CZ281418B6

CZ281418B6 - 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol,způsob výroby a produkční mikroorganismy

Info

Publication number: CZ281418B6
Application number: CS95517A
Authority: CZ
Inventors: Mutsuo Nakajima; Osamu Ando; Shuji Takashi; Kiyoshi Hamano; Hideyuki Haruyama; Takeshi Kinoshita; Akira Sato; Yasuyuki Takamatsu; Ryuzo Enokita
Original assignee: Sankyo Company Limited
Priority date: 1991-02-15
Filing date: 1992-02-13
Publication date: 1996-09-11
Also published as: EP0499489B1; NO177589C; KR920016401A; IS4065A; HK117796A; IS3815A; DE69202075T2; NO177589B; CS43992A3; KR100226305B1; CA2061239A1; FI920663A; IS4066A; NO920555L; US5260447A; ATE121383T1; CA2061239C; IE71947B1; DK0499489T3; NZ241623A

Abstract

Řešení spočívá ve svrchu uvedeném polyhydroxycyklopentanovém derivátu, který má schopnost způsobit inhibici účinnosti různých hydroláz cukrů, zejména beta-glukosidázy a sacharásy. Řešení se týká také způsobu výroby této látky, při němž se hydrolyzuje trehazolin při použití slabé kyseliny nebo se kultivuje mikroorganismus z rodu Micromonospora nebo Amycolatopsis a produkt se oddělí ze živného prostředí. Řešení se týká také produkčních mikroorganismů svrchu uvedeného typu. ŕ

Description

Má se za to, že trehazolin může být stejná sloučenina jako ta, jež je nazývána trehalostatin v PCT mezinárodní publikaci č. WO 90/10010.

Triol podle vynálezu způsobuje inhibici různých hydroláz cukrů, zvláště beta-glukosidázy a sacharázy.

Dosavadní stav techniky

Bylo popsáno, že sloučeniny mající silnou inhibiční aktivitu proti beta-glukosidáze, jako jsou castanospermin a deoxynojirimycin jsou užitečné jako antineoplastická činidla a jako anti-AIDS (Acquired Immunne Deficiency Syndrome) činidla (R. A. Gruters a další, Nátuře, 330, 74 až 77, 1987, M. J. Humphries a další,

Cancer. Res., 46, 5215 až 5222, 1986). Proto se očekává, že sloučeniny mající schopnost inhibovat aktivitu beta-glukosidázy budou užitečné jako antineoplastická a anti-AIDS činidla.

Také bylo popsáno, že sloučeniny mající silnou inhibiční účinnost proti sacharose, jako je AO-128 a Acarbosa jsou užitečné jako antidiabetická činidla a jako antiobesitní činidla (Satoshi Horii a další, Journal of Medicinal Chemistry, 29, 1038 až 1046, 1986, T. Aida a další, Journal of Japanese Society of Food and Nutrition, 34, (2), 134 až 139, 1981). Proto se očekává, že sloučeniny mající schopnost inhibovat aktivitu sacharosy budou užitečné k léčení a profylaxi diabetů a obesity.

Sloučeniny mající určitou strukturní podobnost se sloučeninami podle vynálezu jsou:

mannostatiny popsané mezi jiným T. Aoyagim a další, (The Journal of Antibiotics, sv. XLII, č. 6, 883, 1989), které jak uvedeno, mají schopnost inhibovat aktivitu alfa-D-mannosidasy.

/1S,2R,3S,4R,5R/-methyl-/2,3,4-trihydroxy-5-/hydroxymethyl/cyklopentyl/amin popsaný mimo jiné R. A. Farrem a další, /Tetrahedron Letters, 31, 7109, 1990/, který, jak je také uvedeno, má schopnost inhibovat aktivitu alfa-mannosidázy, allosamidin, popsaný mezi jiným S. Sakudou a další, (Tetrahedron Letters, 27, 2465, 1986), který jak uvedeno, má schopnost inhibovat aktivitu hmyzí chitinázy, a kifunensin, popsaný mezi jiným H. Kayakirim a další, (J. Org. Chem., 54, 4015, 1989), který, jak je uvedeno, je imunomodulátorem se schopností inhibovat aktivitu alfa-mannosidázy.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol a jeho farmaceuticky přijatelné soli.

Součástí podstaty vynálezu je také způsob výroby této látky.

2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol lze vyrobit hydrolýzou trehazolinu působe-2CZ 281418 B6 ním zředěného roztoku kyseliny nebo fermentací s užitím vnitroorganismů rodu Micromonospora nebo Amycolatopsis.

Trehazolin, který se může užít jako výchozí materiál pro výrobu sloučeniny podle vynálezu, lze připravit kultivací trehazolin produkujících mikroorganismů rodu Micromonospora nebo Amycolatopsis, výhodně trehazolin produkujícími mikroorganismy rodu Micromonospora.

Příkladem trehazolin produkujících mikroorganismů rodu Micromonospora je Micromonospora sp. SANK 62390. Tento mikroorganismus byl nejdříve uložen v domácím depositáři Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibarakiken, Japan, 26. července 1990 pod přístupovým číslem FERM P-11631 a potom byl uložen za podmínek Budapešťské smlouvy ve Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 21. srpna 1991, s přístupovým číslem FERM BP-3521.

Příkladem trehazolin produkujících mikroorganismů rodu Amycolatopsis je Amycolatopsis sp. SANK 60791, který byl uložen za podmínek Budapešťské smlouvy ve Fermentation Reserach Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukubashi, Ibakariken, Japan, 14. srpna 1991 s přístupovým číslem FERM BP-3513.

Oba jsou nově izolované kmeny a oba tvoří část tohoto vynálezu.

Charakterizace mikroorganismů

Micromonospora sp.. SANK 62390

Kmen Micromonospora sp. SANK 62390 má následující mykologické vlastnosti.

1. Morfologické vlastnosti

Kmen SANK 62390 roste normálně nebo lehce slaběji v průběhu kultivace při 28 ‘C po období 7 až 14 dnů na běžném agarovém kultivačním médiu užívaném k identifikaci kmenů. Substrátové hyphae se vhodně prodlužují a větví, se světle oranžovým, oranžovým až tmavě hnědošedavým zbarvením, ale bez zářezů, nebo ostrých obrátek pozorovaných u kmenů rodu Nocardia. Vzdušná mycelia jsou reedimentární a jsou zbarvena bíle až šedavé bíle. Spory jsou pozorovány na substrátových hyphae ojediněle a tvoří se po jednom na relativně krátkém sporangioforu. Tvar spor je kulovitý a povrch spor hladký. Nebyly pozorovány žádné speciální orgány jako jsou sporangie, sklerotie, viry a podobně.

2. Růst na různých médiích

Kmen byl kultivován při 28 ’C 14 dnů na různých kultivačních médiích a vykazoval vlastnosti ukázané v tabulce 1. Vyjádření barevných tonů je udáno v barevných číslech v Guide to Color Standard vydaném Japan Color Research Institute.

-3CZ 281418 B6

V tabulce jsou užity následující zkratky:

G: růst, AM: vzdušné mycelium, R: reverse (převrácená), RP: rozpustný pigment.

Tabulka 1

Vlastnosti kmene SANK 62390 médium charakteristika vlastnosti

sacharóso-	G	lehce slabý, hladký,
nitrátový agar		světle oranžový /3-9-6/
	AM	nevytvořeno
	R	světle oranžový /3-9-6/
	RP	nevytvořen
glukoso-	G	lehce slabý, hladký,
asparaginový agar		žlutavě oranžový /12 - 7 - 7/
	AM	nevytvořeno
	R	světle oranžový /6-8-7/
	RP	nevytvořen
glycerol-asparaginový	G	lehce slabý, hladký,
agar /ISP 5/		světle oranžový /8-7-6/
	AM	nevytvořeno
	R	světle hnědavě světlý /2-6-6/
	RP	nevytvořen
anorganické soli	G	dobrý, hladký,
/škrobový agar		světle oranžový
/ISP 4/		/8-7-6/
	AM	nevytvořeno
	R	šedý /N-5/
	RP	nevytvořen
tyrosinový agar	G	lehce slabý, hladký
/ISP 7/		kalně oranžový /6-8-6/
	AM	sotva vytvořeno rudimentární, bílé
	R	hnědavě bílé /2-9-7/
	RP	nevytvořen
nutriační agar	G	lehce slabý, hladký
/DIFCO/		žlutavě oranžový /10 - 8 - 7/
	AM	nevytvořeno
	R	kalně žlutavě oranžový /8-8-7/
	RP	nevytvořen

-4CZ 281418 B6

Tabulka 1 - pokračování médium charakteristika vlastnosti

kvasnicový extrakt	G	dobrý, hladký,
sladový extrakt		tmavě hnědavě šedý
agar /ISP 2/		/1-4-6/
	AM	sotva vytvořeno
		rudimentární hnědavě
		bílé /1-8-6/
	R	hnědavě černý
		/1-2-6/
	RP	nevytvořen
ovesnomoučný agar	G	dobrý, hladký,
/ISP 3/		oranžový
		/10 - 7 - 6/
	AM	sotva vytvořeno,
		rudimentární, bílé
	R	oranžový /12 - 7 - 6/
	RP	nevytvořen
vodní agar	G	lehce slabý, hladký,
		bledě žlutavě oranžový
		/2-9-9/
	AM	nevytvořeno
	R	šedý (N-5/
	RP	nevytvořen
bramborový extrakt	G	dobrý, hladký,
mrkvový extrakt		žlutavě šedý
agar		/1 - 9 - 10/
	AM	sotva vytvořeno,
		rudimentární, bílé
	R	hnědavě bílé
		/2-9-7/
	RP	nevytvořen

3. Fyziologické vlastnosti

Fyziologické vlastnosti kmene SANK 62390 pozorované v období od 2. dne do 21. dne po začátku kultivace, při 28 ’C ukazuje tabulka 2.

