio tai vastaava. On yksinkertaista kokeilemal-30 la määritellä tämän informaation avulla, joka tässä annetaan leustro-duksiineiden ominaisuuksista, jos joku tietty kanta tuottaa näitä yhdisteitä ja tuottaa niitä riittävästi niin, että tämä kanta olisi mahdollisesti taloudellisesti mielenkiintoinen.

35 Edellä kuvatun uuden Streptomvces platensis -kannan lisäksi olemme myös havainneet, että tunnettu kanta, nimittäin Streptomvces platensis 101978 16 SAM-0654 (tallennettu laitokseen Fermentation Research Institute, Japani, talletusnumerolla FERM BP-1668, 22. tammikuuta 1988) myös tuottaa esillä olevan keksinnön mukaisia leustroduksiineja. Tämä tunnettu kanta on täysin kuvattu Euroopan patentissa nro 329 361, jonka sisältöön 5 tässä viitataan.

Esillä olevan keksinnön mukaiset leustroduksiinit voidaan valmistaa viljelemällä näitä sienikantoja tavanomaisissa viljelyväliaineissa, ja joita käytetään muiden käymistuotteiden tuottamiseen samantapaisista 10 mikro-organismeista. Sellaiset väliaineet välttämättä sisältävät mikrobiologisesti assimiloitavia hiililähteitä ja typpilähteitä kuten myös epäorgaanisia suoloja kuten alan ammattihenkilö hyvin tietää.

Edullisia esimerkkejä hiililähteistä ovat: glukoosi, fruktoosi, 15 maltoosi, sakkaroosi, mannitooli, glyseroli, dekstriini, kaura, ruis, maissitärkkelys, perunatärkkelys, maissijauho, soijapapujauho, pumpuli-jyväkakku, pumpulijyväkooste, melassi, sitruunahappo, viinihappo ja vastaavat. Sellaisia yhdisteitä voidaan käyttää yksinään tai minä vain sopivana yhdistelmänä. Yleensä käytetty määrä voi vaihdella alueella 20 1-10 paino-% viljelyväliaineesta.

Edulliset typpilähteet ovat normaalit proteiinia sisältävät materiaalit kuten ne, joita yleensä käytetään käymisprosessissa. Esimerkkejä sellaisista typpilähteistä ovat: soijapapujauho, vehnäjauho, maapähkinä-25 jauho, pumpulijyväkooste, pumpulijyväöljy, pumpulijyväjauho, kaseiini-hydrolysaatit, fermamiini, kalajauho, maissiliuosneste, peptoni, lihauute, hiivauute, mallasuute, natriumnitraatti, ammoniumnitraatti, ammoniumsulfaatti ja vastaava. Näitä typpilähteitä voi käyttää yksinomaan tai minä vain sopivana yhdistelmänä. Yleensä pidämme edullisena 30 käyttää niitä konsentraatiossa 0,2-6 paino-% viljelyväliaineesta.

Ravintoaineiden epäorgaaniset suolat, jotka voidaan sisällyttää vilje-lyvällaineeseen, ovat tavanomaisia suoloja, jotka kykenevät saamaan aikaan erilaisia ioneja, jotka ovat välttämättömiä mikro-organismien 35 kasvulle kuten natrium-, ammonium-, kalsium-, fosfaatti-, sulfaatti-, 101978 17 kloridi- ja karbonaatti-ionit. Lisäksi väliaineen pitäisi sisältää pieniä määriä olennaisia hivenaineita kuten kaliumia, kalsiumia, kobolttia, mangaania, rautaa ja magnesiumia.

5 Kun esillä olevan keksinnön mukainen menetelmä suoritetaan neste-viljelytekniikalla, vaahdon muodostusta vastustavaa ainetta, kuten silikoniöljyä, kasviöljyä tai pinta-aktiivista ainetta käytetään edullisesti viljelyväliaineissa. Viljelyväliaineen pH leustroduksiinin tuottamiseksi viljelemällä Streotornvces olatensis -lajin mikro-organis-10 meja, varsinkin kantaa SANK 60191, vaihtelee edullisesti alueella 5.0-8.0, edullisimmin alueella 5.0-7.0.

Viljely voidaan suorittaa missä vain lämpötilassa alueella 9-37°C. Kasvu etenee kuitenkin hyvin lämpötilassa, joka on alueella 20-35°C ja sellai-15 nen lämpötila on edullinen. Lämpötila, joka on 22-30°C, on edullinen leustroduksiinien tuotannon optimoimiseen.

Nämä yhdisteet tuotetaan anaerobisissa viljelyolosuhteissa ja tavanomaisia anaerobisia viljelymenetelmiä, kuten ovat esim. kiinteä vilje-20 ly, ravistusviljely ja ilmastointisekoitus (upotettuna), voidaan käyttää. Kun kyseessä on viljely pienessä mittakaavassa, käytetään tyypillisesti ravistusviljelyä muutaman päivän lämpötilassa 28°C. Sellaisessa pienen mittakaavan viljelymenetelmässä, viljely voidaan aloittaa yhdellä tai kahdella solujen jakautumisvaiheella, joka tuottaa siemenviljel- * 25 miä, esimerkiksi Erlenmeyer-pulloissa, jotka on varustettu välilevyillä, jotka toimivat nestevirtauksen säätäjinä. Väliaine, jota käytetään siemenviljelyvaiheeseen edullisesti sisältää sekä hiili- että typpiläh-teitä. Edulliset toimenpiteet sellaiseen pienen mittakaavan viljelyyn ovat, että siemenviljelypullot ravistetaan vakiolämpötilassa inkubaat-30 torissa lämpötilassa 28°C 3 päivää, kunnes saadaan riittävä kasvu.

Kasvanut siemenviljelmä siirretään sitten toiseen siemenväliaineeseen tai tuotantoväliaineeseen. Kun käytetään välikasvufaasia, olennaisesti samaa menetelmää käytetään kasvuun ja tuloksena saadun välituotteen osa istutetaan tuotantoväliaineseen. Istutettuja pulloja voidaan hautoa 35 useita päiviä samalla ravistaen ja hautomisen mentyä loppuun pullon sisällöt voidaan sentrifugoida tai suodattaa.

101978 18

Suuren mittakaavan tuotannossa on edullista käyttää sopivaa käymis-astiaa, joka on varustettu sekoittimella ja ilmastointilaitteella.

