CZ51795A3 - 2-AMINO-4-(HYDROXYMETHYL)-3A,5,6,6A-TETRAHYDRO-4H-CYCLOPENT/d/OXAZOLE- -4,5,6-TRIOL, PROCESS OF ITS PREPARATION AND PRODUCTION MICRO-ORGANISMS - Google Patents

2-AMINO-4-(HYDROXYMETHYL)-3A,5,6,6A-TETRAHYDRO-4H-CYCLOPENT/d/OXAZOLE- -4,5,6-TRIOL, PROCESS OF ITS PREPARATION AND PRODUCTION MICRO-ORGANISMS Download PDF

Info

Publication number
CZ51795A3
CZ51795A3 CS95517A CS5179592A CZ51795A3 CZ 51795 A3 CZ51795 A3 CZ 51795A3 CS 95517 A CS95517 A CS 95517A CS 5179592 A CS5179592 A CS 5179592A CZ 51795 A3 CZ51795 A3 CZ 51795A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
hydroxymethyl
amino
tetrahydro
triol
cyclopent
Prior art date
Application number
CS95517A
Other languages
English (en)
Inventor
Mutsuo Nakajima
Osamu Ando
Shuji Takashi
Kiyoshi Hamano
Hideyuki Haruyama
Takeshi Kinoshita
Akira Sato
Yasuyuki Takamatsu
Ryuzo Enokita
Original Assignee
Sankyo Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sankyo Co filed Critical Sankyo Co
Publication of CZ281418B6 publication Critical patent/CZ281418B6/cs
Publication of CZ51795A3 publication Critical patent/CZ51795A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D263/00—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings
    • C07D263/52—Heterocyclic compounds containing 1,3-oxazole or hydrogenated 1,3-oxazole rings condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C215/42—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups or hydroxy groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C215/00—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton
    • C07C215/42—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups or hydroxy groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton
    • C07C215/44—Compounds containing amino and hydroxy groups bound to the same carbon skeleton having amino groups or hydroxy groups bound to carbon atoms of rings other than six-membered aromatic rings of the same carbon skeleton bound to carbon atoms of the same ring or condensed ring system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/10—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings linked by a carbon chain containing aromatic rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/14—Nitrogen or oxygen as hetero atom and at least one other diverse hetero ring atom in the same ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C2601/00—Systems containing only non-condensed rings
    • C07C2601/06—Systems containing only non-condensed rings with a five-membered ring

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Nitrogen And Oxygen As The Only Ring Hetero Atoms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Indole Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Measuring Volume Flow (AREA)
  • Polyesters Or Polycarbonates (AREA)

Description

2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol, způsob výroby a produkční mikroorganismy
Oblast techniky
Podstatu vynálezu tvoří nový polyhydroxycyklopentanový derivát, který má určité hodnotné biologické účinky. Vynález poskytuje způsob výroby této sloučeniny.
Sloučeninou podle vynálezu je 2-amino-4-/hydroxy-
methyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol, vzorce II. Tato sloučenina se připravuje fermentací nebo štěpením sloučeniny známé jako trehazolin, která může být vyjádřena vzorcem III. Ale 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/-oxazol-4,5,6-triol a trehazolin jsou podrobeny tautomerii a mohou proto být /rovně-vyjádřeny vzorci Ila a lila.
/lila/
OH
- 3 Má se za to, že trehazolin může být stejná sloučenina jako ta, jež je nazývána trehalostatin v PCT mezinárodní publikaci č. WO 90/10010.
Triol podle vynálezu způsobuje inhibici různých hydroláz cukrů, zvláště beta-glukosidázy a sacharázy.
Dosavadní stav techniky
Bylo popsáno, že sloučeniny mající silnou inhibiční aktivitu proti beta-glukosidáze, jako jsou castanospermin a deoxynojirimycin jsou užitečné jako antineoplastická činidla a jako anti-AIDS (Acquired Immunne Deficiency Syndrome) činidla /R. A. Gruters a další, Nátuře, 330, 74 χ 77, 1987 , M. J. Humphries a další, Cancer. Res., 46, 5215 x 5222, 1986/. Proto se ocekava, že sloučeniny mající schopnost inhibovat aktivitu beta-glukosidázy budou užitečné jako antineoplastická a anti-AIDS činidla.
/Rovněž/ bylo popsáno, že sloučeniny mající silnou inhibiční účinnost proti sacharose, jako je AO-128 a Acarbosa jsou užitečné jako antidiabetická činidla a jako antiobesitní činidla /Satoshi Horii a další, o 9?
Journal of Medicinal Chemistry, 29, 1038 χ 1046, 1986,
T. Aida a další, Journal of Japanese Society of Food and Nutrition, 34, (2), 134 V 139, 1981/. Proto se očekává, že sloučeniny mající schopnost inhibovat aktivitu sacharosy budou užitečné k léčení a profylaxi diabetů a obesity.
— 4 —
Sloučeniny mající určitou strukturní podobnost se sloučeninami podle vynálezu jsou:
mannostatiny popsané mezi jiným T. Aoyagim a další, /The Journal of Antibiotics, sv. XLII, č. 6, 883, 1989/, které jak uvedeno, mají schopnost inhibovat aktivitu alfa-D-mannosidasy, /IS , 2R,3S,4R,5R/-methyl-/2,3,4-trihydroxy-5-/hydroxymethyl/cyklopentyl/amin popsaný mimo jiné R. A. Farrem a další, /Tetrahedron Letters, 31, 7109, 1990/, který, tak<z jak je /rovněž/ uvedeno, má schopnost inhibovat aktivitu alfa-mannosidázy, allosamidin, popsaný mezi jiným S. Sakudou a další, /Tetrahedron Letters, 27, 2465, 1986/, který jak uvedeno, má schopnost inhibovat aktivitu hmyzí chitinázy, a kifunensin, popsaný mezi jiným H. Kayakirim a další, /J. Org. Chem., 54, 4015, 1989/, který, jak je uvedeno, je imunomodulátorem se schopností inhibovat aktivitu alfa-mannosidázy.
Podstata vynálezu
Podstatu vynálezu tvoří 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol· a jeho farmaceuticky přijatelné soli.
tak<z Součástí podstaty vynálezu je /rovněž/způsob výroby této látky.
2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol lze vyrobit hydrolýzou trehazolinu působením zředěného roztoku kyseliny nebo
- 5— fermentací s užitím vnitroorganismů rodu Micromonospora nebo Amycolatopsis.
Trehazolin, který se může užít jako výchozí materiál pro výrobu sloučeniny podle vynálezu, lze připravit kultivací trehazolin produkujících mikroorganismů rodu Micromonospora nebo Amycolatopsis, výhodně trehazolin produkujícími mikroorganismy rodu Micromonosoora.
Příkladem trehazolin produkujících mikroorganismů rodu Micromonospora je Micromonospora sp. SANK 62390. Tento mikroorganismus byl nejdříve uložen v domácím depositáři Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, 26. července 1990 pod přístupovým číslem 'potonj FERM P-11631 abyl uložen za podmínek Budapeštské smlouvy ve Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, 21. srpna 1991, s přístupovým číslem FERM BP-3521.
Příkladem trehazolin produkujících mikroorganismů rodu Amycolatopsis je Amycolatopsis sp. SANK 60791, který byl uložen za podmínek Budapeštcké smlouvy ve Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tsukuba-shi, Ibakari-ken, Japan, 14. srpna 1991 s přístupovým číslem FERM BP-3513.
Oba jsou nově izolované kmeny a oba tvoří část tohoto vynálezu.
-ZCharakterisace mikroorganismů
Hicromonospora sp.. SANK 62390
Kmen Hicromonospora sp. SANK 62390 má následující mykologické vlastnosti.
1. HcrfoLogické vlastnosti
Kmen SANK 62390 roste normálně nebo lehce slaběji v průběhu kultivace při 23 °C po období 7 až 14 dnů na běžném agarovém kultivačním mediu užívaném k identifikaci kmenů. Substrátové hyphae se vhodně prodlužuji a větvi, se světle oranžovým, oranžovým až tmavě hnědošedavým zbarvením, ale bez zářezů nebo ostrých obrátek pozorovaných u kmenů rodu Nocardia. Vzdušná mycelia jsou resdimentárni a jsou zbarvena bíle až šedavé bíle. Spory jsou pozorovány na substrátových hyphae ojediněle a tvoři se po jednom na relativně krátkém sporangioforu. Tvar spor je kulovitý a povrch spor hladký. Nebyly pozorovány žádné speciální orgány jako jsou sporangie, sklerotie, viry ajpoóobnč'
2. Růst na různých médiích
Kmen byl kultivován při 28 °C 14 dnů na různých kultivačních med iích a vykazoval vlastnosti ukázané v tabulce 1. Vyjádřeni barevných tonů je udáno v barevných číslech v Guide to Color Standard vydaném Japan Color Research Institute.
V tabulce jsou užity následující zkratky:
G: růst, AH: vzdušně mycelium, R: reverse /převrácená/, RP: rozpustný pigment.
-Λ'Tabulka 1
Vlastnosti kmene SANK 62390
medium charakteristika vlastnosti
sáchsrosQ- 5 lehce slabý, hladký
nitrátový agar světle oranžový /3 - 9 - 6/
AM nevytvořeno
R světle oranžový /3-9-6/
R? n evytvo ren
clukoso- G lehce slabý, hladký
asparaginový agar žlutavě oranžový /12-7-7/
AF-i nevytvo řeno
R světle oranžový /6-8-7/
s ? nevytvořen
glycerol-aspara- G lehce slabý, hladký
ginový agar /15? 5/ svět le oranžový /8-7-6/
AM nevytvořeno
a světle hnědavě světlý /2 - 6 - 6/
RP nevytvo řen
anorganické soli G dobrý, hladký,
/škrobový agar světle oranžový
/Σ3Ρ 4/ /8-7-6/
AM nevytvořeno
R šedý /N-5/
RP nevytvořen
i -X-
tyrosinový agar 6 Lehce slabý, hladký
/ISP 7/ kalně oranžový /6-8-6/
AM sotva vytvořeno ruci mentám i, bílé
R hnědavě bílé /2-9-7/
Ri3 nevytvořen
nutriačni agar s lehce slabý, hladký
/DIFCO/ žlutavě oranžový /10 - 8 - 7/
AM nevytvořeno
R kalně žlutavě oranžový / 8 - 3 - 7
RP nevytvořeno
kvasnicový extrakt G dobrý, hladký,
sladový ext rakt tmavě hnědavě šedý
agar /13? 2/ /1-4-6/
AM sotva vytvořeno rudimentární hneda- vě bilě /1 - 8 - 6/
R hnědavě černý /1-2-6/
R? nevytvořen
ovesnornoučný agar G dobrý, hladký,
/ISP 3/ oranžový /10 - 7 - 6/
AM sotva vytvořeno, rudimentární, bílé
R oranžový /12-7-
RP nevytvořen
- Μ -
vodní agar G AM RP lehce slabý, hladký bledě žlutavě oranžový /2 - 9 - 9 / n evytvoreno šedý /ři-5/ nevytvořen
bramborový extrakt G dobrý, hladký,
mrkvový extrakt žlutavě šedý
agar /1 - 9 - 10/
Λ M sotva vy t vo reno, r u d i m e n t á r n i, bílé
ρ hnědave bílé /2-9-7/
a? nevytvořen
3. Fyziologické vlastnosti
Fyziologické vlastnosti kmene SAí-íK 62390 pozorevan<
v období od 2. dne do 21
- · -o o při έύ dne po začátku kultivace, ukazuje tabulka 2.
Tabulka
hydrclysa škrobu positivní
ztek učen i želatiny positivní
redukce nitrátu negativní
koagulace mléka positivní
peptonizace mléka positivní
produkce melanoidnich
, Λ . . . *
pigmentu /med i um 1/ negativní
/medium 2/* negativní
, *
/medium 3/ negativní
dekomposice substrátu kas ei n positivní
t y r o s i n negativní
x an t h i n negativní
- X
teplotní rozsah pro růst /medium 4/* 17 * 4 2 °C
optimální teplota
. /. * ť/Z o
pro růst /medium 4/ 27 ť 32 °c
tolerance soli
* z, .
medium f: t r y o z o η o - x
z .
medium 2: ·“. a r» $· n ;*> ·“· « L·· * t - > w · s v
/ í S P 6 /
z. .
medium a: t y r o s i n o v y
z, .
medium 4: kvasní cový
/13? 2/
Kmen SANK 6>39u
s použitím Priáham-3o
t ryo tono-kv asn i cový extrakt vývar / Z 5 P 1/
SANK 62390 byl /rovněž/ kultivován při 22 °C
Z.
kultivačního media. Asimilace zdrojů uhlíku pozorovaná po 14 cenní kultivaci ukazuje tabulka 5.
Tabulka
B-glúkose v y u ž i t á
B-fruktcsa využi tá
L-arab i nos a využi tá
L-rhamncss nevyuži tá
D-xyloss využi tá
sacnarcs a n evyuž i t a
Σnositel využit
Π a f f i n o s a využita
D-msnni tol nevyužit
kontrola nevyuž i t a
4. Buněčné složky u n ě č n ě stěny metodou B. Beckera 421 4 23 /1 934/]
-di aminopimelovou kmene SANK 62390 byly analysovány et al. [Applied Microbiology, £2, a bylo nalezeno, že obsahuji mesokyselinu. Mimoto cukrové složky stěn celých buněk kmene SANK 62390 byly analysovány metodou Μ. P. Lechevaliera [Journal of Laboratory & Clinical Med ici ne, 71, 934 /1963/] a bylo nalezeno, že obsahuji arabinosu a xylosu, ale nikoli kyselinu mykolovou. Okázalo se, že acylový typ peptidového glykanu v buněčné stěně je g lýko lylového typu. Hlavni detekované ’ měna c'n i nor.ov é složky byly MK-10/ H . / , MK-1 G/ H .. / a O
Μ K — 1 u / H 2 / ·
O
Je proto zřejmé, že tento mikroorganismus by měl být klasifikován jako nový druh, patrici k rodu Mi cromonospor s rodiny Actinomycetes. Na tomto základě byl označen jako Micromonospora sp. SANK 62390.
Amycolatopsis sp. SANK 60791
Kmen Amycolatopsis sp. SANK 60791 má následující mykologické vlastnosti
1. Morfologické vlastnosti
Kmen SANK 60791 roste normálně nebo lehce slabě o
C po období od 7 do 14 dnú v průběhu kultivace při 23 na běžném agarověm kultivačním méciiu užívaném pro identifikaci kmenů. Hyphae substrátu se prodlužuji dobře a větví hladce nebe nepravidelně, s hnědavě bílým, bledě žlutavě hnědým až tlumeně žlutým zbarvením. Vzduchová mycelia jsou řídká nebo rudimentární s bílým, bledě žlutým až světle oranžovým zbarvením. V posledních stadiích inkubace se někdy pozorují hyphae substrátu a vzdušná mycelia rozdělená v sekcích a vzdušná mycelia mající tyčinkovitou strukturu. Hyphae se prodlužuji bez ostrých obratů pozorovaných u kmenů rodu Nocardia,
Nebyly pozorovány žádné speciální orgány jako jsou sp0(rangie, sklerotie, viry ajpod obn<Z.
2. Růst na různých raédiich
Kmen byl kultivován při 23 °C 14 dnů na různých kultivačních mediích a vykazoval vlastnosti ukázaná v tabulce 4. Vyjádření barevných tonů je udáno v barevných číslech v Guide to Color Standard vydaném Japan Color Research Institute.
V tabulce jsou užity následující zkratky:
G: růst, AM: vzdušně mycelium, R: reverse /převrácená/, RP: rozpustný pigment.
Tabulka 4
Vlastnosti kmene SANK 60791
m/d i um charakteristika vlastnosti
sacharoso- G dobrý, hladký,
nitrátový agar žlutavé šedý /1-9-10/
API lehce slabý, bílý
R žlutavě šedý /2-9-10/
RP nevytvořen
glukoso-asparag i nový G lehce slabý,
agar hladký, světle oranžový /3-9-6/
Afi sotva vytvořeno žlutavě šedý /2-9-10/
R světle hnědý /3-8-6/
RP nevytvořen
-χ glycerin-asparaginový G agar ZISP 5/
AM
R
RP anorganické soli- G škrobový agar /ISP 4/
AM a
tyrosinovýagar G /ISP 7/
AM
RP nutriční agar G / D IF C 0 /
AM
R
RP dobrý, hladký, hnědavě bí lý /2-9-7/ rud imentárni, bilě bledě-žlutavě hnědý /0-3-8/ nevytvořen lehce slabý, hladký bi.adě žlutavě hnědý /4-3-9/ rudimentární, bledě žluté /3-9-18/ bledě žlutavě hnědý /6-3-9/ r.evy tvo řen velmi dobrý, vrásčitý, hnědavě bily /2-9-6/ sotva vytvořeno, světle oranžové /3-9-6/ svět le oranžové /6-3-7/ nevytvořen dobrý, hladký, bledě žlutavě hnědý /4-3-8/ rudimentární, bílé bledě žlutý /3-9-3/ nevytvo řeno
-X-
kvasní cový extrakt- 6 dobrý, vrásčitý, matně
sladový extrakt žlutý /10-7-9/
agar ZISP 2/ AM rudimentární, bílý
R matně žlutavě oranžový /10-7-2/
Γ5 r. Γ nevytvořeno
ov es nomouč ný agar A 0 lehce slabý, hladký,
/XSP 3/ bledě žlutavě hnědý
/4-8-97
AM rudimentární, bité
R bledě-žlutý /4-9-9/
RP nevytvořeno
vodní agar G lehce slabý, hladký, žlutavě šedý /1-9-10/
A í’1 lehce s labé, bílé
R žlutavě šedý /1-9-10/
RP nevytvo řeno
br ambo rovy ext rakt- 6 lehce slabý, hladký,
mrkvový ex trakt žlutavě šedý
agar /1-9-10/
AM rudimentární, bilé
R žlutavě šedý /2-9-11/
RP nevytvořeno
3. Fyziologické vlastnosti !
ίΐ
Fyziologické vlastnosti kmene SANX 60791 pozorované v období od 2. dne do 21. dne po začátku kultivace pri j °C ukazuje tabulka 5.
T a 15 -·χ- bulka 5
hydrolysa škrobu negativní
zteku cení želatiny positivní
redukce nitrátu positivní
koagulace mléka positivní
peptinizace mléka produkce melanoidniho / «i ed i u π negativní
pigmentu 1/* negativní
/médium * 2/ negativní
/ m ezd i u m 3/* negativní
dekomposice substrátu k as e i n negativní
t y r o s i n positivní
s an t h i n negativní
tolerance soli /medium ★ 4/ ·> sz □ /«
medium 1: tryptono-kvasnicový extrakt vývar /15? 11 medium 2: peptono-kvasnicový extrakt-žetezitý agar /ISP 6/ medium 3: tyrcsinový agar /ISP 7/ medium 4: kvasnicový extrakt-sledový extrakt agar /ISP 2/ tak<í
Kmen 3ANK 60791 by l /rovn-ěý kultivován při 23 °C s použitím Fridham-Sottliebova agaru /13? 97 jako kultivačního média. Asimilace zdrojů uhlíku pozorovaná po 14 cenní kultivaci ukazuje tabulka ó.
Tabulka 6
D-g lukosa využita
D-fruktosa využ i t a
L-arab i nos a slabě vyu
L- r h a m n o s a využita
D-xy los a využita
sacharosa využita
Inos i to l nevyuž i t
Raffinosa využ i t a
D-mannitol využ i t
kontrola nevyuž i ta
4. 3uněčné složky
Buněčné stěny kmene SANK 60791 byly analyzovány metodou S. Beckera et al. CApplied Microbiology, 12, <72''
421 χ 423 /1984/] a bylo nalezeno, že obsahují kyselinu meso-disminopimelovou. Mimoto byly anatyzovány cukrové složky celých buněčných stěn kmene SANK 6G791 metodou Μ. P. Lschevaliera [Journal o f Laboratory &. Clinical Medicine, 71, 934 /1968/] a bylo nalezeno, že obsahuji araoinosu, ale že neobsahuji kyselinu mykolovou. Bylo stanoveno, že acylový typ pep t i dováno glykanu v buněčné stěně je acetylcvého typu. Hlavni detekovaná menachinonová složka byla
MK-9/H , / .
Je proto vhodné, že mikroorganismus by měl být klasifikován jako nový druh, patrici k rodu Amycolatopsis rodiny Ac t i no my c et es. Na tomto základě byl označen jako Amycolatopsis sp. SANK 60791.
/7
- Identifikace kmenů SANK 62390 a SANK 60791 byla provedena podle standardů ISP /The International Strfptomyces Project/, 3ergey s Planual of Systematic Sacteriology, Vol. 4, The Actinomycetes, Vol. 2 a sou česné l tury o Actinomycetach.
3ylo potvrzeno,, že kmeny SANK 62390 a SAPiK 60791 vytvářejí trehazolin a 2-amino-4-/hydrcxymethyl/-3a,5,ózóa-tetrahydro-4H-cyklopentCd: 0x22c1 — 4,5, 6-triol. Avšak jak je dooře znáno, vlastnosti hub obecně a aktinomycetových organismů zvláště, se mohou značně měnit a takové houby mohou snadno procházet mutaci, jak z přirozených příčin, tak jako výsledek působení arteficidnich prostředků /například ultrafialového záření, radioaktivního zářeni, chemického působeni atdjf/. V souhlase s tím tento vynález obsahuje užiti jakéhokoli mikroorganismu, který může být klasifikován v rozsahu rodu nicromonešpora nebe Amycolatopsis, a který sdílí s kmeny SANK 62390 a SANK 60791 charakteristickou schopnost produkovat trehazolin a 2-aminc-4-/hydroxymethyl/-35,5,6,6a-tetra“ hydro-4'H-cyklopent [dj cxazol-4,5,6-triol. Neočekává se, že nově mikroorganisrny kmenů SANK 62390 a SANK 60791 by byly výjimečné a pojmy SANK 62390 a SANK 60791” zahrnují všechny mutanty těchto kmenů, které sdílí s kmeny SANK 62390 a SANK 60791 cha rakteristickou schopnost produkovat trehazolin a 2-aminc-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,óa-tetrahydro-4H-cyklopentIdl oxazo1-4,5,6-triol Mimoto tyto mutanty zahrnuji mutanty získané prostředky technik genetického inženýrství, například rekomP°ctobn<2 binsci, transdukci, t r ans f o rma c i /a-pe·^. Je předmětem jednoduchého experimentováni určit, na bázi zde podaných informaci, týkajících se vlastnosti trehazolinu a 2-amino-4-/hytíroxymethyl/-3a,5,6,óa-tetrahycro-4Hcyklopent [d]oxazo1-4,5,6-1ri olu, zda jakýkoli daný kmen produkuje tyto sloučeniny nebo zda je produkuje v dostatečném množství, aby takový kmen způsobil možný komerční zájem.
/<£
- >ťTrehazolin a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,ó,6a-tetrahydro-4H-cyklopent [d]oxazol-4,5,6-triol se v souhlase s tímto vynálezem mohou připravit kultivaci těchto kmenu hub v kultivačních médiích typu běžně užívaného pro produkci ostatních fermentačnich produktů z podobných mikroorgani srnu. Taková media nezbytně obsahuji mikrob i o log icky ssimi lovatelně zdroje uhlíku a dusíku, stejně jako anorganické solez jak je dobře známo odborníkům.
'· pocto Ια η (2.
V
Q poctotofte.
Výhodně příklady zdrojů uhlíku zahrnují: glukosuz fruktosuz maltosuz sacharosuz mannitolz glycerolz dextrinz ovesz žito, kukuřičný škrobz bramborový škrob, kukuřičnou mouku, sojovou mouku, koláč z bavlněných semen, olej z bavlněných semen, melasy, kyselinu citrónovou, kyselinu vinnou /»po-<f. Takové stoučeniny mohou být užity samostatně nebo v jakékoli vhodné kombinaci. Obecně užitě množství se může měnit v rozsahu od 1 do 10 Jí hmotnostních kultivačního media.
Výhodnými zdroji dusíku jsou normálně materiály obsahující protein, jako jsou běžně užívané ve fermentačnich procesech. Příklady takových zdrojů dusíku zahrnují: sojovou mouku, pšeničné otruby, mouku z burských oříšků, koláč z bavlněných semen, olej z bavlněných semen, moučku z bavlněných semen, kaseinové nydrolysáty, pnarmamin, rybí maso, kukuřičný výluh, pepton, masový extrakt, kvasnice, kvasnicový extrakt, sladový extrakt, dusičnan sodný, dusičnan amonný, síran amonný Tyto zdroje dusíku se mohou použit jednotlivě nebo v jakékoli vhodné kombinaci. Obecně dáváme přednost použit je v koncentraci mezi 0,2 a 6 Jí hmotnostními kultivačního media.
//
-MŽivné anorganické soli se mohou zahrnout do kultivačního media,jsou to běžné soli, které jsou schopné poskytovat různě ionty nezbytné pro růst mikroorganismů, takové jako sodíkový, amoniakový, kalciový, fosfátový, síranový, chloridový a uhličitanový iont. Mimoto by medium mělo obsahovat menši množství nezbytných stopových prvků, jako jsou draslík, kale i um, kobalt, mangan, železo a hořčík.
Když se způsob podle tohoto vynálezu uskutečňuje technikou tekuté kultury, je s výhodou používáno v médiu protipénOvé činidle, jako je silikonový olej, rostlinný olej nebo povrchově aktivní činidlo. Kultivační medium pro produkci trenazclinu nebo 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,ó,óa-tetrahydro-4H-cyklopent[cloxazol-4,5,6-triolu má mít pH pro kultivaci mikroorganismů rodu Micromonospora a Amyco latopsis, zejména kmenů SANK 6239Q a SANK 60791, výhodně v rozsahu mezi 5,0 sž 8,0, mnohem výhodněji od ó,5 do 7,5.
Kultivace se může uskutečnit za jakékoli teploty v rozsahu od asi 15 do 38 °C, ačkoli je výhodná teplota od 22 do 38 °C pro dobrý vzrůst a teplota od 22 do 28 C je výhodná pro optimalizaci produkce trehazclinu a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,óa-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu.
Tyto sloučeniny se vyrábějí za aerobních kultivačních podmínek a obvyklými aerobními kultivačními metodami, které se mohou použit, jsou pevná kultura, kultura protřepáním a aeračně protřepávaci /submersni/ kultivační metody. V případě kultivace v malém rozsahu je typická kultura protřepávánim po několik dni při 23 °C. V takových kultivačních metodách malého rozsahu, kultivace může být zahájena s jedním nebo dvěma proliferačnimi stupni, vytvořenim naočkovaných kultur, například v Erlenmeyerových lahvích, opatřenými
2ΰ
- X zachycovacími destičkami, které slouží jako regulátor toku tekutiny. Medium pro očkovací kultivační stupně výhodně obsahuje jak zdroje uhliku, tak dusíku. V preferované sekvenci operaci takových kultivaci v malém měřítku, očkované kultivační lahve se třepají při konstantní teplotě inkubátoru při 23 cC po 7 dni nebo dokud se nedosáhne dostatečného vzrůstu. Vzrostlá napobom očkovaná kultura s e P řsn es e do druhého očkovacího media nebo do produkčního media. Kcyž je užito intsrmediárni růstová fáze, v podstatě stejná metoda se užije prcírůst a alikvotní díly výsledného intermediárního produktu se naočkuji do produkčního média. Inckulované lahve se mohou i nkubovat několik dnů za třepáni a po dokončeni inkubace, obsahy lahvi se mohou centrifugovat nebo filtrovat.
V případě výroby ve velkém měřítku, je výhodné použit vhodného kvasného zařízeni opatřeného míchačem a aeračnim aparátem. V takovém případě se živně medium může připravit uvnitř kvasného zařízeni. Médium se výhodně sterilizuje zvýšením teploty na 125 °C; po chlazeni, sterilizované medium se může inokulovat s předtím připravenou očkovací kulturou. KultivacepoΛ kračuje za mícháni a aerace, například při 23 WC.
Tato metoda je vhodná pro získáni sloučenin podle vynálezu ve velkých množstvích.
potom
Pcstup kultivace a množství žádaného trehazolinu a 2-amino-4-/hydroxymethyL/-3a,5,ó,óa-tetrahydro-4H-cyklopentEdjoxazo1-4,5,6-triolu vyprodukovaného jak kultivace pokračuje, se může stanovit měněním biologických aktivit sloučenin nebo vysokovýkoňovou kapalinovou chromatografií nebo plynovou chromstografii/hmotovou spektrometrii purifikovaných vzorků sloučenin z kultivační směsi, jak je dále mnohem detailněji popsáno. Trehazolin má inhibiční účinek proti trehalase
2/
- X bource morušového a jeho produkce se může monitorovat s použitím technik jako jsou % ukázané v následujícím testovnim přikladu 3.
Na druhé straně je výroba 2-amino-4-/hydroxymethy1/· -3s,5zó,Ó2-tetr3hydro-4K-cykloper. t [djoxazo 1-4,5,ó-triolu nej Lepe mor. i t o r o v ána vysokoúčinnou kapalinovou chromaícg r afi i nebo plynovou chromatcgrafii/hmotcvcu spek t rcmetrii. Ta se může uskutečnit uvedením kultivačního například média s vhodnou adsoroenčni pryskyřici Cí^s-p-ě-/ ton, jež se prodává pod obchodním názvem Amberlite IRC-5O k absorpci 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,c,óa-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,ó-triolu, naPobom příklad v chromatografickém s loupe i. múž e následovat promytí vodou, eluce s vhodným elučr.ím činidlem, například C;,5N vodným roztokem amoniaku, koncentraci
Λ elu á t u, například odpařením za sníženého tlaku, a lyofylizaci zbytku k vytvořeni prášku. Množství 2-amino -4-/hydroxymethyl/-3a,5,ó,óa-tetrahydro-4K-cyklopentCdl oxazol-4,5,6-trčolu v prášku se může stanovit použitím vysokovýkonné kapalinové chromatografie. Alternativně může být sloučenina nejdříve acetylována a množství 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6a-tetrahydrc-4H-cyklopent[dlcxazc 1-4,5,ó-trotu v prášku stanoveno plynovou chromatografi i/hmotovou spektrometri i.
Obecně množství 72 a 150 hodinami po trehazolinu dosahuje maxima začátku fermentace, zatímco mezi množství 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,óa-tetrahydro-4H“ -cyklopent [cloxazo 1-4,5,ó-1rio lu dosahuje maxima mezi 9ó a 1ó3 hodinami po začátku fermentace. Avšak přesný čas se bude měnit v závislosti na teplotě a ostatních fermentačnich podmínkách, a přesný optimální čas pro jakoukoli sadu podmínek se snadno může stanovit sledováním výroby žádané sloučeniny jak shora navrhováno.
-XKdyž se užívají kmeny rodu Micromonospora jako trehazoli»> tak 2-amino-4-/hydroxymethyl/-33,5,6,óa-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol jsou normálně produkovány a mohou být odděleny konvenčními způsoby v průběhu regenerační proceduryz jak je popsáno níže. Kmeny rodu Amycolatopsis normálně produkuj í pouze 2-£mino-4-/hydroxymethy/-3a,5,ó,óa-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazo1-4,5,ó-tri ol. Obě sloučeniny se uvolňuji do kopalně fáze, ačkoli jsou obě také přítomné v myceliu. Nejsnadněji se regeneruji z kapalně fáze.
p&ťom
Po dokončeni kultivace, žádaný tr^azolin a/nebo 2-ami no-4-/hydroxymethyl/-5 a,5,6,óa-tet rahydro-4H-cyklopentCdloxazo 1-4,5,ó-tri ol, které jsou přítomny v kapalné fázi kultivačního me^dia, mohou být frakcionovány odfiltrováním mycelia a ostatních pevných materiálů, s výhodou použitím infusiorové hlinkyjjako filtračního prostředku nebo centrifugaci. Tyto sloučeniny, které j sou 4>e-k/pří tomny ve filtrátu nebo supernatantu, se mohou regenerovat extrakcí a mohou se přečistit konvenčními prostředky, s využitím svých fyzikálně chemických vlastností.
Například tyto sloučeniny mohou být regenerovány z filtrátu nebo supernatantu průchodem přes sloupec obsahující adsorbens, jako je iontoměničová pryskyřice, například Amberlite IRC-50 nebo C S-50, nebo Ďowex 50WX4 nebo S3R-P, takže se zadrží buď nečistoty na pryskyřici a tak se odstraní, nebo že se žádaná sloučenina zadrží a j e/pa-ty regenerována eluci, například vodným amoniakem. Příklady dalších adsorbencii zahrnuji aktivní uhli nebo ostatní adsorpční pryskyřice, jako je Amberlit XAO-2 nebo XAD-4 /výrobek Rohm a Haas Co./ nebo Diaion HP-10, HP-20, CHP-2O, H-50 /výrobky Asahi Chemical Industry Co., Ltd./. Roztok obsahující trehazolin a/nebo 2-amino-4-/hydroxymethy l/23
-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triol se nechá projit pres adsorpčni vrstvu obsahující jednu z těchto dalších adsorbenciiz jak popsáno shoraz takže se buď zachytí nečistoty adsorbenciem a tak se odstraní, nebo se zachytí žádaná sloučenina a regeneruje se elu-
rozdělovaci chromatografií na sloupci používající Avicsl /výrobek Asahi Chemical Industry Co.z Ltd./ nebo Sephadex LH-2Q /výrobek Pharmacia lne./; nebo vysokovýkonnou kapalinovou chromatogrsfi i užívající normální, v reversní fázi nebo iontoměr.ičový sloupec.
5-amino-1-/hydroxymethyl/cyklopentan-1,2,3,4-tetraol, sloučenina /1/ tohoto vynálezu a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5zózóa-tetrahydro-4H-cyklopent[d]ox3zol-4,5,ó-triol, sloučenina /11/ tohoto vynálezu, se mohou vyrobit hydrolysou trehazolinu vyrobeného jak bylo shora popsáno.
Tato reakce se výhodně uskutečni v přítomnosti kyseliny a musí se provést za přítomnosti vody. Neexistuje žádné určité omezeni, pokud jde o povahu užité kyseliny, a jakákoli kyselina běžně užívaná pro běžně nydrolyssčni reakce se zde může rovněž použit. Příklady zahrnuji takové anorganické kyseliny, jako jsou kyseliny chlorovodíková nebo sírová a takové organické kyseliny, jako jsou kyselina octová nebo propicnová ve vodném roztoku. Výhodnou kyselinou je kyselina chlorovodíková.
ty
- ><tak<z .
Reakce se může realizovat v širokém rozmezí teplot a přesná reakčni teplota není pro vynález kritická. Obecně je vhodné provést reakci při teplotě od asi teploty místnosti do 120 °C, mnohem výhodněji od 90 °C do 100 °C. Čas požadovaný pro reakci může se /r-ovněš/ široce měnit, v závislosti na faktorech, zejména na reakčni teplotě a povaze použitých reag enc i i a rozpouštědla a jak vysvětleno níže na požadovaném produktu.
Bude ohodnoceno, že jak 5-amino-'Í-/hydroxymetnyl/cyklopentan-1,2,3,4-tetr50l, tak 2-smino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6z65-tetrahydro-4H-cyklopentCdIoxazol-4,5,6-tricl, jsou při praveny ze stejného výchozího materiálu, s užitím stejné hydrolysačni reakce. V souhlasu s tím obecně produkt bude obsahovat směs dvou sloučenin. Avšak je možné upřednostnit výrobu jedné z těchto sloučenin nsd druhou, vhodným výběrem reokónich podmínek. Tak obecně mírnější podmínky budou upred nostňovat výrobu 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,ó,óa-1 et rahyc'ro-4H-cyk topen t [dj oxazo 1-4, 5,ó-t rio lu, zatímco mnohem přísnější podmínky usnadňuji výrobu 5-emino-1-/hydroxvmethyl/cyklopentfln-1,2,3,4-tetraolu.
V souhlasu s tím pro výrobu 2-amino4-/hydroxymcthyl/-3a,5,ó,óa-tetrahydro-4K-cyklopentCd]oxszol-4,5,ó-triolu se dávě přednost užiti relat i vně mi rnějšiho kyselého reagens, například 0,2N vodné kyseliny chlorovodiková a reakce se výhodně ponechá probíhat po období od 1 hodiny do 2 dnů, mnohem výhodněji od 5 do ó hodin.
Na druhé straně, přimět reakci, aby šle převážně cestou výroby 5-amino-1-/hydroxymethy1/cyklopentan-1,2,3,4-tetrsolu, je výhodné užiti silnější kyseliny jako 4ι·ΐ vodná kyselina chlorovodíková a průběh reakce nechat probíhat v období od 1 hodiny do 2 dnů, mnohem výhodněji od 20 do 24 hocin.
2£ takiL
Nadto se 5-amino-1-/hydroxymethyl/cyklopentan-1,2,3,4-tetrao l může vyrobit hydrolysou 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,6'a-tetrahydro-4H-cyklopentCd]oxazol-4,5,ó-1ri o lu. V tomto případě hydrolysačni reakce podle vynalezu se může uskutečnit v přítomnosti kyseliny ibo zásady. Není z ódné ur »·* X *· h omezeni v provozu užitě kyseliny nebo zásady -z jakákoli nebo zásada běžně užívaná v hydro tys ačr. i c h rs se zde může /r o v n použit.
kyselina
Kde je pro reakci užita kyselina, příklady vhodných kyselin zahrnuji: anorganické kyseliny jako iscu kyseliny ha logenovodíkové /například chlcrovodiková, bromovcdiková nebo jodovodíková kyselina/ kyselina sírová, kyselina chloristá, kyselina fosforečná a kyselina dusičná; organické karboxylové kyseliny, jako jsou nižší alkanoické kyseliny /například kyselina mravenčí, kyselina octová, kyselina štavelová nebo kyselina tri— fluoroctová/; nižší alkensulfonove kyseliny /například kyselina methansulfonová, ethansulfonová nebo trifluormethansulfonová/; arylsulfonové kyseliny /například kyselina benzensulfonová nebo p-toluensulfonová atdv/. Výhodnými kyselinami jsou anorganické kyseliny, zejmens kyselina chlorovodíková.
Obecně se reakce uskutečni výhodně a normálně v přítomnosti rozpouštědla. Nejsou žádná určitá omezeni v povaze rozpouštědla, jež má být užito, za předpokladu, že nejsou žádná nepříznivé účinky na reakci nebo na uřitá resgencia a že může rozpouštět, při nejmenšim v určitém rozsahu, tato reagencia. Příklady vhodných rozpouštědel zahrnuji: alkoholy, jako methanol, ethanol, propanol nebo butanol; sulfoxidy, jako dimethylsulfoxid, nebo sulfolan; organické kyseliny, zejména mastné kyseliny, jako kyselina octová nebo propionová; a voda. Výhodná rozpouštědla zahrnuji vodu a směsi vody s organického rozpouštědla.
-MMnožs tv i užité kyseliny je normálně a výhodně od 1 do 20 mol, mnohem výhodněji od 5 do 10 mol, na mol výchozího materiálu.
Reakce se může uskutečnit v rozsahu širokého rozmezí teplot, a přesné reakčni teplota není kritická pro vynález. Obecné bylo nalezeno, že je vhodně provést reakci při teplotě od asi teploty místnosti do 150 °C, mnohem výhodněji od 90 °C do 110 °C. Čas pozadovaný pro reakci se může také široce měnit, zejména podle reakčni teploty a povaze užitých reagencii a rozpouštědel. Avšak za předpokladu, že reakce se uskutečni za výhodných podmínek uvedených shora, bude dostatečné období od 1 hodiny do 2 dnů, mnohem výhodněji od 20 do 30 hodi n .
Když je pro reakci užita zásada, příklady vhodných zásad zahrnuji anorganické zásady, jako hydroxidy alkalických kovů /například hydroxid lithný, sodný nebo draselný/; hydroxidy kovů alkalických zemin /například hydroxid vápenatý nebo barnatý/; uhličitany alkalických kovů /například uhličitan sodný nebo draselný/ a halogenidy alkalických kovů /například jodid sodný, bromid sodný nebo jodid draselný/; a organické zásady, jako amoniak; alkylaminy /například triethylamin/; a heterocyk l ické aminy /například morfolin, N-ethylpiper i din nebo pyridin/.
Obecně se reakce uskutečňuje výhodně a normálně v přítomnosti rozpouštědla. Není zde žádné určité omezeni v povaze užitého rozpouštědla, za předpokladu, že nemá žádný nepříznivý účinek na reakci nebo na použitá reagencia, a že při nejmenším v určitém rozsahu, může tato reagencia rozpouštět. Příklady vhodných rozpouštědel zahrnuji alkoholy, jako methanol, ethanol, propanol nebo butanol; ethery,jako tetrahydrofuřan
2.Tnebo dioxan; sulfoxidy, jako dimethylsulfoxid nebo sulfolan; a vodu. Výhodná rozpouštědla zahrnuji vodu a .směsi vody a organického rozpouštědla.
Množství přidané zásady je normálně a výhodně cd 0,01 do 10 mol, mnohem výhodněji od 1 co 5 mol, na mol výchozí sloučeniny.
tak<z • o z s a h u teplot a přesná reakční teplota není kritická pro vynález. Obecně bylo nalezeno vhodným provést reakci při teplotě oc asi 0 °C do 120 °C, mnohem výhodněji oc asi teploty mistnosti do 100 °C. Požadovaný čas pro reakci se múž e /p^jar-š-š/ š i roce měnit v závislosti na mnoha faktorech, zřetelně na reakčni teplotě a na povaze užitých reagencii a rozpouštědle. Avšak za předpokladu, že reakce je uskutečněna za shora uvedených výhodných podmínek, bude obvykle dostatečně období od 0,5 hodin do 2 dnů, mnohem výhodněji oc 1 hodiny do 20 hodin.
Žádané sloučeniny vzorců I a II se mohou regenerovat z reakčni směsi konvenčními prostředky běžně užívanými pro odděleni a regeneraci organické sloučeniny, například různé chromatografické techniky, zejména chromatografie na sloupci nebo preparativní chromatografie na tenké vrstvě. Různé možnosti volby byly popsány ve spojeni s oddělením a přečištěním trehazolinu a 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,ó,óa-tetrahycro-4K-cyklopent[d3ox3zol-4,5,6-triolu, když jsou připraveny fermantací a tyto možnosti volby se mohou také použit k odděleni a přečištěni 5-amino-1-/hydroxymethyl/cyklopentan-1,2,3,4-tetraolu a 2-amino-4-/hydroxymetnyl/-3s,5,6,óa-tetrahydro-4H-cyklopent[c]oxazo l-4,5,6-1ri o lu získaného, jak shora popsáno, hydro lysou.
- Μ Sloučeniny tohoto vynálezu, 5-amino-1-/hydroxymethyl/cyklopent3n-1,2,3,4-tetraolu a 2-amino-4-/hydro xymethyt/-3a,5,ó,6a-tetrahydro-4rl-cyklopentCd]oxazol-4Z5z6-1ri o luz každá obsahuje nejméně jeden zásaditý atom dusíku, a tak mohou tvořit adiční soli s kyselinami. Není zde žádna určitá restrikce s povaze těchto soli, s výjimkou, že když jsou zamýšleny pro terapeutické užiti, jsou farmacsuticky přijatelné. Xdyš jsou zamýsleny pro neterapeuti cké použiti, nap ři k led jako meziprodukty v přípravě ostatních a možná aktivnějších sloučenin, dokonce není toto omezení aplikovatelné. Frikletíy takových adiónich solí s kyselinami zahrnují: soli s minerálními kyselinami, zejména halogenvodíkovými /jako kyselina fluorovodíková, bromovodíková, jodovodiková nebo chlorovodíková/, kyselina chloristá, kyselina dusičná, kyselina uhličitá, kyselina sírová nebo kyselina fosforečné; soli s nižšími alkylsulfonovými kyselinami, jako kyselina methansuIfonová, t ri f lu met hansu Ifonová nebo ethansulfonova; soli s arylsulfonovými kyselinami, jako kyselina benzensuIfonová nebo p-tcluensulfonová; soli s karboxy lovým i kyselinami, jako kyselina octová, mravenčí, vinná, š t ave lová, maleinová, jablečná, jantarová nebo citrónová; a soli s aminokyselinami, jako kyselina glutamová nebo asparatová.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu nezbytně obsahu j i ve své molekule několik asymetrických atomů uhliku, a tak mohou tvořit optické isomery. Ačkoli tyto všechny jsou zda vyjádřeny jediným molekulárním vzorcem, tento vynález zahrnuje jak individuální izolované isomery, tak směsi, včetně jejich racemátú. Jsou-ti užity stereospeciτické syntetizační techniky nebo jsou užity opticky aktivní sloučeniny, jako výchozí materiá ty, mohou se přímo připravit individuální isomery; na druhé straně, je-li připravena směs isomeru, indivi duální isomery se mohou získat běžnými rozlišovacími technikami.
5-a m i no-1-/hydroxymethyl/cyklcp entan-1,2,3,4-te’crsol má schopnost inhibovsfc aktivitu beta-glukosidasy a má nízkou toxicitu a proto múze být očekáváno, že bude užitečný v léčeni s profylaxi tumoru o ΛΣΰ3. S-amino-4-/' hyd roxymet hy 1/-3 a,S,ó,áa -tet rahyd ro-4H-cyk topen tLd]oxazo 1-4,5,ó-triol má schopnost inhibovat aktivitu sacharosy a má nízkou toxicitu a může proto být očekáváno, že bude užitečný v léčení a profy l axi diabetu a obesity.
Když jsou tyto sloučeniny určeny k terapeut i ckemu užití, mohou být aplikovány samostatně nebo ve vhodném farmaceutickém pří obsahujícím vedlo aktivní sloučeniny jednu nebo více konvenčních ředidel, nosičů nebo vehikulí. Povaha přípravku bude ovšem závislá na zamýšlené aplikační cestě. Avšak pro orální cestu, sloučenina je výhodně upravena jako prášky, granule, tablety nebo kapsle. Pro parenteralní aplikaci jsou výhodně př i p rav eny jako injekce. Tyto přípravky se mohou připravit podle známých způsobů, přidáním takových přídavných látek,jako jsou vehikula, pojivá, desintegračni činidla, lubrik ar. cia, stabilizátory a korigencia. Ačkoli s a dávkováni může měnit v závislosti na symptomech a věku pacienta, povaze a závažnosti nemoci nebe poruchy a cestě a způsobu aplikace, v případě orální aplikace dospělému člověku, sloučeniny podle vynálezu se mohou normálně aplikovat v denní dávce od 1 do -jjbo 0 mg. Sloučeniny mohou být aplikovány v jedné dávce nebo v rozdělených dávkách, například třikrát cenně.
so
P ř i k l adx_gro veden Rvyná l ezu
Výroba sloučenin podle tohoto vynálezu je dále objasněna v následujících neomezujících příkladech.
Přikladl
Výroba ferehazolinu
1/A/ Kultivace
Plná očkovací klička Mi c romono s po r a s p. SAN;< ó 2390 se užije k inokulaci každého ze tri 500 ml crlenmeyerovýc h lahvi, všechny jsou opatřeny přepážkovými destička mi a každá obsahuje mécium 1 /mající níže uvedeno složeni/ a inckulovaně lahve se inkubuji při 2S °C 216 hodin na rotačním třepacím pnstroji, rotujícím rychlosti 220 otáček za minutu, k poskytnuti prvé očkovaná kultury.
Medium 1 :
g lúkos a g lycerin ovesná mouka socha ros a sojová mouka v I 4«
0,5
1,0
2,0 c es ami nově kyseliny 0,5 stlačené kvanics 1,0 í
C3442 0,01 2 voda do 1 00 ’í /pK 7,0 před sterilizaci/.
Procenta jsou hmotnostní, založená na konečném objemu media.
-XKaždá ze čtyř 2 litrových Erlenmeyerových lahvi každá obsahující 800 ml me^ia 2 /mající níže specifř kované složeni/, byla inokulována 40 ml kultivační kutiny z prvých lahvi, a lahve byty třepány při 28 96 hodin na rotačním třepacim přístroji, rotujícím t eo „ rychlostí 220 otáček za minutu, k poskytnuti drun<
očkované kultury. 1,5 litru tát ry se užije k i n o k u l a c i každého ze cvou 3-0 litrových nádob kvasných přístrojů, každý obsahující 13 litrů média 2 /mající níže specifikované složeni/, k' bylo nejprve sterilizováno při 120 °C 35 minut zeno na 28 °C. Kvasné přístroje se promíchávají rychlosti 100 otáček za minutu při 28 °C 9ó hodin s provzdušňovánira proudem vzduchu 15 litrů za minutu.
ere a c h l a
Medium 2:
glukosa -i c/ c Λ
rozpustný škrob 1 *í
stlačené kvánice 0,9 ’í
masový výtažek
/Kyo ku t o/ 0,5 ’í
po lypepton 0,5 %
NaCl ne*/ uz J /·
CsCO^ 0,3 íí
C3442 0,01
voda do 100 %
/pH 7,2 před sterilizaci/
Procenta jsou hmotnostní založená na konečném obj emu med i a.
/3/ Regenerace kg Celite 545 ka pro výrobek Johns ke 30 litrům celkové filtrační pomůcky /obchodní ManvilleProducts Corp./ se kultivační tekutiny získané známpřidá jak
-Xshora popsáno a směs se filtruje. 29 l filtrátu se nechá projit pres sloupec obsahující 6 litrů Dowex S3R-P /Cl/ /obchodní značka výrobku Dow Chemical/. pH eluátu se potom upraví na hodnotu 5,0, potom se roztok nechá projit přes sloupec obsahující 6 litrů Dowex 50wX4 l H / /obchodní značka výrobku Dow
Chemical/. Trehazolin se adsorb se z a c r potom sloupcem. Sloupec se promyje 20 litry d ei on i sovan s vody a/p^Ýse eluuje 50 litry 0,5ři vodného amoniaku, čimž vznikne 13 litrů aktivních frakci. Celek tohoto eluátu /13 litrů/ se koncentruje odpařením za sníženého tlaku a lyofylizací k získáni 43,4 g surového prášku obsahujícího trehazolin. Surový prášek se rozpustí ve 2 litrech 10 mtf pufrového roztoku mravenčanu amonného /pH ó,0/ a roztok se adsorbuje na sloupec obsahující 1,5 litrů Dowex 50WX4 /obchodní název/, který byl předtím ekvilibrován 20 mM pufrovým roztokem mrsvenčanu amonného /pH ó,0/. Sloupec se promyje 3 Litry stejného 20 mí-1 pufrového roztoku mravenčenu amonného, potom 2 litry deionosované vody a potom se eluuje 0,2N vodným amoniakem. Eluát se frakcionuje v 500 ml porcích. Frakce 2 až 4, které obsahuji prakticky všechen trehazolin se smísí a koncentruji odpařením za sníženého tlaku. Produkt se /p-a4< lyo f ili zuj e, čimi vznikf2,55 g surového prášku. Surový prášek připravený opakováním stupňů do tohoto bodu se přímo užije bez dalšího přečištěni v přikladu 3.
Tento surový prášek adsorbuje na sloupci naplněném 200 ml Avicelu /obchodní známka pro výrobek Asahi Chemical Industry Co., Ltd./ s použitím S0 Jí objem/objem vodného acetonitrilu. Sloupec se promyje 700 ml 80 Jí objem/objem vodného acetonitrilu a/b-a-kyse nejprve eluuje potom 500 ml 75 % objem/objem vodného acetonitrilu a pobom
700 ml 70 Jí objem/objem vodného acetonitrilu. Eluát se frakcionuje v 19 porcích. Frakce 35 až 50 obsahující trehazolin se smísí a koncentruji se odpařením za
-Xsníženého tlaku. Zbytek se pak lyofilizuje, čímž vznikne 653 mg prášku. Všechen tento prášek se rozpustí ve 150 ml vody a pH výsledného roztoku se upraví na hodpotom notu 6,0. Roztok s e/ρ-α·γ ads o rbu j s na sloupci naplněném . 3 00 ml Amberlite C G - 5 0 /H+ :ř<H= 2:3, obchodní známka/.
sloupec
T .» Λ · · J5 Λ .i I·’ <* '· V 11 I .· s i i - v v ‘J / se f r ·a k * i o n t potom on purrovíno roztoku mravencanu amonneno i,0/ a výsledný roztek se adsorbuje na sloupe y
vej22 ml porcích. Frakce 9 2 až 121 obsahující trehazo se smisi a koncentruji odpařením za sníženého tlaku. Výsledný zbytek se/p-frkf lycf i lizuj e, čímž vznikne
102,8 mg prášku. Všechen tento prásek se rozpustí v
0 m l /pH naplněném 400 ml Di-sion CHP2GP /obchodní známka pro výrobek Mitsubishi Kasei Co./, s použitím stejného mM puf rováho roztoku mravenč anu amonného . Ξ luát se frskcionuje v 5 ml porcích. Frakce 50 až 73 obsahující trehazolin se smisi a koncentruji se odpařením za sníženého tlaku. Výsledný zbytek se lyof i li zuje, čímž vznikne 13 mg prášku, který se dále čistí eluci přes Sision CHF20P s použitím stejného 2 mM pufrevého rozteku mravencanu amonného jako eluens, čímž vznikne ó,2 mg bezbarvého prášku.
potom to prásek se přečistí preparativni c h r o m a i o g r a jak dále uvedeno, 6,2 mg prášku aplikuje se na 'Ti / .
břlb, 2u:
;3 /objemově/ acetof i i na c en;< e vrstvě, se rozpustí v malém množství vody .
siliksgelové destičky /Merck Art Destičky se vyvinou se směsi 6:
nitrilu, kyseliny octové a vody ns výšku 15 cm. Svazek mezi Rf 0,42 a 0,5 se odškrábe z destiček a naplní se do sloupce. Sloupec se eluuje 100 ml deionisované vody. cluát se nechá projit přes sloupec obsahující 5 ml Dowexu 50UX4 /H /, kde se trehazolin adsorbuje a tak se zadrží. Sloupec se promyje deionisovanou vodou a /p^y potom se eluuje 50 ml 0,5N vodného amoniaku. Eluát se koncentruje &ř
- >rodparenim za sníženého tlaku a výsledný zbytek se lyofilizuje, čímž vznikne 5,1 mg trehazolinu jako bezbarvého prášku, pro který vysokotlaká kapalinová chromatcgrafia ukazuje jediný peak.
Produkt má následující vlastnosti:
1. Povaha a vzhled: zásaditý bezbarvý prášek.
2. Rozpustnost: rozpustný ve vodě a methanolu, n ercz pus trsy v acetonu a ch lo ro for mu.
3. uarevný test: positivní na kyselinu sirovou.
4. Molekulární vzorec: -H_Q^θ.
5. Molekulární hmotnost: 3óó /určeno FAS-hmotnostni spektroskopie - FA3 je Fast/rychléZ-AtomovéSomba rdment/bombardováni/.
6. Specifická rotace: [*K;5 + 99,5^ /c = 0,41, H,0/.
7. ultrafialové absorpční spektrum: λζ nm /S^'* /, max i c m ' ultrafialové absorpční spektrum měřené ve vodě nevykazuje žádná charakteristická absorpční maxima nad 220 nm.
8. Infračervené absorpční spektrum: J cm”' /v K3r/, y/ y/ y/ y \7 ίΠ g X
3Í3Ó7, 2J933, 1J663, 1Ϊ55 2, 1E34 a 1J056.
9. H-nukleárr.i magnetické resonar.ční spekt rum : <f ppm, 1 Η-nukleárni magnetické resonančni spektrum /400 MHz/ bylo měřeno v deuterium oxidu, s užitím TM5 /tetramethy l si l anu/ jako externího standardu a vykazovalo následující signály:
3&
3,22 /1H, dublet dubletů, J = 8, 98 a 10,31 Hz/,
3,33 /1 H, muItiplet, J = 2, 44, 5 Z 26 a 10,31 Hz/
3,46 /1H, dublet dubletu, J * 3, 98 a 9,99 Hz/,
3,53 /1H, dublet, J = 11,96 Hz/,
3,55 /1H, dublet dubletu, J = 5, 26 a i - Z1 1 -i, c l Hz/,
3,57 Z1H, dublet dubletu, J = 5, 3 3 3 a o o z , .· z Hz/,
3,62 /1 H, dublet dubletu, J — £ z / · 44 4¼ 3 * -z , — > » · _ t t
3,63 /1 H, dublet, J = 11,96 u-> / ·♦<-' z
3,77 /1H, dublet, J = 4,39 Hz/,
f ·“ —. S- z U i /1H, dublet dubletu, J — čz u c 2 39 Hz/,
4,17 /1 H, dublet, J = 3,55 Hz/,
4,77 /1H, dublet dubletu, J = 2, 03 a 8,55 Hz/,
5,15 Z1H, dublet, J = 5,33 Hz/ .
spektrum: <? ppm, spektrum /100 použitím t et ra a vykazovalo u,1, 30,3,
C-nukleárni magnetické resonsnčni 1 * 'C-nuk leárni magnetické resonanční MHz/ bylo měřeno v deuterium oxidu, s msthylsilanu jako externího standardu následující signály:
60,7, 61,9, 69,6, 69,9, 72,0, 73,0, 30,6, 32,3, 37,3 a 161,1
t ers In c . / ,
lová 210 nm;
byl pozorován
11. Vysokotlaká kapalinová chromatografie:
sloupec pro odděteni: Senshu Pak ODS-H-2151 /Senshu Scientific Co./ 6á x 150 mm /S^u/; mobilní fáze: 10 % /objem/objem/ acetonitril-vods obsahující 0,5 % PIC 23 /výrobek í J ? *- rychlost proudu: 1,5 ml/minutu;
monitorovaná vlnová délka: ultrafič peak mající retenční čas 6,9 minuj při teplotě sloupce 25 °C,
12. Chromatografie na tenké vrstvě:
Rf hodnota:3,44
Adsorbent: silikagel na skleněné destičce /Merck Art 5715/, vyvíjející rozpouštědlo: 6:1:3 /objemově/ směs acetonitrilu, kyseliny octové a vody.
Proklad 2
Výrowa 5-amino-1-/hydroxymethyl/cyklopentan-1, 2^3,4·
-t et ra\i lu
Roz^pk 19,3 mg trenazolinu /připraveného jak popsáno v př\kladu 1/ rozpuštěného v 1 ml 4íy vodná kvsesa umísti do ampule f hydrolysuje o, líny chlorovodíková se zahřívánim\př i 100
C 24 hodin. Na k/onci této doby se reakčni smě^. smísí s vodou a potosr se koncentruje do sucha odpařeném za sníženého tlak/. Zbytek se opět smísí s vodou a koncentruje do such4 odpařením za sníženého tlaku k odde^s t ilováni kyse/iny chlorovodíková. Zbytek z táto destil\ce se rozpu/stí ve 20 ml vody a pH roztoku se upraví ó,0. V/sledný roztok se nechá projit přes sloupec 20 rel Amb/érlitu CH-50 /NH^/
- obchodní známka - a slcupax se promyje 60 ml deionisovaná vody a pak se elu/je 0,2N vodným amoniakem. Eluát se koncentruje odpa/e\im za sníženého tlaku a zbytek se lyo f i l i zu j e, i/i mž vynikne 5,1 mg nečistého 5-ami no-1-/hydroxymethy1/cy k lo\en t an-1,2,3,4-tetraolu jako bezbarvého prás/u.
Celý /5,1 mg/ nečistého práškh5-anino-1-/hydroxymethyl/cyklopenten-1,2,3,4-tetraolu\zi s kan ého jak shora popsáno, se rozpustí v malém množství vody a přečisti se pomoci preařarativní chromafcografie\na tenké vrstvě, jak dále uve/eno. Roztok se aplikuje na\dvš silikagelové destičky /Merck Art 5715, 2C χ 2G cm/ a vyvine se s užitím /:1:3 /objemově/ směsi acetonitrilu, kyseliny octové a/vody až do výšky 15 cm. Svazek me\i Rf 0,3ó a 0,47/se odškrabe z destičky a naplní se d\sloupce, který/se pak eluuje 50 ml deionisovane vody. e^uát se neci/a projit pres 10 ml Amberlitu CG-50 /NHV, Sfsmino-1//hydroxymethy 1/cyklopentan-1 ,2,3,4-tetraol se >adsor ije na sloupci. Sloupec se pak promyje 50 ml deiοητφο38 sMané vody a eluuje 50 ml 0,2N vodného amoniaku. Elyát s\ koncentruje odpařením za sníženého tlaku a lyoyilizuve, čimž vzniknou 5 mg žádaného 5-amino-1-/hyd/oxymetn\\l/cyk lopentan-1, 2,3,4-tet rao lu jako bezbar/ého prašku\ .který má následující vlastnosti:
ar^ a vzhled: zásaditý bezbarvý praš:
rozpustnost: rozpustný ve vodě, nero/pustný v aceconu\\a chloroformu.
\
Darevný test: positivní na ninhy/rinovou reakci
Molekulární vzorec: C,Η„τΝ0-.
O i J O
Molekulární hmotnost: 179 /járčeno FAS hmotovou spektroskopii/.
Specifická rotace -3,7 0 /c = 0,51, H_0/ «Sy u z \ *****
Ultrafialové absorpč/i spektrum: λ/ nm /ΞΪ” /: r / \ max i c m, ult/afialove absorpč/í s ae k t rum měřené ve vodě nevykazuje žádná <yna rak t e^r i s t i ck a absorpční maxima nad 210 nm.
Infračerve.né Zosorpčni spektrum: 9-,av /7 K3r/, 33 5 8, 1 ό ó 3 ,A397 a 1 0 ó 6.
9. 1 H-nu k l ae rn i magnetické resonanckii spektrum: <f ppm,
H-nuk/eárni magnetické resonsnčnm spektrum /400 Hz//bylo měřeno v deuterium oxidu\ v použitém tefrramethyIsilanu jako externího standardu a vyazovalo následující signály:
Příklad 1
Výroba 2-anino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,ó,óa-tetrahydro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,6-triolu jak popsáno v m g tetrazo· i uu g surověno prasku pnpravenehi přikladu 1 a obsahujícího stanovených ; linu se rozpustí ve směsi 100 ml vody a 150 ml 4N vodné kyseliny chlorovodíkově a pH výsledného roztoku se uprav i na hodnotu 2,5 přidáním 4N vodné kyseliny chlopotvrri rovodikové. K roztoku se/pa-ty přidá 8 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a 72 ml vody k upraveni celkového objemu na 430 ml a poskytnutí koncentrace kyseliny chlorovodíkové 0,2N. Výsledný roztok se umísti do lahve potom s kuta tým dnem a. pi-arkf ss hydrolysuje na olejové lázni
Ί&potc>m udržované na 100 °C po šest hodin, Na konci tohoto ob“ dobi se reakčni smis smisi s vodou s se koncentruje do sucha, odpařením za sníženého tlaku. Sled smísení s vodou a koncentrace odpařením do sucha se opaku je k oddesti lováni kyseliny ch lorovodi kové. Zbytek se ' rozpustí ve 400 ml vody a pH roztoku se upraví na hodnotu ó,0 přidáním 1N vodného roztoku h y d r o xido sodného. Roztok s ezředí vodou na objem o litrů. Výsledpbtonj ný roztok se nechá projit přes sloupec naplněný 600 ml Amberlitu CS-5C /NH*/ a sloupec se promyje ó litry *Ť deicnisovanó vody a potom se eluuje G,5N vodným amoniakem. cluát se koncentruje odpařením za sníženého tlaku na objem 2CQ ml a koncentrát se nechá projít přes sloupec naplněný 000 ml Dowexu '1x2 /OH /. Sloupec se potom eluuje deionisovanou vodou. Potom co se prvých
1,5 litru eluatu odstraní, následující eluát se řrakcionuje ve 20 ml porcích, každá frakce byla změřena níže popsanou kvantitativní analýzou k určeni, zda obsahuje žádanou sloučeninu, frakce 70 až 'i 10, které obsahuji tuto sloučeninu, se smisi a koncentruji odpařením za sníženého tlaku. Zbytek se lyofilizuje, čimž vznikne 30 mg 2-aminc-4-/hydroxymethyl/-3s,5,6,ó5-1etrahydro-4H-cyklopent[d]oxazo1-4,5,6-1ri olu jako bezbarvého prášku majícího následující vlastnosti:
3a rva a vzhled: zásaditý bezbarvý prášek.
Rozpustnost: rozpustný ve vodě, nerozpustný v acetonu a chloroformu.
3. Molekulami vzorec: Ο-,Η^Ν^Ο^.
4. Motekulárni hmotnost: 204 /určeno fAS-hmotovou spektroskopii/.
r 'ΐ
5. Specifická rotace: Mjs /c - 0,51, KgO/.
-X1 e/
6. Ultrafialové absorpční spektrum: λ nm /Ξ* /, max 1cm ' ultrafialové absorpční spektrum měřené ve vodě nevykazuje žádná charakteristická absorpční maxima nad 21 Q nm.
_ Ί
Infračervsne absorpční spektrum: cm ’ /v > o , U , ^0 í, O , ’ ύ 5 0 0.
'H-nukleárni magnetické resonančni soektrum: efcpm, 1
H-nukleárni magnetické resonančni spektrum /500 MHz/ bylo měřeno v deuterium oxidu, s užitím T3F /trimethylsilylpropionát sodný/ jako vnitřního
s t and a r du a vykazovalo následující
3,73 /1H, dublet, J - 11,72 Hz/,
3,82 /1 H, dublet, J = 12,21 Hz/,
3,97 /1 H, dublet, J - 4,4 Hz/,
4,23 /1 H, dublet dubletu, J = 4,4
4,37 /1 H, dublet, J = 3,79 Hz/,
5,03 /1 H, dublet dubletu, J - 8,79
Vysokotlaká kapalinová chromatografie:
Sloupec pro odděleni: Asahu Pak ES-502C /Asahi
Chemical Industry Co., Ltd./, mobilní fáze: 20 mř-í octan amonný /pH 8,5/ + mM vodný roztok chloridu sodného, rychlost proudu: 1 ml/minutu, monitorovaná vlnová délka: ultrafialová 210 nm, teplota: 25 °C, retenční čas: 8,39 minut.
Kvantitativní analýza 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,ó,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[d]ox3Zol-4,5,6-triolu použitím plynové chromatografie/hmotové spektrometrie
Shora referovaná kvantitativní analýza byla provedena takto:
Vzorek se rozpustí v rozpouštědle /vodě/ známého objemu kapaliny. lO^ul výsledného roztoku se umístí v
-anino-1-deoxy-bsta-O-glukosa/ a směs se rozpustí ve 1QG/UI ethylacetátu k přípravě testovaného vzorku pro analýzu plynovou chromatografií/hmotovou spektroskopii. Analýza se provede s použitím kapilárního sloupce z taveného křemene /výrobek J & y Scientific Co.z 03-5, 15 metrů/ jako sloupec pro plynovou chromatografii. Testovni vzorek /2.ul/ se injikuje a tepQ * O lota sloupce se zvýši z óG C na 280 C rychlosti 25 C/minutu. Negativní ionty se detekuji chemickou ionisační metodou s použitím plynu methanu s čtyřpolohovým hmotovým spektrometrem Trio-1 /výrobek VS/. Negativní ionové peaky při m/z 383 /odpovídající vnit nímu standardu pentaacetylové sloučeniny/ a m/z 413 /odpovídej ici pentaacetátu 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3az5z6zóa-tetrahydro-4H-cyklopent[d]ox3zol-4z5zó-triolu/ se užiji ke kvantitativní anatýze. Obsah 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3az5zózóa-tetrahycro-4H-cyklopent [d]oxazol-4z5Zó-1riolu se vypočte metodou vnitřního standardu.
kO
-XPřiklad 3
Výroba 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,ó,6a-tetrahydro-4H-cyklopent{d]oxazol-4,5,6-triolu ! A/ Kultura
Smyčka odebraná ze šikmého agaru kultury Amycolatcpsis sp. S.\N;< Ó0791 se užije k inokulaci každé ze dvou 500 ml Erlenmeyerových lahvi, každá je opatřená přepážkovými destičkami a obsahuje 30 ml media 1 /složeni je uvedeno shora v přikladu 1 / a inokulo vane lahve se inkubuji při 23 °C po 96 hodin na rotačním třspacim přístroji, rotujícím rychlosti 210 otáček za minutu, k poskytnuti naočkovaného kultivačního media.
Dvě 30 litrově obsahující 15 litrů shora v přikladu 1/ Potom se chladí na váného kultivačního nádoby kvasných přístrojů, každá media i /majícího složeni uvecene se sterilizuji při 120 °C 30 minut. 23 °C a i no ku tuje se 75 ml naočkomedia do každé nádoby kvasného přístroje. Nádoby kvasných přístrojů se pak promíchávají při 2S °C rychlosti upravenou v rozsahu od 100 co 400 otáček za minutu /aby bylo udrženo 2 ppm rozpuštěného kyslíku/ po 144 hodin a s aerací proudem vzduchu 7,5 litru za minutu.
/ 3 / Regenerace
K 25 litrům celého kultivačního me^ia tziskaněho jak popsáno v části /A/ shora] se přidá 1,5 kg Celíte 545 filtračního pomocného prostředku a směs se filtruje a poskytne 23 litrů filtrátu. Hodnota pH filtrátu se upraví na 6,0 přidáním vodné kyseliny chlorovodíkové a roztok se nechá projit přes sloupec naplněný 3 litry Amoerlitu IRC-50 /NH^/, aby se adsorboval 2-amino-4potom
Μ
-/hydroxymethyl/-3a,5,6, 6a-tetrahydro-4H-cyklopentfdlo x 3 z o 1 — 4,5,6 — t r i o 1. Sloupec se promyje 15 litry deionisované vody a/p-a-fy's e sluuje C,5ři vodným amoniakem. Potem co eluát začal být alkalický, shromáždi se
4,5 litru eluátu a koncentruje se odpařeni- za sníženého ml. a 3 π c e n · r a · se ne·: * a p r o- : i i ! o /» ·? /. Γ í r* Λ w /«. :*· : * ·—. ·-» λ ·> i » v 7 ί Γ*. í4 ·*-»>·· V ·* 3.J >. m \ÍH/ '►«*··» MÍ w w rt *.t « Λ ·< i V · <
a sloupec se iscvancu vosou. rrvyen euu mu eluát se frakcionuje ve 21
Urei se kvantitativní analýzou užívající bud vysokotlakou kapalinovou chřomatografi i, jak bude později popsáno, nebo plynovou chřomatografi i/hmotnestni spektrometrii, že frakce 60 až 93 obsahuji žádaný 2-amino-4-/hydroxymetnyl/-3sz5,6,6a-tetrshydro-4H-cyklopent[d]cxazot-4,5,ó~tricl a tak se tyto frakce smísí a koncentruji se odpařením za sníženého tlaku. Koncentrát se lyofilizuje, čimž vznikne 16,6 mg 2-amino-4-/hydroxymethyl/-33,5,6,és-tetr3hydro-4Hako bezbarvého
-cy k Lepen t [dlox azo1-4,5,6-triolu j prášku, který má shora popsané vlastnosti.
Kvantitativní analýza užívající vysokotlakou kapalinovou c h r o m a t o g r a f i i;
Sloupec prs oddělení:
Asahi pak Ξ3-502C /výrobek Asahi Cherní c o l Industry Co., Ltd./.
Mobilní fáze: 2u m.’i octan amonný /pH 5,5/ + 50 mM chlorid sodný.
Rychlost průtoku: 1 ml/minutu.
Vlnová délka pro detekci: 210 nm.
Teplota: 25 °C.
Retenční čas: S,39 minut !
i i
s
W2.
Kvantitativní analýza užívající plynovou chromatografii/ hmotnostní spektrometr!i
Shora referovaná kvantitativní analýza se provede v podstatě stejnými postupy, jak přikladu 3 .
sou popsaný v
Přiklad 4
Výroba 2-ámir.o-4-/hydroxymethyl/-3a,5,6,óa-tatrahydrc· -4H-cyklocent[d]ox3zol-4,5,6-triolu /A/ Kultura šikmý agar kultury Micromonospora sp. SANK 62390 se hcmog e,-i i zuj e v 10 ml fyziologického roztoku chlor i du sodného, aby vznikla suspenze. 1 naočkuje do každé ze dvou ?. litrových lahvi, každá je opatřena přepážko/ý.ni každé o bsáhuje 5 3 0 ml media 3 /majíc i složení/ a inokulovaně lahve se «ni suspenze se črlsnmeyerových »J e s c i c x a π i a níže uvedené o „ hodin, na rotačním třepacím přístroji, rotujícím rychlosti 310 otáček za minutu, k přípravě prvého na... / ocxováného kultivačního media.
Med i um 3 :
glukosa kvasnicový extrakt / D i f c o / po typep ton
0,5
0,5
C a C 0 0,1 *í o '
C3-442 0,01 ?í voda do 1 00 li /pH 7,2 před sterilizaci/
Procenta jsou hmotnostní, založena na konečném objemu media.
Μ
V 60 litrové nádobě kvasného přístroje se umísti
Poíom 30 litru media 3 a sterilizuje se při 120 °C 30 minut. /Pa-!/ se ochladí na 2S °C, a 600 ml prvého naočkovaného média se do něj naočkuje. Kvasný přistroj se promíchává rychlosti 165 otáček za minutu při 23 °C 43 hodin s aerací proudem vzduchu 13 litrů za minutu k v ytv o ření druhého kultivačního média.
Pobom 630 litrový tank obsahující 30u litrů .média 4 /o složeni uvedeném níže/ se sterilizuje při 120 C 35 minut. se chladí na 23 °C a 15 litrů druhého kultivačního media se do něj inokuluje. Tank se potom Λ promíchává při 23 C rychlosti upravenou v rozsahu cd 32 do 142 otáček za minutu /aby se zachovaly 2 ppm
'· -s rozpuštěného kyslíku/ po 144 hodin s aeraci proudem vzduchu 153 litrů za minutu a vnitřním tisku 3,5 k g / c m . i'lSC 1 USi 4 J glukosa 3 ;í /předtím sterilizovaná při 1 20 °C po 15 minut/ ★ Lustergen FK 2 % stlačené kvasnice 1,3 % mastný extrakt /Kyokuto/ 1 'í polypepton 1 « NaCl 0,5 % CaCO, 3,3 i/ U Q Λ n *! C e.· I\ —, Π 1 W , \J Λ Z.J /9 C 4 C 3 - 4 4 2 3 , 0 2 Ji voda do 130,0 % /pH 7,2 před sterilizaci/. obchodní název pro druh škrobu prodávaný Nichiden Kagaku Co. Ltd.
Ph
- X /3/ Regenerace
Přidá se 15 kg Celíte 545 filtračního pomocného prostředku ke 300 litrům celkového kultivačního media připraveného jak shora popsáno a smis se filtruje, aby vzniklo 290 litrů filtrátu, pri 20 litrů filtrátu se upraví na hodno tu ó,0 přidáním vodné kys eli ny c hlo rovodikove. Výsledný roztok se nechá projit přes sloupec naplněný 3 litry Amberlitu I2C-5G /hH^/ a požadovaný 2-amino-4-/hydroxymeťnyl/-3a,5,6,óa-tetrahydro-4H-cyklapent[d]oxazo1-4,5, ó-tri oL se zadrží ve sloupci adsorpci. Sloupec se promyje 15 litry deionisované vody a eluuje se 0,5N vodným amoniakem. Potom co se eluát stane alkalickým, 4,5 litrů eluátu se shromáždi a koncentruje se odpařením za sníženého tlaku na objem 150 ml. Koncentrát se nechá projít přes sloupec naplněný 500 ml Oowexu 1x2 /OH / a eluuje se deionisovanou vodou. První 1 litr se odstraní a následující eluát se frakcionuje ve 20 ml porcích. Každá frakce se zkoumá kvantitativní analýzou popsanou v přikladu 3. Sylo nalezeno, že frakce 53 až £0 obsahují aktivní sloučeninu a tyto frakce se smisi a koncentruji se odpařením za sníženého tlaku. Zbytek se lyofilizuje, čímž vznikne 9,ó mg 2-amino-4-/hydroxymethyl/-3a,5,ó,6a -tetrahycro-4H-cyklopent[d]oxazol-4,5,ó-triolu jako surový prásek. Prášek se opět přečisti chrometografii na sloupci, s užitím sloupce naplněného 10Q ml Oowex 1x2 /QH / eluovánim deionisovanou vodou, čímž vznikne
4,8 mg 2-amino-4-/hydroxymefchy1/-3 a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent[dloxazo1-4,5,ó-tri olu jako bezbarvého prášku s vlastnostmi, jež byly v předchozím popsány.
po hory] potom potom potom
Přiklad J té
->8ŮVý roba 5-aminc-1-/hydroxymethyl/cyklopentan-1, 2,3,4-tetraolu
Roztok 1ó mg prášku 2-amino-4-/hydroxymethy l/3 a, 5,6,6a-tetrahydro-4K-cyklopent[d] oxazo1-4,5,6pus t ěného ve 2 ml 6N vodné kyseliny ch Ιοί i a se hydro lysuj e zahřivánim na 100 'C po 24 hodin. Ma konci této doby se k hydrclysátu přidá voda a výsledná směs se končentruje do sucha, odpařením za sníženého tlaku k odstraněni kyseliny chlorovodíkové, výsledný zbytek rozpustí ve 2G ml vody a pn roztoku se upraví na 6,0 přidáním 1M vodného roztoku hydroxidu sodného. Roztok se nechal projit přes 20 ml Amberlitu
CG-5G /Mřít/ k zadrženi 5-amino-1-/hydroxymethyl/cyklopentan-1,2,3,4-tetraolu adsorpcí a sloupec se pro· myje 6G ml ceionisované vody a se eluuje C>, 2N vodným roztokem amoniaku. Sluáfc se koncentruje odpařením za sníženého tlaku, aby se získalo 5 ml koncentrátu. Tento koncentrát se umísti na sloupec naplněný 50 ml Dowexu 1x2 /OH / a sloupec se promyje 2GQ ml ceionisované vody a/p^/se eluuje 20 ’í objem/objem vodným methanolem. Sluáfc se frakcionuie v 5 ml porcích. Frakce 5 až 23, které vykazuji inhibiční aktivitu proti beta-glukosidase, se smísí a koncentruji odpařením za sníženého tlaku, koncentrát se lyofilizuje, čímž vznikne 6,2 mg 5-aminc-1-/hydroxymethyl/cyklopenfcen-1,2,3,4-tetraolu jako bezbarvého prášku majícího shora popsané vlastnosti.
rovcoikova se uzavře v ampul o
Testovní přiklad 1
Siologická aktivita
Inhibiční aktivita 5-a mino-1-Zhydroxymethyl/cyklo· pentsn-'i,2,3,4-tetraolu proti bet s-g1uko s i das e
Vzorky beta-g lukosidasy /oddělena od mandli/, p-ni t rofenyl-bet a-B-glukopyranos i du, deo xy no ji r i my c i nu a castanospsrminu užité v tomto pokuse byly všechny zakoupeny cd Sigma Chemical Co.
Užité testované 3 loučeninyjby ly S-smino-l-/hydroxymethyl / cyk lopsn t sn-í , 2,3 , 4- t et rao l [sloučenina / I / j a deoxynojirimycin nebo castanospermin, obě jsou známé sloučeniny s tímto typem aktivity.
Směs 0,01 j ednotky/iiil bet o—3 lukosidasy a TQQ^ul roztoku pufru /pH 5,6/ tvořeného 20 mM kyseliny citrohydrogenfosforečnanu sodného a testovanou iC!
nove, 4 sloučeninou se ponechá stát při 3 í 5 mnu:. ří a po ba konci tohoto oocobi se přidá ke směsi pufru obsahujícího 3 mg/ml p-nitrofeny1-beta-B-3 lukopyranosidu, směs se ponechá reagovat při 37 °C 20 minut. i< reakčni směsi se přidá 20,ul roztoku pufru i
Μ glycin/hydroxid sodný ZpH iu,4/ 3 množství uvolněného p-nitrofeno lu se monitoruje absorbanci 'při 405 nm. Tabulka 7 uvádí koncentrace každé testované sloučeniny potřebné inhibovat aktivitu beta-glukosidasy na 50 ?í /IC^/.
Tabulka 7
inhibitor 50% inhibični koncentrace beta-glukosidasy
7,0 , u α/πL
L Ο U - 3 Π 7 Π S / á / c £ ο χ / π c j ' r i ~ y c ί π
C 3 3 ’ 2 Π Ο 5 C C Γ :u 1 Π
Tsstovni přiklad 2
Inhibični aktivita S-srai no-4-/ hydroxyme t hy 1/-3a, 5, é, 5a -tetrahydrc-4H-cyklopentLdJoxazct-4, 5,6-1 ri o lu [sloučenina /21/] proti krysí sacharose řočls metody M. Kesslera et al. [Siochi.mi ca et Siophysica Acta, 50ó, 136/^154 /'1973/] roztok enzymu kartáčového lemu membrány krysího tenkého střeva se připraví z tenkých střev tři krysích samců kmene W i s t a r a suspenduje se ve 3 ai l fyziologického r o z t o k u c h l o r i d u s o d n é h o .
Vzorek 4-aminoantipyřinu /A 4332/ byt zakoupen od Sigma Chemical Co., a vzorky peroxidasy /stupně 1/ a glukosooxidasy /stupně 2 / byly zakoupeny od Soehrinner Marsnhaiiň Co. Roztok pufru /pH ó,2z' obsahující 20 mM kyseliny citrónové o 40 mM hydrogenfosforečnanu sodného se užil jako ředidlo v následujícím pokuse.
K a ž d á jamka m i k r o -1 i t r a č n i d s s k y s 96 j a m k ai /výrobek Falcem Co./ byla naplněna 130^ul celkem, směsi obsahující 0,2 mg hovězího sérového albuminu /Sigma, A 7906/, 3 jednotky g lukosooxidasy, 0,132 jednotky peroxidasy, SQ^ug 4-aminoantipyrinu,
Μ
40^ug fenolu, 3^u mol sacharosy a testovanou sloučeninu. K jamce bylo přidáno 2G/Ul 100 násobně zředěného roztoku enzymu kartáčového lemu membrány krysího tenkého střeva. Smés uvolněné glukosy byla racn i to rována absorbsnci při 492 nm.
;χδ/: enzymová reakce Oyls pro v scéna cej prtsam testovaná sloučeniny = bez přidání enzynoveno roztoku, bylo předpokládáno, že koncentrace glukosy jsou 0 K f<Kp<z(cbťv<2 5 ’ϋΟ ;i inhibice, /peap·/ Koncentrace sloučeniny /11/ potřebná k inhibici aktivity krysí sacharosy o 50 % /IC--/ byla 13,ug/ml.
Z ’-J i
Testovni příklad 3
Inhibični aktivita trehazolinu proti trsbalase bource mc rušového
o pá tého i n stáru
nos t 44 g/ s e h o m o -
dni značka/ homog e-
: / pH 5,6/, připrave-
Deset larev bource morušo\ /larválního stadia/ /celková h ;i genizuje použitím Polytron /obr nisštoru, ve 120 ml roztoku puí ného použitím 23 m’4 kyseliny citrónové a 40 mM hydrogenfosřorečnanu sodného, pc 2 minuty, přičemž se chladí ledem. /Stejný roztok pufru se užije v následujícím postupu/. Komogenisovaná směs s e Ae-k/ poborn 10 minut centrifuguje při rychlosti 6^000 otáček za minutu a supernatant se odděli. Přidá se 240 ml acetonu ke 120 ml supernatantu, přičemž se chladí ledem a michá, a výsledná směs se centrifuguje 20 minut při rychlosti 9^000 otáček za minutu. Sediment se odděli a rozpustí se ve vodě a výsledný roztok se lyofilizuje, čimž vzniknou 2,0 g surového enzymu.
Μ
-X130/Ul shora uvedeného roztoku pufru, 5Q^ul vzor ku roztoku obsahujícího trehazclin v různých koncentr cích a 50/Ul roztoku enzymu bource morušového připraveného jak shora popsáno a obsahující 4 mg,'ml enzymu se umísti do testovnich zkumavek, a směs se t-epe na
Ϊ U - · i*'/ 5 < Z Z C ’ í <J 5 ! · * Z > : 1 «· ·,· · . » — .-i r-. 2 ’ · r* ,
3325 se necna reagovat 15 minut.
zahřívá na lázni s vařící se vodou 3 minuty, potom chladí s l edo vo^vodou ./P-a4y s e centrifuguje 10 minut při rychlosti 3χΰΰ0 otáček za minutu a výsledný roz
Z centrace glukosy.
tok, zbavený sedimentu, se použije ke stanoveni
Reakce se provede použitím glukoso-C-testu /výrobek Wako Fůře Chemical Industries Ltd./ a 1 sobných množství vzorkového roztoku nad množství užívanými ve standardním postupu. Inhioiční rych w a k o u π a íil i l o s t se vypočte z koncentraci glukosy dosažených, když se užije roztok pufru miste roztoku vzorku a když s užije roztok pufru místo roztoku substrátu jako a 10G % inhibice, respektive, koncentrace potřebná inhibovat enzymovou aktivitu o 50 % /1C ς -J byla vypočtena jako 2,0 ng/ml.

Claims (11)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,5a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol a jeho farmaceuticky přijatelné soli.
  2. 2. Způsob výroby 2-amino-4-(hydroxymethyi)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,5-triolu, vyznačující se tím, že se hydrolyzuje trehazolin působením zřéděného.roztoku kyseliny.
  3. 3. Způsob podle nároku 2,vyznačující se tím, že se hydrolýza provádí při použití 0,2N vodné kyseliny chlorovodíkové po období od 1 hodiny do 2 dnů.
  4. 4. Způsob podle nároku 3,vyznačující se tím, že se hydrolýza uskuteční použitím 0,2N vodné- kyseliny chlorovodíkové po období od 5 do 6 hodin.
  5. 5. Způsob výroby 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,5,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triolu, vyznačující se tím, že se kultivuje mikroorganismus rodu Micromonospora nebo Amycolatopsis schopný produkce 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triolu při teplotě 23 až 32 °C po dobu 100 až 190 hodin a 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a, 5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol se oddělí od kultivačního média.
  6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačuj íc í se t í m , že mikroorganismus je kmen druhu, ke kterému patří Micromonospora sp. SANK 62390, FERM BP-3521.
  7. 7. Způsob podle nárolu 6, vyznačující * s e t í m , že mikroorganismus je Micromonospora sp. SANK
    62390, FERM BP-3521.
  8. 8. Způsob podle nároku 5, vyznačuj íc í setím, že mikroorganismus je kmen druhu, ke kterému patří Amycolatopsis sp. SANK 60791, FERM BP-3513.
  9. 9. Způsob podle nároku 8, vyznačující se t í m , že mikroorganismus je Amycolatopsis sp.
    SANK 60791, FERM BP-3513.
  10. 10. Kmen Micromonospora sp. produkující 2-amino-4’ -(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4K-cyklopent/d/-oxazol-4,5,6-triol, SANK 62390, FERM BP-3521.
  11. 11. Kmen Amycolatopsis sp. produkující 2-amino-4-(hydroxymethyl)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-cyklopent/d/oxazol-4,5,6-triol, SANK 60791, FERM BP-3513.
    /Zástupu j-e~y ip-ř^edt.
    -%Γ ^-Název—vynáloau-i—-S-amino 1 (hydroxymethyl)-Ua, 5,6,6a·-totrasý
    P hyd-po-HH-cyklopont/d/oxaaol -^5,6 -trio-L,-/ způsob výroby-a produkční mikroorganismy y pentanovém derivátu, který má schopnost způsobit inhibici účinnosti různých hydroláz cukrů, zejména beta-glukosidázy a sacharázy. Řešení se týká také způsobu výroby této látky, při němž se hydrolyzuje trehazolin při použití zředěného roztoku kyseliny nebo se kultivuje mikroorganismus z rodu Micromonospora nebo Amycolatopsis a produkt se oddělí ze živného prostředí. Řešení se týká také produkčních mikroorganismů /svro-h«/ uvedeného typu.
CS95517A 1991-02-15 1992-02-13 2-AMINO-4-(HYDROXYMETHYL)-3A,5,6,6A-TETRAHYDRO-4H-CYCLOPENT/d/OXAZOLE- -4,5,6-TRIOL, PROCESS OF ITS PREPARATION AND PRODUCTION MICRO-ORGANISMS CZ51795A3 (en)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2197691 1991-02-15
JP13294691 1991-06-04
JP21345091 1991-08-26
JP27241291 1991-10-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ281418B6 CZ281418B6 (cs) 1996-09-11
CZ51795A3 true CZ51795A3 (en) 1996-09-11

Family

ID=27457670

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS95517A CZ51795A3 (en) 1991-02-15 1992-02-13 2-AMINO-4-(HYDROXYMETHYL)-3A,5,6,6A-TETRAHYDRO-4H-CYCLOPENT/d/OXAZOLE- -4,5,6-TRIOL, PROCESS OF ITS PREPARATION AND PRODUCTION MICRO-ORGANISMS
CS92439A CZ281476B6 (cs) 1991-02-15 1992-02-13 Polyhydroxycyklopentanové deriváty, způsob výroby a produkční mikroorganismy

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS92439A CZ281476B6 (cs) 1991-02-15 1992-02-13 Polyhydroxycyklopentanové deriváty, způsob výroby a produkční mikroorganismy

Country Status (20)

Country Link
US (1) US5260447A (cs)
EP (1) EP0499489B1 (cs)
KR (4) KR100226305B1 (cs)
CN (1) CN1043422C (cs)
AT (1) ATE121383T1 (cs)
AU (1) AU653384B2 (cs)
CA (1) CA2061239C (cs)
CZ (2) CZ51795A3 (cs)
DE (1) DE69202075T2 (cs)
DK (1) DK0499489T3 (cs)
ES (1) ES2074332T3 (cs)
FI (1) FI920663A7 (cs)
HK (1) HK117796A (cs)
HU (1) HU214702B (cs)
IE (1) IE71947B1 (cs)
IL (1) IL100955A (cs)
IS (4) IS3815A (cs)
NO (1) NO177589C (cs)
NZ (1) NZ241623A (cs)
TW (1) TW221804B (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1131672A (zh) * 1994-11-22 1996-09-25 生化学工业株式会社 氨基环戊烷衍生物
US5981720A (en) * 1996-09-09 1999-11-09 Wisconsin Alumni Res Found Human salivary proteins and fragments thereof having alpha-glucosidase inhibitory activity
US6770468B1 (en) 1999-09-14 2004-08-03 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Phosphodiester-α-GlcNAcase of the lysosomal targeting pathway
US6537785B1 (en) 1999-09-14 2003-03-25 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Methods of treating lysosomal storage diseases
US6800472B2 (en) 2001-12-21 2004-10-05 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Expression of lysosomal hydrolase in cells expressing pro-N-acetylglucosamine-1-phosphodiester α-N-acetyl glucosimanidase
US6905856B2 (en) 2001-12-21 2005-06-14 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. Soluble GlcNAc phosphotransferase
KR101583080B1 (ko) * 2009-03-12 2016-01-07 엘지전자 주식회사 공기조화장치용 실외기
CN104758275A (zh) * 2015-03-05 2015-07-08 青岛申达高新技术开发有限公司 一种治疗结肠癌的药物组合物及其应用
WO2024197188A2 (en) * 2023-03-21 2024-09-26 Spero Renewables, Llc Production and purification of natural vanillin using new strains of amycolatopsis

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4138562A (en) * 1977-02-09 1979-02-06 The Regents Of The University Of Minnesota Adenosine deaminase resistant antiviral purine nucleosides and method of preparation
US4318562A (en) * 1980-03-03 1982-03-09 Libbey-Owens-Ford Company Grasping apparatus for handling heated articles
CH667649A5 (en) * 1986-09-10 1988-10-31 Lonza Ag 2-Substd. amino-benzoxazole and -benzimidazole derivs. prodn. - by reacting prim. amino cpd. with amine in presence of acid catalyst, useful as intermediates e.g. for pharmaceuticals
JP2529365B2 (ja) * 1988-10-17 1996-08-28 ダイハツ工業株式会社 ワ―クの積込積出装置
CA2028117C (en) * 1989-02-28 2000-08-01 Sawao Murao Substance trehalostatin and process for the preparation thereof

Also Published As

Publication number Publication date
IE71947B1 (en) 1997-03-12
HUT63845A (en) 1993-10-28
NO920555L (no) 1992-08-17
CZ281418B6 (cs) 1996-09-11
DK0499489T3 (da) 1995-08-21
NO177589B (no) 1995-07-10
AU1094792A (en) 1992-08-20
HK117796A (en) 1996-07-12
KR920016401A (ko) 1992-09-24
AU653384B2 (en) 1994-09-29
HU214702B (hu) 2000-03-28
NZ241623A (en) 1993-06-25
CA2061239C (en) 2002-04-09
NO920555D0 (no) 1992-02-13
NO177589C (no) 1995-10-18
CN1043422C (zh) 1999-05-19
KR100230626B1 (ko) 2000-03-15
DE69202075T2 (de) 1996-01-11
DE69202075D1 (de) 1995-05-24
CN1064861A (zh) 1992-09-30
IS4064A (is) 1992-08-16
ES2074332T3 (es) 1995-09-01
FI920663L (fi) 1992-08-16
FI920663A7 (fi) 1992-08-16
CA2061239A1 (en) 1992-08-16
HU9200455D0 (en) 1992-04-28
FI920663A0 (fi) 1992-02-14
KR100226305B1 (ko) 1999-10-15
US5260447A (en) 1993-11-09
EP0499489B1 (en) 1995-04-19
ATE121383T1 (de) 1995-05-15
CS43992A3 (en) 1992-09-16
EP0499489A1 (en) 1992-08-19
CZ281476B6 (cs) 1996-10-16
IL100955A0 (en) 1992-11-15
KR100245477B1 (ko) 2000-03-15
IE920481A1 (en) 1992-08-26
IS3815A (is) 1992-08-16
KR100229257B1 (ko) 2000-03-15
TW221804B (cs) 1994-03-21
IL100955A (en) 1997-03-18
IS4065A (is) 1992-08-16
IS4066A (is) 1992-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4460765A (en) Enzyme inhibitor produced by cultivation of streptomyces microorganisms
FR2555586A1 (fr) Complexe antibiotique bbm-2478
CZ51795A3 (en) 2-AMINO-4-(HYDROXYMETHYL)-3A,5,6,6A-TETRAHYDRO-4H-CYCLOPENT/d/OXAZOLE- -4,5,6-TRIOL, PROCESS OF ITS PREPARATION AND PRODUCTION MICRO-ORGANISMS
CZ279299B6 (cs) Nové sloučeniny pojmenované &#34;LEUSTRODUCSINY&#34;, jejich příprava a terapeutické užití
LU85953A1 (fr) Compose antibiotique antitumoral
US5250563A (en) Inhibitors of HIV protease
US6756402B2 (en) Cyclipostins, process for their preparation and use thereof
RU2051900C1 (ru) 5-амино-1-гидроксиметилциклопентан-1,2,3,4-тетраол, 2-амино-4-гидроксиметил-3a,5,6,6a-тетрагидро-4н-циклопент-[d]-оксазол-4,5,6-триол, их фармацевтически приемлемые соли и способы их получения
EP0395418B1 (en) A phospholipase A2 inhibitor, method for producing it and pharmaceutical or veterinary formulations comprising said inhibitor
FI106026B (fi) Menetelmä lääkeaineena käyttökelpoisen 2-amino-4-(hydroksimetyyli)-3a,5,6,6a-tetrahydro-4H-syklopent[d]oksatsoli-4,5,6-triolin valmistamiseksi
JP3209791B2 (ja) オキサゾリン誘導体及びその製造法
JP3106012B2 (ja) オキサゾリン誘導体の製造法
RU2120997C1 (ru) Способ получения 2-амино-4(гидроксиметил)-3а,5,6,6а-тетрагидро-4h-циклопент-[d]-оксазол-4, 5,6-триола и продуцирующие его штаммы актиномицета micromonospora и актиномицета amycolatopsis
JPH0429356B2 (cs)
US5643871A (en) Antitumor antibiotics
JPH06211615A (ja) Ｂｕ−４８０３ｔ抗生物質
JPS594990B2 (ja) 抗生物質グロボマイシン
EP0162422A2 (en) The novel physiologically active substance foroxymithine, a process and microorganisms for its production and its use as medicament
CN1031253A (zh) 抗生素a80577及其生产方法
JPH05163289A (ja) 新規な免疫抑制物質、ｍｉ７１０−５１ｆ６物質およびその製造法
NO301488B1 (no) Polyhydroksycyklopentanderivat, fremgangsmåte til fremstilling derav, samt biologisk rene stammer av mikroorganismer som er anvendelige i fremgangsmåten
JPH023694A (ja) 抗生物質６１０８類、それらの製造法及びその用途
JPS584796A (ja) 抗腫瘍性物質デオキシペンタレニルグルクロンおよびその製造法
JPH05201937A (ja) 新規トレハゾリン誘導体の製造法
JPH0499792A (ja) 新規化合物ａ―７０６１５物質及びその製造法

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic