HU214702B - Polihidroxi-ciklopentán-származékok, eljárás az előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények - Google Patents
Polihidroxi-ciklopentán-származékok, eljárás az előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények Download PDFInfo
- Publication number
- HU214702B HU214702B HU9200455A HU9200455A HU214702B HU 214702 B HU214702 B HU 214702B HU 9200455 A HU9200455 A HU 9200455A HU 9200455 A HU9200455 A HU 9200455A HU 214702 B HU214702 B HU 214702B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- hydroxymethyl
- amino
- oxazole
- tetrahydro
- cyclopent
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
- C07D263/52—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
- C07C215/42—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups or hydroxy groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
- C07C215/42—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups or hydroxy groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
- C07C215/44—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups or hydroxy groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton bound to carbon atoms of the same ring or condensed ring system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
- C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
- C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
- C07D413/10—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing aromatic rings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/14—Nitrogen or oxygen as hetero atom and at least one other diverse hetero ring atom in the same ring
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
- C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
- C07C2601/06—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Indole Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Volume Flow (AREA)
- Polyesters Or Polycarbonates (AREA)
- Materials For Photolithography (AREA)
- Lubricants (AREA)
- Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
Abstract
A jelen találmány két új polihidroxi-ciklopentán-származékravonatkozik, amelyek értékes biológiai tulajdonsággal rendelkeznek, ésezen vegyületek előállítására, valamint gyógyászati és megelőzésicélokra alkalmas eljárásokat és készítményeket bocsát rendelkezésre.Az 5-amino-1-(hidroxi-metil)-ciklopentán-1,2,3,4-tetraol és 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H- ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol, amely vegyületek a cukorhidrolázok, különösen a ß-glükozidáz ésszacharáz működését képesek gátolni, és így daganatos állapotok, AIDS,cukorbaj és elhízás kezelésére és megelőzésére használhatók, atrehazolin erős, illetve gyenge savval végzett hidrolízisévelállíthatók elő. A 2-amino-4-(hidroxi- metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol az újonnan izolált Micromonospora sp.SANK 62390, FERM BP–3521 és az Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERMBP–3513 törzsek felhasználásával, fermentációval is előállítható. ŕ
Description
A jelen találmány két új polihidroxi-ciklopentánszármazékra vonatkozik, amelyek értékes biológiai tulajdonsággal rendelkeznek, és ezen vegyületek előállítására, valamint gyógyászati és megelőzési célokra alkalmas eljárásokat és készítményeket bocsát rendelkezésre.
A jelen találmány szerinti vegyületek az 5-amino-1(hidroxi-metil)-ciklopentán-l,2,3,4-tetraol és a 2-amino4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol, amelyek az I és II általános képletnek megfelelő szerkezetűek. Ezek a vegyületek fermentálással vagy a trehazolin néven ismert III képletű vegyület hasításával állíthatók elő. A 2-amino-4-(hidroximetil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6triol és a trehazolin mindegyike tautomerizálódik, és így a Ha és Illa képletnek megfelelő szerkezettel is jellemezhetők.
Úgy gondoljuk, hogy a trehazolin azonos lehet a WO 90/10010 számon közzétett nemzetközi bejelentésben ismertetett és „trehalostatin”-nak nevezett vegyülettel.
A jelen találmány szerinti vegyületek képesek különböző cukorhidrolázok, különösen a B-glükozidáz és szukráz hatását gátolni.
Több szerző [R. A. Gruters és munkatársai, Natúré, 330, 74-77. (1987) és M. J. Humphries és munkatársai, Cancer Rés., 46, 5215-5222. (1986)] beszámolt már arról, hogy az olyan vegyületek, amelyek erősen gátolják a B-glükozidázokat, például a kasztanospermin és a deoxinojirimicin, antineoplasztikus és AIDS (Jcquired /mmune űeficiency Syndrome) elleni szerként használhatók.
Az olyan vegyületekről, így az AO-128 jelű vegyületről és az Acarbose-ról, amelyek a szukráz ellen fejtenek ki erős gátló hatást, azt írják, hogy cukorbaj és elhízás ellen alkalmazhatók [Satoshi Honi és munkatársai, Journal of Medical Chemistry, 29, 1038-1046. (1986);
T. Aida és munkatársai, Journal of Japanese Society of Food and Nutrition, 34 (2), 134-139. (1981)]. Ezért várható, hogy a szukráz hatását gátló vegyületek használhatónak bizonyulnak a cukorbaj és az elhízás kezelésére és megelőzésére.
Szerkezetileg a következő vegyületek emlékeztetnek a jelen találmány szerinti vegyületekre:
a mannosztatinok, amelyeket többek között T. Aoyagi és munkatársai írtak le [The Journal of Antibiotics, Vol. XLII (6), 883. (1989)], és amelyekről azt közlik, hogy az alfa-D-mannozidáz hatását képesek gátolni;
az (lS,2R,3S,4R,5R)-metil-[2,3,4-trihidroxi-5-(hidroxi-metil)-ciklopentil]-amin, amelyet többek között R. A. Farr és munkatársai ismertettek [Tetrahedron Letters, 31, 7109. (1990)], és amelyről szintén azt közlik, hogy az alfa-mannozidáz hatását képes gátolni;
az allozamidin, amelyről többek között S. Sakuda és munkatársai számoltak be [Tetrahedron Letters, 27, 2475. (1986)], és azt írják, hogy a rovarkitinázzal szemben fejt ki gátló hatást; és a kifünenzin, amelyet többek között H. Kayakiri és munkatársai írtak le (J. Org. Chem. 54, 4015. (1989)], és azt mondják, hogy immunmodulátor, amely képes az alfa-mannozidáz hatását gátolni.
A jelen találmány tárgya tehát olyan új vegyületek rendelkezésre bocsátása, amelyek bizonyos cukorhidrolázokkal szemben gátló hatást fejtenek ki.
A találmány tárgyát továbbá olyan vegyületek képezik, amelyek a fenti hatással bírnak, és ezért várhatóan alkalmazhatók daganatok, AIDS, elhízás és cukorbaj kezelésére és megelőzésére.
A találmány még további tárgyai és előnyei a leírásból megismerhetők.
A jelen találmány szerinti új vegyületek az I képletű 5-amino-1 -(hidroxi-metil)-ciklopentán-1,2,3,4-tetraol és a II képletű 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol.
A találmány kiteljed az 5-amino-l-(hidroxi-metil)ciklopentán-l,2,3,4-tetraol hatásos mennyiségét gyógyászatilag elfogadható hordozóval, hígítóval vagy más segédanyaggal együtt tartalmazó gyógyászati készítményekre is.
A találmány magában foglalja a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol hatásos mennyiségét gyógyászatilag elfogadható hordozóval, hígítóval vagy segédanyaggal alkotott keverék formájában tartalmazó gyógyászati készítményeket is.
A találmány körébe tartozik állatokban, például emlősben, különösen emberben daganatok vagy daganat előtti állapotok kezelésére vagy megelőzésére szolgáló eljárás is, amely abban áll, hogy az 5-amino-l-(hidroximetil)-ciklopentán-l,2,3,4-tetraol hatásos mennyiségét beadjuk.
A találmány továbbá rendelkezésre bocsát egy olyan eljárást is, amely állatban, például emlősben, különösen emberben az AIDS kezelésére vagy megelőzésére alkalmas, és amelynek megfelelően az 5-amino-l-(hidroximetil)-ciklopentán-l,2,3,4-tetraol hatásos mennyiségét adagoljuk.
A találmány tárgyát képezi még egy, állatban, például emlősben, különösen emberben a cukorbaj és elhízás kezelésére vagy megelőzésére szolgáló eljárás is, amely szerint a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6atetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol hatásos mennyiségét adjuk be.
Az 5-amino-l-(hidroxi-metil)-ciklopentán-1,2,3,4tetraolt a trehazolin vagy a 2-amino-4-(hidroxi-metil)3 a, 5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent [d] oxazol-4,5,6-triol hidrolízisével állíthatjuk elő, a későbbiekben részletezett módon. A 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolhoz a trehazolin hidrolízisével vagy egy, a Micromonospora vagy Amycolatopsis nemzetséghez tartozó mikroorganizmus felhasználásával, fermentálással juthatunk.
A jelen találmány szerinti vegyületek előállításához kiindulási anyagként használható trehazolint egy trehazolintermelő, a Micromonospora vagy Amycolatopsis nemzetséghez tartozó mikroorganizmus, előnyösen a Micromonospora nemzetséghez tartozó trehazolintermelő mikroorganizmus tenyésztésével kaphatjuk.
HU 214 702 Β
A Micromonospora nemzetséghez tartozó trehazolintermelő mikroorganizmus egyik példájaként a Micromonospora sp. SANK 62390-et említjük. Ezt a mikroorganizmust először a hazai, a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japán gyűjteményben 1990. július 26-án deponáltuk, ahol a FERM P— 11631 azonosító számot kapta, majd a Budapesti Egyezménynek megfelelően is deponáltuk 1991. augusztus 21-én a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology gyűjteményben, a FERM BP-3521 szám alatt.
Az Amycolatopsis nemzetséghez tartozó trehazolintermelő mikroorganizmus például az Amycolatopsis sp. SANK 60791, amelyet a Budapesti Egyezménynek megfelelően 1991. augusztus 14-én deponáltunk a Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japán gyűjteményben, ahol a FERM BP-3513 azonosító számot kapta.
Mindkét említett törzs újonnan elkülönített, és mindkettő a találmány részét képezi.
A Micromonospora sp. SANK 62390 a következő mikológiái tulajdonságokkal rendelkezik:
1. Morfológiai jellemzők
A SANK 62390 a törzsek azonosításához hagyományosan használt agaron 28 °C-on 7-14 napon át tenyésztve normálisan vagy mérsékelten nő. A szubsztráthifák teljesen nyújtottak és elágazók, színük világosnarancs, narancstól sötét bamásszürkéig változó, de bevágás vagy éles formák a Nocardia nemzetséghez tartozó törzsektől eltérően nem figyelhetők meg. A légmicéliumok fejletlenek és fehér-bamásfehér színűek. A szubsztráthifán a spórák egyedül láthatók, és az aránylag rövid sporangioforon egyenként képződnek. A spóra gömb alakú és felülete sima. Speciális szervek, így sporangium, szklerócium és hasonlók nem figyelhetők meg.
2. Növekedés különböző táptalajokon
A törzset 28 °C-on 14 napon át különböző táptalajokon tenyésztettük, és a mutatott tulajdonságokat az 1. táblázatban foglaljuk össze. A színárnyalatok kifejezéséhez a Japan Color Research Institute által kiadott „Guide to Color Standard” című munkában található színmegjelölést alkalmazzuk.
A táblázatban a következő rövidítéseket használjuk: G: növekedés; AM: légmicélium; R: hátoldal; SP: oldható pigment.
I. táblázat
A SANK 62390 törzs tulajdonságai
| Táptalaj | Jel- lemző | Tulajdonságok |
| Szaharóz-nitrát agar | G: AM: R: SP: | mérsékelt, sima, világosnarancs (3-9-6) nem képződik világosnarancs (3-9-6) nem képződik |
| Táptalaj | Jel- lemző | Tulajdonságok |
| Glükóz-aszparagin | G: | mérsékelt, sima, sár- |
| agar | AM: | gásnarancs (12-7-7) nem képződik |
| R: | világosnarancs (6-8-7) | |
| SP: | nem képződik | |
| Glicerin-aszparagin agar (ISP 5) | G: | mérsékelt, sima, világosnarancs (8-7-6) |
| AM: | nem képződik | |
| R: | világos bamásszürke (2-6-6) | |
| SP: | nem képződik | |
| Szervetlen sók- | G: | jó, sima, világos- |
| keményítő agar | narancs (8-7-6) | |
| (ISP 4) | AM: | nem képződik |
| R: | szürke (N-5) | |
| SP: | nem képződik | |
| Tirozinagar | G: | mérsékelt, sima, |
| (ISP 7) | AM: | tompa narancs (6-8-6) alig képződik, fejletlen, fehér |
| R: | bamásfehér (2-9-7) | |
| SP: | nem képződik | |
| Tápagar (DIFCO) | G: | mérsékelt, sima, sárgásnarancs (10-7-8) |
| AM: | nem képződik | |
| R: | tompa sárgásnarancs (8-8-7) | |
| SP: | nem képződik | |
| Élesztőkivonat- | G: | jó, sima, sötét |
| malátakivonat | bamásszürke (1-4-6) | |
| agar (ISP 2) | AM: | alig képződik, fejletlen, bamásfehér (1 - 8-6) |
| R: | bamásfekete (1-2-6) | |
| SP: | nem képződik | |
| Zabliszt agar | G: | jó, sima narancs |
| (ISP 3) | AM: | alig képződik, fejletlen, fehér |
| R: | narancs (12-7-6) | |
| SP: | nem képződik | |
| Vizes agar | G: | mérsékelt, sima, halvány sárgásnarancs (2-9-9) |
| AM: | nem képződik | |
| R: | szürke (N-5) | |
| SP: | nem képződik | |
| Burgonyakivonat-répa- | G: | jó, sima, sárgásszürke |
| kivonat agar | AM: | (1-9-10) alig képződik, fejletlen, fehér |
| R: | bamásfehér (2-9-7) | |
| SP: | nem képződik |
HU 214 702 Β
3. Fiziológiai tulajdonságok:
A SANK 62390 törzset 28 °C-on tenyésztjük, és a tenyésztés megkezdése utáni 2. naptól a 21. napig teijedő időben megfigyelt fiziológiai tulajdonságait a 2. táblázatban foglaljuk össze.
2. táblázat
| Keményitőhidrolízis | + |
| Zselatinelfolyósítás | + |
| Nitrátredukció | - |
| Tejkoaguláció | + |
| Tejpeptonizálás | + |
| Melanoid pigmentek termelése | |
| (1. táptalaj)* (2. táptalaj)* | — |
| (3. táptalaj)* | - |
| Szubsztrátlebontás: kazein | + |
| tirozin | - |
| xantin | - |
| A növekedés hőmérséklet-tartománya (4. táptalaj)* | 17-42°C |
| A növekedés optimális hőmérséklete (4. táptalaj)* | 27-32°C |
| Sótűrés | 2% |
* 1. táptalaj: tripton-élesztőkivonat(ISP 1)
2. táptalaj: pcpton-élesztőkivonat-vas agar (ISP 6)
3. táptalaj: tirozinagar (ISP 7)
4. táptalaj: clcsztőkivonat-malátakivonat agar (ISP 2)
A SANK 62390 törzset Pridham-Gottlieb-agaron (ISP 9) is tenyésztettük 28 °C-on. A szénforrások 14 napos tenyésztés után megfigyelt asszimilációját a
3. táblázatban adjuk meg.
3. táblázat
| D-Glükóz | + |
| D-Fruktóz | + |
| L-Arabinóz | + |
| L-Ramnóz | - |
| D-Xilóz | + |
| Szacharóz | - |
| Inozit | + |
| Raffinóz | + |
| D-Mannit | - |
| Kontroll | - |
4. Sejtkomponensek
A SANK 62390 törzs sejtfalát B. Becker és munkatársainak az Applied Microbiology, 12, 421-423. (1984) irodalmi helyen leírt módszerével vizsgáltuk, és úgy találtuk, hogy mezo-diamino-pimelinsavat tartalmaz. Emellett a SANK 62390 törzs teljes sejtfalának cukorkomponenseit Μ. P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71, 934. (1968)] módszerével analizáltuk, és arabinózt és xilózt találtunk, de mikolinsavat nem. A sejtfalban az acil típusú peptid-glikán glikolil típusú. A kimutatott fő menakinonkomponensek az MK-10 (H6), MK-10 (H4) és MK-10 (H8).
A fentiek alapján nyilvánvaló, hogy ezt a mikroorganizmust az Actinomycetes család Micromonospora nemzetségéhez tartozó új törzsnek kell tekinteni, ezért Micromonospora sp. SANK 62390-nek neveztük el. Amycolatopsis sp. SANK 60791
Az Amycolatopsis sp. SANK 60791 a következő mikológiái tulajdonságokat mutatja:
1. Morfológiai jellemzők
A SANK 62390 a törzsek azonosításához hagyományosan használt agaron 28 °C-on 7-14 napon át tenyésztve normálisan vagy mérsékelten nő. A szubsztráthifák teljesen elnyújtottak és szabályosan vagy szabálytalanul elágaznak, színük bamásfehér, halvány sárgásbarna-fakó sárga. Légmicélium kevés van vagy fejletlen, fehér, halványsárga-világosnarancs színű. Az inkubálás későbbi szakaszában a szubsztráthifák és légmicéliumok szekciókba rendeződnek, és esetenként a légmicéliumok bacilusszerkezete figyelhető meg. A hifák megnyúltak a Nocardia nemzetség törzseinél megfigyelhető éles formák nélkül. Speciális szervek, így sporangiumok, szkleróciumok és hasonlók nem figyelhetők meg.
2. Növekedés különböző táptalajokon
A törzset 28 °C-on 14 napon át különböző táptalajokon tenyésztettük és a mutatott tulajdonságokat a 4. táblázatban foglaltuk össze. A színárnyalatok kifejezéséhez a Japan Color Research Institute által kiadott „Guide to Color Standard” című munkában található színmegjelölést használjuk.
A táblázatban a következő rövidítéseket alkalmazzuk:
G: növekedés; AM: légmicélium; R: hátoldal; SP: oldható pigment.
4. táblázat
A SANK 60791 törzs tulajdonságai
| Táptalaj | Jel- lemző | Tulajdonságok |
| Szacharóz-nitrát | G: | jó, sima, sárgásszürke |
| agar | AM: R: | (1-9-10) mérsékelt, fehér sárgásszürke (2-9-10) |
| SP: | nem képződik | |
| Glükóz-aszparagin | G: | mérsékelt, sima, vilá- |
| agar | AM: | gosnarancs (3-9-6) alig képződik, sárgásszürke (2-9-10) |
| R: | világosbarna (3-8-6) | |
| SP: | nem képződik | |
| Glicerin-aszparagin | G: | jó, sima, bamásfehér |
| agar (ISP 5) | AM: | (2-9-7) fejletlen, fehér |
| R: | halvány sárgásbarna (6-8-8) | |
| SP: | nem képződik |
HU 214 702 Β
4. táblázat (folytatás)
| Táptalaj | Jel- lemző | Tulajdonságok |
| Szervetlen sókkeményítő agar (ISP 9.) | G: AM: R: SP: | mérsékelt, sima, halvány sárgásbarna (4-8-9) fejletlen, halványsárga (3-9-10) halvány sárgásbarna (6-8-9) nem képződik |
| Tirozinagar (ISP 7) | G: AM: R: SP: | nagyon jó, ráncos, bamásfehér (2-9-6) alig képződik, világosnarancs (3-9-6) világosnarancs (6-8-7) nem képződik |
| Tápagar (DIFCO) | G: AM: R: SP: | jó, sima, halvány sárgásbarna (4-8-8) fejletlen, fehér halványsárga (3-9-8) nem képződik |
| Élesztőkivonat- malátakivonat | G: | jó, ráncos, tompa sárga (10-7-9) |
| agar (ISP 2) | AM: R: SP: | fejletlen, fehér tompa sárgásnarancs (10-7-8) nem képződik |
| Zabliszt agar (ISP 3) | G: AM: R: SP: | mérsékelt, sima, halvány sárgásbarna (4-8-9) fejletlen, fehér halványsárga (4-9-9) nem képződik |
| Vizes agar | G: AM: R: SP: | mérsékelt, sima, sárgásszürke (1 -9-10) mérsékelt, fehér sárgásszürke (1-9-10) nem képződik |
| Burgonyakivonat- répakivonat | G: | mérsékelt, sima, sárgásszürke (1-9-10) |
| agar | AM: R: SP: | fejletlen, fehér sárgásszürke (2-9-11) nem képződik |
3. Fiziológiai tulajdonságok
A SANK 60791 törzs 28 °C-on való tenyésztésének megkezdése utáni 2-21. nap közötti időben megfigyelt fiziológiai tulajdonságait az 5. táblázatban foglaljuk össze.
5. táblázat
| Keményítőhidrolízis | - |
| Zselatinelfolyósítás | + |
| Nitrátredukció | + |
| Tejkoagulálás | + |
| Tejpeptonizálás | - |
| Melanoidpigment-termelés | |
| (1. táptalaj)* | - |
| (2. táptalaj)* | - |
| (3. táptalaj)* | - |
| Szubsztrátlebontás kazein | |
| tirozin | + |
| xantin | - |
| Sótűrés (4. táptalaj)* | 3% |
* 1. táptalaj: tripton-élesztőkivonat (ISP 1)
2. táptalaj: pcpton-clcsztőkivonat-vas agar (ISP 6)
3. táptalaj: tirozinagar (ISP 7)
4. táptalaj: élesztőkivonat-malátakivonat agar (ISP 2)
A SANK 60791 törzset 28 °C-on Pridham-Gottliebagar (ISP 9) táptalajon is tenyésztettük. A szénforrások 14 napos tenyésztés után megfigyelt asszimilációját a 6. táblázatban adjuk meg.
6. táblázat
| D-Glükóz | + |
| D-Fruktóz | + |
| L-Arabinóz kevéssé | |
| L-Ramnóz | + |
| D-Xilóz | + |
| Szacharóz | + |
| Inozit | - |
| Raffinóz | + |
| D-Mannit | |
| Kontroll | - |
4. Sejtkomponensek
A SANK 60791 törzs sejtfalát B. Becker és munkatársai [Applied Microbiology, 12, 421-423. (1984)] módszerével analizáltuk, és azt találtuk, hogy mezodiamino-pimelinsavat tartalmaz. Emellett a SANK 60791 törzs teljes sejtfalának cukorkomponenseit is vizsgáltuk Μ. P. Lechevalier [Journal of Laboratory and Clinical Medicine, 71, 934. (1968)] módszerével, és arabinózt találtunk, de mikolinsavat nem. A sejtfalban az acil típusú peptid-glikán acetil típusúnak bizonyult. A kimutatott fő menakinonkomponens MK-9 (H4) volt.
A fentiek alapján nyilvánvaló, hogy ezt a mikroorganizmust az Actinomycetes család Amycolatipsis nemzetségéhez tartozó új törzsnek kell tekinteni, ezért az Amycolatopsis sp. SANK 60791-nek neveztük el.
A SANK 62390 és SANK 60791 törzseket az ISP (The International Streptomyces Project) standardjainak, a Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4, The Actinomycetes, Vol. 2 és más újabb, az Actinomycetes családdal foglalkozó irodalom alapján azonosítottuk.
Megállapítottuk, hogy a SANK 62390 és a SANK 60791 törzsek trehazolint és 2-amino-4-(hidroxi-metil)3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt
HU 214 702 Β termelnek. Azonban jól ismert, hogy a gombák tulajdonságai általában, és az Actinomycetes családba tartozó mikroorganizmusok tulajdonságai különösen jelentősen változhatnak, és az ilyen gombának természetes okok és mesterséges beavatkozás (például ultraibolya besugárzás, radioaktív besugárzás, kémiai kezelés stb.) eredményeként könnyen képződnek mutánsai. Ennek megfelelően a jelen találmány kiterjed minden olyan mikroorganizmus használatára, amely a Micromonospora vagy Amycolatopsis nemzetségébe osztályozható, és amelyek megegyeznek a SANK 62390 és a SANK 60791 törzsekkel abban, hogy trehazolint és 2amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt termelnek. Az új mikroorganizmusokról, a SANK 62390 és a SANK 60791 törzsekről nem feltételezzük, hogy kivételesek, és így a „SANK 62390” és a „SANK 60791” megjelölés ezen törzsek minden olyan mutánsát magában foglalja, amelyeknek a SANK 62390 és a SANK 60791 törzsekhez hasonlóan jellemző tulajdonsága, hogy trehazolint és 2amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt termel. Ezenfelül ezen mutánsok körébe tartoznak azok is, amelyeket génsebészeti módszerekkel, így például rekombinációs, transzdukciós, transzformációs vagy hasonló eljárással állítottak elő. A trehazolin és a 2-amino-4-(hidroxi-metil)3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol tulajdonságaira vonatkozó, itt megadott információk alapján egyszerű kísérlettel meghatározható, hogy az adott törzs termeli-e ezeket a vegyületeket, vagy termeli-e ezeket olyan kielégítő mértékben, amely a törzset kereskedelmi szempontból érdekessé teheti.