Tabulka 2

hydrolýza škrobu	pozitivní
ztekucení želatiny redukce nitrátu koagulace mléka peptonizace mléka produkce melanoidních	pozitivní negativní pozitivní pozitivní
pigmentů	* /médium 1/ negativní /médium 2/ negativní /médium 3/* negativní

-5CZ 281418 B6 pozitivní negativní negativní až 42 *c až 32 ’C 2 % t

dekompozice substrátu kasein tyrosin xanthin teplotní rozsah pro růst /médium 4/* optimální teplota pro růst /médium 4/* tolerance soli *médium 1: tryotono-kvasnicový extrakt vývar /ISP 1/ médium 2: peptono-kvasnicový extrakt-železitý agar /ISP 6/ médium 3: tyrosinový agar /ISP 7/ médium 4: kvasnicový extrakt-sladový extrakt agar (/ISP 2/

Kmen SANK 62390 byl také kultivován při 28 ’C s použitím

Pridham-Gottliebova agaru /ISP 9/ jako kultivačního média. Asimilace zdrojů uhlíku pozorovaná po 14 denní kultivaci ukazuje tabulka 3.

Tabulka 3

D-glukosa

D-fruktosa

L-arabinosa

L-rhamnosa

D-xylosa sacharosa

Inositol

Raffinosa

D-mannitol kontrola využitá využitá využitá nevyužitá využitá nevyužita využit využita nevyužit nevyužita

4. Buněčné složky

Buněčné stěny kmene SANK 62390 byly analyzovány metodou B. Beckera et al. [Applied Microbiology, 12, 421 až 423 /1984/] a bylo nalezeno, že obsahují mesodiaminopimelovou kyselinu. Mimoto cukrové složky stěn celých buněk kmene SANK 62390 byly analyzovány metodou Μ. P. Lechevaliera [Journal of Laboratory & Clinical Medicine, 71. 934 /1968/] a bylo nalezeno, že obsahují arabinosu a xylosu, ale nikoli kyselinu mykolovou. Ukázalo se, že acylový typ peptidového glykanu v buněčné stěně je glykolylového typu. Hlavní detekované menachinonové složky byly ΜΚ-10/Ηθ/, MK-10/H₄/ a MK-10/H₈/.

Je proto zřejmé, že tento mikroorganismus by měl být klasifikován jako nový druh, patřící k rodu Micromonospora rodiny Actinomycetes. Na tomto základě byl označen jako Micromonospora sp. SANK 62390.

-6CZ 281418 B6

Amycolatopsis sp. SANK 60791

Kmen Amycolatopsis sp. SANK 60791 má následující mykologické vlastnosti

1. Morfologické vlastnosti

Kmen SANK 60791 roste normálně nebo lehce slabě v průběhu kultivace při 28 ’C po období od 7 do 14 dnů na běžném agarovém kultivačním médiu užívaném pro identifikaci kmenů. Hyphae substrátu se prodlužují dobře a větví hladce nebo nepravidelně, s; hnědavě bílým, bledě žlutavě hnědým až tlumeně žlutým zbarvením. Vzduchová mycelia jsou řídká nebo rudimentární s bílým, bledě žlutým až světle oranžovým zbarvením. V posledních stadiích inkubace se někdy pozorují hyphae substrátu a vzdušná mycelia rozdělená v sekcích a vzdušná mycelia mající tyčinkovitou strukturu. Hyphae se prodlužují bez ostrých obratů pozorovaných u kmenu rodu Nocardia. Nebyly pozorovány žádné speciální orgány jako jsou sporangie, sklerotie, viry a podobně.

2. Růst na různých médiích

Kmen byl kultivován při 28 °C 14 dnů na různých kultivačních médiích a vykazoval vlastnosti ukázané v tabulce 4. Vyjádření barevných tonů je udáno v barevných číslech v Guide to Color Standard vydaném Japan Color Research Institute.

V tabulce jsou užity následující zkratky:

G: růst, AM: vzdušné mycelium, R: reverse /převrácená/,

RP: rozpustný pigment.

Tabulka 4

Vlastnosti kmene SANK 60791 médium charakteristika sacharosonitrátový G agar

AM

R

RP glukoso-asparaginový G agar

AM

R

RP vlastnosti dobrý, hladký, žlutavě šedý /1 - 9 - 10/ lehce slabý, bílý žlutavě šedý /2 - 9 - 10/ nevytvořen lehce slabý, hladký, světle oranžový /3-9-6/ sotva vytvořeno, žlutavě šedý /2 - 9 - 10/ světle hnědý /3-8-6/ nevytvořen

-7CZ 281418 B6

Tabulka 4 - pokračování médium charakteristika vlastnosti glycerin-asparaginový G agar /ISP 5/

AM

R

RP anorganické soli G škrobový agar /ISP 4/

AM

R

RP tyrosinový agar G /ISP 7/

AM

R

RP nutriční agar G (DIFCO)

AM

R

RP kvasnicový extrakt G sladový extrakt agar /ISP 2/

AM

R

RP ovesnomoučný agar G /ISP 3/

AM

R

RP vodní agar G

AM

R

RP dobrý, hladký, hnědavě bílý /2-9-7/ rudimentární, bílé bledě-žlutavě hnědý /6-8-8/ nevytvořen lehce slabý, hladký bledě žlutavé hnědý /4-8-9/ rudimentární, bledě žluté /3 - 9 - 10/ bledě žlutavě hnědý /6-8-9/ nevytvořen velmi dobrý, vrásčitý, hnědavě bílý /2-9-6/ sotva vytvořeno, světle oranžové /3-9-6/ světle oranžové /6-8-7/ nevytvořen dobrý, hladký, bledě žlutavě hnědý /4-8-8/ rudimentární, bílé bledě žlutý /3-9-8/ nevytvořeno dobrý, vrásčitý, matně žlutý /10 - 7 - 9/ rudimentární, bílý matně žlutavé oranžový /10 - 7 - 8/ nevytvořen lehce slabý, hladký, bledě žlutavě hnědý /4-8-9/ rudimentární, bílé bledě-žlutý /4-9-9/ nevytvořen lehce slabý, hladký, žlutavě šedý /1 - 9 - 10/ lehce slabé, bílé žlutavě šedý /1 - 9 - 10/ nevytvořen

-8CZ 281418 B6

Tabulka 4 - pokračování

médium	charakteristika	vlastnosti
bramborový extrakt-	G	lehce slabý, hladký,
mrkvový extrakt		žlutavě šedý
agar		/1 - 9 - 10/
	AM	rudimentární, bílé
	R	žlutavě šedý /2 - 9 - 11/
	RP	nevytvořen

3. Fyziologické vlastnosti

Fyziologické vlastnosti kmene SANK 60791 pozorované v období od 2. dne do 21. dne po začátku kultivace při 28 °C ukazuje tabulka 5.

Tabulka 5

hydrolysá škrobu	negativní
ztekucení želatiny			pozitivní
redukce nitrátu			pozitivní
koagulace mléka			pozitivní
peptinizace mléka			negativní
produkce melanoidního
pigmentu	/médium	1/	negativní
	/médium	2/*	negativní
	/médium	3/*	negativní
dekomposice substrátu	kasein		negativní
	tyrosin		pozitivní
	santhin		negativní
tolerance soli	/médium	4/*	3 %

* médium 1: tryptono-kvasnicový extrakt vývar /ISP 1/ médium 2: peptono-kvasnicový extrakt-železitý agar /ISP 6/ médium 3: tyrosinový agar /ISP 7/ médium 4: kvasnicový extrakt-sladový extrakt agar /ISP 2/

Kmen SANK 60791 byl také kultivován při 28 °C s použitím Pridham-Gottliebova agaru /ISP 9/ jako kultivačního média. Asimilace zdrojů uhlíku pozorovaná po 14 denní kultivaci ukazuje tabulka 6.

-9CZ 281418 B6

Tabulka 6

D-glukosa

D-fruktosa

L-arabinosa využita využita

L-rhamnosa

D-xylosa sacharosa

Inositol

Raffinosa

D-mannitol kontrola slabě využita využita využita využita nevyužit využita využit nevyužita

4. Buněčné složky

Buněčné stěny kmene SANK 60791 byly analyzovány metodou B. Beckera et al. [Applied Microbiology, 12, 421 až 423 /1984/] a bylo nalezeno, že obsahují kyselinu meso-diaminopimelovou. Mimoto byly analyzovány cukrové složky celých buněčných stěn kmene SANK 60791 metodou Μ. P. Lechevaliera [Journal of Laboratory & Clinical Medicine, 71. 934 /1968/] a bylo nalezeno, že obsahují arabinosu, ale že neobsahují kyselinu mykolovou. Bylo stanoveno, že acylový typ peptidového glykanu v buněčné stěně je acetylového typu. Hlavní detekovaná menachinonová složka byla MK-9/H₄/.

Je proto vhodné, že mikroorganismus by měl být klasifikován jako nový druh, patřící k Amycolatopsis rodiny Actinomycetes. Na tomto základě byl označen jako Amycolatopsis sp. SANK 60791.'

Identifikace kmenů SANK 62390 a SANK 60791 byla provedena podle standardů ISP /The International Streptomyces Project/, Bergey‘s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4, The Actinomycetes, Vol. 2 a ostatní současné literatury o Actinomycetách.

Bylo potvrzeno, že kmeny SANK 62390 a SANK 60791 vytvářejí trehazolin a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol. Avšak jak je dobře známo, vlastnosti hub obecně a aktinomycetových organismů zvláště, se mohou značně měnit a takové houby mohou snadno procházet mutací, jak z přirozených příčin, tak jako výsledek působení artecifidních prostředků (například ultrafialového záření, radioaktivního záření, chemického působení atd). V souhlase s tím tento vynález obsa huje užití jakéhokoli mikroorganismu, který může být klasifikován v rozsahu rodu Micromonospora nebo Amycolatopsis, a který sdílí s kmeny SANK 62390 a SANK 60791 charakteristickou schopnost produkovat trehazolin a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol. Neočekává se, že nové mikroorganismy kmenů SANK 62390 a SANK 60791 by byly výjimečné a pojmy SANK 62390 a SANK 60791 zahrnují všechny mutanty těchto kmenů, které sdílí s kmeny SANK 62390 a SANK 60791 charakteristickou schopnost produkovat trehazolin a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol. Mimoto tyto mutanty zahrnují mutanty získané prostředky technik genetického inženýrství, například rekombinaci, transdukci, transformaci a podobně. Je předmětem jednoduchého experimentování určit, na bázi zde podaných informací, týkajících se vlastností trehazolinu a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-10CZ 281418 B6

-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu, zda jakýkoli daný kmen produkuje tyto sloučeniny nebo zda je produkuje v dostatečném množství, aby takový kmen způsobil možný komerční zájem.

Trehazolin a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6-6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-ťriol se v souhlase s tímto vynálezem mohou připravit kultivací těchto kmenů hub v kultivačních médiích typu běžně užívaného pro produkci ostatních fermentačních produktů z podobných mikroorganismů. Taková média nezbytně obsahují mikrobiologicky asimilovatelné zdroje uhlíku a dusíku, stejně jako anorganické sole, jak je dobře známo odborníkům.

Výhodné příklady zdrojů uhlíku zahrnují: glukózu, fruktózu, maltózu, sacharózu, mannitol, glycerol, dextrin, oves, žito, kukuřičný škrob, bramborový škrob, kukuřičnou mouku, sojovou mouku, koláč z bavlněných semen, olej z bavlněných semen, molázy, kyselinu citrónovou, kyselinu vinnou a podobné. Takové sloučeniny mohou být užity samostatně nebo v jakékoli vhodné kombinaci. Obecně užité množství se může měnit v rozsahu od 1 do 10 % hmotnostních kultivačního média.

Výhodnými zdroji dusíku jsou normálně materiály obsahující protein, jako jsou běžně užívané ve fermentačních procesech. Příklady takových zdrojů dusíku zahrnují: sojovou mouku, pšeničné otruby, mouku z burských oříšků, koláč z bavlněných semen, olej z bavlněných semen, moučku z bavlněných semen, kaseinové hydrolyzáty, pharmamin, rybí maso, kukuřičný výluh, pepton, masový extrakt, kvasnice, kvasnicový extrakt, sladový extrakt, dusičnan sodný, dusičnan amonný, síran amonný a podobně. Tyto zdroje dusíku se mohou použít jednotlivě nebo v jakékoli vhodné kombinaci. Obecně dáváme přednost použít je v koncentraci mezi 0,2 a 6 % hmotnostními kultivačního média.

Živné anorganické soli se mohou zahrnout do kultivačního média, jsou to běžné soli, které jsou schopné poskytovat různé ionty nezbytné pro růst mikroorganismů, takové jako sodíkový, amoniakový, kalciový, fosfátový, síranový, chloridový a uhličitanový iont. Mimoto by médium mělo obsahovat menší množství nezbytných stopových prvků, jako jsou draslík, kalcium, kobalt, mangan, železo a hořčík.

Když se způsob podle tohoto vynálezu uskutečňuje technikou tekuté kultury, je s výhodou používáno v médiu protipěnové činidlo, jako je silikonový olej, rostlinný olej nebo povrchově aktivní činidlo. Kultivační médium pro produkci trehazolinu nebo 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu má mít pH pro kultivaci mikroorganismů rodu Micromonospora a Amycolatopsis, zejména kmenů SANK 62390 a SANK 60791, výhodně v rozsahu mezi 5,0 až 8,0, mnohem výhodněji od 6,5 do 7,5.

Kultivace se může uskutečnit za jakékoli teploty v rozsahu od asi 15 do 38 ’C, ačkoli je výhodná teplota od 22 do 38 °C pro dobrý vzrůst a teplota od 22 do 28 ^eC je výhodná pro optimalizaci produkce trehazolinu a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu.

-11CZ 281418 B6

Tyto sloučeniny se vyrábějí za aerobních kultivačních podmínek a obvyklými aerobními kultivačními metodami, které se mohou použít, jsou pevná kultura, kultura protřepáním a aeračně protřepávací (submersní) kultivační metody. V případě kultivace v malém rozsahu je typická kultura protřepáváním po několik dní při 28 ’C. V takových kultivačních metodách malého rozsahu, kultivace může být zahájena s jedním nebo dvěma proliferačními stupni, vytvořením naočkovaných kultur, například v Erlenmeyerových lahvích, opatřenými zachycovacími destičkami, které slouží jako regulátor toku tekutiny. Médium pro očkovací kultivační stupně výhodně obsahuje jak zdroje uhlíku, tak dusíku. V preferované sekvenci operací takových kultivací v malém měřítku, očkované kultivační lahve se třepají při konstantní teplotě inkubátoru při 28 °C po 7 dní nebo dokud se nedosáhne dostatečného vzrůstu. Vzrostlá naočkovaná kultura se potom přenese do druhého očkovacího média nebo do produkčního média. Když je užito intermediární růstové fáze, v podstatě stejná metoda se užije pro růst a alikvotní díly výsledného intermediárního produktu se naočkují do produkčního média. Inokulované lahve se mohou inkubovat několik dnů za třepání a po dokončení inkubace, obsahy lahví se mohou centrifugovat nebo filtrovat.

V případě výroby ve velkém měřítku, je výhodné použít vhodného kvasného zařízení opatřeného míchačem a aeračním aparátem. V takovém případě se živné médium může připravit uvnitř kvasného zařízení. Médium se výhodně sterilizuje zvýšením teploty na 125 °C; po chlazení, sterilizované médium se může inokulovat s předtím připravenou očkovací kulturou.. Kultivace potom pokračuje za míchání a aerace, například při 28 ’C. Tato metoda ,je vhodná pro získání sloučenin podle vynálezu ve velkých množstvích.

Postup kultivace a množství žádaného trehazolinu a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu vyprodukovaného jak kultivace pokračuje, se může stanovit měněním biologických aktivit sloučenin nebo vysokovýkonovou kapalinovou chromatografii nebo plynovou chromatografii/ hmotovou spektrometrií purifikovaných vzorků sloučenin z kultivační směsi, jak je dále mnohem detailněji popsáno. Trehazolin má inhibiční účinek proti trehalase bource morušového a jeho produkce se může monitorovat s použitím technik jako jsou ukázané v následuj ícím testovním příkladu 3.

Na druhé straně je výroba 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu nejlépe monitorována vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii nebo plynovou chromatografií/hmotovou spektrometrií. Ta se může uskutečnit uvedením kultivačního média s vhodnou adsorbenční pryskyřicí, [například tou, jež se prodává pod obchodním názvem Amberlite IRC-50 /NH₄ ⁺/] k absorpci 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol]-4,5,6-triolu, například v chromatografickém sloupci. Potom může následovat promytí vodou, eluce s vhodným elučním činidlem, například 0,5M vodným roztokem amoniaku, koncentrací eluátu, například odpařením za sníženého tlaku, a lyofylizací zbytku k vytvoření prášku. Množství 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu v prášku se může stanovit použitím vysokovýkonné kapalinové chromatograf ie. Alternativně může být sloučenina nejdříve acetylována

-12CZ 281418 B6 a množství 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu v prášku stanoveno plynovou chromatografií/hmotovou spektrometrií.

Obecně množství trehazolinu dosahuje maxima mezi 72 a 150 hodinami po začátku fermentace, zatímco množství 2-amino-4-/hydro xymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu dosahuje maxima mezi 96 a 168 hodinami po začátku fermentace. Avšak přesný čas se bude měnit v závislosti na teplotě a ostatních fermantačních podmínkách, a přesný optimální čas pro jakoukoli sadu podmínek se snadno může stanovit sledováním výroby žádané sloučeniny jak shora navrhováno.

Když se užívají kmeny rodu Micromonospora jako trehazolin, tak 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxažol-4,5,6-triol jsou normálně produkovány a mohou být odděleny konvenčními způsoby v průběhu regenerační procedury, jak je popsáno níže. Kmeny rodu Amycolatopsis normálně produkují pouze 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol. Obě sloučeniny se uvolňují do kapalné fáze, ačkoli jsou obě také přítomné v myceliu. Nejsnadněji se regenerují z kapalné fáze.

Po dokončení kultivace, žádaný trehazolin a/nebo 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6· -triol, které jsou přítomny v kapalné fázi kultivačního média, mohou být frakcionovány odfiltrováním mycelia a ostatních pevných materiálů, s výhodou použitím infusiorové hlinky jako filtračního prostředku nebo centrifugaci. Tyto sloučeniny, které jsou potom přítomny ve filtrátu nebo supernatantu, se mohou regenerovat extrakci a mohou se potom přečistit konvenčními prostředky, s využitím svých fyzikálně chemických vlastností.

Například tyto sloučeniny mohou být regenerovány z filtrátu nebo supernatantu průchodem přes sloupec obsahující adsorbens, jako je iontoměničová pryskyřice, například Amberlite IRC-50 nebo CG-50, nebo Dowex 50WX4 nebo SBR-P, takže se zadrží bud nečistoty na pryskyřici a tak se odstraní, nebo že se žádaná sloučenina zadrží a je potom regenerována elucí, například vodným amoniakem. Příklady dalších adsorbencií zahrnují aktivní uhlí nebo ostatní adsorpční pryskyřice, jako je Amberlit XAD-2 nebo XAD-4 (výrobek Rohm a Haas Co.) nebo Diaion HP-10, HP-20, CHP-20, H-50 (výrobky Asahi Chemical Industry Co., Ltd.). Roztok obsahující trehazolin a/nebo 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol se nechá projít přes adsorpční vrstvu obsahující jednu z těchto dalších adsorbencií, jak popsáno shora takže se bud zachytí nečistoty adsorbenciem a tak se odstraní, nebo se zachytí žádaná sloučenina a regeneruje se elucí, například vodným methanolem, vodným acetonem a podobně.

Trehazolin nebo 2-amino-4-/hydroxymethyl-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol takto získané, mohou být dále přečištěny různými známými technikami, například chromatograf ií na absorpční koloně používající nosič jako silikagel nebo Florisil; rozdělovači chromatografii na sloupci používající Avicel (výrobek Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) nebo Sephadex LH-20 (výrobek Pharmacia lne.); nebo vysokovýkonnou kapalinovou

-13CZ 281418 B6 chromatografii užívající normální, v reversní fázi nebo iontoměničový sloupec.

5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2,3,4-tetraol, slouče nina (I) tohoto vynálezu a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol, sloučenina (II) tohoto vynálezu, se mohou vyrobit hydrolýzou trehazolinu vyrobeného jak bylo shora popsáno.

Tato reakce se výhodně uskuteční v přítomnosti kyseliny a musí se provést za přítomnosti vody. Neexistuje žádné určité omezení, pokud jde o povahu užité kyseliny, a jakákoli kyselina běžně užívaná pro běžné hydrolyzační reakce se zde může rovněž použít. Příklady zahrnují takové anorganické kyseliny, jako jsou kyseliny chlorovodíková nebo sírová a takové organické kyseliny, jako jsou kyselina octová nebo propionová ve vodném roztoku. Výhodnou kyselinou je kyselina chlorovodíková.

Reakce se může realizovat v širokém rozmezí teplot a přesná reakční teplota není pro vynález kritická. Obecně je vhodné provést reakci při teplotě od asi teploty místnosti do 120 °C, mnohem výhodněji od 90 °C do 100 ’C. Čas požadovaný pro reakci může se také široce měnit, v závislosti na faktorech, zejména na reakční teplotě a povaze použitých reagencií a rozpouštědla a jak je vysvětleno níže na požadovaném produktu.

Bude ohodnoceno, že jak 5-amino-l-/hydroxymethyl/-cyklopentan-1,2,3-tetraol, tak 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4-5,6-triol, jsou připraveny ze stejného výchozího materiálu, s užitím stejné hydrolyzační reakce. V souhlasu s tím obecně produkt bude obsahovat směs dvou sloučenin. Avšak je možné upřednostnit výrobu jedné z těchto sloučenin nad druhou, vhodným výběrem reakčních podmínek. Tak obecně mírnější podmínky budou upřednostňovat výrobu 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent(d]oxazol-4,5,6 -triolu, zatímco mnohem přísnější podmínky usnadňují výrobu 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2,3,4-tetraolu.

V souhladu s tím pro výrobu 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu se dává přednost užití relativně mírnějšího kyselého reagens, například 0,2N vodné kyseliny chlorovodíkové a reakce se výhodně ponechá probíhat po období od 1 hodiny do 2 dnů, mnohem výhodněji od 5 do 6 hodin.

Na druhé straně, přimět reakci, aby šla převážně cestou výroby 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2,3,4-tetraolu, je výhodné užití silnější kyseliny jako 4N vodná kyselina chlorovodíková a průběh reakce nechat probíhat v období od 1 hodiny do 2 dnů, mnohem výhodněji od 20 do 24 hodin.

Nadto se 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2,3,4-tetraol může vyrobit hydrolýzou 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetra hydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu. V tomto případě hydrolyzační reakce podle vynálezu se může uskutečnit v přítomnosti kyseliny nebo zásady. Není žádné určité omezení v provozu užité kyseliny nebo zásady a jakákoli kyselina nebo zásada běžné užívaná v hydrolyzačních reakcích se zde může také použít.

-14CZ 281418 B6

Kde je pro reakci užita kyselina, příklady vhodných kyselin zahrnuj i: anorganické kyseliny jako jsou kyseliny halogenovodíkové (například chlorovodíková, bromovodíková nebo jodovodíková kyselina) kyselina sírová, kyselina chloristá, kyselina fosforečná a kyselina dusičná; organické karboxylové kyseliny, jako jsou nižší alkanoické kyseliny (například kyselina mravenčí, kyselina octová, kyselina štavelová nebo kyselina trifluoroctová; nižší alkensulfonové kyseliny (například kyselina methansulfonová, ethansulfonová nebo trifluormethansulfonová; arylsulfonové kyseliny (například kyselina benzensulfonová nebo p-toluensulfonová atd.). Výhodnými kyselinami jsou anorganické kyseliny, zejména kyselina chlorovodíková.

Obecně se reakce uskuteční výhodně a normálně v přítomnosti rozpouštědla. Nejsou žádná určitá omezení v povaze rozpouštědla, jež má být užito, za předpokladu, že nejsou žádné nepříznivé účinky na reakci nebo na určitá reagencia a že může rozpouštět, přinejmenším v určitém rozsahu, tato reagencia. Příklady vhodných rozpouštědel zahrnují: alkoholy, jako methanol, ethanol, propanol nebo butanol; sulfoxidy, jako dimethylsulfoxid, nebo sulfolan; organické kyseliny, zejména mastné kyseliny, jako kyselina octová nebo propionová; a voda. Výhodná rozpouštědla zahrnují vodu a směsi vody a organického rozpouštědla.

Množství užité kyseliny je normálně a výhodně od 1 do 20 mol, mnohem výhodněji od 5 do 10 mol, na mol výchozího materiálu.

Reakce se může uskutečnit v rozsahu širokého rozmezí teplot, a přesná reakční teplota není kritická pro vynález. Obecně bylo nalezeno, že je vhodné provést reakci při teplotě od asi teploty místnosti, do 150 ’C, mnohem výhodněji od 90 ’C do 110 ’C. Čas požadovaný pro reakci se může také široce měnit, zejména podle reakční teploty a povaze užitých reagencií a rozpouštědel. Avšak za předpokladu, že reakce se uskuteční za výhodných podmínek uvedených shora, bude dostatečné období od 1 hodiny do 2 dnů, mnohem výhodněji od 20 do 30 hodin.

Když je pro reakci užita zásada, příklady vhodných zásad zahrnují anorganické zásady, jako hydroxidy alkalických kovů (například hydroxid lithný, sodný nebo draselný); hydroxidy kovů alkalických zemin (například hydroxid vápenatý nebo barnatý); uhličitany alkalických kovů (například uhličitan sodný nebo draselný) a halogenidy alkalických kovů (například jodid sodný, bromid sodný nebo jodid draselný); a organické zásady, jako amoniak; alkylaminy (například triethylamin); a heterocyklické aminy (například morfolin, N-ethylpiperidin nebo pyridin).

Obecně se reakce uskutečňuje výhodně a normálně v přítomnosti rozpouštědla. Není zde žádné určité omezení v povaze užitého rozpouštědla, za předpokladu, že nemá žádný nepříznivý účinek na reakci nebo na použitá reagencia, a že přinejmenším v určitém rozsahu, může tato reagencia rozpouštět. Příklady vhodných rozpouštědel zahrnují alkoholy, jako methanol, ethanol, propanol nebo butanol; ethery, jako tetrahydrofuran nebo dioxan; sulfoxidy, jako dimethylsulfoxid nebo sulfolan; a vodu. Výhodná rozpouštědla zahrnují vodu a směsi vody a organického rozpouštědla.

-15CZ 281418 B6

Množství přidané zásady je normálně a výhodně od 0,01 do 10 mol, mnohem výhodněji od 1 do 5 mol, na mol výchozí sloučeniny.

Reakce se může uskutečnit v širokém rozsahu teplot a přesná reakční teplota není kritická pro vynález. Obecně bylo nalezeno vhodným provést reakci při teplotě od asi 0 °C do 120 ’C, mnohem výhodněji od asi teploty místnosti do 100 ’C. Požadovaný čas pro reakci se může také široce měnit v závislosti na mnoha faktorech, zřetelně na reakční teplotě a na povaze užitých reagencií a rozpouštědle. Avšak za předpokladu, že reakce je uskutečněna za shora uvedených výhodných podmínek, bude obvykle dostatečné období od 0,5 hodin do 2 dnů, mnohem výhodněji od 1 hodiny do 20 hodin.

Žádané sloučeniny vzorců I a II se mohou regenerovat z reakční směsi konvenčními prostředky běžně užívanými pro oddělení a regeneraci organické sloučeniny, například různé chromatografické techniky, zejména chromatografie na sloupci nebo preparativní chromatografie na tenké vrstvě. Různé možnosti volby byly popsány ve spojení s oddělením a přečištěním trehazolinu a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu, když jsou připraveny fermentaci a tyto možnosti volby se mohou také použít k oddělení a přečištění 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2,3,4-tetraolu a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent-[d]oxazol-4,5,6-triolu získaného, jak shora popsáno, hydrolýzou.

Sloučeniny tohoto vynálezu, 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-1,2,3,4-tetraolu a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu, každá obsahuje nejméně jeden zásaditý atom dusíku, a tak mohou tvořit adiční soli s kyselinami. Není zde žádná určitá restrikce o povaze těchto solí, s výjimkou, že když jsou zamýšleny pro terapeutické užití, jsou farmaceuticky přijatelné. Když jsou zamýšleny pro neterapeutické použití, například jako meziprodukty v přípravě ostatních a možná aktivnějších sloučenin, dokonce není toto omezení aplikovatelné. Příklady takových adičních solí s kyselinami zahrnují: soli s minerálními kyselinami, zejména halogenvodíkovými (jako kyselina fluorovodíková, bromovodíková, jodovodíková nebo chlorovodíková), kyselina chloristá, kyselina dusičná, kyselina uhličitá, kyselina sírová nebo kyselina fosforečná; soli s nižšími alkylsulfonovými kyselinami, jako kyselina methansulfonová, trifluormethansulfonová nebo ethansulfonová; soli s arylsulfonovými kyselinami, jako kyselina benzensulfonová nebo p-toluensulfonová; soli s karboxylovými kyselinami, jako kyselina octová, mravenčí, vinná, šfavelová, maleinová, jablečná, jantarová nebo citrónová; a soli s aminokyselinami, jako kyselina glutamová nebo asparatová.

Sloučeniny podle tohoto vynálezu nezbytně obsahují ve své molekule několik asymetrických atomů uhlíku, a tak mohou tvořit optické isomery. Ačkoli tyto všechny jsou zde vyjádřeny jediným molekulárním vzorcem, tento vynález zahrnuje jak individuální izolované isomery, tak směsi, včetně jejich racemátů. Jsou-li užity stereospecifické syntetizační techniky nebo jsou užity opticky aktivní sloučeniny, jako výchozí materiály, mohou se přímo připravit individuální isomery; na druhé straně, je-li připravena směs isomerů, individuální isomery se mohou získat běžnými rozlišovacími technikami.

-16CZ 281418 B6

5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2,3,4-tetraol má schopnost inhibovat aktivitu beta-glukosidázy a má nízkou toxicitu a proto může být očekáváno, že bude užitečný v léčení a profylaxí tumorů a AIDS. 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol má schopnost inhibovat aktivitu sacharózy a má nízkou toxicitu a může proto být očekáváno, že bude užitečný v léčení a profylaxi diabetů a obezity.

Když jsou tyto sloučeniny určeny k terapeutickému užití, mohou být aplikovány samostatně nebo ve vhodném farmaceutickém přípravku obsahujícím vedle aktivní sloučeniny jednu nebo více konvenčních ředidel, nosičů nebo vehikulí. Povaha přípravku bude ovšem závislá na zamýšlené aplikační cestě. Avšak pro orální cestu, je sloučenina výhodně upravena jako prášky, granule, tablety nebo kapsle. Pro parenterální aplikaci jsou výhodně připraveny jako injekce. Tyto přípravky se mohou připravit podle známých způsobů, přidáním takových přídavných látek, jako jsou vehikula, pojivá, desintegrační činidla, lubrikancia, stabilizátory a korigencia. Ačkoli se dávkování může měnit v závislosti na symptomech a věku pacienta, povaze a závažnosti nemoci nebo poruchy a cestě a způsobu aplikace, v případě orální aplikace dospělému člověku, sloučeniny podle vynálezu se mohou normálně aplikovat v denní dávce od 1 do 1 000 mg. Sloučeniny mohou být aplikovány v jedné dávce nebo v rozdělených dávkách, například třikrát denně. Příklady provedení vynálezu

Výroba sloučenin podle tohoto vynálezu je dále objasněna v následujících neomezujících příkladech.

Příklad 1

Výroba trehazolinu

1/A/ Kultivace

Plná očkovací klička Micromonospora sp. SANK 62390 se užije k inokulaci každého ze tří 500 ml Erlenmeyerových lahví, všechny jsou opatřeny přepážkovými destičkami a každá obsahuje médium 1 (mající níže uvedené složení) a inokulované láhve se inkubují při 28 ’C 216 hodin na rotačním třepacím přístroji, rotujícím rychlostí 220 otáček za minutu, k poskytnutí prvé očkované kultury.

Medium 1:

glukóza 1 % glycerin 1 % ovesná mouka 0,5 % sacharóza 1,0 % sojová mouka 2,0 % cesaminové kyseliny 0,5 % stlačené kvasnice 1,0 %

CB 442 0,01 % voda do 100 % (pH 7,0 před sterilizací).

Procenta jsou hmotnostní, založená na konečném objemu média.

-17CZ 281418 B6

Každá ze čtyř 2 litrových Erlenmeyerových lahví, každá obsahující 800 ml média 2 (mající níže specifikované složení), byla inokulována 40 ml kultivační tekutiny z prvých lahví, a lahve byly třepány při 28 ‘C 96 hodin na rotačním třepacím přístroji, rotujícím rychlosti 220 otáček za minutu, k poskytnutí druhé očkované kultury. 1,5 litru této druhé očkované kultury se užije k inokúlaci každého ze dvou 30 litrových nádob kvasných přístrojů, každý obsahující 15 litrů média 2 (mající níže specifikované složení), které bylo nejprve sterilizováno při 120 C 35 minut a chlazeno na 28 °C. Kvasné přístroje se promíchávají rychlostí 100 otáček za minutu při 28 ’C 96 hodin s provzdušňováním proudem vzduchu 15 litrů za minutu.

Médium 2:

glukóza 2 % rozpustný škrob 1 % stlačené kvasnice 0,9 % masový výtažek (Kyokuto) 0,5% polypepton 0,5 %

NaCl 0,5 %

CaCO₃ 0,3 %

CB442 0,01 % voda do 100 % (pH 7,2 před sterilizací)

Procenta jsou hmotnostní založená na konečném objemu média.

(B) Regenerace kg Celite 545 filtrační pomůcky (obchodní známka pro výrobek Johns Manville Products Corp.) se přidá ke 30 litrům celkové kultivační tekutiny získané jak shora popsáno a směs se filtruje. 29 1 filtrátu se nechá projít přes sloupec obsahující 6 litrů

Dowex SBR-P (Cl”) (obchodní značka výrobku Dow Chemical). pH eluátu se potom upraví na hodnotu 5,0, potom se roztok nechá projít přes sloupec obsahující 6 litrů Dowex 50WX4 (H⁺) (obchodní značka výrobku Dow Chemical). Trehazolin se adsorbuje a tak se zadrží sloupcem. Sloupec se promyje 20 litry deionisované vody a potom se eluuje 30 litry 0,5N vodného amoniaku, čímž vznikne 13 litrů aktivních frakcí. Celek tohoto eluátu (13 litrů) se koncentruje odpařením za sníženého tlaku a lyofylizací k získání 43,4 g surového prášku obsahujícího trehazolin. Surový prášek se rozpustí ve 2 litrech 10 mM pufrového roztoku mravenčanu amonného (pH 6,0) a roztok se adsorbuje na sloupec obsahující 1,5 litru Dowex 50WX4 (obchodní název), který byl předtím ekvilibrován 20 mM pufrovým roztokem mravenčanu amonného (pH 6,0). Sloupec se promyje 3 litry stejného 20 mM pufrového roztoku mravenčanu amonného, potom 2 litry deionisované vody a potom se eluuje 0,2N vodným amoniakem. Eluát se frakcionuje v 500 ml porcích. Frakce 2 až 4, které obsahují prakticky všechen trehazolin se smísí a koncentrují odpařením za sníženého tlaku. Produkt se potom lyofilizuje, čímž vznikne 2,55 g surového prášku. Surový prášek připravený opakováním stupňů do tohoto bodu se přímo užije bez dalšího přečištění v příkladu 3.

-18CZ 281418 B6

Tento surový prášek adsorbuje na sloupci naplněném 200 ml Avicelu (obchodní známka pro výrobek Asahi Chemical Industry Co., Ltd.) s použitím 80 % objem/objem vodného acetonitrilu. Sloupec se promyje 700 ml 80 % objem/objem vodného acetonitrilu a potom se nejprve eluuje 500 ml 75 % objem/objem vodného acetonitrilu a potom 700 ml 70 % objem/objem vodného acetonitrilu. Eluát se frakcionuje v 19 ml porcích. Frakce 35 až 50 obsahující trehazolin se smísí a koncentrují se odpařením za sníženého tlaku. Zbytek se pak lyofilizuje, čímž vznikne 658 mg prášku. Všechen tento prášek se rozpustí ve 150 ml vody a pH výsledného roztoku se upraví na hodnotu 6,0. Roztok se potom adsorbuje na sloupci naplněném 300 ml Amberlite CG-50 (H⁺:HH₄ ⁺ = 2:3, obchodní známka). Tento sloupec se promyje 500 ml deionizované vody a eluuje se 0,lN vodným amoniakem. Eluát se frakcionuje ve 20 ml porcích. Frakce 92 až 121 obsahující trehazolin se smísí a koncentrují odpařením za sníženého tlaku. Výsledný zbytek se potom lyofilizuje, čímž vznikne 102,8 mg prášku. Všechen tento prášek se rozpustí v 10 ml 2 mM pufrového roztoku mravenčanu amonného (pH 6,0) a výsledný roztok se adsorbuje na sloupci naplněném 400 ml Diaion CHP20P (obchodní známka pro výrobek Mitsubishi Kasei Co.), s použitím stejného 2 mM pufrového roztoku mravenčanu amonného. Eluát se frakcionuje v 5 ml porcích. Frakce 50 až 73 obsahující trehazolin se smísí a koncentrují se odpařením za sníženého tlaku. Výsledný zbytek se potom lyofilizuje, čímž vznikne 18 mg prášku, který se dále čistí elucí přes Diaion CHP20P s použitím stejného 2 mM pufrového roztoku mravenčanu amonného jako eluens, čímž vznikne 6,2 mg bezbarvého prášku.

Tento prášek se přečistí preparativní chromatografií na tenké vrstvě, jak dále uvedeno, 6,2 mg prášku se rozpustí v malém množství vody a aplikuje se na 3 silikagelové destičky (Merck Art 5715, 20x20 cm). Destičky se vyvinou ze směsi 6:1:3 (objemově) acetonitrilu, kyseliny octové a vody na výšku 15 cm. Svazek mezi Rf 0,42 a 0,5 se odškrábe z destiček a naplní se do sloupce. Sloupec se eluuje 100 ml deionisované vody. Eluát se nechá projít přes sloupec obsahující 5 ml Dowexu 50WX4 (H⁺), kde se trehazolin adsorbuje a tak se zadrží. Sloupec se promyje deionizovanou vodou a potom se eluuje 50 ml 0,5N vodného amoniaku. Eluát se koncentruje odpařením za sníženého tlaku a výsledný zbytek se lyofilizuje, čímž vznikne 5,1 mg trehazolinu jako bezbarvého prášku, pro který vysokotlaká kapalinová chromatografie ukazuje jediný peak.

Produkt má následující vlastnosti:

1. Povaha a vzhled: zásaditý bezbarvý prášek.

2. Rozpustnost: rozpustný ve vodě a methanolu, nerozpustný v acetonu a chloroformu.

3. Barevný test: pozitivní na kyselinu sírovou.

4. Molekulární vzorec: Ci3^H22^N2°10

5. Molekulární hmotnost: 366 /určeno FAB-hmotnostní spektroskopie - FAB je Fast/rychlé/-Atomové-Bombardment/bombardování/.

-19CZ 281418 B6

6. Specifická rotace: [a]_D ²⁵ +99,5° (c = 0,41, H₂O).

7. Ultrafialové absorpční spektrum: ^>_max nm /E_lcm ^1%/, ultrafialové absorpční spektrum měřené ve vodě nevykazuje žádná charakteristická absorpční maxima nad 220 nm.

8. Infračervené absorpční spektrum: V^_ax cm“¹ (v KBr),

367, 2 938, 1 663, 1 552, 1 384 a 1 056.

9. ¹H-nukleární magnetické rezonanční spektrum: δ ppm, ¹H-nukleární magnetické rezonanční spektrum (400 MHz) bylo měřeno v deuterium oxidu, s užitím TMS (tetramethylsilanu) jako externího standardu a vykazovalo následující signály:

3,22 /1H, dublet dubletů, J = 8,98 a 10,31 Hz/,

3,38 /1H, multiplet, J = 2,44, 5,26 a 10,31 Hz/,

3,46	/1H,	dublet dubletů,	J = 8,98	a 9,99	Hz/,
3,53	/1H,	dublet, J = 11,	96 Hz/,
3,55	/1H,	dublet dubletů,	J = 5,26	a 12,21	Hz/,
3,57	/1H,	dublet dubletů,	J = 5,38	a 9,99	Hz/,
3,62	/1H,	dublet dubletů,	J = 2,44	a 12,21	Hz/,
3,63	/1H,	dublet, J =11,	96 Hz/,
3,77	/1H,	dublet, J = 4,89 Hz/,
4,02	/1H,	dublet dubletů,	J = 2,08	a 4,89	Hz/,
4,17	/1H,	dublet, J .= 8,55 Hz/,
4,77	/1H,	dublet dubletů,	J = 2,08	a 8,55	Hz/,

5,15 /1H, dublet, J = 5,38 Hz/.

O _>

10. C-nuklearni magnetické rezonanční spektrum: δ ppm, ¹³C-nukleární magnetické rezonanční spektrum (100 MHz) bylo měřeno v deuterium oxidu, s použitím tetramethylsilanu jako externího standardu a vykazovalo následující signály: 60,7, 61,9, 69,6, 69,9, 72,0, 73,0, 80,1, 80,3, 80,6, 82,8,

87,3 a 161,1.

11. Vysokotlaká kapalinová chromatografie: sloupec pro oddělení: Senshu Pak ODS-H-2151 (Senshu Scientific Co.) 6<b x 150 mm (5 μΐ); mobilní fáze: 10 % (objem/objem) acetonitril-voda obsahující 0,5 % PIC B8 (výrobek Waters lne.); rychlost proudu: 1,5 ml/minutu;

monitorovaná vlnová délka: ultrafialová 210 nm;

peak mající retenční čas 6,9 minut byl pozorován při teplotě sloupce 25 °C, ^{12 * * * * *}

12. Chromatografie na tenké vrstvě:

Rf hodnota: 0,44

Adsorbent: silikagel na skleněné destičce (Merck Art 5715), vyvíjející rozpouštědlo: 6:1:3 (objemově) směs acetonitrilu, kyseliny octové a vody.

-20CZ 281418 B6

Příklad 2

Výroba 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu

100 g surového prášku připraveného jak popsáno v příkladu 1 a obsahujícího stanovených 225 mg tetrazolinu se rozpustí ve směsi 100 ml vody a 150 ml 4N vodné kyseliny chlorovodíkové a pH výsledného roztoku se upraví na hodnotu 2,5 přidáním 4N vodné kyseliny chlorovodíkové. K roztoku se potom přidá 8 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a 72 ml vody k upravení celkového objemu na 480 ml a poskytnutí koncentrace kyseliny chlorovodíkové 0,2N. Výsledný roztok se umístí do lahve s kulatým dnem a potom se hydrolyzuje na olejové lázni udržované na 100 “C po šest hodin Na konci tohoto období se reakční směs smísí s vodou a potom se koncentruje do sucha, odpařením za sníženého tlaku. Sled smísení s vodou a koncentrace odpařením do sucha se opakuje k oddestilování kyseliny chlorovodíkové. Zbytek se rozpustí ve 400 ml vody a pH roztoku se upraví na hodnotu 6,0 přidáním 1N vodného roztoku hydroxidu sodného. Roztok se potom zředí vodou na objem 8 litrů. Výsledný roztok se nechá projít přes sloupec naplněný 600 ml Amberlitu CG-50 (NH₄ ⁺) a sloupec se promyje 6 litry deionizované vody a potom se eluuje 0,5N vodným amoniakem. Eluát se koncentruje odpařením za* sníženého tlaku na objem 200 ml a koncentrát se nechá projít přes sloupec naplněný 800 ml Dowexu 1x2 (OH“). Sloupec se potom eluuje deionizovanou vodou. Potom co se prvých 1,5 litru eluátu odstraní, následující eluát se frakcionuje ve 20 ml porcích. Každá frakce byla změřena níže popsanou kvantitativní analýzou k určení, zda obsahuje žádanou sloučeninu. Frakce 70 až 110, které obsahují tuto sloučeninu, se smísí a koncentrují odpařením za sníženého tlaku. Zbytek se lyofilizuje, čímž vznikne 30 mg ?-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent [d]oxazol-4,5,6-triolu jako bezbarvého prášku majícího následující vlastnosti:

1. Barva a vzhled: zásaditý bezbarvý prášek.

2. Rozpustnost: rozpustný ve vodě, nerozpustný v acetonu a chloroformu.

3. Molekulární vzorec: C₇H₁₂ ^N2°5·

4. Molekulární hmotnost: 204 (určeno FAB-hmotovou spektroskopií).

5. Specifická rotace: (^{c =} θ»⁵¹» H₂0).

ΛΤ max ^nm /^Elcm '· ultrafialové absorpční spektrum měřené ve vodě nevykazuje žádná charakteristická absorpční maxima nad 210 nm.

7. Infračervené absorpční spektrum: ^_max cm”¹ (v KBr),

358, 1 668, 1 528, 1 398 a 1 066.

8. ¹H-nukleární magnetické rezonanční spektrum: δ ppm, ¹H-nukleární magnetické rezonanční spektrum (500 MHz) bylo

-21CZ 281418 B6 měřeno v deuterium oxidu, (5 užitím TSP /trimethylsilylpropionát sodný/ jako vnitřního standardu a vykazovalo následující signály:

3,73 /1H, dublet, J = 11,72 Hz/,
3,82	/1H,	dublet, J = 12,21 Hz/,
3,97	/1H,	dublet, J = 4,4 Hz/,
4,23	/1H,	dublet dubletů, J = 4,4 a 2,44 Hz/,
4,37	/1H,	dublet, J = 8,79 Hz/,
5,03	(1H,	dublet dubletů, J = 8,79 a 2,44 Hz/.

9. Vysokotlaká kapalinová chromatografie:

Sloupec pro oddělení: Asahu Pak ES-502C (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.), mobilní fáze: 20 mM octan amonný (pH 8,5) + mM vodný roztok chloridu sodného, rychlost proudu: 1 ml/minutu, monitorovaná vlnová délka: ultrafialová 210 nm, teplota: 25 ’C, retenční čas: 8,39 minut.

Kvantitativní analýza 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu použitím plynové chromatograf ie/hmotové spektrometrie

Shora referovaná kvantitativní analýza byla provedena takto:

Vzorek se rozpustí v rozpouštědle (vodě) známého objemu kapaliny, 10 μΐ výsledného roztoku se umístí v lahvičce a odpaří se do sucha pro acetylaci. Ke zbytku se přidá 30 μΐ anhydridu kyseliny octové, a 50 μΐ pyridinu a výsledná směs se 40 minut zahřívá při 60 °C. Jakýkoli přebytek reagencií se odstraní profoukáváním proudem dusíku skrze reakční směs. Zbytek se smísí se známým množstvím vnitřního standardu /pentaacetyl-l-amino-l-deoxy -beta-D-glukosa/ a směs se rozpustí ve 100 μΐ ethylacetátu k přípravě testovaného vzorku pro analýzu plynovou chromatografií/ hmotovou spektroskopií. Analýza se provede s použitím kapilárního sloupce z taveného křemene (výrobek J & W Scientific Co., DB-5, 15 metrů) jako sloupec pro plynovou chromatografii. Testovní vzorek (2 μΐ) se injikuje a teplota sloupce se zvýší z 60 ’C na 280 ’C rychlostí 25 °C/minutu. Negativní ionty se detekují chemickou ionizační metodou s použitím plynu methanu s čtyřpolohovým hmotovým spektrometrem Trio-1 (výrobek VG). Negativní ionové peaky při m/z 388 (odpovídající vnitřnímu standardu pentaacetylové sloučeniny) a m/z 413 (odpovídající pentaacetátu 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu) se užijí ke kvantitativní analýze. Obsah 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu se vypočte metodou vnitřního standardu.

-22CZ 281418 B6

Příklad 3

Výroba 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu (A) Kultura

Smyčka odebraná ze šikmého agaru kultury Amycolatopsis sp. SANK 60791 se užije k inokulaci každé ze dvou 500 ml Erlenmeyerových lahví, každá je opatřená přepážkovými destičkami a obsahuje 80 ml média 1 (složení je uvedeno shora v příkladu 1) a inokulované lahve se inkubují při 28 °C po 96 hodin na rotačním třepacím přístroji, rotujícím rychlosti 210 otáček za minutu, k poskytnutí naočkovaného kultivačního média.

Dvě 30 litrové nádoby kvasných přístrojů, každá obsahující 15 litrů média 2 (majícího složení uvedené shora v příkladu 1) se sterilizují při 120 ’C 30 minut. Potom se chladí na 28 °C a inokuluje se 75 ml naočkovaného kultivačního média do každé nádoby kvasného přístroje. Nádoby kvasných přístrojů se pak promíchávají při 28 °C rychlostí upravenou v rozsahu od 100 do 400 otáček za minutu (aby bylo udrženo 2 ppm rozpuštěného kyslíku) po 144 hodin a s aerací proudem vzduchu 7,5 litru za minutu.

(B) Regenerace

K 25 litrům celého kultivačního média [získaného jak popsáno v části (A) shora] se přidá 1,5 kg Celíte 545 filtračního pomocného prostředku a směs se filtruje a poskytne 23 litrů filtrátu. Hodnota pH filtrátu se upraví na 6,0 přidáním vodné kyseliny chlorovodíkové a roztok se nechá projít přes sloupec naplněný 3 litry Amberlitu IRC-50 (NH₄ ⁺), aby se adsorboval 2-amino-4-/hydro· xymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol. Sloupec se promyje 15 litry deionizované vody a potom se eluuje 0,5H vodným amoniakem. Potom co eluát začal být alkalický, shromáždí se 4,5 litru eluátu a koncentruje se odpařením za sníženého tlaku na objemu 200 ml. Koncentrát se nechá projít přes sloupec naplněný 450 ml Dowexu 1x2 (OH“) a sloupec se eluuje deionizovanou vodou. Prvých 800 ml eluátu se odstraní a další eluát se frakcionuje ve 20 ml porcích. Určí se kvantitativní analýzou užívající -bud vysokotlakou kapalinovou chromatografii, jak bude později popsáno, nebo plynovou chromatografii/hmotnostní spektrometrii, že frakce 60 až 90 obsahují žádaný 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol a tak se tyto frakce smísí a koncentrují se odpařením za sníženého tlaku. Koncentrát se lyofilizuje, čímž vznikne 16,6 mg 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu jako bezbarvého prášku, který má shora popsané vlastnosti .

Kvantitativní analýza užívající vysokotlakou kapalinovou chromatograf i i :

Sloupec pro oddělení:

Asahi pak ES-502C (výrobek Asahi Chemical Industry Co.,Ltd.)

-23CZ 281418 B6

Mobilní fáze: 20 mM octan amonný (pH 8,5) + 50 mM chlorid sodný. Rychlost průtoku: 1 ml/minutu.

Vlnová délka pro detekci: 210 nm.

Teplota: 25 C.

Retenční čas: 8,39 minut.

Kvantitativní analýza užívající plynovou chromatografii/hmotnostní spektrometrii

Shora referovaná kvantitativní analýza se provede v podstatě stejnými postupy, jak jsou popsány v příkladu 3.

Příklad 4

Šikmý agar kultury Micromonospora sp. SANK 62390 se homogenizuje v 10 ml fyziologického roztoku chloridu sodného, aby vznikla suspenze. 1 ml suspenze se naočkuje do každé ze dvou 2 litrových Erlenmeyerových lahví, každá je opatřena přepážkovými destičkami a každá obsahuje 500 ml média 3 (mající níže uvedené složení) a inokulované lahve se inkubují při 28 °C 96 hodin, na rotačním třepacím přístroji, rotujícím rychlostí 210 otáček za minutu, k přípravě prvého naočkovaného kultivačního média.

Médium 3:

glukóza 2 % kvasnicový extrakt (Difco) 0,5 % polypepton 0,5 %

CaCO₃ 0,1 S

CB-442 0,01 % voda do 100 % (pH 7,2 před sterilizací)

Procenta jsou hmotnostní, založena na konečném objemu média.

V 60 litrové nádobě kvasného přístroje se umístí 30 litrů média 3 a sterilizuje se při 120 ’C 30 minut. Potom se ochladí na 28 ’C, a 600 ml prvého naočkovaného média se do něj naočkuje. Kvasný přístroj se promíchává rychlostí 165 otáček za minutu při 28 °C 48 hodin s aerací proudem vzduchu 15 litrů za minutu k vytvoření druhého kultivačního média.

600 litrový tank obsahující 300 litrů média 4 (o složení uvedeném níže) se sterilizuje při 120 ’C 35 minut. Potom se ochladí na 28 °C a 15 litrů druhého kultivačního média se do něj inokuluje. Tank se potom promíchává při 28 °C rychlostí upravenou

-24CZ 281418 B6 v rozsahu od 82 do 142 otáček za minutu (aby se zachovaly 2 ppm rozpuštěného kyslíku) po 144 hodin s aerací proudem vzduchu 150 litrů za minutu a vnitřním tlaku 0,5 kg/cm².

Médium 4:

glukóza 8 % (předtím sterilizovaná při 120

Lustergen FK* stlačené kvasnice mastný extrakt (Kyokuto) polypepton ’C po 15 minut)

NaCl

CaCO₃ k₂hpo₄

CB—442 voda % 1,8 % 1 % % 0,5 % 0,3 %

0,25

0,02 do 100,0 í (pH 7,2 před sterilizací).

*obchodní název pro druh škrobu prodávaný Nichiden Kagaku Co.Ltd. (B) Regenerace

Přidá se 15 kg Celíte 545 filtračního pomocného prostředku ke 300 litrům celkového kultivačního média připraveného jak shora popsáno a směs se filtruje, aby vzniklo 290 litrů filtrátu. pH 20 litrů filtrátu se upraví na hodnotu 6,0 přidáním vodné kyseliny chlorovodíkové. Výsledný roztok se nechá projít přes sloupec naplněný 3 litry Amberlitu IRC-50 (NH₄ ⁺) a požadovaný 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol se zadrží ve sloupci adsorpcí. Sloupec se promyje 15 litry deionizované vody a eluuje se 0,5N vodným amoniakem. Potom co se eluát stane alkalickým, 4,5 litrů eluátu se shromáždí a koncentruje se odpařením za sníženého tlaku na objem 150 ml. Koncentrát se nechá projít přes sloupec naplněný 500 ml Dowexu 1x2 (OH) a eluuje se deionizovanou vodou. První 1 litr se odstraní a následující eluát se frakcionuje ve 20 ml porcích. Každá frakce se zkoumá kvantitativní analýzou popsanou v příkladu 3. Bylo nalezeno, že frakce 58 až 80 obsahují aktivní sloučeninu a tyto frakce se smísí a koncentrují se odpařením za sníženého tlaku. Zbytek se lyofilizuje, čímž vznikne 9,6 mg 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu jako surový prášek. Prášek se opět přečistí chromatografii na sloupci, s užitím sloupce naplněného 100 ml Dowex 1x2 (OH^-) eluováním deionizovanou vodou, čímž vznikne 4,8 mg 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu jako bezbarvého prášku s vlastnostmi, jež byly v předchozím popsány.

-25CZ 281418 B6

Příklad 5

Výroba 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2,3,4-tetraolu

Roztok 16 mg prášku 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu rozpuštěného ve 2 ml 6N vodné kyseliny chlorovodíkové se uzavře v ampuli a potom se hydrolyzuje zahříváním na 100 ’C po 24 hodin. Na konci této doby se k hydrolyzátu přidá voda a výsledná směs se koncentruje do sucha, odpařením za sníženého tlaku k odstranění kyseliny chlorovodíkové, a potom se výsledný zbytek rozpustí ve 20 ml vody a pH roztoku se upraví na 6,0 přidáním IN vodného roztoku hydroxidu sodného. Roztok se nechal projít přes 20 ml Amberlitu CG-50 (NH₄ ⁺) k zadržení 5-amino-l-(hydroxymethyl)cyklopentan-l,2,3,4-tetraolu adsorpcí a sloupec se promyje 60 ml deionizované vody a potom se eluuje 0,2N vodným roztokem amoniaku. Eluát se koncentruje odpařením za sníženého tlaku, aby se získalo 5 ml koncentrátu. Tento koncentrát se umístí na sloupec naplněný 50 ml Dowexu

1x2 (0H~) a sloupec se promyje 200 ml deionizované vody a potom se eluuje 20 % objem/objem vodným methanolem. Eluát se frakcionuje v 5 ml porcích. Frakce 5 až 23, které vykazují inhibiční aktivitu proti beta-glukosidase, se smísí a koncentrují odpařením za sníženého tlaku. Koncentrát se lyofilizuje, čímž vznikne 6,2 mg 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2,3,4-tetraolu jako bezbarvého prášku majícího shora popsané vlastnosti.

Testovní příklad 1 Biologická aktivita

Inhibiční aktivita 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-l,2,3,4-tetraolu proti beta-glukosidase

Vzorky beta-glukosidasy (oddělené od mandlí), p-nitrofenyl-beta-D-glukopyranosidu, deoxynojirimycinu a castanosperminu užité v tomto pokusu byly všechny zakoupeny od Sigma Chemical Co.

Užité testované sloučeniny byly 5-amino-l-/hydroxymethyl/cyklopentan-1,2,3,4-tetraol [sloučenina /1/] a deoxynojirimycin nebo castanospermin, obě jsou známé sloučeniny s tímto typem aktivity.

Směs 0,01 jednotky/ml beta-glukosidasy a 100 μΐ roztoku pufru (pH 5,6) tvořeného 20 mM kyseliny citrónové, 40 mM hydrogenfosforečnanu sodného a testovanou sloučeninou se ponechá stát při 37 ’C 15 minut. Na konci tohoto období se přidá ke směsi 50 μΐ roztoku pufru obsahujícího 3 mg/ml p-nitrofenyl-beta-D-glukopyranosidu, směs se potom ponechá reagovat při 37’C 20 minut. K reakční směsi se přidá 20 μΐ roztoku pufru 1M glycin/hydroxid sodný (pH 10,4) a množství uvolněného p-nitrofenolu se monitoruje absorbancí při 405 nm. Tabulka 7 uvádí koncentrace každé testované sloučeniny potřebné inhibovat aktivitu beta-glukosidasy na 50 % (IC₅₀).

-26CZ 281418 B6

Tabulka 7 inhibitor 50% inhibiční koncentrace beta-glukosidasy

sloučenina (I)	1,0	μg/ml
deoxynoj irimycin	15	μg/ml
castanospermin	4,3	μg/ml

Testovní příklad 2

Inhibiční aktivita 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3á,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu [sloučenina /II/] proti krysí sacharóze

Podle metody M. Kesslera et al. [Biochimica et Biophysica Acta, 506. 136 až 154 (1978)] roztok enzymů kartáčového lemu membrány krysího tenkého střeva se připraví z tenkých střev tří krysích samců kmene Wistar a suspenduje se ve 3 ml fyziologického roztoku chloridu sodného.

Vzorek 4-aminoantipyrinu (A 4382) byl zakoupen od Sigma Chemical Co., a vzorky peroxidasy (stupně I) a glukosooxidasy (stupně I) byly zakoupeny od Boehringer Mannheim Co. Roztok pufru (pH 6,2) obsahující 20 mM kyseliny citrónové a 40 mM hydrogenfosforečnanu sodného se užil.jako ředidlo v následujícím pokuse.

Každá jamka mikro-titrační desky s 96 jamkami (výrobek Falcon Co.) byla naplněna 130 μΐ celkem, směsi obsahující 0,2 mg hovězího sérového albuminu (Sigma, A 7906), 3 jednotky glukosooxidasy, 0,132 jednotky peroxidasy, 20 p.g 4-aminoantipyrinu, 40 μg fenolu, 3 μ mol sacharózy a testovanou sloučeninu. K jamce bylo přidáno 20 μΐ 100 násobně zředěného roztoku enzymu kartáčového lemu membrány krysího tenkého střeva. Směs uvolněné glukózy byla monitorována absorbancí při 492 nm.

Když enzymová reakce byla provedena bez přidání testované sloučeniny a bez přidání enzymového roztoku, bylo předpokládáno, že koncentrace glukózy jsou 0 % a 100 % inhibice, respektive koncentrace sloučeniny (II) potřebná k inhibici aktivity krysí sacharózy o 50 % (IC_5Q) byla 18 μg/ml.

Testovní příklad 3

Inhibiční aktivita trehazolinu proti trehalase bource morušového.

Deset larev bource morušového pátého instaru (larválního stadia) celková hmotnost 44 g) se homogenizuje použitím Polytron (obchodní značka) homogenizátoru, ve 120 ml roztoku pufru (pH 5,6), připraveného použitím 20 mM kyseliny citrónové a 40 mM hydrogenfosforečnanu sodného, po 2 minuty, přičemž se chladí ledem. (Stejný roztok pufru se užije v následujícím postupu). Homogenizovaná smés se potom 10 minut centrifuguje při rychlosti 6 000 otáček za minutu a supernatant se oddělí. Přidá se 240 ml

-27CZ 281418 B6 acetonu ke 120 ml supernatantu, přičemž se chladí ledem a míchá, a výsledná směs se centrifuguje 20 minut při rychlosti 9 000 otáček za minutu. Sediment se oddělí a rozpustí se ve vodě a výsledný roztok se lyofilizuje, čímž vzniknou 2,0 g surového enzymu.

130 μΐ shora uvedeného roztoku pufru, 50 μΐ vzorku roztoku obsahujícího trehazolin v různých koncentracích a 50 μΐ roztoku enzymu bource morušového připraveného jak shora popsáno a obsahující 4 mg/ml enzymu se umístí do testovních zkumavek, a směs se třepe na vodní lázni udržované na 37 “C 15 minut. Na konci této doby se přidá 20 μΐ 250 mM roztoku trehalosy a směs se nechá reagovat 15 minut. Reakční směs se potom zahřívá na lázni s vařící se vodou 3 minuty, potom se chladí s ledovou vodou. Potom se centrifuguje 10 minut při rychlosti 3 000 otáček za minutu a výsledný roztok, zbavený sedimentu, se použije ke stanovení koncentrace glukózy.

Reakce se provede použitím glukozo-C-testu Wako (výrobek Wako Pure Chemical Industries Ltd.) a 10 násobných množství vzorkového roztoku nad množstvími užívanými ve standardním postupu. Inhibiční rychlost se vypočte z koncentrací glukózy dosažených, když se užije roztok pufru místo roztoku vzorku a když se užije roztok pufru místo roztoku substrátu jako 0 % a 100 % inhibice, respektive, koncentrace potřebná inhibovat enzymovou aktivitu o 50 % (IC₅₀) byla vypočtena jako 2,0 ng/ml.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. 2-amino-4- (hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol a jeho farmaceuticky přijatelné soli.
2. Způsob výroby 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triolu, vyznačuj ící se tím, že se hydrolyzuje trehazolin působením zředěného roztoku kyseliny.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se hydrolýza provádí při použití 0,2N vodné kyseliny chlorovodíkové po období od 1 hodiny do 2 dnů.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se hydrolýza uskuteční použitím 0,2N vodné kyseliny chlorovodíkové po období od 5 do 6 hodin.
5. Způsob výroby 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triolu, vyznačuj ící se tím, že se kultivuje mikroorganismus rodu Micromonospora nebo Amycolatopsis schopný produkce 2-amino-4-(hydroxymethyl )-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triolu při teplotě 23 až 32 °C po dobu 100 až 190 hodin a 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol se oddělí od kultivačního média.

-28CZ 281418 B6
6c Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že mikroorganismus je kmen druhu, ke kterému patří Micromonospora sp. SANK 62390, FERM BP-3521.
7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že mikroorganismus je Micromonospora sp. SANK 62390, FERM BP-3521.
8. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že mikroorganismus je kmen druhu, ke kterému patří Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERM BP-3513.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se tím, že mikroorganismus je Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERM BP-3513.
10. Kmen Micromonospora sp. produkující 2-amino-4-(hydroxymethyl)~3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol, SANK 62390, FERM BP-3521.
11. Kmen Amycolatopsis sp. produkující 2-amino-4-(hydroxymethyl)“3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol, SANK 60791, FERM BP-3513.