Siinä tapauksessa ravintoväliaine voidaan valmistaa käymisastian sisäpuolella. Väliaine steriloidaan edullisesti kohottamalla lämpötila 5 sopivaan lämpötilaan, esim. lämpötilaan 120-125°C; jäähdytyksen jälkeen steriloitu väliaine voidaan istuttaa aikaisemmin valmistettuun siemen-viljelmään. Viljely etenee sitten sekoittaessa ja ilmastoitaessa sopivassa lämpötilassa, joka on esim. 28°C. Tämä menetelmä on sopiva esillä olevan keksinnön yhdisteiden suurten määrien saamiseksi.

10

Viljelyajan kuivuessa muuttuvaa tuotettujen leustroduksiinien määrää voidaan tarkkailla millä vain sopivalla tavalla kuten hyvin tunnetaan fermentointi-alalla, esim. korkean suorituskyvyn nestekromatografiällä. Useimmiten tuotettujen leustroduksiinien määrä saavuttaa maksimin 48-96 15 tunnin viljelyn jälkeen.

Viljelyn mentyä loppuun väliainenesteen nesteosaan jäävät leustroduk-siinit ja bakteerisolut voidaan uuttaa ja puhdistaa tavanomaisin keinoin käyttämällä hyväksi leustroduksiinien fysikaalis-kemiallisia omi-20 naisuuksia. Suodoksessa tai kelluvassa osassa läsnäolevat leustroduk-siinit voidaan esim. uuttaa veteen sekoittumattomalla orgaanisella liuottimella, kuten etyleeniasetaatilla, kloroformilla, etyleeniklori-dilla, metyleenikloridilla tai butanolilla (tai kahden tai useamman näiden liuottimien minkälaisessa vaan seoksessa) happamissa olosuhteis-25 sa; tämän jälkeen se voidaan puhdistaa tavanomaisin keinoin. On myös mahdollista poistaa mahdolliset epäpuhtaudet uuttamalla yhdellä tai useammalla edellä mainitulla liuottimella emäksisissä olosuhteissa, jonka jälkeen se voidaan puhdistaa tavanomaisin keinoin. Vaihtoehtoisesti epäpuhtaudet voidaan poistaa adsorptiolla antamalla nesteen, joka · 30 sisältää leustroduksiineja, kulkea sopivan adsorbentti-kerroksen läpi tai leustroduksiinit voidaan adsorboida sopivaan adsorptioaineeseen ja sitten eluoidaan käyttämällä sopivaa eluointia kuten vesipitoista me-tanolia, vesipitoista asetonia tai vesipitoista butanolia. Esimerkkejä sopivista adsorbointiaineista, joita voidaan käyttää näissä menetel-35 missä mukaanlukien aktiivihiili ja adsorbointiainehartsit, kuten 101978 19

Amberlite XAD-4 (tavaramerkki Rohm & Haas'in tuotteelle) tai Diaion HP-10, HP-20, CHP-20, HP-50 (tavaramerkkejä Mitsubishi Chemical Industries Corn tuotteille). Leustroduksiinit, joita on läsnä soluissa, voidaan saada uuttamalla sopivalla liuottimella kuten 50-90 tilavuus-5 prosenttisella vesi-asetonilla tai vesi-metanolilla, jonka jälkeen seuraa orgaanisen liuottimen poisto; tämän jälkeen tuote voidaan altistaa samanlaisille uutto- ja puhdistusmenetelmille kuin ne, jotka on edellä kuvattu suodosta varten.

10 Siten saatuja leustroduksiineja voidaan puhdistaa edelleen hyvin tunnetuilla tekniikoilla, esim. adsorptio-kolonni-kromatografialla käyttämällä kantajaa kuten silika-geeliä tai magnesium-silika-geeliä, esim. sitä, joka myydään kauppanimellä "Florisil"; partitiokolonni-kromato-grafiaa käyttämällä adsorbointiainetta kuten Sephadex LH-20 (tavara-15 merkki Pharmacian tuotteelle) tai korkean suodatuskyvyn nestekromato-grafiaa käyttämällä normaalifaasi- tai käänteisfaasikolonnia. Kuten alalla hyvin tiedetään, nämä eristämis- ja puhdistusmenetelmät voidaan suorittaa yksinään tai miten vain sopivasti yhdistettyinä ja haluttaes-' sa toistamalla ne haluttujen leustroduksiinien eristämiseksi ja puhdis- 20 tamiseksi.

Tämän keksinnön mukaiset leustroduksiinit ovat uusia yhdisteitä, joita ei aikaisemmin ole ilmoitettu kirjallisuudessa, ne stimuloivat veren-muodostukseen vaikuttavien tekijöiden tuottoa, kuten G-CSF ja GM-CSF, 25 eläimissä (kuten ihmisissä, koirissa, kissoissa ja kaniineissa) ja ovat siten käyttökelpoisia terapeuttisina aineina sivuvaikutusten vähentämiseksi, joita aiheuttavat syövän kemiallinen hoito ja sädehoito; ne myös estävät tartuntoja ja niillä on syöpää vastustava vaikutus makrofagien vaikutusten kautta. Lisäksi leustroduksiinien odotetaan olevan käyttö-30 kelpoisia aivojen aineenvaihdunnan parantamiseksi stimuloimalla NGFrn ‘ tuottoa. Lisäksi ne ovat käyttökelpoisia sienenvastaisina aineina ja niillä on osoitettu olevan sienen vastainen vaikutus Tricophvton metagrophvteiä vastaan.

101978 20

Leustroduksiinien kykyä stimuloida verenmudostukseen vaikuttavien tekijöiden tuotantoa esillä olevan keksinnön mukaisesti, voidaan periaatteessa analysoida menetelmällä, jonka on esittänyt Kohama et ai [Experimental Hematology 16, 603 - 608 (1988)]. Tällä menetelmällä 5 yhdistetään erilaisten verenmuodostukseen vaikuttavien tekijöiden tuotantojärjestelmä ja analysointisysteemi erilaisia verenmuodostukseen vaikuttavia tekijöitä varten. KM-102 -soluja esimerkiksi, jotka ovat peräisin ihmisen luuytimen peruskudossoluista, voidaan käyttää erilaisten verenmuodostukseen vaikuttavien tekijöiden tuottoon. Kuitenkin mitä 10 vain soluja, jotka kykenevät tuottaamaan erilaisia verenmuodostukseen vaikuttavia tekijöitä voidaan käyttää sen sijasta, esim. primäärisesti viljeltyjä, luuytimen peruskudossoluja, verisuonien sisäkettosoluja, lymfosyyttejä tai makrofageja, joita on läsnä luun ytimessä. Yhdisteen testinäyte, jonka vaikutus on tarkoitettu esittää, liuotetaan sopivaan 15 konsentraatioon ja lisätään viljelyjärjestelmään, joka sisältää soluja, jotka tuottavat erilaisia verenmuodostukseen vaikuttavia tekijöitä ("HF-tuottavia soluja"). Sopivan ajan jälkeen, tavallisesti 24 tuntia, osa viljelyväliaineen kelluvasta faasista otetaan ja lisätään solujen viljelyjärjestelmään, jotka riippuvat erilaisista verenmuodostukseen 20 vaikuttavista tekijöistä, esim. TF-l-solut ja NFS-60-solut ("HF-riippu-vaiset solut") sopivassa konsentraatiossa. Tietyn ajan jälkeen verenmuodostukseen vaikuttavien tekijöiden määrä voidaan mitata mittaamalla HF-riipuvien solujen kasvu ja siten yhdisteen kykyä stimuloida erilaisten verenmuodostukseen vaikuttavien tekijöiden tuotantoa voidaan ana-25 lysoida. HF-riipuvaisten solujen kasvu voidaan määrittää millä vain tavanomaisella menetelmällä, kuten solujen tritium-tymidiinin sisällyttämisellä tai käyttämällä MTT [3-(4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli)-2,5-di-fenyylitetratsoliumbromidi] -analysointimenetelmää (Chemicon International Inc., USA). Erilaisten verenmuodostukseen vaikuttavien tekijöi-30 den analyysi voidaan suorittaa millä vain tavanomaisella menetelmällä kuten viljelyä muodostavalla menetelmällä tai ELISA menetelmällä.

Esillä olevan keksinnön mukaiset leustroduksiinit sisältävät sekä happaman ryhmän (fosforihapporyhmän) ja emäksisen ryhmän (aminoryhmän) ja 35 voivat siten muodostaa suoloja. Näiden suolojen laatua ei erityisemmin 101978 21 rajoiteta silla edellytyksellä, että kun niitä käytetään terapeuttisesti, ne ovat farmaseuttisesti hyväksyttäviä. Kun ne on tarkoittu ei-terapeuttisiin käyttöihin esim. väliaineiksi muiden ja mahdollisesti aktiivisempien yhdisteiden valmistukseen, tämäkään rajoitus ei päde.

5 Esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet voivat muodostaa suoloja emästen kanssa. Esimerkkejä sellaisista suoloista ovat: suolat alkaali-metaiIin kanssa, kuten natrium, kalium tai litium; suolat maa-alkaali-metallin kanssa kuten barium tai kalsium; suolat muun metallin kanssa kuten magnesium tai aluminium; orgaaniset emässuolat kuten suola 10 disykloheksyyliamiinin kanssa; ja suolat emäksisen aminohapon kanssa kuten glysiini tai arginiini. Esillä olevan keksinnön mukaiset yhdisteet voivat myös muodostaa happoadditiosuoloja. Esimerkkejä sellaisista happoadditiosuoloista ovat: suolat mineraalihappojen kanssa, varsinkin halogeenivetyhappojen kanssa, kuten fluorivetyhappo, bromivetyhappo, 15 jodivetyhappo tai kloorivetyhappo), typpihappo, perkloorihappo, hiili-happo, rikkihappo tai fosforihappo; suolat alempien alkyylisulfonihap-pojen kanssa, kuten metaanisulfonihappo, difluorimetaanisulfonihappo tai etaanisulfonihappo; suolat aryylisulfonihappojen kanssa kuten bentseenisulfonihappo tai p-tolueenisulfonihappo; suolat orgaanisten 20 karboksyylihappojen kanssa, kuten etikkahappo, fumaarihappo, tartaari-happo, oksaalihappo, maleiinihappo, omenahappo, sukkiinihappo tai sitruunahappo; ja suolat aminohappojen kanssa, kuten glutamiinihappo ja aspartiinihappo.

25 Kun nämä yhdisteet on tarkoitettu terapeuttiseen käyttöön, ne voidaan annostella yksinomaan tai sopivana farmaseuttisena formulointina, joka sisältää paitsi aktiivista yhdistettä yhtä tai useampaa tavanomaista laimenninta, kantajaa, täyteainetta tai apuainetta. Formuloinnin laatu riippuu tietysti tarkoitetusta annostelureitistä. Suun kautta tapahtu-30 vaa reittiä varten yhdiste kuitenkin edullisesti formuloidaan pulveriksi, rakeiksi, tableteiksi, kapseleiksi tai siirapeiksi. Ruoansulatuskanavan ulkopuolista annostelua varten on edullista formuloida ruiskuksi (joka voi on verisuonen sisäinen, lihaksen sisäinen tai ihonalainen) tai puikkojen tai pisaroiden muotoon . Näitä valmisteita voidaan val-35 mistaa tavanomaisin keinoin lisäämällä lisäaineita kuten kantajia, sideaineita, hajotinaineita, voiteluaineita, stabilointiaineita, kor- 101978 22 jausaineita, liuotusaineita, suspensointiaineita tai päällystysaineita. Vaikka annos saattaa vaihdella potilaan oireiden ja iän mukaan, sairauden tai häiriön laadun ja vakavuuden mukaan ja annostelureitin tavasta riippuen, kun kyseessä on aikuisen ihmisen suun kautta tapahtuva annos -5 telu, keksinnön mukaisia yhdisteitä voidaan voidaan normaalisti annostella päivittäisenä annoksena 1-1000 mg. Yhdisteet voidaan annostella yhtenä ainoana annoksena tai jaettuina annoksina esim. kaksi tai kolme kertaa päivässä.

10 Esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistusta kuvataan edelleen seuraavien esimerkkien avulla.

Esimerkki 1 15 Leustroduksiinien viljely ia eristys 1(A) Viljely

Yksi platinasilmukallinen Streptomvces platensis SANK 60191 -itiöitä 20 istutettiin 500 ml:n Erlenmeyer-pulloon, joka oli varustettu välilevyillä ja sisälsi 100 ml aikaisemmin steriloitua viljelyväliainetta (jonka koostumus on kuvattu seuraavassa), ja mikro-organismia viljeltiin 3 päivää lämpötilassa 28°C ja kierrosnopeudella 200 rpm (kiertosäde 7 cm), käyttämällä pyörivää ravistinta.

25

Viljelyväliaine:

Liukoinen tärkkelys 30 g

Raaka hiiva 10 g

Soijapapupulveri 7 g 30 Kalajauho 5 g

Maissin liuotusneste 2 g

Lihauute 1 g

Kalsiumkarbonaatti 1 g

Vettä tilavuuteen 1000 ml 35 pH 7 (ennen sterilointia).

101978 23 15 litraa samaa viljelyväliainetta kuin mitä käytettiin siemenviljelyyn lisättiin jokaiseen neljään 30 l:n ruostumattomasta teräksestä olevaan käymisastiaan, ja steriloitiin kuumentamalla sitä lämpötilassa 120°C 30 min. 150 ml siemenviljelynestettä, joka oli valmistettu kuten on 5 kuvattu edellä, lisättiin sitten. Seosta viljeltiin 3 päivää lämpötilassa 28°C tuulettamalla ilmavirralla nopeudella 15 1/min. samalla sekoittaen. Jotta happipitoisuus nesteessä pidettäisiin arvossa 5 ppm, sekoitusnopeutta kontrolloitiin automaattisesti alueella 100-300 rpm.

10 KB) Eristys 2,4 kg Celite 545 (kauppanimi yhtiön Johns & Manville Project Corporation, USA tuotteelle) lisättiin suodatusapuaineena 60 l:aan viljeltyä liuosta, joka on saatu kuten on kuvattu vaihessa 1(A) edellä ja seos 15 suodatettiin. Viljelynesteen suodatuksen jälkeen saatiin 7,2 kg bakteerisoluja. Solut uutettiin kerran 30 1:11a 50-prosenttisella t/t vesipitoisella asetonilla ja kaksi kertaa 20 1:11a 80-prosenttisella t/t vesipitoisella asetonilla joka kerta. Nämä uutteet yhdistettiin ja orgaaninen liuotin tislattiin pois käyttämällä pyörivää haihdutinta.

20 Sopivaa vesipitoista kloorivetyhappoa lisättiin jäännökseen sen pH:n säätämiseksi arvoon 2,0, ja sitten seos uutettiin kaksi kertaa kumpanakin kertana 10 1:11a etyyliasetaattia. Uutteet yhdistettiin ja 10 1 natriumvetykarbonaatin 1-prosenttista p/t vesiliuosta lisättiin yhdistettyihin uutteisiin. Aktiiviset fraktiot siirrettiin vesikerrokseen ja 25 etyyliasetaattikerros poistettiin. Tämä etyyliasetaattikerros uutettiin taas 5 1:11a 1-prosenttisella p/t natriumvetykarbonaatin vesiliuoksella. Natriumvetykarbonaattiliuokset yhdistettiin ja yhdistetyn liuoksen pH säädettiin arvoon 2,0 lisäämällä vesipitoista kloorivetyhappoa.

Liuos uutettin kaksi kertaa kuminallakin kerralla 10 1 etyyliasetaattia.

30 Orgaaniset uutteet yhdistettiin, pestiin vedellä ja sitten kyllästetyllä natriumkloridi-vesi-liuoksella ja sitten kuivattiin vedettömällä natriumsulfaatilla. Jatkuvan metanolin lisäyksen aikana liuos konden-soitiin haihduttamalla alennetussa paineessa käyttämällä pyörivää haihdutinta, jolloin saatiin 10 ml öljyistä ainetta. Tämä öljyinen aine 35 liuotettiin 100 ml:aan 60-prosenttista t/t vesipitoista metanolia ja tuloksena saatu liuos adsorboitiin Sep-Pak Vac 20 cc C18 Cartridges:lie 101978 24 (Waters Co., USA:n tavaramerkki). Epäpuhtaudet eluoitiin 30 ml:11a 60-prosenttista t/t vesipitoista metanolia. Leustroduksiinit eluoitiin sitten 15 ml:lla 100-prosenttista metanolia ja eluaatti kondensoitiin, jolloin saatiin 800 mg öljyistä ainetta. Tämä öljyinen aine liuotettiin 5 10 ml:aan metanolia ja sille tehtiin korkean suorituskyvyn nestekroma- tografia. Fraktioilla oli huippuja lähellä 30 min. ja 24 min. kerättiin ja niihin viitataan "raakafraktiona A" ja "raakafraktiona B". Kroma-tografiassa käytetyt olosuhteet on esitetty seuraavassa.

10 Preparatiivinen nestekromatografia

Kolonnl: Radial-Pak 25 x 10 (Waters, USA)

Eluointiliuotin: 50 t-% vesipitoista asetonitriiliä, joka sisälsi 0,5 % trietyyliamiinia - fosfaattipuskuria, pH 3,0 Virtausnopeus: 9 ml/min.

15 Aallonpituus: 230 nm Näiden kaikkien huippujen kondensoinnin jälkeen tuloksena saaduille fraktioilla tehtiin preparatiivinen korkean suorituskyvyn nestekromatografia. Raakafraktiolle A tehtiin preparatiivinen kromatografia huipun 20 keräämiseksi lähellä 56 min. seuraavissa olosuhteissa; siitä poistettiin sitten suola ja kondensoitiin käyttämällä Sep-Pak:ia, jolloin saatiin 11,66 mg leustroduksiinia A.

Raaka-fraktion A valmistusolosuhteet: 25 Kolonni: Cosmosil 5C 18-AR 20 x 250 mm (Nakaraitesque Inc.)

Eluointiliuotin: 42 % t/t vesipitoista asetonitriiliä, joka sisälsi 0,5 % trietyyliamiini - fosfaattipuskuria, pH 3,0 Virtausnopeus: 9 ml/min.

Aallonpituus: 230 nm • 30

Raaka-fraktiolle B tehtiin preparatiivinen kromatografia piikkien keräämiseksi lähellä 47 ja 51 minuuttia seuraavissa olosuhteissa; siitä poistettiin sitten suola ja kondensoitiin käyttämällä Sep-Pak:ia, jolloin saatiin 9,83 mg leustroduksiinia B ja 5,22 mg leustroduksiinia C.

35 101978 25

Raaka-fraktion B valmistusolosuhteet:

Kolonni: Cosmosil 5C 18-AR 20 x 250 nm (Nakaraitesque Inc.)

Eluointi1luotin: 47 % t/t vesipitoista asetonitriiliä, joka sisälsi 0,5 % trietyyliamiinia - fosfaattipuskuria, pH 3,0 5 Virtausnopeus: 9 ml/min.

Aallonpituus: 230 nm

Siten saaduilla leustroduksiineilla oli seuraavat ominaisuudet: 10 Leustroduksiini A: 1) Kemiallinen rakenne: kaava (Ia), joka on esitetty edellä.

2) Luonne: hapan ja rasvaan liukeneva.

15 3) Väri: vaalean keltainen öljy.

4) Molekyylikaava: C32H52O10NP.

20 5) Molekyylipaino: 641, määritetty FAB-MS-menetelmällä ("FAB-MS" on

Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry).

6) Ultravioletti-absorptiospektri: 234 nm (maksimi absorptio me-tanolissa).

25 7) Infrapuna-absorptiospektri: infrapuna-spektrissä oli seuraavat absorptiomaksimit (nestekalvo, i/max cm-1): 2933, 2867, 1728, 1464, 1383, 1248, 1176, 1056, 969.

30 8) ^-ydinmagneettinen resonanssispektri: ydinmagneettinen re- sonanssispektri (270 MHz) raskasmetallissa, käyttämällä trime-tyylisilaania sisäisenä standardina, on esitetty seuraavassa: 7,08 (1H, kaksi dublettia, J - 9,8 & 4,9 Hz); 35 6,21-6,35 (2H, multipletti); 6,06 (1H, kaksi dublettia, J - 15,6 & 6,1 Hz); 101978 26 6,02 (1H, kaksi dublettia, J — 9,8 & 1,4 Hz); 5.94 (1H, dubletti, J - 15,6 Hz); 5,46 (1H, multipletti); 5,31 (1H, multipletti); 5 5,10 (1H, kaksi dublettia, J — 6,1 & 4,4 Hz); 4.94 (1H, multipletti); 4,72 (1H, multipletti); 4,29 (1H, kolme dublettia, J - 10,1, 10,1 fit 2,4 Hz); 2,93-3,15 (2H, multipletti); 10 2,50-2,71 (2H, multipletti); 2,25 (2H, tripletti, J - 7,6 Hz); 2,16 (1H, multipletti); 0,99-2,01 (18H, multipletti); 0,95 (3H, tripletti, J - 7,6 Hz); 15 0,89 (6H, dubletti, J - 6,8 Hz).

9) 13C-ydinmagneettinen resonanssispektri: (ί: ppm) ydinmagneettinen resonanssispektri (270 MHz) raskasmetanolissa, käyttämällä tri-metyylisliaania sisäisenä standardina, on esitetty seuraavassa: 20 11,4 (kvartetti), 22,7 (tripletti), 22,9 (kvartetti), 22.9 (kvartetti), 24,0 (tripletti), 24,7 (tripletti), 28.9 (dubletti), 32,4 (tripletti), 33,1 (tripletti), 34.3 (tripletti), 35,7 (tripletti), 36,1 (dubletti), 25 37,1 (tripletti), 39,4 (tripletti), 39,5 (tripletti), 40,6 (dubletti), 40,6 (tripletti), 64,7 (dubletti), 73.9 (dubletti), 77,8 (singletti), 78,5 (dubletti), 82.3 (dubletti), 121,1 (dubletti), 123,7 (dubletti), 124.3 (dubletti), 127,7 (dubletti), 135,3 (dubletti), . 30 137,3 (dubletti), 138,2 (dubletti), 152,7 (dubletti), 166.3 (singletti), 175,0 (singletti).

10) Liukoisuus:

Liukenee alkoholeihin, kuten metanoliin, etanoliin tai bu-35 tanoliin; ja liukenee asetoniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin 101978 27 ja dimetyylisulfoksidiin; osittainen liukenevuus veteen; liukenematon heksaaniin.

11) Värireaktiot: 5 Positiivinen rikkihapolle, jodille, ninhydriinille ja ammonium- molybdaatti-perkloorihapporeaktioille.

12) Korkean suorituskyvyn nestekromatografia:

Erotuskolonni: Cosmosil 5C18-AR (Kolonnin koko, 4,6 x 250 mm, 10 yhtiön Nakaraitesque Inc.tuote)

Liuotin: 45 % t/t vesipitoinen asetonitriili, joka sisälsi 0,5 % trietyyliamiinia - fosfaattipuskuria, pH 3,0 Virtausnopeus: 1 ml/min.

Aallonpituus: 230 nm 15 Viipvmäaika: 9,06 min. ja 9,16 min.

Leustroduksiini B: 1) Kemiallinen rakenne: kaava (Ib), joka on esitetty edellä.

20 2) Luonne: hapan ja rasvaan liukeneva.

3) Väri: vaalean keltainen öljy.

25 4) Molekyylikaava: C3*H56O10NP.

5) Molekyylipaino: 669, määritetty FAB-MS-menetelmällä.

6) Ultravioletti-absorptiospektri: 234 nm (maksimi absorptio me- 30 tanolissa).

7) Infrapuna-absorptiospektri: infrapuna-spektrissä oli seuraavat absorptiomaksimit (nestekalvo, cm'1): 2927, 2855, 1729, 1463, 1380, 1250, 1172, 1056, 968.

35 101S 78 28 8) XH-ydinmagneettinen resonanssispektri: ydinmagneettinen re sonanssi spektri (270 MHz) raskasmetanolissa, käyttämällä trime-tyylisilaania sisäisenä standardina, on esitetty seuraavassa: 5 7,09 (1H, kaksi dublettia, J - 9,8 & 4,9 Hz); 6,21-6,35 (2H, multipletti); 6,07 (1H, kaksi dublettia, J - 15,6 & 6,1 Hz); 6,02 (1H, kaksi dublettia, J - 9,8 & 1,5 Hz); 5.94 (1H, dubletti, J - 15,6 Hz); 10 5,46 (1H, multipletti); 5,31 (1H, multipletti); 5,10 (1H, kaksi dublettia, J - 6,1 & 4,4 Hz); 4.94 (1H, multipletti); 4,72 (1H, multipletti); 15 4,29 (1H, kolme dublettia, J - 9,9, 9,9 & 2,6 Hz); 2,93-3,15 (2H, multipletti); 2,50-2,71 (2H, multipletti); 2,27 (2H, tripletti, J - 7,3 Hz); 2,17 (1H, multipletti); 20 1,00-2,01 (22H, multipletti); 0,95 (3H, tripletti, J - 7,5 Hz); 0,87 (3H, tripletti, J - 6,8 Hz); 0,86 (3H, dubletti, J - 6,6 Hz).

25 9) 13C-ydinmagneettinen resonanssispektri: (6: ppm) ydinmagneettinen resonanssispektri (270 MHz) raskasmetanolissa, käyttämällä tri-metyylisilaania sisäisenä standardina, on esitetty seuraavassa: 11.4 (kvartetti), 11,7 (kvartetti), 19,6 (kvartetti), 30 22,7 (tripletti), 24,7 (tripletti), 26,4 (tripletti), 27,6 (tripletti), 30,6 (tripletti), 32,4 (tripletti), 33,1 (tripletti), 34,1 (tripletti), 35,5 (tripletti), 35.5 (dubletti), 36,1 (dupletti), 37,1 (tripletti), 37,3 (tripletti), 39,4 (tripletti), 40,6 (dubletti), 35 40,6 (tripletti), 64,7 (dubletti), 73,9 (dubletti), 77,8 (singletti), 78,5 (dubletti), 82,3 (dubletti), 101978 29 121.0 (dubletti), 123,7 (dubletti), 124,3 (dubletti), 127,7 (dubletti), 135,2 (dubletti), 137,4 (dubletti), 138,2 (dubletti), 152,7 (dubletti) 166,4 (singletti), 175.1 (singletti).

5 10) Liukoisuus:

Liukenee alkoholeihin, kuten metanoliin, etanoliin tai bu-tanoliin; ja liukenee asetoniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin ja dimetyylisulfoksidiin; osittainen liukoisuus veteen; liukene-10 maton heksaaniin.

11) Värireaktiot:

Positiivinen rikkihapolle, jodille, ninhydriinille ja ammonium· molybdaatti-perkloorihapporeaktioille.

15 12) Korkean suorituskyvyn nestekromatografia:

Erotuskolonnl: Cosmosil 5C18-AR (Kolonnin koko, 4,6 x 250 mm, yhtiön Nakaraitesque Inc.tuote)

Liuotin: 45 % t/t vesipitoinen asetonitriili, joka sisälsi 0,5 % 20 trietyyliamiinia - fosfaattipuskuria, pH 3,0

Virtausnopeus: 1 ml/min.

Aallonpituus: 230 nm

Viipvmäaika: 20,62 min. ja 20,87 min.

25 Leustroduksiini C: 1) Kemiallinen rakenne: kaava (Ie), joka on esitetty edellä.

2) Luonne: hapan ja rasvaan liukeneva.

30 3) Väri: vaalean keltainen öljy.

4) Molekyylikaava: C34H56O10NP.

35 5) Molekyylipaino: 669, määritetty FAB-MS-menetelmällä.

101978 30 6) Ultravioletti-absorptiospektri: 234 ran (maksimi absorptio me-tanolissa).

7) Infrapuna-absorptiospektri: infrapuna-spektrissä oli seuraavat 5 absorptiomaksimit (nestekalvo, >/Bax cm'1): 2930, 2856, 1728, 1464, 1382, 1252, 1172, 1056, 968.

8) ^-ydinmagneettinen resonanssispektri: ydinmagneettinen re-sonanssispektri (270 MHz) raskasmetanolissa, käyttämällä trime- 10 tyylisilaania sisäisenä standardina, on esitetty seuraavassa: 7,08 (1H, kaksi dublettia, J - 9,8 & 4,9 Hz); 6,21-6,35 (2H, multipletti); 6,07 (1H, kaksi dublettia, J - 15,6 & 6,1 Hz); 15 6,02 (1H, kaksi dublettia, J - 9,8 & 1,5 Hz); 5,94 (1H, dubletti, J - 15,6 Hz); 5,46 (1H, multipletti); 5,31 (1H, multipletti); 5,10 (1H, kaksi dublettia, J - 6,1 & 4,4 Hz); 20 4,94 (1H, multipletti); 4,72 (1H, multipletti); 4,28 (1H, kolme dublettia, J - 10,1, 10,1 & 2,4 Hz); 2,93-3,15 (2H, multipletti); 2,50-2,71 (2H, multipletti); 25 2,27 (2H, tripletti, J - 7,3 Hz); 2,16 (1H, multipletti); 1,00-2,01 (22H, multipletti); 0,95 (3H, tripletti, J - 7,3 Hz); 0,88 (6H, dupletti, J - 6,3 Hz).

30 9) 13C-ydinmagneettinen resonanssispektri: (6: ppm) ydinmagneettinen resonanssispektri (270 MHz) raskasmetanolissa, käyttämällä tri-metyylisilaania sisäisenä standardina, on esitetty seuraavassa: 1 11,4 (kvartetti), 22,7 (tripletti), 23,1 (kvartetti), 23,1 (kvartetti), 24,7 (tripletti), 26,2 (tripletti), 101978 31 28.2 (tripletti), 29,1 (dupletti), 30,4 (tripletti), 32.4 (tripletti), 33,1 (tripletti), 34,2 (tripletti), 35.4 (tripletti), 36,1 (dupletti), 37,1 (tripletti), 39.4 (tripletti), 40,0 (tripletti), 40,6 (dupletti), 5 40,6 (tripletti), 64,6 (dubletti), 73,9 (dubletti), 77,8 (singletti), 78,4 (dubletti), 82,3 (dubletti), 121,0 (dubletti), 123,7 (dubletti), 124,3 (dubletti), 127,7 (dubletti), 135,2 (dubletti), 137,3 (dubletti), 138.2 (dubletti), 152,7 (dubletti) 166,4 (singletti), 10 175,0 (singletti).

10) Liukoisuus:

Liukenee alkoholeihin, kuten metanoliin, etanoliin tai bu-tanoliin; ja liukenee asetoniin, kloroformiin, etyyliasetaattiin 15 ja dimetyylisulfoksidiin; osittainen liukoisuus veteen; liukene maton heksaaniin.

11) Värireaktiot:

Positiivinen rikkihapolle, jodille, ninhydriinille ja ammonium-20 molybdaatti-perkloorihapon reaktioille.

12) Korkean suorituskyvyn nestekromatografia:

Erotuskolonni: Cosmosil 5C18-AR (Kolonnin koko, 4,6 x 250 mm, yhtiön Nakaraitesque Inc.tuote) 25 Liuotin: 45 % t/t vesipitoinen asetonitriili, joka sisälsi 0,5 % trietyyliamiinia - fosfaattipuskuria, pH 3,0 Virtausnopeus: 1 ml/min.

Aallonpituus: 230 nm

Viipvmäaika: 21,90 min. ja 22,19 min.

30

Biologinen vaikutus

Seuraava testiesimerkki selittää esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden vaikutuksen yksityiskohtaisemmin.

35

Testi-esimerkki 1 GM-CSF:n tuotannon stimulointi 101978 32 5 Esillä olevan keksinnön mukaisten yhdisteiden GM-CSF tuotannon stimuloinnin määrittäminen suoritettiin, periaatteessa käyttämällä menetelmää, joka on seuraavien menetelmien yhdistelmä: Kohama et ai. [Experimental Hematology 16, 603-608 (1988)] ja Kitamura et el. [Journal of Cellular Physiology 140. 323-334 (1989)]. Yksityiskohtaisemmin ihmisen 10 luuytimestä peräisin olevia KM-102-soluja, jotka tuottivat yhdisteitä GM-CSF, sekoitettiin testinäyteliuokseen, joka laimennettiin sopivaan konsentraatioon ("GM-CSF tuottava järjestelmä"). 24 tunnin inkuboinnin jälkeen osa viljelmän kelluvasta osasta otettiin ja lisättiin GM-CSF-riippuvaiseen ihmisen TF-l-solujen viljelyjärjestelmään. 48-72 tunnin 15 jälkeen GM-CSF:n määrä mitattiin TF-l-solujen kasvulla ("GM-CSF analysointijärjestelmä"), jolloin saatiin GM-CSF-tuotannon stimuloinnin mitta. TF-l-solujen kasvu määriteltiin tritium-tymidi-impulssimerkin-nällä 4 tunnin ajan. Samanlaiset tulokset saatiin myös MTT-kitin avulla (Chemicon Internation Inc., USA) TF-l-solujen kasvun analysoimiseksi ja 20 ELISA-kitin avulla (Genzyme Inc., USA) GM-CSF:n analysoimiseksi. Sitä toimiko GM-CSF:n tuotantoa aikaansaava järjestelmä normaalisti tai ei, tutkittiin rekombinantti-interleukiini 1/J:n avulla (II*-1/}: (Genzyme Inc., USA). IL-Idillä indusoitu GM-CSF:n tuotanto annoksesta riippuvalla tavalla alueella 1-100 yksikköä/ml ja maksimissaan GM-CSF:n tuotan-25 to, joka indusoitiin oli 10-20 kertaa tuotanto ilman IL-1/9, joka osoitti, että koejärjestelmä toimi normaalisti.

Jokaisen leustroduksiinin A, B tai C lisäyksen jälkeen ΚΜΊ02-soluihin tietyssä konsentraatiossa, GM-CSF:n tuotannon havaittiin saatavan an-30 noksesta riippuvalla tavalla. Maksimissaan tuotetun GM-CSF:n määrä oli 10-20 kertainen siihen määrään verrattuna, joka saatiin ilman lisäystä. Leustroduksiinien A, B ja C ED50-arvojen havaittiin olevan 180+50, 50+15 ja 50+15 ng/ml.

35

Testieslmerkki 2 G-CSF:n tuotannon stimulointi: 10 Ί 978 33 5 G-CSF:n tuotannon stimulointi tutkittiin järjestelmässä, jossa GM-CSF-analysointisysteemi, jota käytettiin testiesimerkissä 1, korvattiin G-CSF-analysointisysteemillä [kuten on kuvannut Shirafuji et el.: Experimental Hematology 12, 116-119 (1989)]. Yksityiskohtaisemmin ihmisen luuydinsoluista peräisin olevat KM-102-solut, jotka tuottivat 10 G-CSF:ää lisättiin leustroduksiiniliuokseen, joka laimennettiin sopivaan konsentraatioon ("G-CSF:ää tuottava järjestelmä"). 24 tunnin inku-boinnin jälkeen osa viljelmän kelluvasta osasta otettiin ja lisättiin G-CSF:stä riippuvaisia olevien NFS-60-solujen viljelyjärjestelmään.

24-48 tunnin jälkeen G-CSF:n määrä analysoitiin NFS-60-solujen kasvusta 15 ("G-CSF:n analysointijärjestelmä"), jolloin saatiin G-CSF:n tuotannon stimuloinnin mitta. NFS-60-solujen kasvu määriteltiin tritiumtymidi-impulssimerkinnällä 4 tuntia. Samanlaisia tuloksia saatiin MTT-kitin avulla NFS-60-solujen kasvun analysoimiseksi ja ELISAkitin avulla G-CSF:n analysoimiseksi [Motojima et ai.: Journal of Immunological 20 Methods 118. 187-192 (1989)]. Rekombinantti-interleukiini \β:η avulla tutkittiin, toimiko G-CSF:n tuotantoa aikaansaava järjestelmä normaalisti tai ei (IL-1/9: Genzyme Inc., USA). IL- 1β-indusoitu G-CSF-tuotanto annoksesta riippuvalla tavalla alueella 1-100 yksikköä/ml ja maksimissaan indusoidun G-CSF-tuotanto oli 10-20 kertainen verrattuna tuotan-25 toon ilman IL-l/?:aa, joka osoitti, että koejärjestelmä toimi normaalisti.

Jokaisen leustroduksilnin A, B ja C lisäyksen jälkeen KM-102-soluihin tietyssä konsentraatiossa, G-CSF:n tuotannon havaittiin alkavan annok-30 sesta riippuvalla tavalla. Maksimissaan G-CSF:n tuotannon määrä oli 10-20 kertainen verrattuna määrään ilman lisäystä. Leustroduksilnin A, B ja C ED50-arvojen havaittiin olevan 200+50, 50+15 ja 50+15 ng/ml.

Testieslmerkki 3 NGF:n tuotannon stimulointi: 101978 34 5 Furukawa et gi. raportoi, että fibroplastia muodostavat L-M-solut, jotka on johdettu hiireen sidekudoksesta, tuottavat ja erittävät suhteellisen suuren määrän NGF:ää ja katekoliamiinit stimuloivat tätä tuotantoa ja eritystä [J. Biol. Chem. 261. 6039-6047 (1986)]. Tutkimme stimuloivatko leustroduksiinit NGF:n tuotantoa ja eritystä vai ei.

10 L-M-soluja viljeltiin käyttämällä 199-väliainetta, joka sisälsi 0,5 % peptonia. Jokaiseen seinään 24:n seinän viljelylevyssä istutettiin 5 x 10* L-M-soluja ja viljeltiin C02-inkubaattorissa (37°C, 5 % C02) kunnes ne yhtyivät. Viljelyneste poistettiin ja solut pestiin kerran 15 199-väliaineella, joka sisälsi 0,5 % härän seerumialbumiinia (Sigma).

Yhtä leustroduksiinia lisättiin tietyssä kosentraatiossa 199-väliainee-seen, joka sisälsi 0,5 % härän seerumialbumiinia ja sitten L-M-soluja käsiteltiin tällä seoksella. L-M-soluja viljeltiin sitten C02-inkubaat-torissa 24 tuntia. Viljelynesteen keräämisen jälkeen analysoitiin nes-20 teessä oleva NGF.

NGF analysoitiin entsyymi-immuunianalyysillä [Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 80, 3513-3516 (1983)]. Jokaiseen polystyreeni 96-seinän levyn seinään, kaadettiin 75 μΐ hiirenvastaista /9NGF-vasta-ainetta (Boehringer) 25 -liuosta (0,3 g/μΐ, pH 9,6) ja annettiin seistä yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Vasta-aineen poistamisen jälkeen kaikki seinät pestiin pesuliuoksella kolme kertaa. 50 μΐ standardi-/JNGF (Wako Pure Chem. Ind.) tai standardiliuosta kaadettiin jokaiseen seinään ja seoksen annettiin seistä 6-8 tuntia huoneen lämpötilassa. Tämän jälkeen stan-30 dardi 0NGF tai standardiliuosta poistettiin ja kaikki seinät pestiin kolme kertaa. 50 μΐ merkittyä ^NGF-monoklonaalista vasta-ainetta (Boehringer) -liuosta (100 mU/ml, pH 7,0) kaadettiin jokaiseen seinään ja liuoksen annettiin seistä 15-18 tuntia lämpötilassa 4°C. Tämän jälkeen entsyymillä merkitty vasta-aine poistettiin ja kaikki seinät pes-35 tiin kolme kertaa. 100 μΐ kloorifenooli-/3-D-galaktosiidi (Boehringer) -liuosta (1 mg/ml, pH 7,3) kaadettiin sitten jokaiseen seinään. Kun 101978 35 sopiva väri oli kehittynyt (2-3 tunnin jälkeen huoneen lämpötilassa), määritettiin absorbanssi aallonpituudessa 570 nm. NGF:n määrä laskettiin stadardikäyrästä ja tämä ilmaistiin prosentuaalisena määränä tuotetusta NGF:stä, joka erittyi soluista ilman leustroduksiinikäsittelyä.

5

Kaikkien leustroduksiinien havaittiin stimuloivan NGF:n tuontantoa annoksesta riippuvalla tavalla. Konsentraatiossa 5 μ/ml jokainen leust-roduksiini sai aikaan kaksi- tai useampikertaisen NGF:n tuotannon verrattuna soluihin ilman tätä käsittelyä.

10

Testiesimerkki 4 Sienen vastainen vaikutus 15 Leustroduksiinien sienen vastaisen vaikutuksen tutkimiseksi tauteja aiheuttavia sieniä vastaan eläimillä, vaikutus testattiin mikro-organismia Tricophvton mentagrophvtes vastaan. Jokaista leustroduksiinia varten havaittiin inhiboiva ympyrä konsentraatiossa 1 μg/levy.

20 Testiesimerkki 5

Akuutti myrkyllisyys

Tavanomaisen menetelmän mukaisesti akuutti myrkyllisyys testattiin 25 viidessä ddY-hiiressä (uroksia). Vatsaontelon sisäisen leustroduksiinin A 0,2 mg/kg suuruisen annostelun jälkeen myrkyllisyyttä ei havaittu viitenä päivänä. Myöskään mitään myrkyllisyyttä ei havaittu annostelemalla leustroduksiinia B, leustroduksiinia C ja niihin liittyviä johdannaisia.

30

Edellä esitetyistä tuloksista ilmenee, että leustroduksiinit A, B ja C stimuloivat verisuonien muodostukseen vaikuttavia tekijöitä kuten jy-vässolujen viljelyä stimuloivaa tekijää ja jyvässolu-makrofagiviljelyä stimuloivaa tekijää. Sen mukaisesti leustroduksiinit ovat käyttökelpoi-35 siä hoitoaineita kemiallisen hoidon ja säteilyhoidon sekä syövän hoidon sivuvaikutusten vähentämiseksi. Ne suojaavat myös tartunnoilta ja niil- 101978 36 la on syöpää vastustava vaikutus makrofagian vaikutuksen kautta. Lisäksi leustroduksiinit ovat käyttökelpoisia NGF:n stimulointi-tuotannon aivojen aineenvaihdunnan parantamiseksi. Lisäksi leustroduksiinit ovat käyttökelpoisia sienen vastaisia aineita, kuten niiden sienen vastainen 5 vaikutus mikro-organismeja Tricophvton mentaprophvtes vastaan osoittaa.

i

Claims

101978 37

1. Menetelmä kaavan (I) mukaisen lääkeaineena käyttökelpoisen leustro-duksiinin tai sen farmaseuttisesti hyväksyttävän suolan valmistamisek- 5 si: HO^ //° P - HO7 OH \ 10 ^OH I r R f (I) 15 jossa R on 5-metyyliheksanoyylioksiryhmä, 6-metyylioktanoyylioksiryhmä • tai 7-metyylioktanoyylioksiryhmä, tunnettu siitä, että viljel- 20 lään mikro - organismia, joka on leustroduksiinia tuottavaa lajin Strep-tomvces olatensis kantaa, ja kerätään ainakin yksi leustroduksiini viljelmästä .

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 25 että mainitulla yhdisteellä on kaava (Ia): HO^ //° ho7N> oh

30 N/ |S>H T /CH3 ^ OCOCHjCHjCHjCH CHj O'^'V^^CHj (Ia) 35 101978 38

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunne ttu siitä, että mainitulla yhdisteellä on kaava (Ib): c O

5 HO^ // h°/P^? V ΓΓ Γ-ΟΗ T J ococh2ch2ch2ch2ch

10. CH3 (Ib) 15

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunne ttu siitä, että mainitulla yhdisteellä on kaava (Ie): O

20 HO^ // Ho'^O O» ^OH I /CH3 J OCOCH2CH2CH2CH2CH2CH. ^ CH, 25 (le) 0^ 30 • 5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu mikro-organismi on Streptomvces platensis SANK 60191 (FERN BP-3288). 35 101978 39