KR100230626B1 - 폴리히드록시시클로펜탄 유도체, 그의 제조방법 및 그의 치료적 용도 - Google Patents

폴리히드록시시클로펜탄 유도체, 그의 제조방법 및 그의 치료적 용도 Download PDF

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Abstract

당 가수분해 효소, 특히 β - 글루코시다아제 및 슈크라아제의 활성 억제 능력을 갖고 따라서 종양 상태, AIDS, 당뇨병 및 비만증의 치료 및 예방을 위해 사용될 수 있는, 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올은 트레하졸린의 가수분해에 의해 생성될 수 있다. 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올은 또한 신규의 단리 균주인 미크로모노스포라 sp. SANK 62390, FERM BP - 3521 및 아미콜라톱시스 sp. SANK 60791, FERM BP - 3513 을 사용한 발효에 의해 제조될 수 있다.

Description

폴리히드록시시클로펜탄 유도체, 그의 제조방법 및 그의 치료적 용도 {POLYHYDROXYCYCLOPENTANE DERIVATIVES, THEIR PREPARATION AND THEIR THERAPEUTIC USE}
본 발명은 가치높은 생물학적 활성을 갖는 2 가지의 신규 폴리히드록시시클로펜탄 유도체, 이들 화합물의 제조방법, 뿐만 아니라 이들 화합물을 이용한 치료 및 예방용 조성물과 그 방법을 제공한다.
본 발명의 화합물은 각각 하기 일반식 (I) 및 (II) 로 표시되는 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올이다. 이들 화합물은 하기식 (III) 으로 표시될 수도 있는 트레하졸린으로 공지된 화합물의 발효 또는 분해에 의해 제조될 수도 있다. 그러나, 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a, 5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올 및 트레하졸린은 모두 호변 이성질 현상을 겪게 되므로, 또한 각각 하기 일반식 (IIa) 및 (IIIa) 로 표시될 수도 있다.
트레하졸린은 PCT 국제 공개 제 WO 90 / 10010 호에서 '트레할로스타틴' 으로 명명된 것과 동일한 화합물인 것으로 추측된다.
본 발명의 화합물은 다양한 당 가수분해 효소, 특히 β - 글루코시다아제 및 슈크라아제의 활성을 억제하는 능력을 가지고 있다.
카스타노스페르민 및 데옥시노지리마이신과 같이, β - 글루코시다아제에 대해 강력한 억제 활성을 갖고 있는 화합물은 항 - 종양제 및 항 - AIDS (후천성 면역 결핍증) 제로서 유용함이 보고되어 있다 [R.A. Gruters et al., Nature, 330, 74 ∼ 77 (1987) ; M.J. Humphries et al., Cancer Res., 46, 5215 ∼ 5222 (1986)]. 따라서, β - 글루코시다아제의 활성을 억제하는 능력을 갖는 화합물이 항 - 종양 또는 항 - AIDS 제로서 유용할 것으로 기대된다.
또한, AO - 128 및 아카르보스와 같이, 슈크라아제에 대해 강력한 억제 활성을 갖는 화합물이 항 - 당뇨제 및 항 - 비만제로서 유용함이 보고되어 있다 [Satoshi Horii 등 Journal of Medicinal Chemistry, 29, 1038 ∼ 1046 (1986) ; T. Aida 등 Journal of Japanese Society of Food and Nutrition, 34, (2) 134 ∼ 139 (1981)]. 따라서, 슈크라아제의 활성을 억제하는 능력을 갖는 화합물의 당뇨병 및 비만증의 치료 및 예방에 유용할 것으로 기대된다.
본 발명의 화합물과 구조적으로 유사한 화합물은 다음과 같다 :
만노스타틴 [특히 T. Aoyagi 등에 의해 기술됨, The Journal of Antibiotics, vol. XLII, No. 6, 883 (1989)] 은 α - D - 만노시다아제의 활성억제 능력을 가진 것으로 알려져 있으며 ;
(1S, 2R, 3S, 4R, 5R) - 메틸 [2,3,4 - 트리히드록시 - 5 - (히드록시메틸) 시클로펜틸] 아민 [특히, R.A.Farr 등에 의해 기술됨, Tetrahedron Letters, 31, 7109 (1990)] 은 또한 α - 만노시다아제의 활성 억제 능력을 가진 것으로 알려져 있고 ;
알로사미딘 [특히 S, Sakuda 등에 의해 기술됨, Tetrahedron Letters, 27, 2475 (1986)] 은 곤충키틴아제의 활성 억제 능력을 가진 것으로 알려져 있고 ;
키후넨신 [특히 H. Kayakiri 등에 의해 기술됨, J. Org. Chem., 54, 4015 (1989)] 은 α - 만노시다아제의 활성 억제 능력을 갖는 면역 조절제로 알려져 있다.
본 발명의 목적은 특정한 당 가수분해 효소에 대한 억제 활성을 갖는 신규 화합물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 종양, AIDS, 비만증 및 당뇨병의 치료 및 예방에서 유용할 것으로 기대되는 상기 활성을 갖는 화합물을 제공하는데 있다.
기타 목적 및 장점은 이하 기술될 상세한 설명에서 명백해질 것이다.
본 발명의 화합물은 상기 일반식 (I) 의 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올 및 상기 일반식 (II) 의 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a, 5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] - 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올이다.
본 발명은 또한, 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 희석제 또는 부형제와 혼합된 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 캐리어, 희석제 또는 부형제와 혼합된 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] - 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 유효량을 함유하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올의 유효 투여량을 동물, 예를 들어 포유 동물, 특히 인간에게 투여함으로써 상기 동물의 종양 또는 전 - 종양 상태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올의 유효 투여량을 동물, 예를 들어 포유 동물, 특히 인간에게 투여함으로써 상기 동물의 후천성 면역 결핍증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 유효 투여량을 동물, 예를 들어 포유 동물, 특히 인간에게 투여함으로써 상기 동물의 당뇨병 또는 비만증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
이하에서 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올은 트레하졸린 또는 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 가수 분해에 의해 제조될 수도 있다. 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올은 트레하졸린의 가수분해에 의해 또는 미크로모노스포라 속 또는 아미콜라톱시스속의 미생물을 사용한 발효에 의해 제조될 수도 있다.
본 발명의 화합물의 제조를 위한 출발 물질로서 사용될 수도 있는 트레하졸린은 미크로모노스포라 속 또는 아미콜라톱시스 속의 트레하졸린 - 생성 미생물, 바람직하게는 미크로모노스포라 속의 트레하졸린 - 생성 미생물을 배양함으로써 제조될 수도 있다.
미크로모노스포라속의 트레하졸린 - 생성 미생물의 예는 미크로모노스포라종 SANK 62390 이다. 이 미생물은 일본국 이바라끼껭 스꾸바시에 위치한 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 기술 연구소 국내 기탁부에 1990년 7월 26일자로 수탁번호 FERM P - 11631 로 처음 기탁되었으며, 이어서 부다페스트 조약하에 1991년 8월 21일자로 통상 산업성 공업 기술원 미생물 공업 연구소에 수탁번호 FERM BP - 3521 로 기탁되었다.
아미콜라톱시스 속의 트레하졸린 - 생성 미생물의 예로는 아미콜라톱시스 종 SANK 60791 을 들 수 있으며, 이는 부다페스트 조약하에 1991년 8월 14일자로 일본국 이바라끼껭 스꾸바시에 위치한 통상 산업성 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 수탁번호 FERM BP - 3513 으로 기탁되었다.
상기 미생물 속은 둘다 신규의 단리 균주이며 본 발명의 일부를 형성하고 있다.
미생물의 특징
미크로모노스포라종 SANK 62390
균주 미크로모노스포라 종 SANK 62390 은 하기의 균주 성질을 갖는다.
1. 형태학적 특징
균주 SANK 62390 은 균주 동정을 위해 사용되는 통상의 한천 배양 배지상에서 7 ∼ 14 일 동안 28℃ 에서 배양시에 정상적으로 또는 약간 빈약하게 생육된다. 기질 균사는 적절히 신장되고 분지되며 연한 오렌지색, 오렌지색 내지 어두운 갈회색을 갖지만, 노카르디아 속의 균주에서 관찰되는 급커브나 결각은 없다. 기생(氣生) 균사체는 거의 없거나 미발달되고, 백색 ∼ 갈색을 띈 백색의 색을 갖는다. 포자는 기질 균사에서만 관찰되며, 하나씩 비교적 짧은 포자낭병을 형성한다. 포자 형태는 구형이며, 포자 표면은 매끄럽다. 포자낭, 균핵, 윤생분기 등과 같은 특이한 기관은 관찰되지 않는다.
2. 다양한 배지상에서의 생육
균주를 28℃ 에서 14 일간 각종 배양 배지상에서 배양시키면 표 1 에 기재된 특성을 나타낸다. 색조의 표현은 일본국 색상 연구소에 의해 발행된 'Guide to Color Standard' 에 있는 색상 번호로 표시하였다.
표에서는 하기의 약어가 사용된다 :
G : 생육 ; AM : 기생 균사체 ; R : 리버어스 (Reverse)
SP : 가용성 색소
3. 생리학적 성질
28℃ 에서 배양을 개시한 후 2 일 ∼ 21 일에 걸쳐 균주 SANK 62390 의 생리학적 성질을 관찰하고, 이를 표 2 에 나타낸다.
* 배지 1 : 트립톤 - 이스트 추출물 브로쓰 (ISP 1)
배지 2 : 펩톤 - 이스트 추출물 - 철 한천 (ISP 6)
배지 3 : 티로신 한천 (ISP 7)
배지 4 : 이스트 추출물 - 맥아 추출물 한천 (ISP 2)
배양 배지로서 프리드햄 - 고틀리브 (Pridham - Gottlieb) 한천 (ISP 9) 을 사용하여 28℃ 에서 균주 SANK 62390 을 배양한다. 14 일 동안 배양후에 탄소원의 동화를 관찰하고, 이를 표 3 에 나타낸다.
4. 세포 성분
균주 SANK 62390 의 세포벽을 B.Becker 등의 방법 [Applied Microbiology, 12, 421 ∼ 423 (1984)] 에 의해 분석하면, 메조 - 디아미노피멜산이 포함되어 있음을 알 수 있다. 또한 균주 SANK 62390 의 전체 세포벽의 당 성분을 M.P. Lechevalier 의 방법 [Journal of Laboratory & Clinical Medicine, 71, 934 (1968)] 에 의해 분석하면, 아라비노오스 및 크실로오스가 포함됨을 알 수 있지만 미콜산은 발견되지 않는다. 세포벽내의 아실계 펩티드 글리칸은 글리콜릴계임이 밝혀진다. 검출된 메나퀴논 주 성분은 MK - 10(H6), MK - 10(H4) 및 MK - 10(H8) 이다.
따라서, 이 미생물은 액티노마이세테스족의 미크로모노스포라 속에 속하는 신규의 변형으로서 분류되어야 함이 명백하다. 이를 근거로 하여, 이 미생물을 미크로모노스포라 종 SANK 62390 으로 명명하였다.
아미콜라톱시스 종 SANK 60791
균주 아미콜라톱시스 종 SANK 60791 은 하기의 균류 성질을 갖는다.
1. 형태학적 특징
균주 SANK 60791 은 균주 동정을 위해 사용되는 통상의 한천 배양 배지상에서 7 ∼ 14 일 동안 28℃ 에서 배양시에 정상적으로 또는 약간 빈약하게 생육된다. 기질 균사는 적절히 신장되고 매끄럽게 또는 불규칙하게 분지되며, 갈색을 띈 백색, 담황색을 띈 갈색 내지 흐린 황색을 갖는다. 기생 균사체는 거의 없거나 미발달되고, 백색, 담황색 내지 연한 오렌지색을 갖는다. 배양의 후기 단계에, 기질 균사 및 기생 균사체가 단편으로 분할되며, 바실러스 구조를 갖는 기생 균사체가 때로 관찰된다. 균사는 노카르디아 속의 균주에서 관찰되는 급커브를 갖지 않은 채로 신장된다. 포자낭, 균핵, 윤생 분기 등과 같은 특이한 기관은 관찰되지 않는다.
2. 다양한 배지 상에서의 생육
균주를 28℃ 에서 14 일간 각종 배양 배지상에서 배양시키면 표 4 에 기재된 특성을 나타낸다. 색조의 표현은 일본국 색상 연구소에 의해 발행된 'Guide to Color Standard' 에 있는 색상번호로 표시하였다.
표에서는 하기의 약어가 사용된다 :
G : 생육 ; AM : 기생 균사체 ; R : 리버어스 (Reverse)
SP : 가용성 색소
3. 생리학적 성질
28℃ 에서 배양을 개시한 후 2 일 ∼ 21 일에 걸쳐 균주 SANK 60791 의 생리학적 성질을 관찰하고, 이를 표 5 에 나타낸다.
* 배지 1 : 트립톤 - 이스트 추출물 브로쓰 (ISP 1)
배지 2 : 펩톤 - 이스트 추출물 - 철 한천 (ISP 6)
배지 3 : 티로신 한천 (ISP 7)
배지 4 : 이스트 추출물 - 맥아 추출물 한천 (ISP 2)
배양 배지로서 프리드햄 - 고틀리브 (Pridham - Gottlieb) 한천 (ISP 9) 을 사용하여 28℃ 에서 균주 SANK 60791 을 배양한다. 14 일 동안 배양후에 탄소원의 동화를 관찰하고, 이를 표 6 에 나타낸다.
4. 세포 성분
균주 SANK 60791 의 세포벽을 B.Becker 등의 방법 [Applied Microbiology, 12, 421 ∼ 423 (1984)] 에 의해 분석하면, 메조 - 디아미노피멜산이 포함되어 있음을 알 수 있다. 또한, 균주 SANK 60791 의 전체 세포벽의 당 성분을 M.P. Lechevalier 의 방법 [Journal of Laboratory & Clinical Medicine, 71, 934 (1968)] 에 의해 분석하면, 아라비노오스는 포함되어 있지만 미콜산은 포함되어 있지 않음을 알 수 있다. 세포벽 내의 아실계 펩티드글리칸은 아세틸계임이 밝혀진다. 검출된 메나퀴논 주 성분은 MK - 9(H4) 이다.
따라서, 이 미생물은 액티노마이세테스 족의 아미콜라톱시스 속에 속하는 신규의 변형으로서 분류되어야 함이 명백하다. 이를 근거로 하여, 이것을 아미콜라톱시스 종 SANK 60791 으로 명명하였다.
ISP (The International Streptomyces Project) 의 규격, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 4, The Actinomycetes, vol. 2 및 액티노마이세테스에 관한 최근의 기타 문헌에 따라서, 균주 SANK 62390 및 균주 SANK 60791 의 동정을 행하였다.
균주 SANK 62390 및 SANK 60791 은 트레하졸린 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] - 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올을 생성함이 입증되어 있다. 그러나, 공지된 바와 같이, 일반적인 진균류, 특히 액티노마이세테스 미생물의 성질은 상당히 다양하게 변하며, 이러한 진균류는 자연적 원인에 의해 또는 인공적 수단 (예를 들어, 자외선 조사, 방사선 조사, 화학 처리 등) 에 의한 유도의 결과로서 쉽게 변이될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 미크로모노스포라 속 또는 아미콜라톱시스 속의 범위내로 분류될 수 있고 균주 SANK 62390 및 SANK 60791 과 함께 트레하졸린 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올을 생산하는 고유한 능력을 공유하는 임의의 미생물의 이용도 포함한다. 신규의 미생물인 균주 SANK 62390 및 SANK 60791 도 예외가 아닌 것으로 기대되며, 용어 'SANK 62390' 및 'SANK 60791' 은 균주 SANK 62390 및 SANK 60791 과 함께 트레하졸린 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올을 생산하는 능력을 공유하는 모든 변이주를 포함한다. 또한, 이 변이주들은 유전 공학 기술, 예를 들어 재조합, 형질도입, 형질전환 등에 의해 수득되는 것을 포함한다. 트레하졸린 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) -3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] - 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 성질에 관해 본 명세서에서 주어진 정보를 근거로 하여, 임의의 특정 균주가 상기 화합물을 생성할 수 있는지 또는 장차 가능한 영리적 이익을 균주에 제공할 만큼 상기 화합물을 충분한 양으로 생성할 수 있는지의 여부를 결정하는 것은 단순한 실험 작업의 문제이다.
본 발명에 따른 트레하졸린 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올은, 유사한 미생물로 부터 다른 발효 생성물을 생성하기 위해 사용되는 통상적인 유형의 배양 배지에서, 상기 진균 균주를 배양시킴으로써 제조될 수도 있다. 당업자에게 잘 알려진 바와같이, 이러한 배지는 미생물적으로 동화가능한 탄소원 및 질소원 뿐만 아니라 무기 염류를 반드시 함유하고 있다.
탄소원의 바람직한 예로는 글루코오스, 프락토오스, 말토오스, 슈크로오스, 만니톨, 글리세롤, 덱스트린, 귀리, 호밀, 옥수수 전분, 감자 전분, 옥수수 가루, 대두분, 면실 케이크, 면실유, 당밀, 시트르산, 타르타르산 등을 들 수 있다. 이러한 화합물은 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용될 수 있다. 일반적인 사용량은 배양 배지의 1 ∼ 10 중량 % 범위내에서 변할 수도 있다.
바람직한 질소원은 통상 발효 공정에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 단백질 - 함유 물질이다. 이러한 질소원의 예로는 대두분, 밀기울, 땅콩분, 면실 케이크, 면실유, 면실분, 카제인 가수분해물, 파르마민 (pharmamin), 어분, 옥수수 침지액, 펩톤, 육류 추출물, 이스트, 이스트 추출물, 맥아 추출물, 질산 나트륨, 질산 암모늄, 황산 암모늄 등을 들 수 있다.
이러한 질소원은 단독으로 또는 적절히 조합하여 사용될 수도 있다. 일반적으로, 이들을 배양 배지의 0.2 ∼ 6 중량 % 의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
배양 배지에 혼입될 수도 있는 영양성 무기 염류는, 소듐, 암모늄, 칼슘, 인산염, 황산염, 염산염 및 탄산염 이온과 같이 미생물의 생육에 필요한 다양한 이온을 제공할 수 있는 통상의 염류이다. 또한, 배지는 칼륨, 칼슘, 코발트, 망간, 철 및 마그네슘과 같은 소량의 필수 미량 원소를 함유해야 한다.
액체 배양 기술에 의해 본 발명의 방법을 수행할때, 실리콘유, 식물성유 또는 계면 활성제와 같은 발포 방지제를 배양 배지중에 사용하는 것이 바람직하다. 미크로모노스포라 속 및 아미콜라톱시스 속, 특히 균주 SANK 62390 및 SANK 60791 의 미생물 배양에 의해 트레하졸린 또는 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H, - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올을 생성하기 위한 배양 배지의 pH 는 바람직하게는 5.0 ∼ 8.0, 더욱 바람직하게는 6.5 ∼ 7.5 의 범위내에서 변한다.
양호한 생육을 위해서는 22 ∼ 38℃ 의 온도가 바람직하지만 15 ∼ 38℃ 범위내의 임의의 온도에서 배양을 수행할 수도 있으며, 트레하졸린 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 생성을 최적화하기 위해서는 22 ∼ 28℃ 의 온도가 바람직하다.
상기 화합물은 호기성 배양 조건하에서 생성되며, 고체 배양, 진탕 배양 및 통기 - 교반 (수침) 배양 방법과 같은 통상의 호기성 배양 방법을 사용할 수도 있다. 소규모 배양의 경우에는, 28℃ 에서 수일간의 배양이 전형적이다. 이러한 소규모 배양 방법에서는 1 또는 2 증식 단계로 배양을 개시하여, 예를 들어 액체 유동 조절기로 작용하는 배플판이 장착된 에렌마이어 플라스크내에서 종 배양액을 제조할 수도 있다. 종 배양 단계를 위한 배지는 바람직하게는 탄소원과 질소원을 모두 함유한다. 이러한 소규모 배양을 위해 바람직한 조작 순서에 있어서, 먼저 종 배양 플라스크를 28℃ 의 항온 배양기내에서 7 일간 또는 충분한 생육이 얻어질 때까지 진탕한다. 이어서, 생육된 종 배양액을 두번째 종 배지 또는 생성 배지로 옮긴다. 중간 생육상이 사용될때에는, 생육을 위해 필수적으로 동일한 방법을 사용하고, 얻어진 중간 생성물의 소량을 생성 배지에 접종한다. 접종된 플라스크를 진탕하면서 수일간 배양하고, 배양이 완료된 후, 플라스크의 내용물을 원심분리 또는 여과시킬 수도 있다.
대규모 제조의 경우에는, 교반기와 통기 장치가 장착된 적절한 발효기를 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우에, 영양 배지가 발효기 내부에서 제조될 수 있다. 온도를 125℃ 까지 승온시킴으로써 배지를 바람직하게 멸균시키고 ; 식힌 후 미리 제조된 종 배양액을 멸균된 배지에 접종시킬 수도 있다. 이어서, 예를 들어 28℃ 에서, 교반 및 통기하에 배양을 진행한다. 이 방법은 본 발명의 화합물을 대량 수득하기 위해 적절하다.
이하에 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 배양 브로쓰로 부터 정제된 화합물 샘플의 고 성능 액체 크로마토그래피 또는 기체 크로마토그래피 / 질량 분광 분석법에 의해, 또는 화합물의 생물학적 활성 측정에 의해, 배양의 진행 상황과 배양이 진행됨에 따라 생성되는 목적하는 트레하졸린 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 양을 측정할 수 있다. 트레하졸린은 누에 트레할라아제에 대한 억제 활성을 가지며, 하기 시험예 3 에서 예증되는 것과 같은 기술을 사용하여 누에 트레할라아제에 대한 배양 브로쓰의 활성을 측정함으로써 트레하졸린의 생성을 탐지할 수도 있다.
한편, 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a- 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 생성은 고성능 액체 크로마토그래피 또는 기체 크로마토그래피 / 질량 분광 분석법에 의해 최상으로 탐지된다. 이것은 예를 들어 크로마토그래피 컬럼내에서 배양 브로쓰를 적절한 흡착 수지 [예를 들어, 상품명 앰버라이트 (Amberlite) IRC - 50 (NH4 +) 로 시판되는 것] 와 접촉시켜 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올을 흡착시킴으로써 수행될 수도 있다. 이어서, 이것을 물로 세척하고 ; 적절한 용리액, 예를들어 0.5 N 암모니아 수용액으로 용출시키고 ; 용출액을 예를 들어 감압 증발에 의해 농축시키고 ; 잔류물을 동결건조시켜 분말을 수득한다. 분말 상태의 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 양은 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수도 있다. 대안적으로는, 화합물을 먼저 아세틸화시킬 수도 있고, 분말 상태의 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트[d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 양을 기체 크로마토그래피 / 질량 분광 분석법에 의해 측정할 수도 있다.
일반적으로, 트레하졸린의 양은 발효 개시후 72 ∼ 150 시간내에 최대값에 도달하며, 반면 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4 H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 양은 발효 개시후 96 ∼ 168 시간내에 최대값에 도달한다. 그러나, 실제 시간은 온도 및 기타 발효 조건에 의존하여 변할 수 있고, 소정의 조건하에서 실제적인 최적 시간은 상기 제시된 바와 같이 목적 화합물의 생성을 측정함으로써 쉽게 결정될 수 있다.
미크로모노스포라 속의 균주를 사용할때, 트레하졸린 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올이 둘다 통상적으로 생성되며, 이들은 하기 기술되는 바와 같이 회수 절차중에 통상의 수단에 의해 분리될 수도 있다. 아미콜라톱시스 속의 균주는 통상 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸)- 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올만을 생성한다. 상기 화합물들은 둘다 균사체에 존재하긴 하지만, 모두 액체상으로 방출된다. 이들은 액체상으로 부터 매우 쉽게 회수된다.
배양의 완결후에, 배양 브로쓰의 액체상에 존재하는 목적 트레하졸린 및 / 또는 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올은, 바람직하게는 필터에이드로서 규조토를 사용하여 균사체 및 기타 고형 물질을 여과 제거함으로써 또는 원심 분리에 의하여 분별될 수 있다. 어어서, 여액 또는 상층액 중에 존재하는 이들 화합물을 추출에 의해 회수할 수 있고, 이어서 이들의 물리화학적 성질을 이용한 통상의 수단에 의해 화합물을 정제할 수 있다.
예를 들어, 이온 교환 수지와 같은 흡착제, 예를 들어 앰버라이트 (Amberlite) IRC - 50 또는 CG - 50, 또는 도웩스 (Dowex) 50WX4 또는 SBR - P 를 함유하는 컬럼을 통해 여액 또는 상층액을 통과시켜, 불순물을 수지에 의해 보유시키고 이를 제거하거나, 또는 목적 화합물을 보유시킨 다음 예를 들어 수성 암모니아로 용출시켜 회수함으로써, 여액 또는 상층액으로 부터 이 화합물들을 회수할 수 있다. 기타 흡착제의 예로는 활성탄 또는 기타 흡착 수지, 예컨데 앰버라이트 XAD - 2 또는 XAD - 4 (롬 앤드 하스사 제품), 또는 다이아이온 (Diaion) HP - 10, HP - 20, CHP - 20, HP - 50 (미쓰비시 가세이 가부시끼가이샤 제품) 을 들 수 있다. 트레하졸린 및 / 또는 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] - 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올을 함유하는 용액을 상기 기술된 흡착제중의 어느 하나를 함유하는 흡착층에 통과시켜, 불순물울 흡착제에 의해 보유시키고 이를 제거하거나, 또는 목적 화합물을 보유시킨 다음 예를 들어 수성 메탄올, 수성 아세톤 등을 사용하여 용출시킴으로써 회수할 수 있다.
이렇게 수득된 트레하졸린 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올을 다양한 공지 기술, 예를 들어 실리카겔 또는 플로리실 (Florisil) 과 같은 담체를 이용한 흡착 컬럼 크로마토그래피 ; 아비셀 (Avicel) (아사히 가가꾸 고오교 가부시끼가이샤 제품) 또는 세파덱스 (Sephadex) LH - 20 (Pharmacia Inc. 의 제품) 을 이용한 분배 컬럼 크로마토그래피 ; 또는 통상의 역상 또는 이온 교환 컬럼을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 더욱 정제시킬 수 있다.
5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올, 즉 본 발명의 화합물 (I), 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올, 즉 본 발명의 화합물 (II) 은 상기 기술된 바와 같이 제조되는 트레하졸린의 가수분해에 의해 제조될 수 있다.
이 반응은 바람직하게는 산의 존재하에 수행되며, 물의 존재하에 수행되어야 한다. 사용되는 산의 특성에는 특별한 제한이 주어지지 않으며, 통상의 가수분해 반응을 위해 사용되는 산이면 어떤 것이든 여기에서도 동일하게 사용할 수도 있다. 산의 예로는 염산 또는 황산과 같은 무기산 및 아세트산 또는 프로피온산과 같은 유기산의 수용액을 들 수 있다. 바람직한 산은 염산이다.
반응은 넓은 범위의 온도에 걸쳐 일어날 수 있고 정확한 반응 온도가 본 발명에 중요한 것이 아니다. 일반적으로, 약 실온 ∼ 120℃, 더욱 바람직하게는 90℃ ∼ 100℃ 의 온도에서 반응을 수행하는 것이 편리함을 알아내었다. 또한, 반응에 필요한 시간은 많은 요인, 특히 반응 온도 및 사용되는 시약 및 용매의 특성과, 이하 설명된 바와 같이 목적하는 생성물에 의존하여 매우 다양하게 변할 수도 있다.
5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올은 둘다 동일한 출발 물질로 부터 동일한 가수분해 반응에 의해 제조됨을 이해하게 될 것이다. 따라서, 일반적으로, 생성물은 두가지 화합물의 혼합물을 함유하게 된다. 그러나, 반응 조건을 적절히 선택함으로써 이 화합물들중의 어느 하나를 나머지 하나보다 유리하게 제조할 수 있다. 즉, 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 제조를 위해서는 일반적으로 온화한 조건이 유리하며, 반면, 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올의 제조에는 보다 격렬한 조건이 유리하다.
따라서, 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 제조를 위해서는, 비교적 온화한 산성 시약, 예를 들어 0.2 N 염산 수용액을 사용하는 것이 바람직하며, 바람직하게는 1 시간 ∼ 2 일, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 6 시간 동안 반응을 계속한다.
한편, 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올을 제조하기 위해 모든 방법으로 반응을 진행시키고자 할때는 4 N 염산 수용액과 같은 강산이 바람직하며, 반응을 바람직하게는 1 시간 ∼ 2 일 동안, 더욱 바람직하게는 20 시간 ∼ 24 시간 동안 계속 유지한다.
또한, 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올은 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 가수분해에 의해 제조될 수도 있다. 이 경우에, 본 발명의 가수분해 반응은 산 또는 염기의 존재하에 수행될 수도 있다. 사용되는 산 또는 염기의 특성에는 특별한 제한이 주어지지 않으며, 가수분해 반응에서 통상적으로 사용되는 임의의 산 또는 염기를 본 발명에서 동일하게 사용할 수도 있다.
반응을 위해 산을 사용하는 경우, 적절한 산의 예로는 할로겐화 수소산 (예를 들어 염산, 브롬화 수소산, 또는 요오드화 수소산), 황산, 과염소산, 인산 및 질산과 같은 무기산 ; 저급 알칸산 (예를 들어 포름산, 아세트산, 옥살산 또는 트리플루오로아세트산) 과 같은 유기 카르복실산 ; 저급 알칸술폰산 (예를 들어 메탄술폰산, 에탄술폰산 또는 트리플루오로메탄술폰산) ; 및 아릴술폰산 (예를 들어 벤젠술폰산 또는 p - 톨루엔술폰산 등) 을 들 수 있다. 바람직한 산은 무기산, 특히 염산이다.
일반적으로, 반응을 바람직하게는 용매의 존재하에 수행한다. 반응을 통상 바람직하게는 용매의 존재하에 실행한다. 사용되는 용매가 반응 또는 관련 시약에 역효과를 미치지 않고 시약을 적어도 어느 정도까지 용해시킬 수 있는 한, 사용 용매의 특성에는 특별한 제한이 주어지지 않는다. 적절한 용매의 예로는, 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올과 같은 알코올 ; 디메틸술폭시드 또는 술포란과 같은 술폭시드 ; 아세트산 또는 프로피온산과 같은 유기산, 특히 지방산 ; 및 물을 들 수 있다. 바람직한 용매는 물 및 물과 유기 용매의 혼합물이다.
산의 사용량은 통상 출발 화합물 1 몰당 바람직하게는 1 ∼ 20 몰, 더욱 바람직하게는 5 ∼ 10 몰이다.
반응은 넓은 범위의 온도에 걸쳐 일어날 수 있으며, 정확한 반응 온도가 본 발명에 중요한 것은 아니다. 일반적으로, 약 실온 ∼ 150℃, 더욱 바람직하게는 90℃ ∼ 110℃ 의 온도에서 반응을 수행하는 것이 편리함을 알아내었다. 또한, 반응에 필요한 시간은 많은 요인, 특히 반응 온도 및 사용되는 시약 및 용매의 특성과, 이하 설명된 바와 같이 목적하는 생성물에 의존하여 매우 다양하게 변할 수도 있다. 그러나 반응이 상기에서 제시한 바람직한 조건하에서 진행된다면, 반응 시간은 1 시간 ∼ 2 일, 더욱 바람직하게는 20 시간 ∼ 30 시간의 기간이면 통상 충분하다.
반응을 위해 염기를 사용하는 경우, 적절한 염기의 예로는, 알칼리 금속 수산화물 (예를 들어 수산화 리튬, 수산화 나트륨 또는 수산화 칼륨) , 알칼리 토금속 수산화물 (예를 들어 수산화 칼슘 또는 수산화 바륨), 알칼리 금속 탄산염 (예를 들어 탄산 나트륨 또는 탄산 칼륨), 및 알칼리 금속 할로겐화물 (예를 들어 요오드화 나트륨, 브롬화 나트륨 또는 요오드화 칼륨) 과 같은 무기염기 ; 및 암모니아, 알킬아민 (예를 들어 트리에틸아민), 및 헤테로 고리 아민 (예를 들어 모르폴린, N - 에틸피페리딘 또는 피리딘) 과 같은 유기 염기를 들 수 있다.
일반적으로, 반응을 바람직하게는 용매의 존재하에 수행한다. 반응을 통상 바람직하게는 용매의 존재하에 실행한다. 사용되는 용매가 반응 또는 관련 시약에 역효과를 미치지 않고 시약을 적어도 어느 정도까지 용해시킬 수 있는한, 사용되는 용매의 특성에는 특별한 제한이 주어지지 않는다. 적절한 용매의 예로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올과 같은 알코올 ; 테트라히드로푸란 또는 디옥산과 같은 에테르 ; 디메틸술폭시드 또는 술포란과 같은 술폭시드 ; 및 물을 들 수 있다. 바람직한 용매는 물 및 물과 유기 용매의 혼합물이다.
염기의 첨가량는 통상 출발 화합물 1 몰당 바람직하게는 0.01 ∼ 10 몰, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 5 몰이다.
반응은 넓은 범위의 온도에 걸쳐 일어날 수 있으며, 정확한 반응 온도가 본 발명에 중요하지는 않다. 일반적으로, 0℃ ∼ 120℃, 더욱 바람직하게는 약 실온 ∼ 100℃ 의 온도에서 반응을 수행하는 것이 편리함을 알 수 있다. 반응을 위해 필요한 시간은 많은 요인, 특히 반응 온도 및 사용되는 시약과 용매의 특성에 의존하여 매우 다양하게 변할 수도 있다. 그러나, 반응을 상기 제시한 바람직한 조건하에서 실행하는 한, 0.5 시간 ∼ 2 일, 더욱 바람직하게는 1 시간 ∼ 20 시간의 기간이면 통상 충분하다.
일반식 (I) 및 (II) 의 목적 화합물은, 유기 화합물의 분리 및 회수를 위해 사용되는 통상적 수단, 예를 들어 다양한 크로마토그래피 기술, 특히 컬럼 크로마토그래피 또는 프레파라티브(preparative) 박막 크로마토그래피에 의해 반응 혼합물로 부터 회수될 수 있다. 발효에 의해 제조된 트레하졸린 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] - 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 분리 및 정제와 관련하여 다양한 선택이 기술되어 있으며, 이 선택들을 사용하여 상기 기술된 바와 같이 가수분해에 의해 수득되는 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) -3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올을 분리 및 정제할 수도 있다.
본 발명의 화합물들, 즉 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올은 각각 적어도 하나의 염기성 질소 원자를 함유하며, 따라서 산 부가염을 형성할 수 있다. 이들 염이 치료적 용도를 위한 것인 경우, 이들 염이 약제학적으로 허용가능한 한, 염의 특성에는 특별한 제한이 주어지지 않는다. 염이 비 - 치료적 용도, 예를 들어 기타의 가능한한 더욱 활성이 큰 화합물 제조에 있어서의 중간 물질로 사용되는 경우에는 이러한 제한 조차도 주어지지 않는다. 이러한 산 부가염의 예로는, 광물산, 특히 할로겐화 수소산 (예컨대 플루오르화 수소산, 브롬화 수소산, 요오드화 수소산 또는 염산), 과염소산, 질산, 탄산, 황산 또는 인산과의 염 ; 메탄술폰산, 트리플루오로메탄술폰산 또는 에탄술폰산과 같은 저급 알킬술폰산과의 염 ; 벤젠술폰산 또는 p - 톨루엔술폰산과 같은 아릴술폰산과의 염 ; 아세트산, 푸마르산, 타르타르산, 옥살산, 말레산, 말산, 숙신산 또는 시트르산과 같은 유기 카르복실산과의 염 ; 및 글루탐산 또는 아스파르트산과 같은 아미노산과의 염을 들 수 있다.
본 발명의 화합물은 필수적으로 그들의 분자내에 수개의 비대칭 탄소 원자를 함유하며, 따라서 광학 이성질체를 형성할 수 있다. 화합물들은 모두 본 명세서에서 하나의 분자식으로 표시되지만, 본 발명은 개개의 단리된 이성질체 및 이들의 라세미체를 포함한 혼합물을 포함하고 있다. 입체 특이적 합성 기술이 사용되거나 광학 활성 화합물이 출발 물질로 사용되는 경우, 개개의 이성질체는 직접적으로 제조될 수도 있고 ; 한편 이성질체의 혼합물이 제조된다면, 개개의 이성질체가 통상의 분할 기술에 의해 수득될 수도 있다.
5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올은 β - 글루코시다아제의 활성을 억제하는 능력을 갖고 저 독성을 가지므로, 따라서 종양 및 AIDS 의 치료 및 예방에서 유용한 것으로 기대된다. 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올은 슈크라아제의 활성을 억제하는 능력을 갖고 저 독성을 가지므로, 따라서 당뇨병 및 비만증의 치료 및 예방에서 유용한 것으로 기대될 수 있다.
이 화합물들을 치료적 용도를 위해 사용하는 경우, 이들을 단독으로 또는 활성 화합물 이외에 1 종 이상의 통상의 희석제, 캐리어 또는 부형제를 함유하는 적절한 제제형으로 투여할 수도 있다. 물론, 제형의 특성은 의도되는 투여 경로에 의존한다. 그러나, 경구 투여 경로를 위해서, 화합물은 바람직하게는 분말, 과립, 정제 또는 캡슐로 제형화 된다. 비경구적 투여를 위해서는, 바람직하게는 주사액으로 제형화 된다. 이 제제들은 부형제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 안정제 및 교정제와 같은 첨가제를 첨가함으로써 공지의 방법에 따라 제조될 수 있다. 투여량은 환자의 증세 및 연령, 질병 또는 장해의 특성 및 심각성, 및 투여 경로 및 투여 방식에 의존하여 변할 수도 있으며, 성인환자에게 경구 투여하는 경우 본 발명의 화합물은 통상 1 ∼ 1000 mg 의 1 일 투여량으로 투여될 수도 있다. 화합물은 1 회 투여 또는 예를 들어 1 일 2 ∼ 3 회의 분할 투여로 투여될 수도 있다.
본 발명의 화합물의 제조는 하기 비 - 제한적 실시예에 의해 더욱 예증된다.
실시예 1
트레하졸린의 제조
(A) 배양
각각 80 ml 의 배지 1 (조성은 하기 기재된 바와 같다) 을 함유하고 모두 배플판이 장착되어 있는 3 개의 500 ml 에렌마이어 플라스크의 각각에, 백금 이량의 미크로모노스포라 종 SANK 62390 을 접종하고, 접종된 플라스크를 28℃ 에서 회전 속도 220 rpm 의 회전 진탕기에서 216 시간 동안 배양시켜, 첫번째 종 배양액을 수득한다.
배 지 1 :
글루코오스 1 %
글리세린 1 %
오트밀 0.5 %
슈크로오스 1 %
대두분 2 %
카사미노산 0.5 %
압착 이스트 1 %
CaCO30.1 %
CB 442 0.01 %
물 100 % 까지의 잔량
(멸균전 pH 7.0)
백분율은 배지의 최종 부피를 기준으로 한 중량 % 이다.
각각 800 ml 의 배지 2 (조성은 하기 기재된 것과 같다) 을 함유하는 4 개의 2 l 에렌마이어 플라스크의 각각에, 첫번째 플라스크로 부터의 배양 브로쓰 40 ml 을 접종시키고, 플라스크를 28℃ 에서 회전 속도 220 rpm 의 회전 진탕기에서 96 시간 동안 진탕하여 두번째 종 배양액을 수득한다. 미리 120℃ 에서 35 분간 멸균시키고 28℃ 로 식힌 배지 2 (조성은 하기 기재된 바와 같다) 15 l 를 함유하는 2 개의 30 l 통 발효기의 각각에 상기 두번째 종 배양 브로쓰 1.5 l 를 접종시킨다. 발효기를 1 분당 15 l 의 공기 유량으로 통기시키면서 28℃ 에서 96 시간 동안 100 rpm 의 속도로 교반한다.
배 지 2 :
글루코오스 2 %
가용성 전분 1 %
압착 이스트 0.9 %
육류 추출물 (Kyokuto) 0.5 %
폴리펩톤 0.5 %
NaCl 0.5 %
CaCO30.3 %
CB 442 0.01 %
물 100 % 까지의 잔량
(멸균전 pH 7.2)
백분율은 배지의 최종 부피를 기준으로 한 중량 % 이다.
(B) 회수
상기 기술된 바와 같이 수득된 총 브로쓰 30 l 에 셀라이트 545 필터 에이드 (등록상표. Johns Manville Products Corp. 의 제품) 3 kg 을 첨가하고, 혼합물을 여과한다. 여액 (29 l) 을 6 l 의 도웩스 SBR - P (Cl-) (등록상표, Dow Chemical 의 제품) 함유 컬럼을 통해 통과시킨다. 용출액의 pH 를 5.0 으로 조정한 다음, 6 l 의 도웩스 50 WX4 (H+) (등록상표, Dow Chemical 의 제품) 함유 컬럼을 통해 용액을 통과시킨다. 트레하졸린을 컬럼상에 흡착시켜 머물게 한다. 컬럼을 20 l 의 탈이온수로 세척한 다음, 0.5 N 수성 암모니아 30 l 로 용리시켜 활성 분획 13 l 을 수득한다. 총 용출액 (13 l) 를 감압하 증발에 의해 농축시키고 동결 건조시켜, 트레하졸린 함유 조 분말 43.4 g 을 수득한다. 조 분말을 10 mM 암모늄 포르메이트 완충용액 (pH 6.0) 2 l 에 용해시키고, 미리 20 mM 암모늄 포르메이트 완충용액 (pH 6.0) 으로 평형화시킨 도웩스 50 WX4 (등록상표) 1.5 l 을 함유하는 컬럼상에 용액을 흡착시킨다. 컬럼을 동일한 20 mM 암모늄 포르메이트 완충용액 3 l 로 세척한 다음 탈이온수 2 l 로 세척한 후, 이를 0.2 N 수성 암모니아로 용출시킨다. 용출액을 500 ml 분량으로 분별한다. 실제로 모든 트레하졸린이 함유된 분획 2 - 4 을 합하고, 감압하 증발에 의해 농축시킨다. 이어서 생성물을 동결 건조시켜 조 분말 2.55 g 을 수득한다. 이 시점까지의 단계를 반복함으로써 제조된 조 분말을, 더 이상의 정제 단계를 거치지 않은채로, 실시예 3 에서 직접 사용한다.
80 % v/v 수성 아세토니트릴을 사용하여 200 ml 의 아비셀 (Avicel) (등록상표, 아사히 가가꾸 고오교 가부시끼가이샤 제품) 이 충진된 컬럼상에 상기 조 분말을 흡착시킨다. 컬럼을 80 % v/v 수성 아세토니트릴 700 ml 로 세척한 다음, 먼저 75 % v/v 수성 아세토니트릴 500 ml 로 용출시키고, 이어서 70 % v/v 수성 아세토니트릴 700 ml 로 용출시킨다. 용출액을 19 ml 분량으로 분별한다. 트레하졸린을 함유하는 분획 35 ∼ 50 을 합하고 감압하 증발에 의해 농축시킨다. 잔류물을 동결건조시켜 분말 658 mg 을 수득한다. 총 분말을 물 150 ml 에 용해시키고, 얻어진 용액의 pH 를 6.0 의 값으로 조정한다. 이어서, 앰버라이트 CG - 50 (H+: NH4 += 2 : 3, 등록상표) 이 충진된 컬럼상에 용액을 흡착시킨다. 이 컬럼을 탈이온수 500 ml 로 세척하고 0.1 N 수성 암모니아로 용출시킨다. 용출액을 20 ml 분량으로 분별한다. 트레하졸린을 함유하는 분획 92 ∼ 121 을 합하고 감압하 증발에 의해 농축시킨다. 얻어진 잔류물을 동결건조시켜 분말 102.8 mg 을 수득한다. 총 분말을 2 mM 암모늄 포르메이트 완충용액 (pH 6.0) 10 ml 에 용해시키고, 얻어진 용액을 동일한 2 mM 암모늄 포르메이트 완충용액을 사용하여 다이아이온 (Diaion) CHP20P (등록상표, 미쓰비시 가세이 가부시끼가이샤 제품) 이 충진된 컬럼상에 흡착시킨다. 컬럼을 동일한 2 mM 암모늄 포르메이트 완충용액으로 용출시킨다. 용출액을 5 ml 분량으로 분별한다. 트레하졸린을 함유하는 분획 59 ∼ 73 을 합하고 감압하 증발에 의해 농축시킨다. 얻어진 잔류물을 동결 건조시켜 분말 18 mg 을 수득하고, 용리액으로서 동일한 2 mM 암모늄 포르메이트 완충용액을 사용하여 다이아 이온 CHP20P 를 통해 용출시킴으로써 상기 분말을 더욱 정제하여, 무색 분말 6.2 mg 을 수득한다.
이 분말을 다음과 같이 프레파라티브 박막 크로마토그래피에 의해 정제한다. 분말 (6.2 mg) 을 소량의 물에 용해시키고, 3 개의 실라카겔 판 (Merck Art 5715, 20 x 20 cm) 에 가한다. 판을 아세토니트릴, 아세트산 및 물의 혼합물 (6 : 1 : 3 부피비) 로 15 cm 높이까지 전개시킨다. 판으로 부터 RF 0.42 ∼ 0.5 사이의 밴드를 긁어 모아 컬럼에 충진시킨다. 컬럼을 탈이온수 100 ml 로 용출시킨다. 용출액을 도웩스 50 WX4 (H+) 5 ml 함유 컬럼을 통해 통과시키면, 트레하졸린이 흡착되어 머물게 된다. 컬럼을 탈이온수로 세척한 다음, 50 ml 의 0.5 N 수성 암모니아로 용출시킨다. 용출액을 감압하 증발에 의해 농축시키고, 얻어진 잔류물을 동결 건조시켜, 트레하졸린 5.1 mg 을 무색 분말로 수득한다. 이를 고 성능 액체 크로마토그래피시키면 단일 피크가 나타난다.
생성물의 성질은 다음과 같다 :
1) 특성 및 외관 : 염기성 무색 분말 ;
2) 용해성 : 물과 메탄올에 가용성, 아세톤과 클로로포름에 불용성 ;
3) 색시험 : 황산에 대해 양성 ;
4) 분자식 : C13H22N2O10;
5) 분자량 : 366 (FAB - 질량 분광법에 의해 측정, - 'FAB' 은
'고속 원자 충격 (Fast Atom Bombardment)' 이다.)
6) 고유광회전도 := + 99.5o(c = 0.41, H2O) ;
7) 자외선 흡수 스펙트럼 : λmaxnm: 수중에서 측정된 자외선
흡수 스펙트럼은 220 nm 이상의 어떠한 흡수 최대치도 나타내지
않는다.
8) 적외선 흡수 스펙트럼 : νmaxcm-1(KBr)
3367, 2938, 1663, 1552, 1384 및 1056 ;
9)1H - NMR 스펙트럼 : δppm,
1H - NMR 스펙트럼 (400 MHz) 은 외부 표준으로서 TMS (테트라메틸실
란) 을 사용하여 중수소 산화물(deuterium oxide)에서 측정되며, 하
기의 시그날을 나타낸다 :
3.22 (1H, d of d, J = 8.98 & 10. 31Hz) ;
3.38 (1H, m, J = 2.44, 5.26 & 10.31Hz) ;
3.46 (1H, d of d, J = 8.98 & 9.99Hz) ;
3.53 (1H, d, J = 11.96Hz) ;
3.55 (1H, d of d, J = 5.26 & 12.21Hz) ;
3.57 (1H, d of d, J = 5.38 & 9.99Hz) ;
3.62 (1H, d of d, J = 2.44 & 12.21Hz) ;
3.63 (1H, d, J = 11.96Hz) ;
3.77 (1H, d, J = 4.89Hz) ;
4.02 (1H, d of d, J = 2.08 & 4.89Hz) ;
4.17 (1H, d, J = 8.55Hz) ;
4.77 (1H, d of d, J = 2.08 & 8.55Hz) ;
5.15 (1H, d, J = 5.38Hz) ;
10)13C - NMR 스펙트럼 : δppm,
13C - NMR 스펙트럼 (100 MHz) 은 외부 표준으로서 테트라메틸실란을
사용하여 중수소 산화물에서 측정되며, 하기의 시그날을 나타낸다:
60.7, 61.9, 69.6, 69.9, 72.0, 73.0, 73.0, 80.1, 80.3, 80.6,
82.8, 87.3 및 161.1 ;
11) 고성능 액체 크로마토그래피 :
분리용 컬럼 : 센슈 (Senshu) Pak ODS - H - 2151
(Senshu Scientific Co.) 6Φ x 150 mm (5 μ) ;
이동상 : 0.5 % 의 PIC B8 (Waters Inc. 제품) 함유 10 % (v/v)
아세토니트릴 - 물 ;
유 속 : 1.5 ml / 분 ;
탐지 파장 : 자외선 210 nm ;
6.9 분의 체류 시간을 갖는 피크가 25℃ 의 컬럼 온도에서 관찰된다 ;
12) 박막 크로마토그래피 :
Rf 치 : 0.44 ;
흡수제 : 유리판상 실리카겔 (Merck Art 5715) ;
전개 용매 : 아세토니트릴, 아세트산 및 물의 6 : 1 : 3 부피비
혼합물.
실시예 2
5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올의 제조
4N 염산 수용액 1 ml 에 용해시킨 19.3 mg 의 트레하졸린 (상기 실시예 1 에서와 같이 제조) 용액을 앰플에 넣고, 100℃ 에서 24 시간 동안 가열함으로써 가수분해 시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 물과 혼합한 다음, 감압하 증발에 의해 건조 상태로 농축시킨다. 잔류물을 다시 물과 혼합하고 감압하 증발에 의해 건조 상태로 농축시켜 염산을 증류 제거한다. 증류로 부터의 잔류물을 물 20 ml 에 용해시키고, 용액의 pH 를 6.0 으로 조정한다. 얻어진 용액을 앰버라이트 CG - 50 (NH+ 4) - 등록 상표 - 의 컬럼을 통해 통과시키고, 용액을 탈이온수 60 ml 로 세척한 다음 0.2 N 수성 암모니아로 용출시킨다. 용출액을 감압하 증발에 의해 농축시키고 잔류물을 동결건조시켜, 불순한 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올 5.1 mg 을 무색 분말로 수득한다.
상기에서와 같이 수득된 불순 분말 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올 (5.1 mg) 의 전체를 소량의 물에 용해시키고, 다음과 같이 프레파라티브 박막 크로마토그래피에 의해 정제한다. 용액을 2 개의 실리카겔 판 (Merck Art 5715, 20 x 20 cm) 에 가하고, 아세토니트릴, 아세트산 및 물의 혼합물 (6 : 1 : 3 부피비) 을 사용하여 15 cm 의 높이까지 전개시킨다. Rf 0.36 ∼ 0.47 사이의 밴드를 판으로 부터 긁어 모아 컬럼에 충진시키고, 이를 50 ml 의 탈이온수로 용출시킨다. 용출액을 앰버라이트 CG - 50 (NH+ 4) 10 ml 을 통해 통과시키면, 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올이 컬럼상에 흡착된다. 이어서 컬럼을 탈이온수 50 ml 로 세척하고 0.2 N 수성 암모니아 50 ml 로 용출시킨다. 용출액을 감압하 증발에 의해 농축시켜, 목적 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올 3 mg 을 하기 성질을 갖는 무색 분말로 수득한다 :
1) 색상 및 외관 : 염기성 무색 분말 ;
2) 용해성 : 물에 가용성, 아세톤 및 클로로포름에는 불용성 ;
3) 색 시험 : 닌히드린 반응에 대해 양성 ;
4) 분자식 : C6H13NO5;
5) 분자량 : 179 (FAB - 질량 분광법에 의해 측정)
6) 고유 광회전도 := -3.7o(c = 0.51, H2O) ;
7) 자외선 흡수 스펙트럼 : λmaxnm: 수중에서 측정된 자외선
흡수 스펙트럼은 210 nm 이상의 어떠한 흡수 최대치도 나타내지
않는다 ;
8) 적외선 흡수 스펙트럼 : νmaxcm-1(KBr)
3384, 1582, 1474, 1380 및 1040 ;
9)1H - NMR 스펙트럼 : δppm,
1H - NMR 스펙트럼 (400 MHz) 은 외부 표준으로서 테트라메틸실란을
사용하여 중수소 산화물에서 측정되며, 하기의 시그날을 나타낸다 :
3.12 (1H, d, J = 7.1Hz) ;
3.56 (1H, d, J = 11.98Hz) ;
3.62 (1H, d, J = 12.2Hz) ;
3.62 (1H, d, J = 6.8Hz) ;
3.78 (1H, d of d, J = 5.5 & 6.8Hz) ;
3.90 (1H, d of d, J = 5.5 & 7.1Hz) ;
10)13C - NMR 스펙트럼 : δppm,
13C - NMR 스펙트럼 (100 MHz) 은 외부 표준으로서 테트라메틸실란을
사용하여 중수소 산화물에서 측정되며, 하기의 시그날을 나타낸다:
57.8, 61.0, 73.6, 79.4, 81.5 및 81.7
11) 박막 크로마토그래피 :
Rf 치 : 0.39 ;
흡수제 : 유리판상 실리카겔 (Merck Art 5715) ;
전개 용매 : 아세토니트릴, 아세트산 및 물의 6 : 1 : 3 부피비
혼합물.
실시예 3
2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 제조
실시예 1 에서와 같이 제조되고 대략 225 mg 의 트레하졸린을 함유하는 조 분말 100 g 을 물 100 ml 및 4 N 염산 수용액 150 ml 의 혼합물에 용해시키고, 4 N 염산 수용액의 첨가에 의해 얻어진 용액의 pH 를 2.5 로 조정한다. 진한 염산 8 ml 및 물 72 ml 를 용액에 첨가하여 총 부피를 480 ml 로 만들고 0.2 N 의 염산 농도를 제공한다. 얻어진 용액을 둥근 바닥 플라스크에 넣은 다음 100℃ 로 유지시킨 오일욕에서 6 시간 동안 가수분해시킨다. 이어서, 반응 혼합물을 물과 혼합한 다음 감압하 증발에 의해 건조 상태로 농축시킨다. 물과의 혼합과 건조상태로 증발시키는 연속 단계를 반복하여 염산을 증류제거시킨다. 잔류물을 물 400 ml 에 용해시키고, 수산화 나트륨 1N 수용액의 첨가에 의해 용액의 pH 를 pH 6.0 으로 조정한다. 총 부피 8 l 까지 용액을 물로 희석한다. 얻어진 용액을 600 ml 의 앰버라이트 CG - 50 (NH+ 4) 가 충진된 컬럼을 통해 통과시키고, 컬럼을 탈이온수 6 l 로 세척한 다음 0.5 N 수성 암모니아로 용출시킨다. 용출액을 감압하 증발에 의해 부피 200 ml 까지 농축시키고, 농축액을 도웩스 1 x 2 (OH-) 800 ml 가 충진된 컬럼을 통해 통과시킨다. 이어서 컬럼을 탈이온수로 용출시킨다. 용출액의 첫번째 1.5 l 을 제거한 후, 그뒤의 용출액을 20 ml 분량씩 분별한다. 각각의 분획을 하기 기술된 정량 분석에 의해 평가하여, 이것이 목적 화합물을 함유하는지의 여부를 결정한다. 이 화합물을 함유하는 분획 70 ∼ 110 을 합하고, 감압하 증발에 의해 농축시킨다. 잔류물을 동결건조시켜, 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올 30 mg 을 하기 성질을 갖는 무색 분말로 수득한다 :
1) 색상 및 외관 : 염기성 무색 분말 ;
2) 용해성 : 물에 가용성, 아세톤 및 클로로포름에는 불용성 ;
3) 분자식 : C7H12N2O5;
4) 분자량 : 204 (FAB - 질량 분광법에 의해 측정)
5) 고유 광회전도 := + 10.0o(c = 0.51, H2O) ;
6) 자외선 흡수 스펙트럼 : λmaxnm: 수중에서 측정된 자외선
흡수 스펙트럼은 210 nm 이상의 어떠한 흡수 최대치도 나타내지
않는다 ;
7) 적외선 흡수 스펙트럼 : νmaxcm-1(KBr)
3358, 1668, 1528, 1398 및 1066 ;
9)1H - NMR 스펙트럼 : δppm,
1H - NMR 스펙트럼 (500 MHz) 은 외부 표준으로서 테트라메틸실란을 사
용하여 중수소 산화물에서 측정되며, 하기의 시그날을 나타낸다 :
3.73 (1H, d, J = 11.72Hz) ;
3.82 (1H, d, J = 12.21Hz) ;
3.97 (1H, d, J = 4.4Hz) ;
4.23 (1H, d of d, J = 4.4 & 2.44Hz) ;
4.37 (1H, d, J=8.79 Hz);
5.03 (1H, d of d, J = 8.79 & 2.44Hz) ;
9) 고성능 액체 크코마토그래피:
분리용 칼럼 : Asahi Pak ES-502C (Asahi Chemical Industry Co., Ltd.);
이동상 : 20 mM 암모늄 아세테이트 (pH 8.5) + 50 mM 수성 소듐 클로라이
드
유 속 : 1 ml / 분 ;
탐지 파장 : 자외선 210 nm ;
온 도 : 25℃ ;
체류 시간 : 8.39 분.
기체 크로마토그래피 / 질량 분광 분석법을 사용한 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 정량 분석
상기 언급된 정량 분석을 다음과 같이 수행한다 :
공지된 액체 부피의 용매 (물) 에 샘플을 용해시킨다. 얻어진 용액 10 μl 을 바이알에 넣고, 아세틸화를 위해 건조 상태로 증발시킨다. 아세트산 무수물 30 μl 및 피리딘 50 μl 을 잔류물에 첨가하고, 얻어진 혼합물을 60℃ 에서 40 분간 가열한다. 반응 혼합물을 통해 질소 기류를 송풍시킴으로써 임의의 과량의 시약을 제거한다. 잔류물을 공지된 양의 내부 표준 (펜타아세틸 - 1 - 아미노 - 1 - 데옥시 - β - D - 글루코오스) 와 혼합하고, 혼합물을 100 μl 의 에틸 아세테이트에 용해시켜 기체 크로마토그래피 / 질량 분광 분석을 위한 시험 샘플을 만든다. 기체 크로마토그래피 컬럼으로서 용융 실리카 모세관 (J & W Scientific Co. 의 제품, DB - 5, 15 미터) 을 사용하여 분석을 수행한다. 시험 샘플 (2 μl) 을 주입하고, 컬럼 온도를 25℃ / 분의 속도로 60℃ 에서 280℃ 로 올린다. 사중극자 질량 분석계 Trio - 1 (VG 의 제품) 와 메탄 기체를 사용하여 화학적 이온화 방법에 의해 음이온을 검출한다. m/z 388 (내부 표준 펜타아세틸 화합물에 상응) 및 m/z 413 [2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 펜타아세테이트에 상응] 에서의 음이온 피크가 정량 분석에 사용된다. 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] - 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 함량을 내부 표준법에 의해 계산한다.
실시예 4
2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 제조
(A) 배양
각각 80 ml 의 배지 1 (조성은 실시예 1 에 주어진 바와 같다) 을 함유하고 배플판이 장착된 2 개의 500 ml 에렌마이어 플라스크의 각각에, 아미콜라톱시스 종 SANK 60791 의 슬랜트로 부터 취한 백금 이량을 접종시키고, 접종된 플라스크를 28℃ 에서 회전속도 210 rpm 의 회전 진탕기에서 96 시간 동안 배양시켜 종 배양 브로쓰를 수득한다.
각각 15 l 의 배지 2 (조성은 실시예 1 에서 주어진 바와 같다) 을 함유하는 2 개의 30 l 통 발효기를 120℃ 에서 30 분간 멸균시킨다. 이어서 이들을 28℃ 로 식히고, 종 배양 브로쓰 75 ml 을 각각의 통 발효기에 접종한다. 통 발효기를 1 분당 7.5 l 의 공기 유량으로 통기시키면서 28℃ 에서 144 시간 동안 ( 2 ppm 의 용존 산소를 유지시키기 위해) 100 ∼ 400 rpm 범위로 조정된 속도로 교반시킨다.
(B) 회수
25 l 의 총 브로쓰 [상기 (A) 에서와 같이 수득됨] 에 셀라이트 545 필터 에이드 1.5 kg 을 첨가하고 혼합물을 여과하여 여액 23 l 을 수득한다. 염산 수용액의 첨가에 의해 여액의 pH 를 6.0 으로 조정하고, 3 l 의 앰버라이트 IRC - 50 (NH+ 4) 가 충진된 컬럼을 통해 용액을 통과시켜 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올을 흡착시킨다. 컬럼을 15 l 의 탈이온수로 세척한 다음 0.5 N 수성 암모니아로 용출시킨다. 용출액이 알칼리성으로 된 후, 용출액 4.5 l 을 수집하고 감압하 증발에 의해 200 ml 의 부피까지 농축시킨다. 농축액을 도웩스 1 x 2 (OH-) 450 ml 가 충진된 컬럼을 통해 통과시키고, 컬럼을 탈이온수로 용출시킨다. 첫번째의 용출액 800 ml 을 제거하고, 그뒤의 용출액을 20 ml 분량씩 분별한다. 이하 기술된 바와 같은 고성능 액체 크로마토그래피 또는 기체 크로마토그래피 / 질량 분광 분석법을 사용한 정량 분석에 의해, 분획 60 ∼ 90 이 목적하는 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올을 함유하고 있음을 결정하고, 이 분획들을 합하고 감압하 증발에 의해 농축시킨다. 농축액을 동결 건조시켜 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올 16.6 mg 을 하기 성질을 갖는 무색 분말로 수득한다.
고성능 액체 크로마토그래피를 이용한 정량 분석
분리용 컬럼 : 아사히 팩 ES - 502C (아사히가가꾸고오교 가부시끼가이샤
의 제품) ;
이동상 : 20 mM 암모늄 아세테이트 (pH 8.5) + 50 mM 염류 용액 ;
유 속 : 1 ml / 분
탐지 파장 : 210 nm ;
온 도 : 25℃
체류 시간 : 8.39 분.
기체 크로마토그래피 / 질량 분광 분석법을 사용한 정량 분석
실시예 3 에서와 실질적으로 동일한 절차를 사용하여 상기에 언급된 정량 분석을 수행한다.
실시예 5
2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올의 제조
(A) 배양
미크로모노스포라 종 SANK 62390 의 슬랜트를 10 ml 의 생리적 식염수에 균질화시켜 현탁액을 수득한다. 현탁액 1 ml 을, 각각 500 ml 의 배지 3 (조성은 하기에 주어진 바와 같다) 을 함유하는 2 개의 2 l 에렌마이어 플라스크의 각각에 접종시키고, 접종된 플라스크를 회전속도 210 rpm 의 회전 진탕기에서 28℃ 에서 96 시간 동안 배양시켜 첫번째 종 배양 브로쓰를 수득한다.
배지 3 :
글루코오스 2 %
이스트 추출물 (디프코) 0.5 %
폴리펩톤 0.5 %
CaCO30.1 %
CB - 442 0.01 %
물 100 % 까지 잔량
(멸균 전 pH 7.2)
백분율은 배지의 최종 부피를 기준으로 한 중량 % 이다.
30 l 의 배지 3 을 60 l 통 발효기를 넣고 120℃ 에서 30 분간 멸균시킨다. 이어서 28℃ 로 식히고, 첫번째 종 배양 브로쓰 600 ml 을 여기에 접종한다. 발효기를 28℃ 에서 1 분당 15 l 의 공기 유량으로 통기시키면서 48 시간 동안 165 rpm 의 속도로 교반시켜, 두번째 종 배양 브로쓰를 수득한다.
300 l 배지 4 (조성은 하기 주어진 바와 같다) 를 함유하는 600 l 탱크를 120℃ 에서 35 분간 멸균시킨다. 이어서 28℃ 로 식히고, 두번째 종 배양 브로쓰 15 l 을 여기에 접종한다. 이어서 탱크를 1 분당 150 l 의 공기유량으로 통기시키면서 0.5 kg / cm2의 내부 압력하에 28℃ 에서 144 시간 동안 (2 ppm 의 용존 산소를 유지하기 위해) 82 ∼ 142 rpm 범위로 조정된 속도로 교반시킨다.
배 지 4 :
글루코오스 8 %
(120℃ 에서 15 분간 미리 멸균시킴)
루스테르겐 (Lustergen) FK*2 %
압착 이스트 1.8 %
육류 추출물 (Kyokuto) 1 %
폴리펩톤 1 %
NaCl 0.5 %
CaCO30.3 %
K2HPO40.25 %
CB - 442 0.02 %
물 100 % 까지의 잔량
(멸균전의 pH 7.2)
*니찌덴 가가꾸가부시끼가이샤 시판의 전분 품종에 대한 등록상표.
(B) 회수
상기에서와 같이 제조된 300 l 의 총 브로쓰에 셀라이트 545 필터 에이드 15 kg 을 첨가하고, 혼합물을 여과시켜 290 l 의 여액을 수득한다. 염산 수용액의 첨가에 의해 여액 20 l 의 pH 를 6.0 으로 조정한다. 얻어진 용액을 3 l 의 앰버라이트 IRC -50 (NH+ 4) 가 충진된 컬럼을 통해 통과시키고, 목적하는 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 -트리올을 흡착에 의해 컬럼에 지지시킨다. 컬럼을 15 l 의 탈이온수로 세척하고 0.5 N 수성 암모니아로 용출시킨다. 용출액이 알칼리성으로 된 후, 용출액 4.5 l 을 수집하고 감압하 증발에 의해 부피 150 ml 까지 농축시킨다. 농축액을 500 ml 의 도웩스 1 x 2 (OH-) 가 충진된 컬럼을 통해 통과시키고 탈이온수로 용출시킨다. 첫번째 1 l 을 제거하고, 그뒤의 용출액을 20 ml 분량씩 분별한다. 실시예 3 에 기술한 정량 분석에 의해 각 분획을 검사한다. 분획 58 ∼ 80 이 활성 화합물을 함유함을 알 수 있으며, 이 분획들을 합하여 감압하 증발에 의해 농축시킨다. 잔류물을 동결 건조시켜 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] - 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올 9.6 mg 을 조 분말로 수득한다. 100 ml 의 도웩스 1 x 2 (OH-) 가 충진된 컬럼을 사용하고 탈이온수로 용출시키면서 분말을 컬럼 크로마토그래피에 의해 다시 정제시켜, 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올 4.8 mg 을 상기 기술된 성질을 갖는 무색 분말로 수득한다.
실시예 6
5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) - 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올의 제조
2 ml 의 6 N 염산 수용액에 용해시킨 분말 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올 16 mg 의 용액을 앰플에 넣고 밀봉시킨 다음, 100℃ 에서 24 시간 동안 가열에 의해 가수분해 시킨다. 이어서, 물을 가수분해물에 첨가하고, 얻어진 혼합물을 감압하 증발에 의해 건조상태로 농축시킨다. 잔류물을 다시 물에 용해시키고, 얻어진 용액을 다시 건조상태로 농축시켜 염산을 제거한 다음, 얻어진 잔류물을 물 20 ml 에 용해시키고, 1 N 수산화 나트륨 수용액의 첨가에 의해 용액의 pH 를 6.0 으로 조정한다. 용액을 20 ml 의 앰버라이트 CG - 50 (NH+ 4) 에 통과시켜, 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올을 흡착에 의해 머물게 하고, 컬럼을 탈이온수 60 ml 로 세척한 다음 0.2 N 암모니아 수용액으로 용출시킨다. 용출액을 감압하 증발에 의해 농축시켜 5 ml 의 농축액을 수득한다. 이 농축액을 50 ml 의 도웩스 1 x 2 (OH-) 가 충진된 컬럼에 넣고, 컬럼을 탈이온수 200 ml 로 세척한 다음 20 % v/v 수성 메탄올로 용출시킨다. 용출액을 5 ml 분량으로 분별한다. β - 글루코시다아제에 대한 억제 활성을 나타내는 분획 5 ∼ 23 을 모으고, 감압하 증발에 의해 농축시킨다. 농축액을 동결 건조시켜 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올 6.2 mg 을 상기 기술된 성질을 갖는 무색 분말로 수득한다.
시험예 1
생물학적 활성
β- 글루코시다아제에 대한 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1, 2, 3, 4 - 테트라올의 억제 활성
이 실험에서 사용되는 β - 글루코시다아제(아몬드로부터 분리), p - 니트로페닐 - β - D - 글루코피라노시드, 데옥시노지리마이신 및 카스타노스페르민의 샘플은 모두 시그마 화학주식회사(Sigma Chemicals Co.)에서 구입된 것이다.
사용되는 시험 화합물들은 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1, 2, 3, 4 - 테트라올 [화합물 (I)], 및 데옥시노지리마이신 또는 카스타노스페르민 이며, 이 둘은 모두 상기 유형의 활성을 갖는 공지 화합물이다.
0.01 유니트/ml 의 β - 글루코시다아제와 20mM 의 시트르산, 40 mM 의 디소듐 포스페이트 및 시험 화합물을 함유하는 완충용액 (pH 5.6) 100 μl의 혼합물을 37℃ 에서 15 분간 방치한다. 이어서, 3mg/ml 의 p - 니트로페닐 - β - D - 글루코피라노시드를 함유하는 완충용액 50 μl 을 혼합물에 첨가하고, 이를 37℃ 에서 20분간 반응시킨다. 1M 글리신/ 수산화 나트륨 완충용액 (pH 10.4)의 20 μl 을 반응 혼합물에 첨가하고, 유리된 p - 니트로페닐의 양을 405nm 에서의 흡광도에 의해 측정한다. 표 7 에는 β - 글루코시다아제의 활성을 50% 억제하는데 필요한 각 시험 화합물의 농도 (IC50)가 기재되어 있다.
시험예 2
쥐 슈크라아제에 대한 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a, 5, 6, 6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4, 5, 6 - 트리올 [화합물 (II)] 의 억제 활성
M. Kessler 등의 방법 [Biochimica et Biophysica Acta, 506, 136-154(1978)] 에 따라서, 위스타 계통의 3 마리 수컷 쥐의 소장으로 부터 쥐 소장의 쇄자연 막 효소 용액을 제조하고 이를 생리적 식염수 3ml 에 현탁시킨다.
4 - 아미노안티피란 (A 4382)의 샘플은 Sigma Chemical Co.로 부터 구입되며, 과산화효소 (I 등급) 및 글루코오스 산화효소 (I 등급)의 샘플은 Boehringer Mannheim Co 으로 부터 구입된 것이다. 20mM 의 시트르산 및 40mM 의 디소듐 포스페이트를 함유하는 완충 용액(pH 6.2)은 다음의 실험에서 희석제로 사용된다.
96 개의 웰이 있는 미세 적정(micro - titer)판의 각각의 웰을 모두, 소혈청 알부민 0.2mg (시그마, A 7906), 글루코오스 산화효소 3 유니트, 과산화효소 0.132 유니트, 4 - 아미노안티피란 20 μg, 페놀 40 μg, 슈크로오스 3 μ몰 및 시험 화합물을 함유하는 혼합물 130 μl 으로 채운다. 쥐 소장의 쇄자연 막 효소용액의 100배 희석 용액 20 μl 을 웰에 첨가한다. 혼합물을 20 분 동안 37 ℃에서 반응시키고 유리된 글루코오스의 양을 492nm 에서의 흡광도로 측정한다.
시험 화합물을 첨가하지 않은 채로, 또한 효소 용액을 첨가하지 않은채로 효소 반응을 수행할때, 글루코오스의 농도는 각각 0% 및 100 % 억제인 것으로 추측된다. 쥐 슈크라아제의 활성을 50% 로 억제하는데 필요한 화합물 (II)의 농도 (IC50) 는 18 μg/ml 임을 알 수 있다.
시험예 3
누에 트레할라아제에 대한 트레하졸린의 억제 활성
20mM 의 시트르산 및 40mM 의 디소듐 포스페이트를 사용하여 제조된 완충용액 (pH 5.6) 120ml 중에, 폴리트론 (Polytrone) (등록상표) 균질화기를 사용하여, 2분간 빙냉하에 10 마리의 제 5 충기의 누에 애벌레 (총중량 44g)를 균질화시킨다(이하에서도 동일한 완충용액을 사용한다). 이어서 균질화된 혼합물을 6,000 rpm의 속도로 10분간 원심분리하고 상층액을 분리한다. 빙냉하에 교반하면서 아세톤 240ml 을 상층액 120ml 에 첨가하고, 얻어진 혼합물을 9000 rpm의 속도로 20분간 원심분리한다. 침강물을 분리하고 물에 용해시킨 다음, 얻어진 용액을 동결건조시켜 조효소 2.0g 을 수득한다.
상기 완충용액 130 μl, 다양한 농도로 트레하졸린을 함유하는 샘플 용액 50 μl, 및 상기와 같이 제조되고 4mg/ml의 효소를 함유하는 누에 효소 용액 50 μl 을 시험관에 넣고, 혼합물을 37℃로 유지시킨 수중욕에서 15분간 진탕시킨다. 이어서, 250mM 트레할로스 용액 20 μl 을 첨가하고, 혼합물을 15분간 반응시킨다. 반응 혼합물을 비등수욕에서 3분간 가열시킨 후, 이것을 빙수로 냉각한다. 이어서, 3,000 rpm 의 속도로 10분간 원심분리하고, 침강물이 제거된 얻어진 용액을 사용하여 글루코오스 농도를 측정한다.
글루코오스 C - 시험 와코(Wako) (Wako Pure Chemical Industries Ltd.의 제품) 및 샘플 용액의 10 배량을 사용하여 표준 절차를 따라 반응을 수행한다. 샘플 용액 대신에 완충용액을 사용할때, 그리고 기질 용액 대신에 완충 용액을 사용할때 각각 0 % 및 100 % 억제로서 얻어진 글루코오스 농도로 부터 억제 속도를 계산하여, 효소활성을 50% 로 억제하는 데 필요한 농도 (IC50)를 산출한 결과, 2.0 ng/ml 임을 알 수 있었다.
본 발명에 의해, 당 가수분해 효소, 특히 β - 글루코시다아제 및 슈크라아제의 활성 억제 능력을 갖고 따라서 종양 상태, AIDS, 당뇨병 및 비만증의 치료 및 예방을 위해 사용될 수 있는, 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1,2,3,4 - 테트라올 및 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a,5,6,6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4,5,6 - 트리올을 수득할 수 있다.

Claims (8)

  1. 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a, 5, 6, 6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4, 5, 6 - 트리올의 가수분해에 의한 5 - 아미노 - 1 - (히드록시메틸) 시클로펜탄 - 1, 2, 3, 4 - 테트라올의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 산 또는 염기를 사용한 수성 매질에서 가수분해를 수행하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 산이 염산인 방법.
  4. 제 2 항 또는 3 항에 있어서, 산의 사용량이 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a, 5, 6, 6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4, 5, 6 - 트리올 1 몰당 1 ∼ 20 몰인 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 산의 사용량이 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a, 5, 6, 6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4, 5, 6 - 트리올 1 몰당 5 ∼ 10 몰인 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 염기가 수산화리튬, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화칼슘, 수산화바륨, 탄산나트륨, 탄산칼륨, 요오드화 나트륨, 브롬화 나트륨, 요오드화 칼륨, 암모니아, 트리에틸아민, 모르폴린, N- 에틸피페리딘 또는 피리딘인 방법.
  7. 제 2 항 또는 6 항에 있어서, 염기의 사용량이 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a, 5, 6, 6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4, 5, 6 - 트리올 1몰당 0.01 ∼ 10 몰인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 염기의 사용량이 2 - 아미노 - 4 - (히드록시메틸) - 3a, 5, 6, 6a - 테트라히드로 - 4H - 시클로펜트 [d] 옥사졸 - 4, 5, 6 - 트리올 1 몰당 1 ∼ 5 몰인 방법.
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