A trehazolin és a 2-amino-4-(hidroxi-metil)3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol a jelen találmány szerint a fenti gombatörzsek olyan típusú táptalajban való tenyésztésével állíthatók elő, amelyeket más fermentációs termékek hasonló mikroorganizmusokból való előállítására általában használnak. Az ilyen táptalajok szükségszerűen mikrobiológiailag asszimilálható szén- és nitrogénforrást, valamint szervetlen sókat tartalmaznak, mint ahogy az a szakemberek számára jól ismert.
A szénforrás előnyös példái többek között a glükóz, fruktóz, maltóz, szacharóz, mannit, glicerin, dextrin, zab, árpa, kukoricakeményítő, burgonyakeményítő, kukoricaliszt, szójaliszt, gyapotmagpogácsa, gyapotmagolaj, melasz, citromsav, borkősav és hasonlók. Az ilyen vegyületeket önmagukban vagy bármilyen kombinációban használhatjuk, mennyiségük általában a táptalaj 1 és 10 tömeg%-a között változhat.
Az előnyös nitrogénforrások azok az általában fehérjetartalmú anyagok, amelyeket a fermentációs eljárásban gyakran alkalmaznak. Ilyen nitrogénforrások többek között a szójaliszt, búzakorpa, földimogyoróliszt, gyapotmagpogácsa, gyapotmagolaj, gyapotmagliszt, kazeinhidrolizátumok, farmamin, halliszt, pepton, húskivonat, élesztő, élesztőkivonat, malátakivonat, nátrium-nitrát, ammónium-nitrát, ammónium-szulfát és hasonlók. Ezeket a nitrogénforrásokat önmagukban vagy bármilyen alkalmas kombinációban használhatjuk. A táptalajra vonatkoztatva általában előnyösen a 0,2 és 6 tömeg% közötti mennyiségben alkalmazzuk.
A táptalajba kevert szervetlen tápsók általában azok, amelyek a mikroorganizmus növekedéséhez szükséges különböző ionokat, így nátrium-, ammónium-, kalcium-, foszfát-, szulfát-, klorid- és karbonátionokat szolgáltatnak. Emellett a tápközegnek minimális mennyiségben esszenciális nyomelemeket, például káliumot, kalciumot, kobaltot, mangánt, vasat és magnéziumot is kell tartalmaznia.
Ha a találmány szerinti eljárást folyékony tenyésztési technikával végezzük, előnyösen habzásgátló anyagot, így például szilikonolajat, növényi olajat vagy felületaktív anyagot is adunk a táptalajhoz. A trehazolin vagy a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol Micromonospora és Amycolatopsis nemzetségekhez tartozó mikroorganizmusok, különösen a SANK 62390 és a SANK 60791 törzsek tenyésztésével való előállításakor a közeg pH-ja előnyösen 5,0 és 8,0, előnyösebben 6,5 és 7,5 között változik.
A tenyésztést 15 és 38 °C közötti hőmérsékleten végezhetjük, azonban a jó növekedéshez 22 és 38 °C közötti, és a trehazolin és a 2-amino-4-(hidroxi-metil)3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol optimális termeléséhez előnyösen 22 és 28 °C közötti hőmérsékletet alkalmazunk.
Ezeket a vegyületeket aerob tenyésztési körülmények között állítjuk elő, és aerob tenyésztési eljárásokat, így szilárdtenyésztést, rázott és levegőztetett (süllyesztett) eljárást alkalmazhatunk. Kisméretű fermentáció esetén a néhány napig 28 °C-on végzett rázott tenyésztés a jellemző. Ilyen kis méretben végzett tenyésztési eljárásnál a fermentálást 1 vagy 2 szaporítási lépéssel kezdjük, mellyel az oltótenyészetet állítjuk elő, ami például Erlenmeyer-lombikokban történhet, és a lombikokat terelőlemezekkel látjuk el, amelyek folyadékáramszabályzóként szolgálnak. Az oltótenyészethez használt tápközeg előnyösen mind szén-, mind nitrogénforrást tartalmaz. Az ilyen kis méretben végzett tenyésztés esetében előnyösen úgy járunk el, hogy az oltótenyészetet tartalmazó lombikot állandó hőmérsékletű inkubátorban 28 °C-on, 7 napig vagy addig rázatjuk, amíg megfelelő mértékű növekedést érünk el. A megnőtt oltótenyészetet aztán átvisszük egy második oltótápközegbe vagy a termelő tápközegbe. Amikor egy közbenső tenyésztési fázist alkalmazunk, lényegében az előzőhöz hasonló módon járunk el, és a kapott közbenső termék egy alikvot részét oltjuk a termelő táptalajra. A beoltott lombikot rázás közben néhány napig inkubáljuk, és aztán az inkubálás befejezése után a lombik tartalmát centrifugáljuk vagy szűrjük.
Nagyméretű előállítás esetén előnyösen egy megfelelő méretű, keverővei és levegőztetőberendezéssel ellátott fermentort használunk. Ilyenkor a tápközeget előállíthatjuk magában a fermentorban. A közeget előnyösen a hőmérséklet 125 °C-ra való emelésével sterilezzük; hűtés után a sterilezett közeget az előzőekben előállított oltótenyészettel inokuláljuk. A fermentációt keverés és levegőztetés közben, például 28 °C-on végez6
HU 214 702 Β zük. Ez az eljárás alkalmas a találmány szerinti vegyületek nagy mennyiségben való előállítására.
A fermentáció előrehaladását és a kívánt trehazolin és 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4Hciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol előállított mennyiségét a vegyületek biológiai aktivitásának mérése vagy a fermentációs közegből származó vegyület tisztított mintájának nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás vagy gázkromatográfiás/tömegspektrometriás vizsgálata útján határozhatjuk meg. A trehazolin gátló hatást fejt ki a selyemhemyó-trehalázzal szemben, és így a képződését nyomon követhetjük a fermentációs közeg selyemhemyó-trehalázzal szemben mutatott aktivitása alapján, mint azt a 3. vizsgálati példában bemutatjuk.
Másrészt a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6atetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol-termelését legjobban a nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás eljárással vagy gázkromatográfia/tömegspektroszkópia segítségével követhetjük. Ez oly módon történhet, hogy a tenyészközeget alkalmas adszorbens gyantával, például az Amberlite IRC-50 kereskedelmi néven forgalomba hozott, (NH4 +) formában levő gyantával hozzuk érintkezésbe, például egy kromatográfiás oszlopban a 2amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol megkötésére. Ezután aztán vízzel való mosás, alkalmas eluálószerrel, például 0,5 N vizes ammóniaoldattal való eluálás, az eluátum például csökkentett nyomáson való bepárlása, és a maradék liofilizálása következhet, amelynek eredményeként por alakú terméket kapunk. A por 2-amino-4-(hidroxi-metil)3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-trioltartalmát nagy teljesítményű folyadékkromatográfia segítségével határozhatjuk meg. Eljárhatunk úgy is, hogy a vegyületet először acetilezzük, és a 2-amino-4-(hidroximetil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6triol porban levő mennyiségét gázkromatográfia/tömegspektrometria segítségével mérjük.
A trehazolin mennyisége a fermentáció megkezdésétől számított 72 és 150 óra között, míg a 2-amino-4(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol mennyisége 96 és 168 óra között éri el a maximumot. Azonban a mindenkor szükséges idő a hőmérséklettől és más fermentációs körülményektől függően változik, és az optimális idő bármely feltételegyüttes esetén a kívánt vegyület termelésének követése alapján, mint ahogy azt az előzőekben ajánlottuk, könnyen meghatározható.
Ha Micromonospora nemzetséghez tartozó törzset használunk, általában trehazolin és a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol is képződik, és ezeket az alábbiakban ismertetett, szokásos elkülönítési módszerekkel nyerhetjük ki. Az Amycolatopsis nemzetségbe tartozó törzsek általában csak 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt termelnek. Mindkét vegyület a folyadékfázisba kerül, de a micéliumban is mindkettő jelen van. A legegyszerűbben a folyadékfázisból nyerhetők ki.
A tenyésztés befejezése után a kívánt trehazolint és/vagy 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt, amelyek a fermentációs közeg folyadékfázisában vannak, elkülöníthetjük a micélium és az egyéb szilárd anyagok kiszűrésével, előnyösen diatómaföld szűrési segédanyag alkalmazásával vagy centrifugálással. Ezek a vegyületek, amelyek most már a szűrletben vagy a felülúszóban találhatók, extrakcióval kinyerhetők, és aztán, kihasználva fizikai-kémiai tulajdonságaikat, szokásos módszerekkel tisztíthatok.
A szűrletből vagy a felülúszóból például úgy különíthetjük el ezeket a vegyületeket, hogy egy adszorbenst, például ioncserélő gyantát, így Amberlite IRC-50 vagy CG-50 vagy Dowex 50WX4 vagy SBR-P jelű gyantát tartalmazó oszlopon átengedjük, és így vagy a szennyezések maradnak a gyantán, és így elkülöníthetők, vagy a kívánt anyag marad a gyantán, és aztán eluálással, például vizes ammóniával az oszlopról leoldható. Az adszorbensekre további példaként az aktivált szenet vagy más adszorbens gyantát, így az Amberlite XAD-2-t vagy XAD-4-et (Rohm and Haas Co. terméke) vagy a Diaion HP-10-et, ΗΡ-20-at, CHP-20-at, ΗΡ-50-et (Mitsubishi Kaséi Corporation terméke) említhetjük. A trehazolint és/vagy 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6triolt tartalmazó oldatot ezen adszorbensek egyikét vagy más adszorbenst tartalmazó rétegen átengedjük, mint ahogy fentebb említettük, úgyhogy vagy a szennyezés marad az adszorbensen, és így elkülönül, vagy a kívánt vegyület marad vissza, amelyet aztán eluálással, például vizes metanollal, vizes acetonnal vagy hasonlóval leoldunk.
Az így előállított trehazolint vagy a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol4,5,6-triolt különböző módszerekkel tisztíthatjuk, például abszorpciós oszlopkromatográfia segítségével, amelyhez adszorbensként kovasavgélt vagy Florisilt alkalmazunk; megoszlási oszlopkromatográfiás módszerrel, amelyhez Avicelt (az Asahi Chemical Industry Co. Ltd. terméke) vagy Sephadex LH-20-at (a Pharmacia Inc. terméke) használunk; vagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás eljárással, amelyhez szokásos, fordított fázisú vagy ioncserélő oszlopot alkalmazunk.
Az 5-amino-1 -(hidroxi-metil)-ciklopentán-1,2,3,4tetra-olt, a jelen találmány szerinti (I) képletű vegyületet és a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt, a jelen találmány szerinti (II) képletű vegyületet az előzőek szerint előállított trehazolin hidrolízisével kaphatjuk.
Ezt a reakciót előnyösen sav és mindenképpen víz jelenlétében végezzük. Az alkalmazott sav természetével kapcsolatban nincs különösebb megkötés, és minden sav, amelyet általában hidrolízises reakciókhoz használnak, itt is alkalmazható. Példaként szervetlen savakat, így a hidrogén-kloridot vagy kénsavat és szerves savakat, így az ecetsavat vagy propionsavat említhetjük, amelyek vizes oldatban vannak. Előnyös sav a hidrogén-klorid.
A reakció széles hőmérséklet-tartományban mehet végbe, és a reakció-hőmérséklet pontos megadása a találmány szempontjából nem döntő jelentőségű. Általá7
HU 214 702 Β bán úgy találjuk, hogy a reakció körülbelül szobahőmérséklet és körülbelül 120 °C közötti, előnyösen 90 és 100 °C közötti hőmérsékleten kényelmesen elvégezhető. A reakció végbemeneteléhez szükséges idő szintén tág határok között változhat, számos tényezőtől, így a reakció-hőmérséklettől és az alkalmazott reagensek és oldószer természetétől, és amint azt a későbbiekben megmagyarázzuk, a kívánt terméktől függően.
Mind az 5-amino-l-(hidroxi-metil)-ciklopentán1,2,3,4-tetraolt, mind a 2-amino-4-(hidroxi-metil)3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt ugyanabból a kiindulási anyagból és ugyanazzal a hidrolízisreakcióval állítjuk elő. Ennek megfelelően a termék általában a két vegyület keverékét tartalmazza. Azonban lehetséges olyan reakciókörülményeket találni, amelyek a két vegyület közül az egyik vegyület keletkezésének jobban kedveznek. így az enyhébb körülmények között a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6atetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol képződik inkább, míg az erőteljesebb reakciókörülmények az 5amino-1 -(hidroxi-metil)-ciklopentán-1,2,3,4-tetraol keletkezését segítik.
A fentieknek megfelelően, ha 2-amino-4-(hidroximetil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol4,5,6-triolt állítunk elő, előnyösen enyhén savas reagenst, például 0,2 N vizes hidrogén-kloridot alkalmazunk, és a reakciót előnyösen 1 óra és 2 nap közötti, előnyösebben 5 és 6 óra közötti ideig végezzük.
Más esetben, hogy a reakciót egészen az 5-amino1 -(hidroxi-metil)-ciklopentán-1,2,3,4-tetraol keletkezésének irányába toljuk el, előnyösen erősebb savat, például 4 N vizes hidrogén-klorid-oldatot alkalmazunk, és a komponenseket előnyösen 1 óra és 2 nap, előnyösebben 20 és 24 óra közötti ideig hagyjuk reagálni.
Az említett eljárás mellett az 5-amino-l-(hidroximetil)-ciklopentán-l,2,3,4-ol a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6triol hidrolízisével is előállítható. Ebben az esetben a jelen találmány szerinti hidrolízisreakció sav vagy bázis jelenlétében is megvalósítható. Az alkalmazott bázis vagy sav természetét illetően nincs különösebb megszorítás, a hidrolízises reakciókban általában használatos bázisok és savak bármelyike alkalmazható.
Ha savat használunk, a megfelelő savak példáiként a következőket említjük: szervetlen savak, így hidrogénhalogenidek, például hidrogén-klorid, hidrogén-bromid vagy hidrogén-jodid, kénsav, perklórsav, foszforsav és salétromsav; szerves karbonsavak, így kevés szénatomos alkánkarbonsavak, például hangyasav, ecetsav, oxálsav vagy trifluor-ecetsav; kevés szénatomos alkánszulfonsavak, például metánszulfonsav, etánszulfonsav vagy trifluor-metánszulfonsav; aril-szulfonsavak, például benzolszulfonsav vagy p-toluolszulfonsav stb. Előnyösek a szervetlen savak, különösen a hidrogén-klorid.
A reakciót általában és előnyösen oldószer jelenlétében végezzük. Az alkalmazott oldószer természetére vonatkozóan nincsenek megkötések, feltéve, hogy nincs káros hatással a reakcióra vagy az abban részt vevő reagensekre, és a reagenseket legalább kismértékben oldja. Alkalmas oldószerek többek között az alkoholok, így a metanol, etanol, propanol vagy butanol; szulfoxidok, így a dimetil-szulfoxid vagy szulfolán; szerves savak, különösen a zsírsavak, így az ecetsav vagy propionsav; és a víz. Előnyös oldószer a víz és a víz és valamely szerves oldószer elegye.
A savból a kiindulási vegyület egy móljára vonatkoztatva általában és előnyösen 1 és 20 mól, előnyösebben 5 és 10 mól közötti mennyiséget használunk.
A reakció széles hőmérséklet-tartományban lejátszódik, és a reakció-hőmérséklet pontos megadása a találmány szempontjából nem döntő jelentőségű. Általában úgy találtuk, hogy a reakció körülbelül szobahőmérséklet és 150 °C, előnyösen 90 és 110 °C közötti hőmérsékleten kényelmesen elvégezhető. A reakció végbemeneteléhez szükséges idő szintén tág határok között változhat számos tényezőtől, nevezetesen a reakció-hőmérséklettől és az alkalmazott reagensek és oldószer természetétől függően. Azonban, feltéve, hogy a reakciót az előzőekben körvonalazott előnyös körülmények között végezzük, a lejátszódásához 1 óra és 2 nap közötti, előnyösebben 20 és 30 óra közötti időtartam megfelelő.
Ha bázist használunk a reakcióban, az alkalmasak közül példaként a következőket említhetjük: szervetlen bázisok, így alkálifém-hidroxidok, például lítium-hidroxid, nátrium-hidroxid vagy kálium-hidroxid; alkáliföldfémek hidroxidjai, például kalcium-hidroxid vagy bárium-hidroxid; alkálifém-karbonátok, például nátriumkarbonát vagy kálium-karbonát; alkálifém-halogenidek, például nátrium-jodid, nátrium-bromid vagy kálium-jodid; és szerves bázisok, így ammónia, alkil-aminok, például trietil-amin; és heterogyűrűs aminok, például morfolin, N-etil-piperidin vagy piridin.
A reakciót általában és előnyösen oldószer jelenlétében hajtjuk végre. Az alkalmazott oldószer természetére vonatkozóan nincsenek megkötések, feltéve, hogy a reakcióra vagy az abban részt vevő reagensekre nincs káros hatással, és a reagenseket legalább kismértékben oldja. Megfelelő oldószerek például az alkoholok, így a metanol, etanol, propanol vagy butanol; éterek, így a tetrahidrofurán vagy dioxán; szulfoxidok, így a dimetil-szulfoxid vagy szulfolán; és a víz. Előnyös oldószer a víz és a víz és valamely szerves oldószer elegye.
A reakcióban alkalmazott bázisnak a kiindulási anyag egy móljára számított mennyisége általában és előnyösen 0,01 és 10 mól között, előnyösebben 1 és 5 mól között változik.
A reakció széles hőmérséklet-tartományban végbemegy, és a reakció-hőmérséklet pontos megadása a találmány szempontjából nem döntő jelentőségű. Úgy találjuk, hogy a reakció általában 0 °C és 120 °C közötti, előnyösebben körülbelül szobahőmérséklet és 100 °C közötti hőfokon kényelmesen elvégezhető. A reakció végbemeneteléhez szükséges idő szintén tág határok között változhat, számos tényezőtől, nevezetesen a reakció-hőmérséklettől és az alkalmazott reagensek és oldószer természetétől függően. Azonban, feltéve, hogy a reakciót a fentiekben körvonalazott előnyös körülmények között végezzük, a lejátszódásához 0,5 óra és 2 nap, előnyösebben 1 óra és 20 óra közötti időtartam elegendő.
HU 214 702 Β
Az 1 és II képletű, kívánt vegyületeket a szerves vegyületek elválasztására és kinyerésére általánosan használt módszerekkel, például különböző kromatográfiás eljárások, így oszlopkromatográfia vagy preparatív vékonyréteg-kromatográfia alkalmazásával különíthetjük el a reakcióelegyből. A fermentációval előállított trehazolin és 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol elválasztásával és tisztításával kapcsolatban különböző lehetőségeket már leírtunk, és ezeket a fenti módon, hidrolízissel kapott 5-amino-l-(hidroxi-metil)-ciklopentán-l,2,3,4tetraol és 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopen[d]oxazol-4,5,6-triol elválasztására és tisztítására is alkalmazhatjuk.
A találmány szerinti vegyületek, az 5-amino-l-(hidroxi-metil)-ciklopentán-l,2,3,4-tetraol és a 2-amino-4(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol mindegyike legalább egy bázikus nitrogénatomot tartalmaz, és így savaddíciós sót képezhet. A sók természete vonatkozásában nincs különösebb megszorítás, feltéve, hogy amennyiben gyógyászati alkalmazásra készülnek, gyógyászatilag elfogadhatók. Amennyiben gyógyászati alkalmazásuk nincs tervbe véve, például más és feltehetően hatásosabb vegyületek közbenső termékei, még ez a megszorítás sem érvényes. Ilyen savaddíciós sók például az ásványi savakkal, különösen a hidrogén-halogenidekkel, így a hidrogén-fluoriddal, hidrogén-bromiddal, hidrogén-jodiddal vagy hidrogén-kloriddal, perklórsavval, salétromsavval, szénsavval, kénsavval vagy foszforsavval; kevés szénatomos alkánszulfonsavakkal, így metánszulfonsavval, trifluor-metánszulfonsavval vagy etánszulfonsavval; arilszulfonsavakkal, így benzolszulfonsavval vagy p-toluolszulfonsavval; szerves karbonsavakkal, így ecetsavval, fumársavval, borkősavval, oxálsavval, maleinsavval, almasavval, borostyánkősavval vagy citromsavval; és aminosavakkal, így glutaminsavval vagy aszparaginsavval alkotott sók.
A jelen találmány szerinti vegyületek szükségképpen tartalmaznak molekulájukban néhány aszimmetriás szénatomot, és így optikai izomereket képezhetnek. Bár ezek mindegyikét egyetlen molekulaképlettel ábrázoltuk, a jelen találmány kiteljed mind az egyes, elkülönített izomerekre, mind ezek keverékére, a racemátokat is beleértve. Amennyiben sztereospecifikus szintézismódszert vagy optikailag aktív kiindulási anyagokat alkalmazunk, az egyes izomereket közvetlenül előállíthatjuk; ha viszont izomerek elegyét állítjuk elő, az egyes izomereket a szokásos rezolválási eljárásokkal különíthetjük el.
Az 5-amino-1 -(hidroxi-metil)-ciklopentán-1,2,3,4tetrazol képes a β-glükozidáz hatását gátolni, és toxicitása kicsi, ezért várhatóan alkalmas daganatok és AIDS kezelésére és megelőzésére. A 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6triol a szukrázt gátolja, és toxicitása kicsi, így várhatóan hatásos cukorbaj és elhízás kezelésére és megelőzésére.
Amikor ezeket a vegyületeket gyógyászati célra kívánjuk alkalmazni, adagolhatok önmagukban vagy megfelelő gyógyászati készítmény formájában, amely a hatóanyagon kívül egy vagy több szokásos hígítóanyagot, hordozót vagy segédanyagot tartalmaz. A készítmény formája természetesen az adagolás módjától függ. Orális alkalmazásra a vegyületet előnyösen por, granula, tabletta vagy kapszula formájú készítménnyé alakítjuk. Parenterális adagolásra az injekció előnyös. Ezeket a készítményeket ismert módon, segédanyagok, például vivőanyagok, kötőanyagok, szétesést elősegítő anyagok, csúsztatószerek, stabilizálószerek és módosítóanyagok felhasználásával állítjuk elő. Bár a dózis a beteg tüneteitől és korától, a betegség vagy rendellenesség természetétől és súlyosságától, valamint az adagolás módjától függően változhat, orális adagolás esetén egy felnőtt ember betegnek a jelen találmány szerinti vegyületet naponta 1 és 1000 mg közötti mennyiségben adjuk be. A vegyületeket adagolhatjuk egyetlen dózisban vagy osztott dózisban, például napi 2 vagy 3 alkalommal.
A találmány szerinti vegyületek előállítását a következő, nem korlátozó jellegű példák mutatják be.
I. példa
Trehazolin előállítása
A) Fermentálás
Három db 500 ml-es Erlenmeyer-lombikot, amelyek mindegyike 80 ml, az alábbiakban megadott összetételű 1. táptalajt tartalmaz és terelőlemezzel van ellátva, egy-egy kacsnyi Micromonospora sp. SANK 62390-nel beoltunk, a lombikokat 28 °C-on egy rázógépen 220 fordulat/perc mellett inkubáljuk, így az első oltótenyészetet kapjuk.
| táptalaj: | |
| glükóz | 1% |
| glicerin | 1% |
| zabliszt | 0,5% |
| szacharóz | 1% |
| szójaliszt | 1% |
| kazaminosavak | 0,5% |
| préselt élesztő | 1% |
| kalcium-karbonát | 0,1% |
| CB442 | 0,01% |
vízzel 100%-ra feltöltve (a pH sterilezés előtt 7,0).
A százalékok a táptalaj végtérfogatához viszonyított tömegszázalék-értékek.
Négy darab 2 literes Erlenmeyer-lombikot, amelyek 800 ml, az alábbiakban megadott összetételű 2. táptalajt tartalmaznak, az első lombikokból vett 40 ml tenyészettel beoltunk, és a lombikokat 28 °C-on egy rotációs rázógépen 96 órán át inkubáljuk, 220 fordulat/perc sebesség mellett, így a második oltótenyészetet kapjuk. Ezen második tenyészet 1,5 literét használjuk két 30 literes üvegfermentor beoltására, amely fermentorok 15 liter, az alább megadott összetételű 2. táptalajt tartalmaznak, amelyet először 120 °C-on 35 percig sterilezünk, majd 28 °C-ra hűtünk. A fermentorokat 100 fordulat/perc sebességgel keverjük 28 °C-on, 96 órán át, miközben 15 liter/perc sebességű levegőárammal levegőztetjük.
HU 214 702 Β
2. táptalaj:
| glükóz | 2% |
| oldható keményítő | 1% |
| préselt élesztő | 0,9% |
| húskivonat(Kyokuto) | 0,5% |
| polipepton | 0,5% |
| nátrium-klorid | 0,5% |
| kalcium-karbonát | 0,3% |
| CB442 | 0,01% |
| vízzel | 100%-ra kiegészítve |
| (a pH a sterilezés előtt 7,2). | |
| A százalékok a táptalaj végtérfogatára vonatkozta- |
tott tömegszázalék-értékek.
B) Kinyerés
A fenti módon előállított 30 liter tenyészethez 3 kg Celite 545 (a Johns Manville Products Corp. termékének védjegye) szűrési segédanyagot adunk, és az elegyet szűrjük. A 29 liter szűrletet egy 6 liter CU formában levő Dowex SBR-P (a Dow Chemical termékének védjegye) adszorbenst tartalmazó oszlopon engedjük keresztül. Az eluátum pH-ját 5,0-re állítjuk, majd az oldatot 6 liter, H+ formában levő Dowex 50 WX4 (a Dow Chemical termékének védjegye) adszorbenst tartalmazó oszlopon engedjük át. A trehazolin adszorbeálódik, és így az oszlopon marad. Az oszlopot 20 liter ionmentes vízzel mossuk, majd 30 liter 0,5 N vizes ammóniával eluáljuk, így 13 liter aktív frakciót kapunk. Mind a 13 liter eluátumot csökkentett nyomáson bepároljuk, majd liofílizáljuk, így 43,4 g nyers, trehazolint tartalmazó port kapunk. A nyersport 2 liter 10 mM koncentrációjú ammónium-formiát-pufferoldatban (pH 6,0) feloldjuk, és az oldatot egy 1,5 liter Dowex 50WX4 (védjegy) adszorbensből álló oszlopon adszorbeáljuk, amely oszlopot előzőleg 20 mmol-os ammónium-formiát-pufferoldattal (pH 6,0) hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot 3 liter ugyanilyen, 20 mM koncentrációjú ammónium-formiát-pufferoldattal, majd 2 liter ionmentes vízzel mossuk, és aztán 0,2 N vizes ammóniával eluáljuk. Az eluátumból 500 ml-es frakciókat szedünk. A 2-4. frakciókat, amelyek lényegében az összes trehazolint tartalmazzák, egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A terméket liofílizáljuk, így 2,55 g nyersport kapunk. Az eddigi lépések ismétlésével kapott nyersport közvetlenül, további tisztítás nélkül használjuk fel a 3. példában.
Ezt a nyersport egy 200 ml Avicel (az Asahi Chemical Industry Co. Ltd. termékének védjegye) adszorbenssel töltött oszlopon adszorbeáltatjuk, amelyhez 80 térfogat%-os vizes acetonitrilt használunk. Az oszlopot 700 ml 80 térfogat%-os vizes acetonitrillel mossuk, majd először 500 ml 75 térfogat%-os vizes acetonitrillel, majd 700 ml 70 térfogat%-os vizes acetonitrillel eluáljuk. Az eluátumot 19 ml-es frakciókban gyűjtjük. A 35-50 frakciókat, amelyek trehazolint tartalmaznak, egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot liofílizáljuk, így 658 mg port kapunk. Ezt az egész mennyiséget 150 ml vízben oldjuk, és a kapott oldat pH-ját 6,0-ra állítjuk. Ezután az oldatot egy 300 ml Amberlite CG-50 (H+:NH4 +=2:3, védjegy) adszorbenst tartalmazó oszlopon adszorbeáljuk. Az oszlopot
500 ml ionmentes vízzel mossuk, és aztán 0,1 N vizes ammóniával eluáljuk. Az eluátumból 20 ml-es frakciókat szedünk. A 92 -121., trehazolint tartalmazó frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot liofílizáljuk, így 102,8 mg port kapunk. Ezt a port 10 ml 2 mmol-os ammónium-formiát-pufferoldatban (pH 6,0) oldjuk, és egy 400 ml Diaion CHP20P (Mitsubishi Kaséi Co. termékének védjegye) adszorbensoszlopon adszorbeáljuk, ugyanazon 2 mM koncentrációjú ammónium-formiát-pufferoldatot használva. Az oszlopot ugyancsak 2 nM koncentrációjú ammónium-formiát-pufferoldattal eluáljuk. Az eluátumból 5 ml-es frakciókat szedünk. Az 59-73. frakciókat, amelyek trehazolint tartalmaznak, egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot aztán liofilizáljuk, így 18 mg port kapunk, amelyet Diaion CHP20P adszorbensen, ugyanazon 2 mM koncentrációjú ammónium-formiát-pufferoldattal eluálva tovább tisztítunk, így 6,2 mg színtelen port különítünk el.
Ezt a port preparatív vékonyrétegen tisztítjuk a következők szerint. A 6,2 mg port kis mennyiségű vízben oldva 3 darab 20x20 cm-es kovasavgél lemezre (Merck Art 5715) visszük fel. A lemezeket acetonitril, ecetsav és víz 6:1:3 térfogatarányú elegyében futtatjuk 15 cm magasságig. A 0,42 és 0,5 Rf-érték közötti sávot lekaparjuk a lemezről, és egy oszlopba töltjük. Az oszlopot 100 ml ionmentes vízzel eluáljuk. Az eluátumot 5 ml, (H+) formában levő Dowex 50WX4 oszlopon engedjük át, amelyen a trehazolin adszorbeálódik és rajtamarad. Az oszlopot ionmentes vízzel mossuk, és aztán 50 ml 0,5 N vizes ammóniával eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepároljuk és a maradékot liofílizáljuk, így 5,1 g trehazolint kapunk színtelen por alakjában, amely a nagy teljesítményű folyadékkromatogramon egyetlen csúcsként jelenik meg.
A termék a következő tulajdonságokat mutatja:
1. természet és megjelenés: bázikus, színtelen por;
2. oldhatóság: vízben és metanolban oldódik, acetonban és kloroformban nem oldódik;
3. színpróba: kénsavra pozitív;
4. molekulaképlet: C13H22N2O10;
5. molekulatömeg: 366 (FAB, azaz Fást Atom Bombardment, gyorsatom-bombázásos tömegspektroszkópia segítségével meghatározva).
6. fajlagos forgatóképesség: [alfa]D 2S =+99,5° (c=0,41,H2O);
7. ultraibolya abszorpciós spektrum: lambdamax nm(E1%lcm), az ultraibolya abszorpciós spektrum vízben felvéve 220 nm felett semmilyen jellemző abszorpciós maximumot nem mutat;
8. infravörös abszorpciós spektrum: ymax cm-' (KBr), 3367, 2938, 1663, 1552, 1384 és 1056;
9. Ή-mágneses magrezonancia spektrum: δ ppm [az Ή-mágneses magrezonancia spektrumot (400 MHz) deutérium-oxidban, tetrametil-szilán (TMS) külső standard jelenlétében mértük és a következő jeleket mutatta]:
3,22 (1H, dublettek dublettje, J=8,98 és 10,31 Hz); 3,38 (1H, multiplett, J=2,44, 5,26 és 10,31 Hz);
HU 214 702 Β
3,46 (1H, dublettek dublettje, J=8,98 és 9,99 Hz);
3,53 (1H, dublett, J=11,96 Hz);
3,55 (1H, dublettek dublettje, J=5,26 és 12,21 Hz);
3,57 (1H, dublettek dublettje, J=5,38 és 9,99 Hz);
3.62 (1H, dublettek dublettje, J=2,44 és 12,21 Hz);
3.63 (1H, dublett, J= 11,96 Hz);
3.77 (1H, dublett, J=4,89 Hz);
4,02 (1H, dublettek dublettje, J=2,08 és 4,89 Hz);
4,17 (1H, dublett, J=8,55 Hz);
4.77 (1H, dublettek dublettje, J=2,08 és 8,55 Hz);
5,15 (1H, dublett, J=5,38).
10. l3C-mágneses magrezonancia spektrum: δ ppm, [a l3C-mágneses magrezonancia spektrumot (100 MHz) deutérium-oxidban tetrametil-szilán külső standard jelenlétében mértük, és a következő jeleket mutatta] 60,7; 61,9; 69,6; 69,9; 72,0; 73,0; 80,1; 80,3; 80,6; 82,8; 87,3 és 161,1;
11. nagy teljesítményű folyadékkromatográfia: az elválasztáshoz használt oszlop Senshu Pák ODS-H-2151 (Senshu Scientific Co.), 6x 150 mm (5μ);
mozgófázis: 10 térfogat%-os acetonitril-víz elegy, amely 0,5% PIC B8-at (a Waters Inc. terméke) tartalmaz;
átfolyási sebesség: 1,5 ml/perc; követési hullámhossz: 210 nm;
°C oszlophőmérséklet mellett egy 6,9 perc retenciós idejű csúcsot figyeltünk meg; és
12. vékonyréteg-kromatográfia:
Rf-értéke: 0,44;
adszorbens: kovasavgél üveglemezen (Merck Art 5715);
futtatószer: acetonitril, ecetsav és víz 6:1:3 térfogatarányú elegye.
2. példa
5-Amino-l-(hidroxi-metil)-ciklopentán-l ,2,3,4-tetraol előállítása
19,3 mg, az előző, 1. példában előállított trehazolint ml 4 N vizes hidrogén-klorid-oldatban feloldunk, és egy ampullába helyezve 100 °C-on hevítve 24 órán át hidrolizálunk. A 24 óra eltelte után a reakcióelegyet vízzel hígítjuk, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot ismét vízzel keveijük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk a hidrogén-klorid eltávolítására. A maradékot ezután 20 ml vízben oldjuk, és az oldat pH-értékét 6,0-ra állítjuk. Az így kapott oldatot 20 ml, (NH4 +) formában levő Amberlite CG-50 (védjegy) adszorbensből álló oszlopon átengedjük, és az oszlopot 60 ml ionmentes vízzel mossuk, majd 0,2 N vizes ammóniaoldattal eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepároljuk és a maradékot liofilizáljuk, így 5,1 g szennyezett 5-amino-l-(hidroxi-metil)-ciklopentán-l,2,3,4-tetraolt kapunk színtelen por alakjában.
Ezt a fenti módon előállított 5,1 mg, por alakú, szennyezett 5-amino-1 -(hidroxi-metil)-ciklopentán1,2,3,4-tetraolt kevés vízben oldjuk és preparatív rétegkromatográfiás úton tisztítjuk a következőképpen. Az oldatot két 20x20 cm-es kovasavgél lemezre (Merck 5715) visszük, és acetonitril, ecetsav és víz 6:1:3 térfogatarányú elegyében a kromatogramot 15 cm magasságig futtatjuk. A 0,36 és 0,47 Rf-érték közötti sávot a lemezről lekaparjuk és egy oszlopba töltjük, majd 50 ml ionmentes vízzel eluáljuk. Az eluátumot 10 ml, (NH4+) formában levő Amberlite CG-50 adszorbensből álló oszlopon engedjük át, amelyen az 5-amino-(l-hidroximetil)-ciklopentán-l,2,3,4-tetraol adszorbeálódik. Az oszlopot aztán 50 ml ionmentes vízzel mossuk és 50 ml 0,2 N vizes ammóniaoldattal eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepároljuk és aztán liofilizáljuk, így 3 mg kívánt 5-amino-l-(hidroxi-metil)-ciklopentán1,2,3,4-tetraolt kapunk színtelen por formájában, amely a következő tulajdonságokat mutatja:
1. szín és megjelenés: bázikus színtelen por;
2. oldhatóság: vízben oldódik, acetonban és kloroformban nem oldódik;
3. színpróba: pozitívninhidrinreakciót ad;
4. molekulaképlet: C6H13NO5;
5. molekulatömeg: 179 (FAB-tömegspektrometriás módszerrel meghatározva);
6. fajlagos forgatóképesség: [alfa]D 25=-3,7° (c=0,51, H2O);
7. ultraibolya abszorpciós spektrum: lambdamílx nm (Elcm l%): az ultraibolya abszorpciós spektrum vízben felvéve 210 nm felett semmilyen jellemző abszorpciós maximumot nem mutat;
8. infravörös abszorpciós spektrum: ymax cnr1 (KBr), 3384, 1582, 1474, 1380 és 1040.
9. Ή-mágneses magrezonancia spektrum: δ ppm [az Ή-mágneses magrezonancia spektrumot (400 Hz) deutérium-oxidban, tetrametil-szilán külső standard jelenlétében mértük, és a következő jeleket mutatta]:
3,12 (1H, dublett, J=7,l Hz);
3,56 (1H, dublett, J= 11,98 Hz);
3,62 (1H, dublett, J= 12,2 Hz);
3,62 (1H, dublett, J=6,8 Hz);
3,78 (1H, dublettek dublettje, J=5,5 és 6,8 Hz); 3,90 (1H, dublettek dublettje, J=5,5 és 7,1 Hz);
10. 13C-mágneses magrezonancia spektrum: δ ppm [a 13C-mágneses magrezonancia spektrumot (100 MHz) deutérium-oxidban, tetrametil-szilán külső standard jelenlétében mértük, és a következő jeleket mutatta]: 57,8; 61,0; 73,6; 79,4; 81,5 és 81,7; és
11. vékonyréteg-kromatográfia:
Rf-érték: 0,39;
adszorbens: kovasavgél üveglemezen (Merck Art 5715);
futtatószer: acetonitril, ecetsav és víz 6:1:3 térfogatarányú elegye.
3. példa
2-Amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol előállítása
100 g, az 1. példában leírtak szerint előállított nyersport, amely körülbelül 225 mg trehazolint tartalmaz, 100 ml víz és 150 ml 4 N vizes hidrogén-klorid-oldat elegyében feloldunk, és a kapott oldat pH-ját 4 N vizes hidrogén-klorid-oldat adagolásával 2,5-re állítjuk. Ezután 8 ml tömény sósavat és 72 ml vizet adunk az oldat11
HU 214 702 Β hoz, így teljes térfogata 480 ml, és a hidrogén-klorid-oldat koncentrációja 0,2 N lesz. Az így kapott oldatot gömblombikba tesszük, és 100 °C-os olaj fürdőn melegítve 6 órán át hidrolizáljuk. A 6 óra eltelte után a reakcióelegyet vízzel keverjük és csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A vízzel való elegyítést és a szárazra párlást a hidrogén-klorid eltávolítására megismételjük. A maradékot 400 ml vízben oldjuk, és az oldat pH-ját 1 N vizes nátrium-hidroxid-oldat adagolásával 6,0-ra állítjuk. Az oldatot aztán vízzel 8 literre hígítjuk, majd 600 ml, (NH4 +) formában levő Amberlite CG-50 adszorbensből álló oszlopon átengedjük. Az oszlopot 6 liter ionmentes vízzel mossuk, majd 0,5 N vizes ammóniaoldattal eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson 200 ml-re bepároljuk, és a koncentrátumot 800 ml, OH- formában levő Dowex 1 χ 2 adszorbensből álló oszlopon átengedjük. Az oszlopot ionmentes vízzel eluáljuk. Az eluátum első 1,5 literét elöntjük, a következő részt 20 ml-es frakciókban gyűjtjük. Minden frakció mennyiségi analízisét a későbbiekben részletezett módon elvégezzük annak érdekében, hogy meghatározzuk, tartalmazza-e a kívánt vegyületet. A 70-110. frakciókat, amelyek ezt a vegyületet tartalmazzák, egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot liofílizáljuk, így 30 mg 2-amino-4-(hidroxi-metil)3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt kapunk színtelen por alakjában, amely a következő tulajdonságokat mutatja:
1. szín és külső: bázikus színtelen por;
2. oldhatóság: vízben oldódik, acetonban és kloroformban nem oldódik;
3. molekulaképlet: C7Hi2N2O5;
4. molekulatömeg: 204 (FAB-tömegspektrometriás módszerrel meghatározva);
5. fajlagos forgatóképesség: [alfa]D 25 = +10,0° (c=0,51,H2O);
6. ultraibolya abszorpciós spektrum: larnbdamax nm (Elcm 1%): az ultraibolya abszorpciós spektrum vízben felvéve 210 nm felett semmilyen jellemző maximumot nem mutat;
7. infravörös abszorpciós spektrum: ymax cm-' (KBr), 3358, 1668, 1528, 1398 és 1066;
8. 'H-mágneses magrezonancia spektrum: δ ppm [az 'H-mágneses magrezonancia spektrumot (500 MHz) deutérium-oxidban, TSP, azaz nátriumtrimetil-szilil-propionát belső standard jelenlétében vettük fel, és a következő jeleket mutatta]:
3,73 (1H, dublett, J= 11,71 Hz);
3,82 (1H, dublett, J= 12,21 Hz);
3,97 (1H, dublett, J=4,4 Hz);
4,23 (1H, dublettek dublettje, J=4,4 és 2,44 Hz); 4,37 (1H, dublett, J=8,79 Hz);
5,03 (1H, dublettek dublettje, J=8,79 és 2,44 Hz);
9. nagy teljesítményű folyadékkromatográfia: az elválasztáshoz használt oszlop Asahi Pák ES-502C (Asahi Chemical Industry Co. Ltd.);
mozgófázis: 20 mM ammónium-acetát (pH 8,5)+50 mM vizes nátrium-klorid-oldat; átfolyási sebesség: 1 ml/perc;
követési hullámhossz: ultraibolya 210 nm;
hőmérséklet: 25 °C; retenciós idő: 8,39 perc.
A 2-amino-4-(hidroxi-metil-3a,5,6,6a-tetrahidro4H-ciklo-pent[d]oxazol-4,5,6-triol gázkromatográfiás és tömegspektrometriás módszerrel végzett mennyiségi analízise
A fentebb említett mennyiségi analízist a következőképpen végezzük:
Egy mintát ismert térfogatú oldószerben (vízben) feloldunk. Ebből az oldatból 10 μΐ-t egy fiolába helyezünk, és csökkentett nyomáson szárazra párolunk. A maradékhoz 30 μί ecetsavanhidridet és 50 μί piridint adunk, és a kapott elegyet 60 °C-on 40 percig melegítjük. A reagensek feleslegét úgy távolítjuk el, hogy a reakcióelegyen nitrogéngázt buborékoltatunk át. A maradékhoz ismert mennyiségű belső standardot (pentaacetil-1-amino-l-deoxi-3-D-glükózt adunk, és az elegyet 100 μί etil-acetátban oldjuk, így a gázkromatográfiás/tömegspektrometriás analízishez megfelelő mintát kapunk. A gázkromatográfiás analízishez 15 méteres DB-5 jelű szilícium kapilláris kolonnát (a J&W Scientific Co. terméke) használunk. A vizsgálandó mintából 2 μΐ-t injektálunk, és az oszlop hőmérsékletét 25 °C/perc sebességgel 60 °C-ról 280 °C-ra emeljük. A negatív ionokat kémiai ionizációs módszerrel detektáljuk metángázt alkalmazva egy Trio-1 négypólusú spektrométer (a VG terméke) segítségével. Az m/z 388nál jelentkező negatívion-csúcsot, ami a pentaacetilvegyület belső standardnak felel meg, és az m/z 413-nál jelentkező negatívion-csúcsot, ami a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol4,5,6-triolnak felel meg, használtuk a mennyiségi analízishez. A 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol-tartalmat belsőstandard-módszer segítségével számítottuk.
4. példa
2-Amino-4-(hidroxi-metil)-3a, 5,6,6a-tetrahidro4H-ciklopent[d] oxazol-4,5,6-triol előállítása
A) Fermentálás darab 500 ml-es Erlenmeyer-lombikot, amelyek 80-80 ml, az 1. példában megadott összetételű 1. táptalajt tartalmaznak, az Amycolatopsis sp. SANK 60791 ferde tenyészetéből oltókaccsal vett oltóanyaggal inokulálunk, és a lombikokat 28 °C-on 96 órán át egy rotációs rázógépen 210 fordulat/perc sebesség mellett inkubáljuk, így egy oltótenyészetet kapunk.
Két 30 literes üvegfermentort, amelyek 15 liter, az
1. példában megadott összetételű 2. táptalajt tartalmaznak, 120 °C-on 30 percig sterilezünk. Ezután 28 °C-ra hűtjük, és 75-75 ml oltótenyészettel inokuláljuk. Az üvegfermentorokat 28 °C-on 144 órán át, 100 és 400 fordulat/perc közötti sebességgel keveijük annak érdekében, hogy 2 ppm oldott oxigén legyen jelen, és 7,5 liter/perc levegőárammal levegőztetjük.
B) Kinyerés
1,5 kg Celite 545 szűrési segédanyagot adunk az összesen 25 liter, az A) lépésben kapott tenyészethez, és az elegyet szűrjük. A 23 liter szűrlet pH-ját vizes hidrogénklorid-oldat adagolásával 6,0-ra állítjuk, és az
HU 214 702 Β oldatot 3 liter, (NH4 +) formában levő Amberlite IRC-50 adszorbensből álló oszlopon engedjük keresztül a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol adszorbeálására. Az oszlopot 15 liter ionmentes vízzel mossuk, majd 0,5 N vizes ammóniaoldattal eluáljuk. Miután az eluátum bázisossá válik, 4,5 liter eluátumot gyűjtünk és csökkentett nyomáson 200 ml térfogatra bepároljuk. A koncentrátumot 450 ml, (OH ) formában levő Dowex 1 x 2 adszorbensből álló oszlopon engedjük át, és az oszlopot ionmentes vízzel eluáljuk. Az első 800 ml eluátumot elöntjük, és a további eluátumot 20 ml-es frakciókban gyűjtjük. Nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás eljárással, amelyet a későbbiekben ismertetünk, vagy gázkromatográfiás és tömegspektrometriás módszerrel végzett mennyiségi analízissel meghatározzuk, hogy a 60-90. frakciók tartalmazzák a 2amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt, úgyhogy ezeket a frakciókat egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A koncentrátumot liofilizáljuk, így 16,6 mg 2-amino-(4-hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt kapunk színtelen por alakjában, amely a fenti tulajdonságokat mutatja.
Mennyiségi analízis nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás módszerrel
Az elválasztásra használt oszlop Asahi pák ES-502C (az Asahi Chemical Industry Co. Ltd. terméke); mozgófázis: 20 mM ammónium-acetát (pH 8,5)+50 mM nátrium-klorid-oldat; átfolyási sebesség: 1 ml/perc;
a detektálás hullámhossza: 210 nm;
hőmérséklet: 25 °C;
retenciós idő: 8,39 perc.
Mennyiségi analízis gázkromatográfiás/tömegspektrometriás módszerrel
A mennyiségi analízist, amelyre fentebb utaltunk, lényegében a 3. példában leírt eljárás szerint végezzük.
5. példa
2-Amino-4-(hidroxi-metil)-3a, 5,6,6a-tetrahidro4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol előállítása
A) Fermentálás
Egy Micromonospora sp. SANK 62390 ferde agartenyészetet 10 ml fiziológiás sóoldattal homogenizálva szuszpenziót készítünk. Ebből a szuszpenzióból 1-1 ml-t két 2 literes, a későbbiekben megadott összetételű 3. táptalajból 500 ml-t tartalmazó Erlenmeyerlombikba leoltunk, és a lombikokat 28 °C-on egy rotációs rázógépen, 210 fordulat/perc forgási sebesség mellett 96 órán át inkubálunk, így kapjuk az első oltótenyészetet,
3. táptalaj:
| glükóz | 2% |
| élesztőkivonat (DIFCO) | 0,5% |
| polipepton | 0,5% |
| kalcium-karbonát | 0,1% |
| CB-442 | 0,01% |
| vízzel kiegészítve | 100%-ra |
| (a pH sterilezés előtt 7,2). |
A százalékok a tápközeg végtérfogatára vonatkoztatott tömegszázalék-értékek.
A 3. táptalajból 30 litert egy 60 literes üvegfermentorba helyezünk és 120 °C-on 30 percig sterilezzük. Ezután 28 °C-ra hűtjük és 600 ml első oltótenyészettel inokuláljuk. A fermentort 165 fordulat/perc sebességgel 28 °C-on, 48 órán át keverjük, miközben 15 liter/perc levegőárammal levegőztetjük, így egy második oltótenyészetet kapunk.
Egy 300 liter, a későbbiekben megadott összetételű 4. táptalajt tartalmazó 600 literes tartályt 120 °C-on 30 percig sterilezünk. Ezután 28 °C-ra hűtjük és 15 liter második oltótenyészettel inokuláljuk. A tartályt 144 órán át 28 °C-on 82 és 142 fordulat/perc közötti sebességgel keverjük a 2 ppm oldott oxigéntartalom fenntartására, miközben 150 liter/perces levegőárammal levegőztetjük, a belső nyomás 0,5 kg/cm2.
| táptalaj | |
| glükóz | 8% |
| (előzőleg 120 °C-on 15 percig | |
| sterilezve) | |
| lustergen FK* | 2% |
| préselt élesztő | 1,8% |
| húskivonat (Kyokuto) | 1% |
| polipepton | 1% |
| nátrium-klorid | 0,5% |
| kalcium-karbonát | 0,3% |
| dikálium-hidrogén-foszfát | 0,25% |
| CB-442 | 0,02% |
| vízzel kiegészítve | 100%-ra |
| (a pH sterilezés előtt 7,2). |
* a Nichidcn Kagaku Co. Ltd. által forgalomba hozott keményítőfajta kereskedelmi neve
B) Kinyerés
Az előzőekben leírt módon előállított 300 liter tenyészethez 15 kg Celite 545 szűrési segédanyagot adunk, és az elegyet szűrjük, így 290 liter szűrletet kapunk. Ebből egy 20 literes részletet kiveszünk, és a pHját vizes hidrogén-klorid-oldat adagolásával 6,0-ra állítjuk. A kapott oldatot (NH4+) formában levő 3 liter Amberlite IRC-50 adszorbensből álló oszlopra visszük és a kívánt 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol az oszlopon adszorbeálódik. Az oszlopot 15 liter ionmentes vízzel mossuk, majd 0,5 N vizes ammóniaoldattal eluáljuk. Amikor az eluátum bázikussá válik, 4,5 litert belőle összegyűjtünk, és csökkentett nyomáson 150 ml-re bepárolunk. A koncentrátumot 500 ml, (OH-) formában levő Dowex 1 x 2 adszorbensből álló oszlopra visszük, és ionmentes vízzel eluáljuk. Az első 1 liter eluátumot elöntjük, és a további eluátumot 20 ml-es frakciókban gyűjtjük. Minden frakciót a 3. példában leírt módon mennyiségileg analizálunk. Az 58-80. frakciók tartalmazzák a hatásos vegyületet, és ezeket egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot liofilizáljuk, így 9,6 mg 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6atetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt kapunk nyerspor alakjában. A port oszlopkromatográfiásan ismételten tisztítjuk, ehhez (OH ) formában levő 100 ml Dowex 1 x 2 adszorbenst használunk, amelyet ionmen13
HU 214 702 Β tes vízzel eluálunk, és 4,8 mg 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6triolt kapunk színtelen por formájában, amely a fentebb megadott tulajdonságokat mutatja.
6. példa
5-Amino-l-(hidroxi-metil)-ciklopentán-l ,2.3,4-tetraol előállítása mg por alakú 2-amino-4-(hidroxi-metil)3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt 2 ml 6 N vizes hidrogén-klorid-oldattal készült oldatban egy leforrasztott ampullában 24 órán át 100 °C-on tartva hidrolizáljuk. A 24 óra eltelte után a hidrolizátumhoz vizet adunk, és a kapott elegyet csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot ismételten vízben oldjuk és a kapott oldatot újra szárazra pároljuk a hidrogén-klorid eltávolítására. Ezután a maradékot 20 ml vízben oldjuk, és az oldat pH-ját 1 N vizes nátrium-hidroxid-oldat adagolásával 6,0-ra állítjuk. Az oldatot (NH4 +) formában levő Amberlite CG-50 adszorbensből álló oszlopon engedjük át, amely az 5-amino1 -(hidroxi-metil)-ciklopentán-1,2,3,4-tetraolt adszorbeálja. Az oszlopot 60 ml ionmentes vízzel mossuk, majd 0,2 N vizes ammóniaoldattal eluáljuk. Az eluátumot csökkentett nyomáson bepároljuk, így 5 ml koncentrátumot kapunk. Ezt 50 ml, (OH-) formában levő Dowex 1 x 2 adszorbensből álló oszlopra visszük, és az oszlopot 200 ml ionmentes vízzel mossuk, majd 20 térfogat%-os vizes metanollal eluáljuk. Az eluátumot 5 ml-es frakciókban gyűjtjük. Az 5-23. frakciókat, amelyek a B-glükozidázzal szemben gátló hatást mutatnak, egyesítjük és csökkentett nyomáson bepároljuk. A koncentrátumot liofilizáljuk, így 6,2 mg 5-amino-1(hidroxi-metil)-ciklopentán-l,2,3,4-tetraolt kapunk színtelen porként, amely a fentebb leírt tulajdonságokat mutatja.
1. vizsgálati példa
Biológiai hatás
Az 5-amino-1 -(hidroxi-metil)-ciklopentán-1,2,3,4tetraol gátló hatása B-glükozidázzal szemben
Mandulából elkülönített B-glükozidáz-mintát, pnitro-fenil-B-D-glükopiranozidot, deoxinojirimicint és kasztanospermint használtunk ebben a kísérletben, amely anyagokat a Sigma Chemicals Co.-től szereztük be.
Az 5-amino-1 -(hidroxi-metil)-ciklopentán-1,2,3,4tetraol [(I) képletű vegyület] és deoxinojirimicin vagy kasztanospermin hatását vizsgáltuk, ez utóbbi két vegyületről ismert, hogy ilyen típusú hatást mutat.
0,01 egység/ml B-glükozidáz és 100 μΐ 5,6 pH-jú, 20 mM citromsavat és 40 mM dinátrium-foszfátot tartalmazó pufferoldat, valamint a vizsgálandó vegyület elegyét 37 °C-on 15 percig hagytuk állni. A 15 perc eltelte után 3 mg/ml p-nitro-fenil-B-D-glükopiranozidot tartalmazó 50 μΐ puffért adtunk az elegyhez, amelyet aztán 37 °C-on 20 percig hagytunk reagálni. 20 pl,
10,4 pH-jú 1 M glicin/nátrium-hidroxid pufferoldat hozzáadása után a reakcióelegyben levő felszabadult p-nitro-fenol mennyiségét mértük 405 nm-en mutatott abszorbancia alapján. A 7. táblázatban megadjuk a vizsgált vegyületek IC50-értékét, azaz azon koncentrációját, amely a B-glükozidáz hatásának 50%-kal való csökkentéséhez szükséges.
7. táblázat
| Inhibitor | A β-glükozidáz 50%-os gátlásához szükséges koncentráció |
| I képletű vegyület | 1,0 pg/ml |
| Deoxinojirimicin | 15 pg/ml |
| Kasztanospermin | 4,3 pg/ml |
2. vizsgálati példa
A 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol [(11) képletű vegyület] gátló hatása patkányszukrázzal szemben
M. Kessler és munkatársainak a Biochimica et Biophysica Acta, 506, 136-154. (1978) irodalmi helyen leírt módszere szerint kefeszegélymembránenzimoldatot készítünk három Wistar törzshöz tartozó hím patkány vékonybeléből, és 3 ml fiziológiás sóoldatban szuszpendáljuk.
A következő kísérlethez egy 4-amino-antipirin- (A 4382) mintát a Sigma Chemical Co.-től és peroxidáz(Grade I) és glükóz-oxidáz- (Grade I) mintákat a Boehringer Mannheim cégtől szereztünk be. Hígítószerként 20 mM citromsavoldatból és 40 mM dinátrium-foszfátoldatból álló 6,2 pH-jú pufferoldatot használunk.
Egy 96 mérőhelyes mikrotiterlemez (a Falcon Co. terméke) minden üregébe összesen 130 μΐ térfogatban 0,2 mg borjú-szérumalbumint (Sigma, A 7906), 3 egység glükóz-oxidázt, 0,132 egység peroxidázt, 20 pg 4amino-antipirint, 40 pg fenolt, 3 pmol szacharózt és a vizsgálandó vegyületet tartalmazó elegyet töltünk, majd 20 pl, 100-szoros hígítású patkányvékonybélből készült kefeszegélymembránenzim-oldatot mérünk. A reakcióelegyet 37 °C-on 20 percen át reagálni hagyjuk, és a felszabadult glükóz mennyiségét a 492 nm-en mutatott elnyelés alapján határozzuk meg.
Amikor az enzimreakciókat vizsgálandó vegyület nélkül, illetve enzimoldat hozzáadása nélkül végeztük, a glükózkoncentrációt 0%-nak, illetve a gátlást 100%nak vettük. A patkányszukráz hatásának 50%-os gátlásához a II képletű vegyület 18 pg/ml koncentrációja volt szükséges (IC50-érték).
3. vizsgálati példa
A trehazolin gátló hatása selyemhemyó-trehalázzal szemben darab 5. lárvaállapotú selyemhemyólárvát Polytrone (védjegy) homogenizálóban 120 ml, 20 mM citromsavoldatból és 40 mM dinátrium-foszfát-oldatból készült 5,6 pH-jú puff erői datban 2 percig, jeges hűtés közben homogenizálunk. (A későbbiekben is ugyanezt a pufferoldatot használjuk.) A homogenizált elegyet 6000 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugáljuk, és a felülúszót elválasztjuk. 120 ml felülúszóhoz 240 ml acetont adunk jeges hűtés és keverés közben, és
HU 214 702 Β a kapott elegyet 9000 fordulat/perc sebességgel 20 percig centrifugáljuk. Az üledéket elválasztjuk és vízben oldjuk, és a kapott oldatot liofilizáljuk, így 2,0 g nyers enzimet kapunk.
130 pl fenti pufferoldatot, 50 pl különböző koncentrációjú trehazolinoldatot és 50 μΐ fenti módon előállított és 4 mg/ml enzimet tartalmazó selyemhemyóenzim-oldatot kémcsőbe mérünk, és az elegyet 37 °Con tartott vízfürdőben 15 percig rázzuk. A 15 perc eltelte után 20 μΐ 250 mmol-os trehalózoldatot adunk a fenti keverékhez, és 15 percig hagyjuk reagálni. A reakcióelegyet ezután forró vízfürdőn tartjuk 3 percig, majd jeges vízzel lehűtjük, ezt követően 3000 fordulat/perc sebességgel 10 percig centrifugáljuk, és a kapott oldatot az üledéktől való megtisztítás után a glükózkoncentráció meghatározásához használjuk fel.
A reakciót glükóz C-teszt Wako (a Wako Pure Chemical Industries Ltd. terméke) és a standard eljáráson túl a mintaoldat 10-szeres mennyiségeinek felhasználásával végeztük. A gátlás arányát azon glükózkoncentrációkból számítottuk, amelyeket a mintaoldat pufferoldattal való és a szubsztrátoldat pufferoldattal való helyettesítésekor 0%-os, illetve 100%-os gátlás esetén mértünk, és ily módon az enzimaktivitás 50%-os csökkentéséhez szükséges koncentrációt (IC50) 2,0 ng/mlnek találtuk.
Claims (12)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás 5-amino-l-(hidroxi-metil)-ciklopentán1,2,3,4-tetraol és gyógyászatilag elfogadható sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy trehazolint erős savval hidrolizálunk, kívánt esetben a terméket sóvá alakítjuk, és az előállítani kívánt terméket elkülönítjük.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrolízist 4 N vizes sósavoldattal 24 órán át végezzük.
- 3. Eljárás 5-amino-l-(hidroxi-metil)-ciklopentán1,2,3,4-tetraol és gyógyászatilag elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6triolt vagy egy sóját savval hidrolizáljuk, és kívánt esetben a terméket sóvá alakítjuk.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrolízist vizes közegben végezzük.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy savként hidrogén-kloridot használunk.
- 6. A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2-amino-4-(hidroxi-metil)3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol 1 móljára számítva 1 és 20 mól közötti mennyiségű savat használunk.
- 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol egy móljára számítva 5 és 10 mól közötti mennyiségű savat használunk.
- 8. Eljárás 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol és gyógyászatilag elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy trehazolint gyenge savval hidrolizálunk, kívánt esetben a terméket sóvá alakítjuk, és az előállítani kívánt terméket elkülönítjük.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hidrolízist 0,2 N vizes sósavoldattal 6 órán át végezzük.
- 10. Eljárás 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol és gyógyászatilag elfogadható sói előállítására, azzal jellemezve, hogy 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro4H-ciklopent[d]oxazol-4,5,6-triol termelésére képes, a Micromonospora vagy Amycolatopsis nemzetséghez tartozó mikroorganizmust tenyésztünk, a tenyészetből a 2-amino-4-(hidroxi-metil)-3a,5,6,6a-tetrahidro-4Hciklopent[d]oxazol-4,5,6-triolt elkülönítjük, és kívánt esetben a terméket sóvá alakítjuk.
- 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Micromonospora sp. SANK 62390, FERM BP-3521 jelű törzset tenyésztünk.
- 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy mikroorganizmusként Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERM BP-3513 jelű törzset tenyésztünk.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2197691 | 1991-02-15 | ||
| JP13294691 | 1991-06-04 | ||
| JP21345091 | 1991-08-26 | ||
| JP27241291 | 1991-10-21 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9200455D0 HU9200455D0 (en) | 1992-04-28 |
| HUT63845A HUT63845A (en) | 1993-10-28 |
| HU214702B true HU214702B (hu) | 2000-03-28 |
Family
ID=27457670
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9200455A HU214702B (hu) | 1991-02-15 | 1992-02-14 | Polihidroxi-ciklopentán-származékok, eljárás az előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények |
Country Status (20)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5260447A (hu) |
| EP (1) | EP0499489B1 (hu) |
| KR (4) | KR100226305B1 (hu) |
| CN (1) | CN1043422C (hu) |
| AT (1) | ATE121383T1 (hu) |
| AU (1) | AU653384B2 (hu) |
| CA (1) | CA2061239C (hu) |
| CZ (2) | CZ281418B6 (hu) |
| DE (1) | DE69202075T2 (hu) |
| DK (1) | DK0499489T3 (hu) |
| ES (1) | ES2074332T3 (hu) |
| FI (1) | FI920663A (hu) |
| HK (1) | HK117796A (hu) |
| HU (1) | HU214702B (hu) |
| IE (1) | IE71947B1 (hu) |
| IL (1) | IL100955A (hu) |
| IS (4) | IS3815A (hu) |
| NO (1) | NO177589C (hu) |
| NZ (1) | NZ241623A (hu) |
| TW (1) | TW221804B (hu) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1131672A (zh) * | 1994-11-22 | 1996-09-25 | 生化学工业株式会社 | 氨基环戊烷衍生物 |
| US5981720A (en) * | 1996-09-09 | 1999-11-09 | Wisconsin Alumni Res Found | Human salivary proteins and fragments thereof having alpha-glucosidase inhibitory activity |
| US6642038B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-11-04 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | GlcNAc phosphotransferase of the lysosomal targeting pathway |
| US6770468B1 (en) | 1999-09-14 | 2004-08-03 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Phosphodiester-α-GlcNAcase of the lysosomal targeting pathway |
| US6800472B2 (en) | 2001-12-21 | 2004-10-05 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Expression of lysosomal hydrolase in cells expressing pro-N-acetylglucosamine-1-phosphodiester α-N-acetyl glucosimanidase |
| US6905856B2 (en) | 2001-12-21 | 2005-06-14 | Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. | Soluble GlcNAc phosphotransferase |
| US20110312264A1 (en) * | 2009-03-12 | 2011-12-22 | Lg Electronic, Inc. | Outdoor unit for air conditioner |
| CN104758275A (zh) * | 2015-03-05 | 2015-07-08 | 青岛申达高新技术开发有限公司 | 一种治疗结肠癌的药物组合物及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4138562A (en) * | 1977-02-09 | 1979-02-06 | The Regents Of The University Of Minnesota | Adenosine deaminase resistant antiviral purine nucleosides and method of preparation |
| US4318562A (en) * | 1980-03-03 | 1982-03-09 | Libbey-Owens-Ford Company | Grasping apparatus for handling heated articles |
| CH667649A5 (en) * | 1986-09-10 | 1988-10-31 | Lonza Ag | 2-Substd. amino-benzoxazole and -benzimidazole derivs. prodn. - by reacting prim. amino cpd. with amine in presence of acid catalyst, useful as intermediates e.g. for pharmaceuticals |
| JP2529365B2 (ja) * | 1988-10-17 | 1996-08-28 | ダイハツ工業株式会社 | ワ―クの積込積出装置 |
| WO1990010010A1 (fr) * | 1989-02-28 | 1990-09-07 | Sawao Murao | Nouvelle substance, trehalostatine, et sa production |
-
1992
- 1992-02-13 CZ CS95517A patent/CZ281418B6/cs unknown
- 1992-02-13 NO NO920555A patent/NO177589C/no not_active IP Right Cessation
- 1992-02-13 US US07/835,185 patent/US5260447A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-13 CZ CS92439A patent/CZ281476B6/cs unknown
- 1992-02-14 NZ NZ241623A patent/NZ241623A/xx unknown
- 1992-02-14 IE IE920481A patent/IE71947B1/en not_active IP Right Cessation
- 1992-02-14 IL IL100955A patent/IL100955A/xx not_active IP Right Cessation
- 1992-02-14 FI FI920663A patent/FI920663A/fi unknown
- 1992-02-14 HU HU9200455A patent/HU214702B/hu not_active IP Right Cessation
- 1992-02-14 AU AU10947/92A patent/AU653384B2/en not_active Ceased
- 1992-02-14 IS IS3815A patent/IS3815A/is unknown
- 1992-02-14 TW TW081101047A patent/TW221804B/zh active
- 1992-02-14 CA CA002061239A patent/CA2061239C/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-15 CN CN92101834A patent/CN1043422C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1992-02-15 KR KR1019920002281A patent/KR100226305B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1992-02-17 AT AT92301258T patent/ATE121383T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-02-17 EP EP92301258A patent/EP0499489B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-17 DK DK92301258.7T patent/DK0499489T3/da active
- 1992-02-17 ES ES92301258T patent/ES2074332T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1992-02-17 DE DE69202075T patent/DE69202075T2/de not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-08-16 IS IS4065A patent/IS4065A/is unknown
- 1993-08-16 IS IS4064A patent/IS4064A/is unknown
- 1993-08-16 IS IS4066A patent/IS4066A/is unknown
-
1996
- 1996-07-04 HK HK117796A patent/HK117796A/xx not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-03-26 KR KR1019990010486A patent/KR100245477B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-03-26 KR KR1019990010487A patent/KR100229257B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-03-26 KR KR1019990010488A patent/KR100230626B1/ko not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4990448A (en) | Bu-4061T | |
| US5071957A (en) | Antibiotic BU-4061T | |
| GB2147582A (en) | Bbm-2478 antibotic complex | |
| HU214702B (hu) | Polihidroxi-ciklopentán-származékok, eljárás az előállításukra és ezeket tartalmazó gyógyászati készítmények | |
| EP1319666B1 (en) | Antibacterial compounds | |
| HU216875B (hu) | Eljárás leusztrodukszin és az azt tartalmazó gyógyászati készítmény előállítására | |
| US6432978B1 (en) | SF2809-I,II,III,IV,V and VI substances exhibiting chymase-inhibiting activities | |
| US5914348A (en) | Substance FA-70D, process for producing the same, and uses thereof | |
| US5061730A (en) | Carboxylic acid derivatives | |
| JP3830964B2 (ja) | 海洋放線菌から単離した新規なチオデプシペプチド | |
| CA1339467C (en) | New antibiotics called "mureidomycins a, b, c and d", a process for their preparation and their therapeutic use | |
| FI106026B (fi) | Menetelmä lääkeaineena käyttökelpoisen 2-amino-4-(hydroksimetyyli)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-syklopent[d]oksatsoli-4,5,6-triolin valmistamiseksi | |
| EP0721957B1 (en) | Compound ge3 | |
| US4572895A (en) | Process for preparing an antibiotic complex by culturing actinomyces strain ATCC 39417 | |
| JP3209791B2 (ja) | オキサゾリン誘導体及びその製造法 | |
| US4725621A (en) | CL-1957E antibiotic compound and its production | |
| RU2120997C1 (ru) | Способ получения 2-амино-4(гидроксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4h-циклопент-[d]-оксазол-4, 5,6-триола и продуцирующие его штаммы актиномицета micromonospora и актиномицета amycolatopsis | |
| US5656736A (en) | Compound UCH9 | |
| JP3106012B2 (ja) | オキサゾリン誘導体の製造法 | |
| JP2000159765A (ja) | 新規抗細菌化合物 | |
| JP3109923B2 (ja) | 新規トレハゾリン誘導体の製造法 | |
| NO301488B1 (no) | Polyhydroksycyklopentanderivat, fremgangsmåte til fremstilling derav, samt biologisk rene stammer av mikroorganismer som er anvendelige i fremgangsmåten | |
| JPH07173186A (ja) | Ｗｓ８２４２物質 | |
| JPH0539265A (ja) | 新規物質ｗｋ−２９５５およびその製造法 | |
| JPH06279481A (ja) | Ｗｓ６４８２６物質 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DBF9 | Cancellation of earlier publication on application | ||
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |