KR0145680B1 - "류스트로덕신"으로 명명된 신규 화합물, 그의 제조방법 및 그의 치료학적 용도 - Google Patents

"류스트로덕신"으로 명명된 신규 화합물, 그의 제조방법 및 그의 치료학적 용도

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가와무라 요시부미
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Abstract

하기 구조식(Ⅰ)의 류스트로덕신으로 명명된 신규 화합물 또는 그의염을 스트렙토마이세스 속의 미생물, 특히 스트렙토마이세스 플라텐시스 종의 균주, 예컨대 균주 SANK60191(FERM BP-3288)을 사용하는 발효하는 의해 제조 할 수 있다.
[상기식에서, R은 5-메틸헥사노일옥시기, 6-메틸옥타노일옥시기 또는 7-메틸옥타노일옥시기를 나타낸다.] 이들 화합물은 암 화학요법 또는 방사선요법으로 인한 해로운 작용; 감염; 암; 뇌 기능장애; 및 진균 감염의 치료 및 예방에 사용될 수 있다.

Description

류스트로덕신 (LEUSTRODUCSINS)으로 명명된 신규 화합물, 그의 제조방법 및 그의 치료학적 용도
본 발명은 류스트로덕신A (Leustroducsin A), 류스트로덕신B 및 류스트로덕신C로 명명된 일련의 신규 화합물에 관한 것이다. 이 화합물은 이하에 도시된 구조식(Ⅰ)을 갖는다. 본 발명은 신규하고 본 발명의 일부를 구성하는 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 특히 스트렙토마이세스 플라텐시스(Streptomyces platensis)속의 균주의 미생물을 사용하여 발효시킴으로서 상기 화합물을 제조하는 방법도 제공한다. 본 발명 화합물은 각종의 치료적 효과를 지니기 때문에, 본 발명은 또한 상기 화합물을 사용하는 조성물 및 치료 또는 예방 방법도 제공한다.
본 발명의 류스트로덕신은 조혈인자, 가령 과립세포 군체-자극인자(이하 G-CSF'로 약칭함) 및 과립세포-거식세포 군체-자극인자(이하 CM-CSF로 약칭함)의 생산을 자극하고;신경 성장 인자(이하 NGF로 약칭함)의 생산도 자극하며;게다가, 예를들면, 트리코피톤 멘타그로피테스(Tricophyton mentagrophytes)에 대한 항진균효과를 나타내는 신규한 화합물이다.
조혈 활성이 있는 각종의 사이토키닌, 가령 군체-자극 인자(이하 CSF로 약칭함) 및 몇몇 종류의 당단백질(통상, 인터류킨 (interleukins)라 칭함)는 현재, 유전자 조작 기술로 제조되고 있다. 상기 물질은 보통 암의 화학요법으로 기인하는 해로운 부작용을 경감하고 감염을 방지하여 임상핫적인 각종의 방법에 사용되고 있다. 상기 물질의 유효성은 최근들어 명백해졌다(Br. J. Cancer 59, 2~5(1989)).
상기 인자들을 각종의 경로로 인체에 투여하면 명백한 약리학적 효과를 결과한다는 사실이 발견되었으며, 이는 치료에 있어서 상기 인자의 가능한 용도를 이끌어 내었다. 그러나, 이 인자들은 복잡한 조절계를 거쳐 생체내의 어떤 종류의 세포(예컨대, 임파구, 단핵세포, 섬유아세포, 혈관 내피성세포 및 지질세포)로 부터 필수적으로 생산되고, 이들은 각종의 혈액세포의 생산에 항상성의 역할을 하는 것으로 추측된다. 따라서, 이 조절 메카니즘의 미묘한 균형에 관한 어떤 고려없이 투여된다면, 몇몇 부작용이 관찰될 수 있으며 이는 조절 메카니즘의 불균형을 유발할 수 있으며;이러한 부작용의 예는 주사한 부위의 염증, 뼈의 통증, 열 및 강직등을 포함한다.
반면, 조혈인자 자체를 투여하는 대신, 인체내의 상기 조혈인자의 생산을 자극하는 것으로 알려진 어떤 물질을 투여하는 것도 가능하다. 예컨대, 인터류킨 1(이하 IL-1으로 약칭함) 및 종양 괴사 인자(이하 TNF로 약칭함)는 각종의 세포에 의해서 CSF등의 생산을 유도할 수 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 이들 인자는 그 자체가 각종의 기타 생물학적 활성을 지니고 있기 때문에 항상 조혈 인자의 특이적 유도물질로 작용할 수 없다.
각종의 저분자량 면역 활성체(immunoactivators), 가령 리포폴리삭카라이드(이하 LPS로 약칭함) 및 뮤라밀디펩티드(이하 MDP로 약칭함)는 단핵세포 및 거식세포의 활성으로 각종의 CSF를 생산할 수 있다는 사실이 알려져 있다. 그러나, 거식세포의 활성으로 기인되는 기타 생리학적 효과, 예르를면 모노킨(monokines), 예컨대 IL-1 및 TNF가 동시에 발생하여, 각종의 부작용, 예컨대 발열을 결과할 수 있다는 사실이 공지되어 있다.[참조, Nippon Acta Radiologica 48, (4), 514(1988)].
포로볼(phorobol)에스테르 및 칼슘 이오노포레스(ionophores)가 상승적으로 CSF생산을 유도하는 것으로 공지되어 있으나(참조, Kohama 일행;Experimental Hematology 16, 603~608(1988)), 조혈인자의 생산을 자극할 뿐만아니라 호르몬, 예컨대 인슐린을 포함하는 전체 분비 단백질의 생산 및 분비를 자극한다고도 공지되어 있다[참조, Y. Nishizuka:Science 225, 1365(1984)].
정확한 메카니즘은 아직 규명되지 않았지만 혈액세포의 생성에 있어서, 각종의 성숙한 혈액세포는 각종 조혈 인자 및 세포 대 세포 상호 작용을 거쳐 조혈 간세포로 불리는 일반세포 전구물질로 부터 형성할 수 있다. 정상 성인의 혈액세포가 형성되는 부위가 골수의 내부에만 국한되고 골수에 존재하는 지질 세포로 불리는 세포가 혈액세포의 형성에 중요한 역할을 하며(Dexter 일행;J. Cell. Physiol. 91, 335(1977)). 골수중의 지질세포가 각종의 조혈인자를 생산한다는(harigaya 일행;Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82, 3477(1985);Kohama 일행;Experimental Hematology 16, 603~608(1988)), 사실이 학립되었다.
따라서, 지질세포에 의한 조혈 인자의 생산을 자극하는 물질을 발견할 수 있다면, 이 물질은 생리학적 조건 및 혈액학적 질병의 병리학에 있어서 조혈 메카니즘 작용의 분석에 매우 중요한 역할을 할 뿐만아니라 현저한 임상학적 용도를 발견할 수 있다.
유럽 특허 공고 제329 361호는 이하에 정의될 기R의 성질이 다르다는 점을 제외하고 본 발명의 화랍물과 유사한 특정 신규의 2-피라논유도체를 개시한다. 이 선행기술 화합물은 또한 농업용 생물독으로만 기술되고 공지 기술문헌에 본 발명 화합물의 유용하고 예측치 못한 치료 및 예방적 활성에 관해서는 언급이 없었다. 선행기술 화합물이 본 발명 화합물과 같이 스트렙토마이세스 플라텐시스 종의 미생물에 의해 생산은 되었지만, 선행 문헌에 기술된 균주는 여기에 기술된 것과 명백하게 다르다고 생각된다.
실질적으로 동일한 개시된 유용성을 갖는동일한 화합물 및 미생물은 일본국 특허출원 공개 제2-186호에 기재되어 있으며, 마찬가지로 이것도 여기에 기술된 화합물 및 미생물과 명백하게 구별된다고 생각된다.
Jjournal of Antibiotics, XLII권 제29호 1331면은 저자가 포스폴린(phospoline)이라 칭하고 스트렙토마이세스 속의 미생물에 의해 생산되고, 새롭게 분리된 신규한 항종양 화합물을 개시한다. 그러나, 상기의 미생물은 명백하게 스트렙토마이세스 하이그로스코피커스(Streptomyces hygroscopicus)로 서술되고 있으며, 본 발명에 사용하는 스트렙토 플라텐시스와 구별된다. 게다가, 본 발명의 화합물과 유사한 선행 기술의 포스폴린이 아미노기 및 인산기를 갖지만, 다른 분자식을 갖고 있어서 명백하게 구별된다.
따라서, 본 발명의 목적은 다양한 약리학적 활성을 갖는 일련의 신규한 인산 화합물을 제공하는 것이다.
특히 본 발명의 화합물은 하기의 활성을 갖는 것으로 생각된다;암의 화학요법 또는 방사선요법에 기인하는 해로운 작용을 감소시키고;감염에 대하여 보호를 하며;거식세포를 활성화하여 항종양 효과를 지니며;뇌 기능을 개선하고;부가적으로, 항진균제로 작용한다.
따라서, 본 발명은 하기 화학식(1)의 화합물 및 그의 염을 제공한다.:
[상기식에서, R은 5-메틸헥사노일옥시기, 6-메틸옥타노일옥시기 또는 7-메틸옥타노일옥시기를 나타낸다].
상기 화합물을 각각, 류스트로덕신A, 류스트로덕신B 및 류스트로덕신C로 명명하였다.
본 발명은 또한 스트렙토마이세스 속의 류스트로덕신-생산 미생물을 배양하고 배양물로부터 적어도 하나 이상의 류스트로덕신을 채취함을 특징으로 류스트로덕신의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합된 적어도 하나 이상의 류스트로덕신 또는 그의 염을 포함하는 제약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 암의 화학요법 또는 방사선요법에 기인하는 해로운작용;감염;암;뇌의 기능장해; 및 진균 감염의 치료 또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 적어도 하나 이상의 류스트로덕신 또는 그의 염의 유효량을 상기의 작용, 감염, 암 또는 기능장해에 걸려 있거나 걸리기쉬운 포유동물(인간이어도 무방)에 투여하는 것으로 구성된다.
본 발명의 3종의 류스트로덕신은 하기와 같다:
류스트로덕신 A:
류스트로덕신 B:
류스트로덕신 C:
본 발명의 류스트로덕신인 다수의 비대칭탄소 및 몇몇 이중결합을 함유하고 있다는 사실은 상기 구조식에서 명백하다. 따라서 상기는 각종의 광학 및 기하 이성질체를 형성할 수 있다. 상기 화합물을 단일 분자식으로 여기에 모두 나타내지만, 본 발명은 개별적으로 분리된 이성질체 및 그의 라세미체를 포함하는 혼합물을 포함한다. 입체특이성 합성기술을 사용하거나 광학 활성 화합물을 출발물질로 사용한다면, 개개의 이성질체는 직접 제조될 수 있으며;반면, 이성질체 혼합물이 제조되면, 개개의 이설질체는 통상의 분리 기술에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 류스트로덕신은 스트렙토마이세스 속의 류스트로덕신-생산 미생물을 배양하고, 이어서 배양 배지에서 하나 이상의 류스트로덕신을 채취하여 제조될 수 있다.
특히, 스트렙토마이세스 플라텐시스 종에 속하는 계통을 확립하고 명칭 SANK 60191(FERM BP-3288)로 지정한 스트렙토마이세스 속의 신규한 분리 규주를 특히 바람직하게 미생물로서 사용한다.
이 미생물은 1991년 2월 20일 부다페스트 조약하의 통상산업성 공업기술원 미생물 공업기술 연구소(Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology)에 기탁번호 FERM BP-3288로 기탁되었다.
스트렙토마이세스 플라텐시스 SANK 60191(FERM-3288)의 미생물학적 특성의 상세한 설명은 하기에 나타난다.
1. 미생물학적 특성
스트렙토마이세스 플라텐시스 SANK 60191을 1SP(국제 스트렙토마이세스 기획;International Streptomyces Project)에 이해 정의된 각각의 아가 배니상에서 28℃에서 14일간 배양한다. 14일간 배양한 다음 현미경으로 간찰하면, 이 균주의 기질 균사체는 잘 신장되고 분지되어 있으며 황회색 또는 엷은 황오렌지색을 띤다는 것이 발견되었다. 그러나, 노카르디아형(Nocardioform)방선균에서 관찰할 수 있는 분열(fragmentation) 및 지그-재그식 신장은 관찰되지 않는다. 대기 노출 균사체의 분지는 단순했다. 포자의 연결체(chain)는 늘어진 나선형태이고 10~50 또는 그 이상의 포자가 연결체를 형성한다. 주사 전자현미경에 의한 관찰은 평탄한 포자의 표면 구조를 보여준다. 포자는 난형 또는 타원형이고 크기가 0.5~0.6×0.6~1.3㎛이다. 대기노출 균사체의 와형 보속균체, 균사의 분열 및 특이기관, 예컨대 포자낭등을 발견할 수 없다.
2. 각종 배양 배지 상에서의 성질
표1은 각종 배양 배지 상에서 28℃로 14일간 배양한 후의 atodanf 성질을 나타낸다. 그 색상은 Nippon Shikisai Kenkyusho에 의해 편집된 색상 표준에 대한 가이드(Guide to Color Standard)에 주어진 색상 치고수(color tip number)로 나타낸다. 상기 균주를 적시면 시간의 경과에 따라, 그 색상이 검게 변한다.
표에서, 하기의 약어가 사용된다;
G:성장, AM:erlshcnf 균사체, R:이며(Reverse), SP:가용성 색소 SC:특징.
3. 생리학적 특성
28℃로 배양을 시작한 다음 2~21일에 걸쳐 관찰한 균주 SANK 60191의 생리학적 특성은 하기 표2에 나타낸다.
균주 SANK 60191을 또한 배양배지로 프리드함-고틀리에브(Pridham-Gottlieb)아가(ISP 9)를 사용하여 28℃에서 배양한다. 14일간 배양후에 관찰한 탄소원의 이용 패턴은 표3에 나타난다.
4. 세포성분
균주 SANK 60191의 세포벽을 B. Becker 일행의 방법(Applied Microbiology 12, 421~423(1984))로 분석한다. LL-디아미노피멜산이 검출되었기 때문에, 세포벽은 형태 I임이 확인된다. 또한, 균주 SANK 60191의 전체 세포 수가 성분을 M. P. Lechevalier의 방법(Journal of Laboratory Clinical Medicine, 71, 934(1968))으로 분석하였다. 특별한 패턴은 발견되지 않는다.
이들 미생물학적 성질로 부터, 이 균주가 방선균류의 스트렙토 마이세스 속에 속함을 확인하였다.E. b. Shirling 및 D. Gottlieb의 ISP(International Journal of Systematic Bacteriology 18, 68~189(1968);18, 279~392(1968);19, 391~512(1969)22, 265~394(1972))에 기재된 균주 및 S.A. Waksman의 The Actinomycetes, Vol. 2, R.E. Buchanan 및 N.E. Gibbons의 Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8판(1974), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4(1989) 및 방선균류에 관한 기타 최근 문헌과 같은 기타 문헌에 기재된 균주와 비교하여, 이 균주는 스트렙토마이세스 플라텐시스에 매우 가까운 것으로 간주된다.
더우기, 효모-덱스트로즈 배지를 이용하여 액체 배양한후, SANK 60191 균주가 선명한 적갈색을 지닌 가용성 색소를 생산한다. 0.05N 염산을 가하면 색깔이 황색으로 바뀌며 0.05N 수산화나트륨 수용액을 가하면 어떠한 변화도 관측되지 않는다.
효모 추출물-맥아 추출물 아가, 오트밀 아가, 무기염-스타치 아가 및 글리세롤-아스파라긴 아가 배지상에서 배양한후, 스트렙토마이세스 플라텐시스는 적색 도는 황색 색소를 생산한다. 반면 균주 SANK 60191은 이들 색소를 거의 생산하지 않으며, 이점이 공지의 스트렙토마이세스 플라텐시스 균주와 이 균주와의 차이점을 나타낸다. 그러나 신규 균주와 공지의 균주가 가용성 색소의 생성에 있어서의 차이로서만 구별될 수 있기 때문에, SANK 60191이 스트렙토마이세스 플라텐시스으 새로운 균주로서 확인된다.
균주 SANK 60191이 류스트로덕신을 생산함은 주지의 사실이다. 그러나, 공지된 것이지만, 일반적으로 잔균류, 및 특히 방선균류 미생물의 성질이 심하게 변형될 수 있으며 이러한 진균류가 인공적 수단(예;자외선 조사, 방사선조사, 화학적 처리등)에 의해 유발되는 결과 및 자연적 원인에 의해 쉽게 돌연변이될 수 있다. 따라서, 본 발명은 스트렙토마이세스 속으로 분류될 수 있고, 류스트로덕신을 생성할 수 있는 특성을 균주 SANK 60191과 함께 공유하는 임의의 미생물의 사용을 포함한다. 예외적인 것으로 예상되지 않는 신규 미생물, 균주 SANK 60191 및 SANK 60191이라는 용어는 류스트로덕신을 생산할 수 있는 특성을 균주 SANK 60191과 함께 공유하는 이 균주의 모든 돌연변이체를 포함하는 것으로 사용하고 있다. 더우기, 이들 돌연변이체들은 예를들면 재조합, 인공적항원변환, 형질전환 같은 유전공학기술에 의하여 수득되는 것들을 포함한다. 류스트로덕신의 성질에 관하여 여기에 주어진 정보를 바탕으로, 임의의 주어진 균주가 이들 화합물을 생산하는지 또는 그 균주를 잠재적 상업성이 있을 정도로 이 화합물을 충분한 양으로 생산하는가를 결정하는 것은 간단한 실험적 문제이다.
본 발명자들은 또한 상기 기재된 스트렙토마이세스 플라텐시스의 신규 균주뿐 아니라, 공지의 균주, 즉 스트렙토마이세스 플라텐시스 SAM-0654(1988년 1월 22일에 기탁번호 FERM BP-1668로 일본 통상산업성 공입기술원 미생물 공업기술 연구소에 기탁됨)가 본 발명의 류스트로덕신을 생산함을 발견하였다. 이 공지의 균주는 유럽 특허 제329 361호에 완전하게 기재되어있다.
본 발명의 류스트로덕신은 유사한 미생물로 부터의 기타 발효 생성물의 제조용으로 종래에 사용된 유형의 배양 배지에서 이들 균주를 배양함으로써 제조될 수 있다. 이러한 배지는 당업계의 숙련인에게 공지되어 있는 바와 같이 무기염 뿐만아니라 미생물학적으로 동화 가능한 탄소 및 질소원을 필수적으로 함유한다.
탄소원의 바람직한 예로는 글루코오즈, 프럭토오즈, 말토오즈, 수크로오즈, 만니톨, 글리세롤, 덱스트린, 오트, 호밀, 옥수수 전분, 감자 전분, 옥수수분, 대두곡분, 목화종자 케이크,목화종자유, 당밀, 시트르산, 타르타르산등이 포함된다. 이러한 화합물을 단독 또는 임의의 적당한 조합으로 사용할 수 있다. 일반적으로 사용량은 배양 배지의 1내지 10중량%의 범위내이다.
질소원은 발효 공정에 통상 사용되는 단백질 함유 물질이 일반적으로 바람직하다. 이러한 질소원의 예로는 대두곡분, 밀겨, 땅콩곡분, 목화종자 케이크, 목화종자유, 목화종자곡분, 카제인 가수분해물, 페르마민, 어류분, 콘스팁 리쿼, 펩톤, 육 추출물, 효모, 효모 추출물, 맥아 추출물, 질산 나트륨, 질산 암모늄, 황산 암모늄 등이 포함된다. 이들 질소 원천은 단독 또는 임의로 적당히 조합하여 사용할 수 있다. 일반적으로 본 발명자들은 배양 배지의 0.2내지 6중량%의 농도로 그것을 사용하였다.
배양 배지에 배합될 수 있는 영양 무기염은 미생물의 성장에 필요한 각종 이온, 즉, 나트륨, 암모늄, 칼슘, 인산염, 황산염, 염산 및 탄산이온을 제공할 수 있는 종래의 염이다. 또한, 배지는 소량의 필수 미량 원소, 즉, 칼륨, 칼슘, 코발트, 망간, 철 및 마그네슘을 함유하여야 한다.
본 발명의 방법을 액체 배양 기술로 실행할 때, 실리콘 오일, 식물성 오일 또는 계면활성제와 가은 지포제를 배양 배지에 사용하는 것이 바람직하다. 스트렙토마이세스 속의 미생물, 특히 균주 SANK 60191을 배양함으로써 류스트로덕신을 제조하기 위한 배양 배지의 pH는 바람직하게는 5.0내지 .0, 보다 바람직하게는 5.0내지 7.0의 범위에서 변한다.
9℃내지 37℃온도 범위내의 임의의 온도에서 배양을 실행할 수 있다. 그러나, 20내지 35℃ 의 온도 범위내에서 성장이 잘 진행되므로 이러한 온도가 바람직하다. 류스트로덕신의 적절한 제조를 위해서는 22내지 30℃의 온도가 바람직하다.
호기성 배양 건조하에서 이들 하합물이 생산되며, 종래의 호기성 배양 방법, 즉 고체배양, 진탕 배양 및 통기 교반(침수)배양 방법을 사용할 수 있다. 소규모 배양시, 28℃에서 수일간의 진탕 배양 방법이 전형적으로 사용된다. 이러한 소규모 배양 방법에 있어서, 예를들면 액체 유동 조절기로서 작동하는, 저판이 장착된 엘렌메이어(Erlenmeyer)플라스크 내에서 시드 배양물을 생산하는 1 또는 의 증식 단계로 배양이 개시될 수 있다. 시드 배양 단계용 배지는 탄소 및 질소원 모두를 함유하는 것이 바람직하다. 이러한 소규모 배양용으로 바람직한 일련의 조작에 있어서, 시드 배양 플라스크를 28℃의 항온 배양기에서 3일 또는 충분히 성장할때까지 진탕시킨다. 성장한 시드 배양물을 2차 시드 배지 또는 생산 배지로 옮긴다. 중간 성장 상을 사용할 때, 성장을 위해 동일한 방법을 필수적으로 사용하고 생성된 중간 생산물의 부분표본을 생선 배지로 접종한다. 접종된 플라스크를 진탕하면서 수일간 배양할 수 있고 배양이 종료된후, 플라스크의 내용물을 원심분리 또는 여과할 수 있다.
대규모 제조의 경우에 있어서는, 교반기 및 통기장치가 장착된 적당한 발효기를 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우에 있어서, 영양 배지를 발효기 내부에서 제조할 수 있다. 120℃내지 125℃의 적당한 온도로 온도를 상승시켜 배지를 살균하는 것이 바람직하며, 냉각후 살균된 배지에 이미 제조된 시드 배양물을 접종할 수 있다. 28℃의 적당한 온도에서 교반 및 통기하에서, 배양을 한다. 이 방법은 본 발명의 화합물을 과량으로 수득하는데에 적당하다.
배양 시간이 흐름에 따라 생산된 류스트로덕신의 양의 변화를 발효 업계에 공지된 적당한 임의의 방법, 즉 고성능 액체 크로마토그래피로 기록할 수 있다. 매우 일반적으로, 제조된 류스트로덕신의 양은 48시간 내지 96시간동안 배양한후 최대치에 도달한다.
배양이 종결된후, 류스트로덕신의 물리화학적 성질을 이용한 종래 방법으로 배지 액체의 액체부분 및 세균 세포에 잔류하는 류스트로덕신을 추출 및 정제할 수 있다. 예를들면, 여액 또는 상청액중에 존재하는 류스트로덕신을 산성조건하에서 수불용성 유기 용매 즉 에틸 아세테이트, 글로포름, 에틸렌클로라이드, 메틸렌클로라이드 또는 부탄올(또는 이들 용매 2이상의 임의의 혼합물로)등으로 추출할 수 있으며;추출후 종래 방법으로 정제할 수 있다. 또한 염기성 조건하에서 하나 이상의 상기 언급한 용매로 추출함으로써 불순물을 제거할 수 있으며, 추출후 종래 방법으로 정제할 수 있다. 대안적으로 적당한 흡착제층을 통해 류스트로덕신을 함유하는 액체를 통과시켜 흡착시킴으로써 불순물을 제거할 수 있거나 류스트로덕신을 적당한 흡착제상에 흡착시킨 뒤 메탄올수, 아세톤수 또는 부탄올수와 같은 적당한 용출액을 사용하여 용출시킨다. 이 방법에 사용될 수 있는 적당한 흡착제의 예로는 활성 탄소 및 Amberlite XAD-4(Rohm Haas 제품의 상표)또는 Diaion HP-10, HP-20, CHP-20, HP-50(Mitsubishi Chemical Industries Co. 제품의 상표)과 같은 흡착제 수지가 포함된다. 세포에 존재하는 류스트로덕신을 50~90부피% 이세톤수 또는 메탄올수와 같은 적당한 용매로 추출한 뒤, 유기 용매를 제거함으로써 수득할 수 있고;이후에, 유사한 추출 및 여과를 이용한 상기 기재된 정제 방법을 이 생성물에 사용할 수 있다.
예를들면, 상표 Florisil로 시판되는, 실리카겔 또는 마그네슘-실리카겔과 같은 담체를 이용한 흡착 컬럼 크로마토그래피;Sephadex LH-20(Pharmacia 제품의 상표)과 같은 흡착제를 이용한 분배 컬럼 크로마토글피;또는 정규상 또는 역상 컬럼을 이용한 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 공지 기술로 상기 수득된 류스트로덕신을 추가로 정제할 수 있다. 당업계에 공지된 바와같이, 이들 분리 및 정제 방법을 단독 또는 임의의 적당한 조합으로 수행할 수 있으며, 필요하다면 반복하여 원하는 류스트로덕신을 분리 및 정제할 수 있다.
본 발명의 류스트로덕신은 종래 문헌에 기재되지 않은 신규 화합물이다. 그것은 G-CSF 및 GM-CSF와 같은, 동물(예;인간, 개 고양이 및 토끼)의 조혈 인자 제조를 자극하며 따라서 암 화학요법 및 방사요법에 의해 야기되는 부작용을 감소시키는 치료제로서 유용하며;그것은 또한 감염을 방지하고 대식세포의 활성을 통하여 항암작용을 나타낸다. 또한, 류스트로덕신은 NGF의 생성을 자극함으로써 뇌의 대사를 향상시키는데에 유용한 것으로기대된다. 더욱이, 그것은 항진균제로서 유용하며 트리코피톤 멘타그로피테스에 EOGS 항진균 효과가 시험되었다.
본 발명에 따르는 조혈 인자 생성을 자극하는 류스트로덕신의 기능은 일반적으로 Kohama일행에 의한 방법으로 분석할 수 있다(Experimental Hematology 16, 603~608(1988)). 이 방법에 있어서, 각종 조혈 인자용 생성계 및 분석계는 결합된다. 예를들면, 인체 골수 지질 세포로부터 유래된 KM-102 세포를 각종 조혈 인자 생성에 사용할 수 있다. 그러나, 각종 조혈 인자를 제조할 수 있는 임의의 세포는 예를들면 골수에 존재하는 1차 배양 골수 지질세포,혈관 내피성 세포, 임파구 또는 대식세포 대신 사용할 수 있다. 활성이 평가될 화합물의 시험표본을 희석하여 적당한 농도로 만들고 각종 조혈 인자를 생성하는 세포(HF-생성 세포)를 함유하는 배양 시스템에 가한다. 적당한 시간, 통상 24시간후에, 배양 배지의 상청액을 취하여 각종 조혈인자, 예를들면, TF-1세포 및 NFS-60 세포 의존세포(HF-의존 세포)의 배양 시스템에 적당한 농도로 가한다. 일정한 시간후에, HF-의존 세포의 성장을 측정함으로써 조혈 인자의 양을 측정할 수 있고 따라서 각종 조혈 인자의 생성을 자극하는 화합물의 능력을 평가할 수 있다. 세포에 의한 트리튬-티미딘의 혼입 또는 MTT-(3-(4, 5-디메틸티아졸-2-일)2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드)분석방법(Chemicon International Inc, USA)과 같은 임의의 종래 방법으로 HF-의존세포의 성장을 측정할 수 있다. 군체-형성방법 또는 ELISA방법과 같은 임의의 종래 방법으로 각종 조혈 인자의 분석을 실행할 수 있다.
본 발명의 류스트로덕신은 산성기(인산기) 및 염기성기(아미노기)모두를 함유하고 따라서 염을 형성할 수 있다. 이들 염이 치료용으로 의도되고, 제약학적으로 허용가능한 것이며, 이들 염의 성질에는 특별한 제한이 없다. 그것이 예를들면 다른것의 제조시 중간체로서와 같은 비치료용 용도로 의도되고 보다 활성인 화합물인 경우일 때, 이들 제한 조차도 적용되지 않는다. 본 발명의 화합물은 염기와 염을 형성할 수 있다. 이러한 염의 예로는 나트륨, 칼륨 또는 리튬과 같은 알칼리금속과의 염;바륨 또는 칼슘과 같은 알칼리토금속과의 염;마그네슘 또는 알루미늄과 같은 기타금속과의 염;디시클로헥실아민과의 염과 같은 유기염; 및 라이신 또는 아르기닌과 같은 염기성 아민산과의 염이 포함된다. 본 발명의 화합물은 또한 산부가염을 형성할 수 있다. 이러한 산부가염의 예로는 특히 할로수소산(불화수소산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 또는 염산), 질산, 과염소산, 탄소산, 황산 또는 인산과 같은 무기산과의 염;메탄술폰산, 트리플 루오로메탄술폰산 또는 에탄술폰산과 같은 저급 알킬술폰산과의 염;벤젠술폰산 또는 p-톨루엔술폰산과 같은 아릴술폰산과의 염;아세트산, 푸마르산, 타르타르산, 옥살산, 말레산, 말산, 숙신산 또는 시트르산과 같은 유기카르복실산과의 염; 및 글루탐산 또는 아스파트산과 같은 아미노산과의 염등이 포함된다.
이들 화합물을 치룡용으로 의도될 때, 활성 화합물 뿐만 아니라, 1종 이상의 종래의 희석제, 담체, 부형제 또는 보조제를 함유하는 적당한 제약학적 제제로 또는 단독으로 그것을 투여할 수 있다. 물론 제제의 성질은 의도되는 투여경로에 따를 것이다. 그러나, 경구 투여를 위해서는, 이 화합물을 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 시럽으로 제형화하는 것이 바람직하다. 비경구 투여를 위해서는, 주사(정맥내, 근육내 또는 피하주사일 수있다)로서 또는 구약 또는 좌약으로서 제형화하는 것이 바람직하다. 담체, 결합체, 붕해제, 윤활제, 안정제, 교정제, 용해제, 현탁제 또는 피복제와 같은 첨가제를 첨가하는 종래 방법으로 이들 제제를 제조할 수 있다.
투여량은 한자의 증상이나 나이, 질병의 성질이나 정도 및 투여 경로나 방법에 따라 변할 수 있으나, 성인 환자에 대한 경구투여의 경우에, 통상 하루에 본 발명의 화합물을 1㎎내지 1000㎎ 투여할 수 있다. 이 하합물을 하루에 한번 또는 2또는 3회로 나누어 복용할 수 있다.
본 발명의 화합물 제조를 하기 비-제한적 실시예로 좀더 설명한다.
[실시예 1]
류스트로덕신의 배양 및 단리
[1(A) 배양]
스트렙토마이세스 플라텐시스 SANK 60191의 1백금이를 저판이 장치되어 있고 100㎖의 미리 살균된 배양 배지(하기의 조성을 갖는)를 함유하는 500㎖의 엘렌메이어 플라스크내로 접종하고, 미생물을 28℃에서 히전진탕기를 T용하여 200rpm(7㎝의 히전 반경)에서 3일간 배양한다.
시드 배양에 사용한 것과 동일한 배양 배지 15ℓ를 30ℓ스텐인레스 잘 반응기 4개 각각에 충진하고 120℃에서 30분간 가열하여 살균한다. 상기 제조한 150㎖의 시드 배양액을 첨가한다. 혼합물을 28℃에서, 15ℓ/분의 공기 유속으로 통기하고 교반하면서 3일간 배양한다. 액체내의 산소농도를 5ppm으로 유지하기 위하여, 교반속도를 100내지 300rpm에서 자동으로 조절한다.
[1(B) 단리]
2.4㎏의 Celite 545(Johns Manville Project corporation, USA제품의 상표)를 상기 1(A)에 기술한대로 수득한 60ℓ의 배양액에 대한 여과보조제로서 첨가하고, 혼합물을 여과한다. 배양액의 여과후, 7.2㎏의 세균세포를 수득한다. 세포를 30ℓ의 50%v/v수성 아세톤으로 1회, 각각 20ℓ의 80%v/v수성 아세톤으로 2회 세척한다. 이들 추출물을 합하고, 유기 용매를 회전증발기를 사용하여 증류시킨다. 충분한 수성 염산을 잔류물에 첨가하여 그의 pH 값을 2.0으로 한다음 혼합물을 각각 10ℓ의 초산에틸로 2회 세척한다. 추출물을 합하고, 10ℓ의 1%v/v탄산수소나트륨 수용액을 합한 추출물에 첨가한다. 활성 분획을 수성층내로 이동시키고 초산 에틸층을 제거한다. 이 초산 에틸층을 5ℓ의 1%v/v수성탄산수소나트륨 수용액으로 추출한다. 탄산수소나트륨 용액을 합하고 합한 용액의 pH를 수성 염산을 첨가하여 2.0으로 조정한다. 용액을 각각 10ℓ의 초산 에틸로 2회추출한다. 유기 추출물을 합하고, 물로 세척한 다음 염화 나트륨의 포화 수용액으로 세척하고 무수 황산 나트륨상에서 건조시킨다. 메탄올의 연속적인 첨가시, 용액을 회전 증발기를 사용하여 감압하에 증발시켜서 농축시켜서 10㎖의 오일성 물질을 수득한다. 이 오일성 물질을 100㎖의 60%v/v수성 메탄올내에 용해시키고, 생성 용액을 Sep-Pak Vac 20cc C18Cartridges(Waters Co., USA제품의 상표)상에 흡착시킨다. 불순물을 30㎖의 60%v/v수성 메탄올로 용출시킨다. 그다음 류스트로덕신을 15㎖의 100% 메탄올로 용출시키고, 용출물을 농축하여 800㎎의 오일성 물질을 수득한다. 이 오일성 물질을 10㎖의 메탄올에 용해시키고 고성능 액체 크로마토그래피 한다. 13분 및 24분 근처의 피크를 보여주는 분획을 수집하고 원료 분획 A 및 원료 분획B로 각각 부른다. 크로마토그래피에 사용된 조건은 다음과 같다.
예비 액체 크로마토그래피
컬럼:Radial-Pak 25×10(Wsters, USA)
용출 용매:50부피% 수성 아세토니트릴, 0.5% 트리에틸아민-인산염 완충액 함유, pH3.0
유속:9㎖/분
파장:230㎚
이들 피크 모두를 농축한 후에, 생성 분획을 예비 고성능 액체 크로마토그래피 한다. 원료 분회 A를 예비 크로마토그래피하여 하기 조건하에서 56분 근처의 피크를 수집한다;이를 탈염하고 Sep-Pak을 사용하여 농축하여 11.66㎎의 류스트로덕신A를 수득한다.
원료 분획A에 대한 예비 조건
컬럼:Cosmosil 5C 18-AR 20×250㎚(Nakaraitesque Inc.)
용출 용매:42%v/v 수성 아세토니트릴, 0.5% 트리에틸아민-인산염 완충액 함유, pH3.0
유속:9㎖/분
파장:230㎚
원료 분획 B를 예비 크로마토그래피하여 하기 조건하에서 47 및 51분 근처의 피크를 수집한다;이를 탈염하고 Sep-Pak을 사용하여 농축시켜서 9.83㎎의 류스트로덕신 B 및 5.22㎎의 류스트로덕신C를 수득한다.
원료 분획B에 대한 예비 조건
컬럼:Cosmosil 5C 18-AR 20×250㎚(Nakaraitesque Inc.)
용출 용매:47%v/v 수성 아세토니트릴, 0.5% 트리에틸아민-인산염 완충액 함유, pH3.0
유속:9㎖/분
파장:230㎚
이렇게 수득된 류스트로덕신은 하기 성질을 갖는다.
류스트로덕신 A:
1) 화학적 구조:상기 구조식(Ia)
2) 성질:산성 및 지용성
3) 색상:엷은 황색 오일
4) 분자식:C32H52O10NP.
5) 분자량:FAB-MS 방법에 의해 측정시 641.
(FAB-MS는 고속 원자 충격 질량 스펙트럼(Fast Atom Bonbardment Mass Spectrometry)이다).
6) 자외선 흡수 스펙트럼:234㎚(메탄올중 최대흡수)
7) 적외선 흡수 스펙트럼:적외선 흡수 스펙트럼은 하기 흡수 최대값을 보여준다(액체 필름, υmax cm-1)
2933, 287, ,1728, 1464, 1383, 1248, 1176, 1056, 969.
8) 1H-핵자기 공명 스펙트럼:트리메틸실란을 내부 표준으로서 사용한 중 메탄올 내에서의 핵자기 공평 스펙트럼(270MHz)은 하기와 같다.
9)13C-핵자기 공명 스펙트럼:(δ:ppm):내부 표준으로서 트리메틸실란을 사용하는, 중 메탄올 내에서의 핵자기 공명 스펙트럼(270MHz)을 하기에나타낸다:
10) 용해도:
알콜, 예컨대 매탄올, 에탄올 또는 부탄올 내에서 가용성; 및 아세톤, 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 디메틸 술폭시드 내에서 가용성;물내에서 한정된 용해도;헥산내에서 불용성.
11) 색깔 반응:
황산, 요오드, 닌히드린 및 암모늄 몰리브데이트-퍼클로르산 반응에 대하여 양성.
12) 고성능 액체 크로마토그래피:
분리컬럼:Cosmosil 5C18-AR
(컬럼크기, 4.6×250㎚(Nakaraitesque Inc.의 제품)
용매:0.5% 트리에틸아민-인산염 완충액을 함유하는 45%v/v 수성 아세토니트릴 (pH3).
유속:1㎖/분
파장:230㎚
보유시간:9.06분 및 9.16분.
류스트로덕신 B:
1) 화학구조:상기 구조식(Ib)
2) 성질:산성 및 지용성
3) 색상:엷은 황색 오일
4) 분자식:C34G56O10NP
5) 분자량:FAB-MS 방법에 의해 측정시 669
6) 자외선 흡수 스펙트럼:234㎚(메탄올중 최대흡수)
7) 적외선 흡수 스펙트럼:하기 흡수 최대치를 보여주는 적외선 흡수 스펙트럼(액체 필름, υmax cm-1)
2927, 2855, 1729, 1463, 1380, 1250, 1172, 1056, 968.
8)1H-핵자기 공명 스펙트럼:트리메틸실란을 사용하는 중 메탄올내에서의 핵자기 공평 스펙트럼(270MHz)은 하기에 나타낸다:
9)13C-핵자기 공명 스펙트럼:(δ:ppm):내부 표준으로서 트리메틸실란을 사용하는 중 메탄올 내에서의 핵자기 공명 스펙트럼(270MHz)을 하기에 나타낸다:
10) 용해도:
알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올 또는 부탄올내에서 가용성;및 아세톤, 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 디메틸 술폭시드 내에서 가용성;물내에서 한정된 용해도;헥산내에서 불용성.
11) 색깔 반응:
황산, 용오드, 닌히드린 및 암모늄 몰리브데이트-퍼클로르산 반응에 대하여 양성.
12) 고성능 액체 크로마토그래피:
분리컬럼:Cosmosil 5C 18-AR
(컬럼크기, 4.6×250㎚(Nakaraitesque Inc.의 제품)
용매:0.5% 트리에틸아민-인산염 완충액을 함유하는 45%v/v 수성 아세토니트릴 (pH3).
유속:1㎖/분
파장:230㎚
보유시간:20.62분 및 20.87분.
류스트로덕신 C:
1) 화학구조:상기 구조식(Ic)
2) 성질:산성 및 지용성
3) 색상:엷은 황색 오일
4) 분자식:C34G56O10NP
5) 분자량:FAB-MS 방법에 의해 측정시 669
6) 자외선 흡수 스펙트럼:234㎚(메탄올중 최대흡수)
7) 적외선 흡수 스펙트럼:하기 흡수 최대치를 보여주는 적외선 흡수 스펙트럼(액체 필름, υmax cm-1)
2930, 2856, 1728, 1464, 1382, 1252, 1172, 1056, 968.
8)1H-핵자기 공명 스펙트럼:내부 표준으로서 트리메틸실란을 사용하는 중 메탄올내에서의 핵자기 공평 스펙트럼(270MHz)은 하기에 나타낸다:
9)13C-핵자기 공명 스펙트럼:(δ:ppm):내부 표준으로서 트리메틸실란을 사용하는 중 메탄올 내에서의 핵자기 공명 스펙트럼(270MHz)을 하기에 나타낸다:
10) 용해도:
알콜, 예컨대 메탄올, 에탄올 또는 부탄올내에서 가용성;및 아세톤, 클로로포름, 에틸 아세테이트 및 디메틸 술폭시드 내에서 가용성;물내에서 한정된 용해도;헥산내에서 불용성.
11) 색깔 반응:
황산, 용오드, 닌히드린 및 암모늄 몰리브데이트-퍼클로르산 반응에 대하여 양성.
12) 고성능 액체 크로마토그래피:
분리컬럼:Cosmosil 5C 18-AR
(컬럼크기, 4.6×250㎚(Nakaraitesque Inc.의 제품)
용매:0.5% 트리에틸아민-인산염 완충액을 함유하는 45%v/v 수성 아세토니트릴 (pH3).
유속:1㎖/분
파장:230㎚
보유시간:21.90분 및 22.19분.
생물학적 활성
하기 시험 실시예는 본 발명 하합물의 효과를 보다 상세히 설명한다.
[시험예 1]
GM-CSF 생산의 자극
본 발명의 화합물에 의한 GM-CSF생산의 자극 측정을 Kohama 일행의 방법(Experimental Hematology 16, 603~608(1988)) 및 Kitamura 일행의 방법[Journal of Cellular Physiology 140, 323~334(1989)]을 조합하여 사용하여 원칙에 따라 실행한다. 보다 상세히, GM-CSF를 생산하는 인간의 골수 지질 세포로 부터 유래한 KM-102 세포를 적절한 농도로 희석된 시험 생픔 용액과 혼합한다GM-CSF 생산계. 24시간동안 배양한 후에, 배양상청액의 일부를 취하고 GM-CSF-의존 인간 TF-1 세포의 배양계에 첨가한다. 48내지 72시간후에, GM-CSF의 양을 TF-1세포의 성장에 의해 측정하여 'GM-CSF 분석계) GM-CSF 생산의 자극을 측정한다. TF-1 세포의 서장은 4시간동안 트리튬 티미딘 펄스-라벨링(pulse-labelling)에 의해 측정한다. 유사한 결가를 또한 MIT 키트(Chemicon International Inc. USA)]에 의하여는 GM-CSF를 분석한다. GM-CSF 생산 유도계가 정상적으로 작용하였는지 아닌지를 재조합 인터류킨 1β(IL-1β:Genzyme Inc. USA)에 의해 분석한다. IL-1β는 1내지 100유니트/㎖내에서 투여량-의존 방식으로 GM-CSF생산을 유도하였으며, 최대로 유도된 GM-CSF의 생산은 시험계의 정상적 작용화를 보여준주는 IL-1β가 없는 생산의 10 내지 20배 였다.
특정 농도로 KM-102 세포에 류스트로덕신 A, B 및 C를 각각 투여한 후에, GM-CSF 생산은 투여량-의존 방식으로 유도됨이 발견되었다. 최대치에서, 생산된 GM-CSF의 양은 첨가 없이 생산된 양의 10 내지 20배 였다.
ED50값은 류트스트로덕신 A,B, 및 C 각각에 대하여 180+50, 50+15 및 50+15ng/㎖인 것으로 발견되었다.
[시험예 2]
G-CSF 생산의 자극:
G-CSF 생산의 자극을 시험예 1에서 사용된 GM-CSF 분석계가 G-CSF분석계[Shirafuji 일행에 의해 기술된 바와 같음:Experimental Hematology 17, 116~119(1989)]로 교체된 계에 의해 분석한다. 보다 상세하게, G-CSF를 생산하는 인간의 골수 지질 세포로 부터 유래한 KM-102세포를 적절한 농도로 희석된 류스트로덕신 용액에 첨가한다(G-CSF 생산계). 24시간동안 배양한 후에, 배양 상청액의 일부를 취하고 G-CSF-의존 NFS-60 세포의 배양계에 첨가한다. 24내지 48시간후에, G-CSF의 양을 NFS-60세포의 성장에 의해 측정하여 (G-CSF 분석계) G-CSF 생산의 자극을 측정한다. NFS-60세포의 성장은 4시간동안 트리튬-티미딘 펄스-라벨링에 의해 측정한다. 유사한 결과를 또한 MIT키트에 의해 얻어서 NFS-60세포의 성장을 분석하고 ELISA키트에 의하여는 G-CSF를 분석한다(Motojima 일행:Journal of Immunological Methods 118, 187~192(1989)). G-CSF생산 유도계가 정상적으로 작용했는지 아닌지를 재조합 인터류킨 1β(IL-1β:Genzyme Inc. USA)에 의해 분석한다. IL-1β는 1내지 100유니트/㎖내에서 투여량-의존 방식으로 G-CSF생산을 유도하였으며, 최대로 유도된 G-CSF의 생산은 시험계의 정상적 작용화를 보여준주는 IL-1β가 없는 생산의 10 내지 20배 였다.
특정 농도로 KM-102 세포에 류스트로덕신 A, B 및 C를 각각 투여한 후에, G-CSF 생산은 투여량-의존 방식으로 유도됨이 발견되었다. 최대치에서, 생산된 G-CSF의 양은 첨가 없이 생산된 양의 10 내지 20배 였다.
ED50값은 류트스트로덕신 A,B, 및 C 각각에 대하여 180+50, 50+15 및 50+15ng/㎖인 것으로 발견되었다.
[시험예 3]
NGF 생산의 자극
Furukaw 일행은 생쥐 결합 조직으로 부터 유래한 섬유아세포-형성 L-M세포가 비교적 대량의 NGF를 생산 분비하며 카테콜아민이 이 생산 및 분비를 자극한다고 보고하였다[J. Biol. Chem 261, 6039~6047(1986)]. 우리는 류스트로덕신 NFG생산 및 분비를 자극하는지 아닌지를 시험하였다.
L-M 세포를 0.5%의 펩톤을 함유하는 199배지를 사용하여 배양하였다. 24-웰 배양 플레이트의 각 웰내로, 5×104의 LM-세포를 접종하고 융합할때까지 CO2인큐베이터(37℃, S5%CO2)내에서 배양한다. 배양액을 제거하고, 세포를 0.5% 소혈청 알부인(Sigma)을 함유하는 199배지로 1회 세척한다. 류스트로덕신중 하나를 특정 농도로 0.5% 소혈청 알부민을 함유하는 199배지에 첨가한 다음 L-M세포를 이 혼합물로 처리한다. L-MTPVH를 CO2인큐베이터 내에서 24시간동안 배양한다. 배양액을 수집한 후에, 액체내의 NGF를 분석한다.
NGF를 효소 면역분석법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3513~3516[1983]]에 의해 분석한다. 폴리스티렌 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 75μ1의 항-생쥐-β-NGF 항체[Boehringer]용액[0.3㎍/㎖, pH9.6]을 붓고, 실온에서 한시간동안 방치한다. 항체를 제거한 후에, 모든 웰을 세척용액으로 3회 세척한다. 50μ1의 표준 βNGF(Wako Pure Chem. Ind.) 또는 표준 용액을 각각의 웰내로 붓고 혼합물을 실온에서 6 내지 8시간동안 방치한다. 이 시간의 마지막에, 표준 βNGF 또는 표준용액을 제거하고, 모든 웰을 3회 세척한다. 50μ1의 라벨딩된 항-βNGF단클론성 항체(Boehringer)용액[100mU/M1, pH7.0]을 각 웰에 붓고, 용액을 4℃에서 15내지 18시간동안 방치한다. 이 시간의 마지막에, 효소-라벨링된 항체를 제거하고 모든 웰을 3회 세척한다. 100μ1의 클로로페놀-β-D-갈라토시드(Boehringer)용액[1㎎/㎖, pH7.3]을 각각의 웰내로 붓는다. 적절한 색깔이 전개된 후에(실온에서 2 내지 3시간 후에), 570nm 에서의 흡광도를 측정한다. NGF의 양을 표준 곡선으로 부터 계산 하며, 백분율로서의 이값은 류스트로덕신 처리 없이 이 세포로 부터 생산되고 분비된 NGF의 양과 관련이 있다.
류스트로덕신은 모두 투여량-의존 방식으로 NGF의 생산을 자극하는 것으로 발견되었다. 각각의 류스트로덕신 5μ/㎖에서, 처리 없는 세포와 비교하여 2배 이상의 NGF생산이 유도되었다.
[시험예 4]
항진균 활성
진균의 동물에 대한 병원성에 대한 류스트로덕신의 항균 활성을 시험하기 위하여 트리코피톤 멘타그로피테스에 대하여 활성을 시험하였다. 각각의 류스트로덕신에 있어서, 1㎍/디스크 농도에서 저래 환이 관찰되었다.
[시험예 5]
급성독성
통상적인 방법에 따라서, 급성 독성을 5마리의 ddy 생쥐(수컷)에서 시험했다. 류스트로덕신A의 0.2㎎/㎏투여량의 복강내 투여후 독성은 5일동안 관찰되지 않았다. 유사하게 류스트로덕신B, 류스트로덕신C 및 그들의 관련된 유도체 첨가후 독성은 관찰되지 않았다.
상기 보고된 결과로 부터, 류스트로덕신A, B 및 C는 과립세포 군체-자극 인자 및 과립 세포 거식 세포 군체-자극 인자와 같은 조혈 인자의 생산을 자극함이 명백하다. 따라서, 류스트로덕신은 암 화학요법 및 방사선 요법에 의해 야기된 부작용을 경감하기 위한 치료제로서 유용하다. 또한, 그들은 감염을 예방하며 거식세포의 횔성화를 통한 항암효과를 갖는다. 또한, 류스트로덕신은 NGF 생산을 자극함으로써 뇌의 대사를 개선시키는데에도 유용하다. 또한, 류스트로덕신은 트리코피톤 멘타그로피테스에 대한 그들의 항진균 효과에 이해 보여진 바와같이 항 진균제로서 유용하다.

Claims (7)

  1. 하기 구조식(Ⅰ)의 화합물 또는 그의 염:
    [상기식에서, R은 5-메틸헥사노일옥시기, 6-메틸옥타노일옥시기 또는 7-메틸옥타노일옥시기를 나타낸다.]
  2. 제1항에 있어서, 하기 구조식(Ⅰa)을 갖는 화합물 또는 그의 염:
  3. 제1항에 있어서, 하기 구조식(Ⅰb)을 갖는 화합물 또는 그의 염:
  4. 제1항에 있어서, 하기 구조식(Ⅰc)을 갖는 화합물 또는 그의 염:
  5. 스트렙토마이세스 플라텐시스 SANK 60191 균주(FERM BP-3288)의 류스트로덕신-생산 미생물을 배양하고 배양물로부터 적어도 하나의 류스트로덕신을 채취하는 것을 특징으로하는 제1항 내지 제4항중 어느 한항에 따른 적어도 하나의 류스트로덕신 또는 그의 염의 제조방법.
  6. 스트렙토마이세스 플라텐시스 SANK 60191(FERM BP-3288)의 분리된 배양물.
  7. 제약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 혼합된 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 류스트로덕신 또는 그의 염을 포함하는 제약학적 조성물.
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