TW212182B

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Publication number: TW212182B
Application number: TW081102373A
Authority: TW
Original assignee: Sankyo Co
Priority date: 1991-03-27
Filing date: 1992-03-27
Publication date: 1993-09-01
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212182 Λ 6 U6 經濟部屮央榣準局员工消t合作杜印製五、發明説明（1)發明背景本發明提供一条列名為”白斯妥達辛A ”，”白斯妥逢辛B” 及”白斯妥逹辛C”之新穎化合物。此化合物如後述式（I) 所示。本發明亦提供一種使用鍵徽菌，特指箐拉斯_徽 sati行覆酵而製得此化合物，其亦為新潁且為本發明之一部份。本發明化合物具有多種療效，且本發明亦提供使用此化合物以進行防治之組成物及方法。明之白斯妥達辛為新穎化合物且可剌激産生生血因子，如粒狀細胞鯖落剌瀲因子（此後稱為” G-CSF”）及粒狀細胞巨噬醱醣落刺瀲因子（此後稱為，，GM-CSP”） ;其亦可刺激神經生長因子（此後稱為NGP )之産生；此外，其亦具有抗真豳效力，如對續髮癣jg有抗爽豳效力。許多種细胞激素皆具有生血活性，如刺激菌落之因子 (此後稱為” CSP"),且可由基因操作方法製得各種糖蛋白（普通名為”間白質”）。於睡床上己赛泛地使用此物質以降低因癌症化學療法及同位素療法所引起之不良作用且阻礙感染。近來此物質之效力已明瞭（Br.J. Cancer 69 , 2 -5 ( 1 989)]。已知由各種途徑将此因子投予至人時會造成明顯之麵理效力，因而可使用此因子以作治療。然而，此因子僳由某種细胞於活臞内經複雜之讕節条統而産生（如淋巴細胞，單细胞•成繼維细胞，血管内霣细胞及基質細胞 -3- (請先間讀背而之注恚事項#填寫-i λ) 本紙ft尺度遑用中國B家楳準(CNS)T4規格(210x297公*) 81. 2： 20,000 Λ 6 Β 6 212182 五、發明説明（2 ) 1 ,因此於産生各種血球細胞時扮演穩定之角色。因此 .若不考*此調節檐制之微妙平衡而投予此因子時，則可因此調節檐制之不平衡而引起各種副作用：此副作用之例子包括注射部位發炎，骨疼痛，發熱及寒戰。 S —方面，除了投予生血因子之外，亦可投予某些已知可剌激此生血因子産生之物質。例如•已知間白質1 (此後稱為IL-1)及腹《澳死因子（此後稱為ΤΗΠ可引起各種細胞産生CSF等。然而，此因子因具有各種生物活性，因此不能作為生血因子的專一誘發_。已知各種低分子量免疫活化劑，如脂聚糖（此後稱為 LPS)及胞壁Β基雙版<i«uraByldipeptide)(此後稱為ΜρΡ )可因活化單細胞及巨噬鼸而産生各種csp。然而，亦可同時産生因活化巨噬體而引起生理效褰.如産生 nonokines,如IL-1及TNP,其可造成各種副作用，如發熱[Nippon Acta Radiologica 48, (4>， 514(1988)]。已知Phorbol酯及鈣雄子載腰可協力引發CSF産生 [ICoha^a等人：Experimental He 鼸 atolohy 16, 603-608 、 (1988)],然而，其不僅剌激生血因子之生成亦可剌瀲産生整傾分泌蛋白質，包含荷爾蒙，如胰島素[Y. Nishizuka: Science 225, 1365(1984)]〇雖然此確切機制仍未明瞭，但芘為於形成血球細胞時 ,可因各種生血因子之作用及細胞間之作用，由普通細胞先趨物（生血幹细胞）形成各種成熟血球細胞。已知正 -4- 本紙»尺度遑用中《«家楳準(CNS)甲4規格(210X297公¢) ?先W1讀背'而之注4-^項#填寫4^)

T 象經濟部屮央楳準局貝工消费合作社印製 81. 2. 20,000 212182 五、發明説明（3 ) 經濟部中央檁準局员工消佾合作杜印製常成人形成血球細胞之位置僅限於骨《*，於骨鷂中存在之基霣細胞於形成血球細胞中扮演重要的角色[Dexter 等人，J.Cell. Physiol. 91， 335(1977)]，且骨 β 中基質細胞可産生各種生血因子[Harisaya等人：Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3477 ( 1 985): KohaM 等人： Experimental He重atology 16， 603-608(1988)]〇因此，若發現可剌激基質細胞産生生血因子之物質時則此物質可於生理條件及血液疾病病理下分析生血機制作用中扮演極重要的角色，且其亦可作為》床用途。於歜洲專利申請害第329361號中刊載某種新潁2 -吡喃酮衍生物，其輿本發明化合物相似，除了” R”（定義如後）之本質不同。此先前技術化合物儀可作為農業殺生劑，但不曾發表任何具有如本發明化合物之有價值的防治活性。雖然先前技術之化合物如本發明化合物，皆由普拉斯鏈徽菌製得，但先前文獻所述菌株與此所描述者全然不同。於日本専利申請公閬平2-186中刊載具有相同用途之相似化合物及微生物，且其與此處所述化合物及微生物完全不同。於The Souraal of Antibiotics, Vol. XLII Ηο· 9， P1331中刊載一種新穎抗_化合物（稱為” Phospholine”），其由鏈徽囍所産生且為首次分離出來。然而，此微生物為吸水鍵徽麴且其與本發明所用普拉斯鍵徽豳不同β -5 - 本紙5Jt尺度遑用中ΒΒ家楳準(CNS)T4規格(210x29/公：《：) 81. 2. 20,000 (請先閲讀背·而之注愈事項朴塡寫為) % Τ 212182 Λ 6 Η 6 五、發明説明（4 此外，雖然先前技術之Phospholine輿本發明化合物相似，皆具有胺基及磷基，但二者之分子式不同。發明總結本發明目的之一為提供一条列新穎雔酸化合物，且其具有多種蕖理活性。且認為本發明化合物有下列活性：可降低由癌症化學療法或同位素療法所引起之不良反應；可保護不受感染! ;可活化巨噬體因而有抗癌效用；可增進腦的功能；且可作為抗舆菌剤。因此，本發明提供如式（I)之化合物及其鹽： .0

先閲請背 (ίί 之注事項填 % 本一經濟部中央櫺準局员工消t合作社印製或基氣 0 辛基甲 6 為，名基命氣別醏分己物基合甲化 5-此為。及 R 基 Β 中氣辛式酵達辛達妥斯白辛妥基斯甲白辛逹妥斯白含液包養中培其由，並法，方物之生辛微逹之妥辛斯逹白妥備斯製白種生二産供可提之亦皤明徽發鏈本餐培混且鹽其或辛達妥斯白。上辛以達種妥一斯含白種的一種供 1 提少亦至明集發收本可本紙張尺度逍用中國國家榣準(CNS) <P4規格(210x297公A) 81. 2. 20,000 212182 Λ f) η 6

五、發明説明（5) 合以製藥容許載體或稀釋劑之製藥組成物。本發明亦提供一種防治由癌症化學療法或間位素療法所引起的不良反慝；感染；癌症；腦功能不足，及真菌感染之方法，其中包含投予有效量之一種以上白斯妥連辛或其鹽至哺乳動物，其可為患有或易感染以此反醮，感染，癌症或功能不足之人。本發明之詳述本發明之三種白斯妥達辛如下所示：白舫容璩辛A

(請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁) 裝- 線· 經濟部中央榣準局员工消费合作社印製

-7 本紙張尺度遍用中a Η家楳毕(CNS) T4規格(210x297公龙) 81. 2. 20,000 212182 Λ fi It 6 五、發明説明（6) ' ， 6-甲基辛醏氣基白容璩辛Γ

經濟部中央標準局员工消费合作杜印製由上式可知本發明之白斯妥達辛含數備不對稱磺原子及雙鍵。因此可形成各種光學及幾何異構物。雖然此處皆以單一分子式表示，但本發明含値別，分離之異構物及其混液，及其消旋異構物。當使用立體專一性合成技術或使用光學活性化合物為原料，亦可直接製得偁別異構物；此外，當製得異構物混液時，可依傳統解析方法得匍別異構物。本發明之白斯妥逹辛可經由培餐鐽徽a之可産生白斯妥逹辛的微生物，再由培餐液收集一種以上白斯妥達辛而製得。持別喜歡使用由鏈徽薗新分雔出來的薗株，其傜靨於普拉斯鏈徽薗且命名為SANK 6019UFERM BP-3288 >。此撤生物是依布逹傾斯條約，於2月20日，199〗存於醱酵研究所（日本工、業科技院），其编號為FERM BP-3288 ~ 8 - 本紙張尺度逍用中B 8家»準(CNS)T 4規格(210X297公；it) 81. 2. 20,000 212182 Λ 6 Ιϊ 6 五、發明説明（7 經濟部中央標準局β工消费合作杜印製下列詳述普拉斯鏈徽薗之微生物性質。 1 .外形特性將普拉斯鐽徽菌S A Ν 1C 6 0 1 9 1於I S Ρ (國際鏈徽@計畫）所定義之洋菜培養基及2 8 t：下培養1 4天β 1 4天後於顯微鏡下觀察，可發現此豳株之受質菌絲伸長且分枝，顔色為黃灰色或淡黄桔色。然而，參見諸Nocardia形放線菌之片段化及鋸齒形之延長。其氣生薗絲有籣單之分枝。孢子鐽為鬆螺旋形，且每條鏈上會形成10-50以上之孢子。於掃描電子顯撇鏡下觀察可發現孢子表面平滑。孢子為卵形成椭圔形，且大小為0.5-0.6X 0.6-1.3/u ·。且並無氣生菌絲旋轉，_核，菌絲Η段化及特別器官，如孢子囊。 2.於各種培養基之性質将微生物於各種培養基及28t：下培餐14天之性質列於表1 。顔色是依日本彩色研究所所著” Guide to Color Standard”之號碼來表示。此豳會随時間變潮溼且顔色變為黑色。於表中，使用下列缩寫： G ：生長 AM :氣生菌絲 ' R : 反相 SP :可溶性色素 i 先閲讀而之注意. 事項冉填寫木一 Ά 裝線本紙張尺度遑用中B明家榣準(CNS) 4規格(210X297公《：) 81. 2. 20,000 212182 Λ 6 η 6 五、發明説明（8 ) S C :特殊性質表1 培養基項目 SANK 60191之性質經濟部中央檁準局β工消费合作杜印製廉糖 -硝酸鹽 G ：良好 • 平 ,淡黄桔色 (2 -9· -9) 洋菜 AH ：良好 t 輕柔 ,淡棕灰色 (2 -7- -8) R ：淡棕色 (2 _ 8 -9) SP ：不形成 m 萄糖- 天門冬 G ：良好 » 平滑 ,淡黃桔色 (2 -9- -9) 胺酸 AM ：適度 > 輕柔 ,白色洋菜 R ：淡棕色 (2 -8 -9) SP ：不形成甘油 -天門 G ：非常良好 » 平滑 9 淡黃桔色 (2-9-9) 胺酸 AH ：適度 9 輕柔 >棕灰色 (2 -6 -8 洋菜 R ：淡黃棕色 (4 -8-9) (ISP 5) SP ：不形成無機鹽- 澱粉 G ：良好，平滑 ,淡黃桔色 (2 -9 -9) 洋菜 AM : 良好 t 輕柔 ,栋白色 (1 _ 6 -6 (ISP 4) R ：棕灰色 (2 -5 -9) SP : 不形成 SC : 氣生菌絲潮溼且顔色變為黑色 -10- (請先閲讀K之注态事項#填寫裝· _ 線. 本紙張尺度逍用中國Β家《準(CN5) 規格(210X297公龙) 81. 2. 20,000 212182 Λ 6 Π 6 五、發明説明（9 酪胺酸洋菜 (ISP 7) 營養洋菜 (DIFCO) 酵母萃取液肉萃取液 (ISP 2) G:非常良好，平滑，淡黃桔色（2-9-9) AM:良好，輕柔，白色，淡棕灰（2-7-8)點 R :淡黃棕色（4-8-9) SP :不形成 G :逋度，平滑，淡黃桔色（2-9-9) AM :良好，輕柔，白色 R :淡黃棕色（4-8-9) SP :不形成 G:非常良好，平滑，淡黃桔色（2-9-9) AM:大量形成，輕柔，淡棕白色（1-7-6) R :淡黃棕色（6-7-9) SP :不形成 SC:氣生菌絲潮溼且顔色變為黑色

Tk 先閲讀背，而之注事項填 % 本一裝訂燕麥洋菜 (ISP 3) 經濟部中央橾準局员工消费合作社印製 G:良好，平滑，淡黃桔色（2-9-9> AM:良好，輕柔，黑棕灰色U-4-6) R :黄棕色（4-6-9) SP :不形成 11- 本紙張尺度逍用中a B家楳準(CNS) Ή規格(210x297公龙) 81. 2. 20,000 212182 Λ 6 Π 6 五、發明説明（ίο) 水洋菜 G :生長適度，平滑，黄灰色（1-9-10) AM:適度，輕柔，棕灰色（2-5-8) R :亮棕灰色（2-7-8) SP :不形成馬鈴鬈萃取液胡蘿葡萃取液洋菜 G:適度，平滑，黃灰色（2-9-10) AM:適度，輕柔，棕灰色（2-5-8) R :淡棕灰色（2-7-8) SP :不形成 3.生理性質將菌株S A N Κ 6 0 1 9 1於28 *0下培養2 - 2 1天間所觀察之生理性質列於表2 。 1? 先閲而之 /ΐ 事項孙填 % 裝 η 線經濟部屮央標準局貞工消费合作杜印製 -12- 本紙51尺度遑用中國明家楳準(CNS) ΤΜ規格(210X297公货) 81. 2. 20,000 212182 Λ fi Π 6 五、發明説明（11) 經濟部屮央樣準局貝工消费合作社印製表2 水解澱粉 + 液化明醪 - 邏原硝酸鹽 - 凝聚牛奶 - 牛乳諫化 - 産生類黑色素 (培養基1) ** - (培養基2) - (培養基3 ) - 分解受質酪朊 - 酪胺酸 + 黃質 - 生長溫度範ΒΒ (培養基4) 9-35V 最適生長溫度（培餐基2 0-26 t：氛化納射受力 10X **培餐基1:胰蛋白膝-酵母萃取液（ISP 1) 2:臃-酵母萃取液雄質洋菜（ISP 6) 3:酪胺酸洋菜 4:酵母萃取液-肉萃取掖洋菜（ISP 2) 使用Pridhaa-Gottieb洋菜（ISP 9)為培養基並於281C 下培養菌株SANK 60191。於14天後對1«葱之蓮用情形列 13- 本紙張尺度逍用中a B家標毕(CNS)甲4規格（210X297公¢) 81. 2. 20,000 1? 先閲背而- 之注意. 事項孙填寫本- t 裝訂 Λ 6 Η 6 212182 五、發明説明（12) 於表3 。表3 D-果耱 L-鼠李糖廉耱棉子糖對照組先閲 ih 背而之注意事項 # 填寫本 D-葡萄耱 + L -眄拉伯糖 - D -木糖 _ 肌酵 + D-甘露耱酵 + 4.細胞成份依 B.Bocker等人之方法[Applied Microbiolohy， 12· 4 21 - 4 2 3 (19 8 4)]分析薗株S A N P 6 0 1 91之細胞壁。由於可偵測到LL -二胺庚二酸，因而確定為型式I之細胞壁。此外，依 M.P.Lechevalier之方法[Journal of Laboratory & Clinical Medicine, 71, 934(1968)]分析 SAHK 60191 之全部細胞的耱組成份。無任何待殊之形式。由此撤生物性質可知此皤株傺屬於放線菌的鰱徽當與由 E.B.Shirling及 D.Gottlieb之 ISP[International Journal of Systematic Bacteriology 18, 08-189(1968) 經濟部屮央標準局貝工消费合作社印製；18, 279-392(1968)； 19, 391-513(1969)； 22, 265-394(1972)]所述®株，及其它如S.A.Waksian所著"The Actionycetes, V ο 1. 2"由 R.E.Buchanan及 Η.E.Gibbons 所述 ’’Borgey's Manual of Determinative Bacteriology ,81 h Edition ( 1974) ", "Bergey ' s Man.ual of Systematic B a c t e r i o 1 o g y，V o 1 . 4 (1 9 8 9) ” 中所述 S3 株，及其它有 -14- 81. 2. 20,000 本紙Λ尺度遑用中a B家楳毕(CNS) T4規格(210：)<297公釐> 212182 Λ 6 η 6 經濟部+央櫺準局貝工消费合作杜印製五、發明説明（13) 鬭放線_之文獻所述蔺株相比較，可知此菌相當坻似替拉斯鐽徽鋪。此外，當使用酵母S 一葡萄糖培餐基進行液_培養後 ,19株SANK 60191可産生具有紅棕色的可溶性色素。當加入0.05N HC1之後，則會變為黄色，當加入〇.〇5n NaOH 後則無任何改變。将普拉斯鏈徽讁於酵母豳萃取液一肉萃取液洋菜，燕麥洋菜，無機鹽一澱粉洋菜，及甘油一天門冬胺酸洋菜培餐基上培餐後，可産生紅色或黃色色素。此外，鼸株 SANK 60191幾乎不産生此色素.亦即此鮪株與已知普拉斯鐽徽菌不同。然而，此新穎豳株與已知_株之差異僅在於可溶性色素之生成，故将SAHK 60 191定為普拉斯鏈徽齠之新潁菌株。已知豳株SANK 60191可産生白斯妥逹辛。然而，如眾所知，一般真特指放線菌之性質可有相酋的變異，且可自然因素及人為方法（如UV照射，同位素照射，化學處理等）而引起變異。因此，本發明包含任何分類為鐽徽0,且具有SAHK 60191之可産生白斯妥逋辛之徹生物的用途。此外亦包含由基因工程技術，如重組，轉導，轉形等方法而得之突變株。基於此處所提供白斯妥達辛之性質，經由簡睪實驗可澜定篇株是否産生此化合物或産生足夠之量使其成為具有商業價值。除了上述普拉斯鏈徽_之新纘篇株，亦發明普拉斯鰱 -1 5 -- (請先閱讀背_而之注咅.&*事項再填、寫4{^)

T 泉本紙》尺度遑用中a Η家標毕(CNS>>fM規格(210x297公; 81. 2. 20,000 212182 Λ 6 Π 6 五、發明説明（14) 經濟部中央標準局员工消费合作杜印製嫌菌SAM-0654 (於1月22日，1988存於醱酵研究所，日本 ^ 請 ,编號為FERM ΒΡ-1668)可産生本發明之白斯妥逵辛。 ^ 於歃洲専利第329361號中已詳述此菌株 » 因此亦列入本讀背. 發明以參考〇而之注本發明之白斯妥達辛可依将此真菌於相似微生物用以意. 事産生其它醱酵産物之傳统培養基中培養而製得〇如精於項填此 m 者所知 9 此培養基含有撤生物可利用之磺源及氮源寫本一擎及無機鹽〇 m 源之較佳例子含 : 葡萄糖 9 果糖参麥芽糖 * 餘糖甘露糖酵 » 甘油 * 糊精 » 燕麥 » 大麥 » 玉米澱粉 » 馬鈴 m k 澱粉 9 玉米粉 • 大豆粉 > 棉籽餅 » 棉籽油 9 糖蜜 » 檸樣酸 » 酒石酸等〇此化合物可單播使用或適雷組合使用〇 ‘丁一般使用量可為培養基重量百分比之 1-10*0 較佳氮源為含蛋白質之物質 • 如一般醱酵作用中所使 ψ 用者〇此氰源之例子為 ·* 大豆粉 * 小麥期 9 花生粉 » 棉籽拼 • 棉籽油 9 棉籽粉 9 酪朊水解物 ♦ 發 m 胺擎魚粉 9 玉米浸液 « 諫 9 肉萃取液 9 酵母 f 酵母萃取液 t 肉萃取液 9 m 酸納 * 硝酸软 9 硫酸銨等〇此 m 源可單 m 使用或適當组合使用〇一般使用量為培養基重量百分 fcb 0 . 2- 6% 較佳〇欲混入培餐基之營餐無機鹽可為傳统用以提供徽生物 ·%, 生長所需各種離子之鹽 9 如 m » 銨 > m » m 酸鹽 t 硫酸鹽 » 氮及硪酸鹽離子〇此外 * 培養基可含少量之必需黴 -16- 本紙張尺度逍用中國Β家標準(CNS) Τ 4規格(210X297公*) 81. 2. 20,000 Λ 6 Η 6 212182 五、發明説明（15) (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) 量元素，如鉀，鈣，鈷，錳，鐵及鎂。當以液髓培餐方法進行本發明製法時，最好加入抗起泡劑，如矽油，植物油或表面活性劑至培養液中。於培餐鏈徽_ (特指SANK 60191)以産生白斯妥逹辛之培餐基的pH最好為5.0-8.0,又以pH5.0-7.0較佳。此培餐可於9-37P間任何溫度之下進行。然而，於20 -35t：間之生長較好，因此以20-35¾較佳。22-30Ρ為最適於産生白斯妥逹辛的溫度。經濟部屮央標準局β工消费合作社印製此化合物可於好氣培餐條件及傳统好氣培養方法之下製得，如可使用固鼸培養，振遢培餐及通以氣鼸並攪拌之培餐方法。於小量培養時，一般為於28 t：之下振通培養數天。於小量培餐之方法中，可先將培餐液於載有播板之錐瓶（其作為液醱流動_節器）中作一或二次增殖步驟以産生種培養基。作為種培養步®之培餐基最好含有磺及氣源。於此小董培餐之較佳操作序列中，可將種培餐瓶於28 t之培養箱中振播3天或直到逹到足夠之生長。將種培餐液移至第二種培餐基或生産培餐基中。當使用中間生長相時，則需使用相同方法以生長並將所得中間産物液臁接種至生産培餐基中。將所接種之煉瓶振盪培養數天，且培餐之後，将燒瓶中液體離心或過滅。於大量生産時，則最好使用附有攪拌器及通氣設備之適當强'酵機。於此例子中，可於醱酵機中製得營養培餐基。将溫度提升至適當溫度，如120- 1 25·〇以將培餐基 -17- 本紙張尺度遑用中Β困家楳準(CNS) Τ4規格(210x297公Α) 81. 2. 20,000 212182 Λ () Ιϊ 6 五、發明説明（16) 滅_;冷卻後，將無豳培餐基接種以先前製得之液。於振鼸，通氣及如28Ό之適當溫度下進行培此方法可得大量之本發明化合物。可使用任適當方法，如於醱酵方法中熟知之离液體靥析法來偵测随著培餐時間之增加所製得白種培餐養。由辛量的變化解析度斯妥達般而言，當培養48-96小時後可産生最經濟部中央櫺準局员工消t合作杜印製多的白斯妥逹辛。培餐之後，可使用傳統方法，如使用白斯妥逹辛之物化性質來萃取純化留於培餐液及細菌細·胞之白斯妥連辛。例如，當白斯妥逹辛存於濾液或上清液時，則可使用水不混溶之有機溶劑，如乙酸乙酯，氛仿，二氰乙烷，二氛甲烷或丁醇（或任二種以上溶劑之混液），於酸性之下萃取出來。再以傳统方法純化。亦可於齡性下使用一種以上之上述溶劑举取以去除不純物。再以傳統方法純化。此外，亦可將含白斯妥逹辛之液體通適當吸附層以吸附除去不純物，或者可將白斯妥逹辛吸附於適當吸附薄I上再以適酋溶離液，如甲酵，丙酮或丁酵溶離。於此方法中可用之適笛吸附劑含活性硪及吸附樹脂，如 Anberlite XAD-4(Roh· & Haas産m之商品名）或Diaion HP-10, HP-20, CHP-20, HP-50(三菱化學工業公司産品之商品名）。笛白斯妥連辛存於細胞時，則可用適酋溶劑，如臞稹為50-90X之丙酮或甲酵溶液荦取，除去有機溶劑，再依上述濾液所用萃取及純化方法處理。 -18 本紙張尺度遑用中a國家標毕(CHS)1? 4規格(2丨0X297公址） 81. 2. 20,000

? 先閲背、而之注意· 事項孙填寫本一V 裝 •3Τ 212182 Λ 6 η 6 經濟部中央榣準局貝工消费合作杜印製五、發明説明（Γ7) 所得白斯妥達辛可再依己知方法純化，如使用繭釀（如依商品名為"Florisil"之矽膠或鎂-矽驂）之吸附管柱層析法；使用如Sephadex LH-20((Phareacia産品之商品）為吸附劑之部份管柱層析法；或使用一般相或反相管柱之离解析度液體靥析法。如眾知周知，此分離及純化可單ϊ»進行或以適當組合來進行.且若需要，可重覆以分離純化目的之白斯妥連辛。本發明之白斯妥達辛為未於文獻中報導遇之新穎化合物。其可於動物（如人，狗，貓及兔子.）中剌激造血因子，如G-CSF及GM-CSF之産生，因此可作為降低因癌症化學療法及同位素療法所引起的副作用之治療劑；其亦可經活化巨噬龌而預防感染及表現出抗癌作用。此外，白斯妥達辛可因刺激生成NGF而增進臛部代謝。此外，其可作為抗真@瘌且對鬚髮癣菌有抗真麴效力。依本發明白斯妥遽辛刺瀲生成造血因子之能力可由如 Kohama等人所述方法分析[Experimental Hematolohy 16，603-608 ( 1 988)]。於此方法中，將各種造血因子之生産糸統與各種造血因子的分析条統結合。例如，使用源自人骨«基霣細胞之KM-102以産生各種造血因子。然而，可使用任何可産生各種进血因子之细胞以取代之· 如首次培《骨《基質細胞，血管内皮細胞，淋巴細胞或存於骨《之巨噬龌。将待澜活性之化合物試驗樣本稀釋至適當濃度並加入含可産生各種造血因子之細胞（HP-生 -19- 本紙»尺度遑用中國困家楳毕(CNS) T4規格(210x297公 81. 2. 20,000 經濟部中央櫺準局β工消赀合作社印製 ^1218¾ 五、發明説明（18) 成細胞）的培養条。經適當時間（一般為24小時）後，取出培餐液之部份上清液，並以適當濃度加入視各種造血因子之细胞，如TF-1細胞及NFS-60細胞（"HF -産生細胞）的培餐条中。經一段畤間後，經測量HF-産生細胞之生長可測得造血因子之量，並可分析此化合物剌激産生各種造血因子之能力。依各種傳統方法，如於細胞中混入氚-胸腺嘧啶或使用MTT[3-(4,5-二甲喀唑-2-基）2,5-二苯四唑溴]分析方法，可測得依賴HF -細胞之生長。可依任何傳統方法，如_落形成方法或ELISA方法，進行各種造血因子之分析。本發明白斯妥逹辛含酸性基（磷酸基）及齡性基（胺基） ,因此可形成鹽。關於所使用之鹽並無持別限制，笛其為治療用刖為製藥容許即可。當為非翳療用途，如製儋中間産物，則可為更具活性之化合物。本發明化合物可與_形成鹽。此鹽之例子含齡金臑鹽，如納，鉀或鋰；鹺土金屬鹽，如鋇或鈣；其它金屬之鹽，如鎂或鋁；有機齡鹽，如二瑪己胺鹽；及齡性胺基酸之鹽，如離胺酸或精胺酸。本發明化合物亦可形成酸加成鹽。此酸加成鹽之例子含有金靨酸鹽，待指氫鹵酸（如氫氟酸，氫溴酸，氫碘酸费氫氛酸），硝酸，過氱酸，碳酸，硫酸或磷酸；低烷磺酸鹽，如甲烷磺酸，三氟甲烷磺酸或乙烷磺酸；芳磺酸鹽，如苯磺酸或對一甲苯磺酸；有機羧酸鹽，如乙酸，甲酸，酒石酸，草酸，順丁烯二酸，羥基 -20- * (請先閲讀背而之注意事項#堝寫本頁) 裝· 訂· 線. 本紙張尺度逍用中國困家標準(CNS)肀4規格（210X297公¢) 83. 2. 20,000 212182 Λ fiη 6 五、發明説明（19) 丁二酸天門冬當此活性化形劑，視投予方為粉 ,則最 )或滴合劑，浮劑或病m及法而定 ,琥珀醴胺酸。化合物欲合物之外或佐劑的途徑而定末，粒劑好處方為劑，栓劑崩散劑，被覆劑之年齡，疾。當以口胺或檸檬酸；及胺基酸鹽，如麩胺酸或為治療 ,添加適當製。然而 ,錠劑注射液。此製潤滑劑已知方病之本投予至用途時，則一種以上傅藥處方來投，於口投予，膠囊或糖 (其可為靜劑可由加入，穩定劑，法而製得。質及嚴重程成人病患時以一天之劑量為lmg-1000«g投予。分批劑置投予，如一天投予2-3次可單》统稀釋予。此時，此漿。於脈，肌添加物橋正劑雖然劑度，及 ,則本此化合投予或劑，載處方的化合物非膠胃肉或皮 ,如載，溶解量可視投予途發明化物可以者除了體，賦本霣可最好處投予時下投予體，結劑，懸病人之徑及方合物可單獮或

Tk 先閲讀背而' 之注意* 事項再寫本·一·' 裝訂經濟部屮央櫺準局兵工消费合作社印製本發明化合物之製備將由下列例子作更詳盡説明，但其範圍並不限於此。例1 培養並分離白斯妥達辛 1 (A)培養將-鉑環量之普拉斯鏈徽讁SAHP 載有播板及含100·1無菌培養液（其 »1錐瓶中.並於28 ΐ：及使用轉動振 60191之孢子接種至組成如下所示）之500 通器於200rp» (旋轉 -21 本紙》尺度逍用中a B家標準(CNS)肀4規格(210x297公址) 81. 2. 20,000 212182 Λ 6 It 6 五、發明説明（20) 為 7c B ) 之下培養3天。養液可溶性澱粉 30g 天然酵 .母 m 10g 大豆粉 7g 隹 “、、粉 5 g 玉米浸液 2g 肉萃取物 1 g m 酸鈣 1 g 加水至 1000 n 1 先閲讀背而之 /ϊ 意《事項孙填 % 本 η 經濟部屮央櫺準局貝工消费合作社印製 PH7 (滅菌之前）將作為種培養之相同培餐液15JI各置於4値30JI之不銹鋼醱酵瓶中，加熱至1201C 30分以滅菌。加入150*U之上述所得種培養液。將混液於28C及15立/分之通氣速度之下懺拌培養3天。為了使液體中氣氣灌度維持為5 ppb ,則需自動控制播拌率為100-300rpm。 1 (B)分離於上述1 (A)中所得培養液60 JI中加入2 . 4kg Celite 545 (Johns & M a n v i 1 1 e Project Corporation, USA産品之商品名）作為肋濾器，並過濾混合液。過濾之後可得7.41^細_細胞。將細胞以30_{150!^、丙_萃取1次，再以20A80!U/V丙酮各萃取2次。結合萃取液並使用轉動蒸發器蒸除有機溶劑。加入足夠的鹽酸以調整pH值為 -22- 本紙張尺度遑用中Β Β家標毕(CNS)T4規格(210x297公*) 81. 2. 20,000 212182 Λ 6 Β 6 五、發明説明（21) 經濟部中央標準局员工消费合作社印製 2.0，並將混合液以10义乙酸乙酯萃取二次。結合萃取液並加入10 A liiw/v硪酸氫納溶液。將活性部份移至水靥並除去乙酸乙酯。將乙酸乙酯層再以5jllS!w/y磺酸氳納溶液洗。結合硝酸氫納溶液並加入HC1調整pH值為 2.0 。將溶液以10JL乙酸乙酯各萃取二次。結合有機萃取液，以水及飽和氰化納溶液洗後於與水硫酸銷下乾燥。於持鑛加入甲酵期間，将溶液使用轉動蒸發器減壓濃縮可得ΙΟβΙ油狀物。将油狀物溶於100ml 60!U/V甲酵中，並将溶液以 Sep-Pak Vac 20. cc Cia Cartridges (Waters Co.産品之商品名，美國）吸附。将不純物以30 ml 60!Uv/v甲酵溶離。再將白斯妥達辛以15a»l 100X甲酵溶離，濃縮後可得800»g油狀物。將油狀物溶於10ml甲醇中並通以高解析度液饅層析。收集於約13分及24分有高峰之部份並分別名為”部份A ”及”部份B”。下列為靥析所用之條件。製備液體層析管柱：Radial-Pak 25xlO(Waters,美國）溶離溶劑：50X乙腈，其中含0.5JK三乙胺-磷酸鹽緩衝液，PH3.0 流娃：9毫升/分波長：2 3 0 η 將所有高峰溶液濃縮後，將所得部份通以製備高解析液體層析。将部份Α於下列條件下通以裂備靥析以收集 -23 本紙張尺度遑用中a明家楳準(CNS) Τ4規格(2丨0X297公;¢) 81. 2. 20,000 先閲讀背而之注意事項填寫本 η 21218 212182 Λ 6 η 6 五、發明説明（22) 經濟部屮央標準局员工消费合作社印製約56分之高峰；再以Sep-Pak去鹽及濃縮可得11.66«g白斯妥逹辛A 。部份A之製備條件管柱：C 〇 s 〇 s i 1 5 C 1 8 - A R 2 Ο X 2 5 0 (N a k a r a i t e s q u e Inc.) 溶離溶劑：42!K v/v乙脯，其中含0.5X三乙胺-磷酸鹽缓衡液，pH3 . Ο 流速：9毫升/分波長：230η· 将部份Β以下列條件通以製備層析以收集約47及51分之高峰；再以Sep-Pak去鹽及濃縮可得9.83ag白斯妥達辛B及5 . 22ng白斯妥逹辛C 。部份B之製備條件管柱：C 〇 s 〇 s i 】5 C 1 8 - A R 2 Ο X 2 5 0 a b ( H a k a r* a i t e s q u e Inc.) 溶離溶47!K v/v乙腈，其中含0.5S；三乙胺-磷酸鹽缓衝液，pH3 . Ο 流速：9毫升/分波長：230η π 所得白斯妥達辛具有下列待質：白斯妥達辛A 1) 化學式：上述式（la)。 2) 本質：酸性及脂溶性。 -24 本紙5艮尺度遑用中國Β家標毕(CNS) f 4規格(210X297公；¢) 81. 2. 20,000

Tk 先閲背而之注意事項孙填 % 本 η 21218 21&182 Λ 6 B 6 五、發明説明（23) 3)_色：淡黄色油狀物。 4 )分子式：c32 Η 52 °10、N p 5)分子董：841,以FAB-MS方法满定（"FAB-MS”為

East, At〇 Boibardient Mass Spect-roaetry〇 6>UV吸牧光譜：234nB(於甲酵有極大吸收值） 7)红外線吸收光譜：紅外線光辑有下列極大吸收值 (液膜 "vmax cm -1 ) ：2933, 2867， 1 728 , 1464, 1 383 , 1 248 , 1176, 1056 , 969 H- NMR光譜：於重甲酵 ,使用三甲矽烷為内部標準，可得下列 NMR光譜 (270 ΗΗ 7 . 08 (1H , 二 m 雙線， J = 9 . 8 & 4. 9 Η ζ)； 6 . 21 -6.35 (2Η · 多線） • 6 . 06 (1H , 二 m 雙線， J = 15 .6 & 6 .1 Ηζ)； 6 . 02 (1H, 二雙線， J = 9 . 8 & 1 . 4 Η ζ)； 5 . 94 (1 Η , 雙線 ,J = 15 .6 Hz) • 9 5 · 46 (1Η , 多線 )； 5 . 31 (1Η , 多線 )； 5 . 10 (1Η . 二個雙線， J = 6 . 1 & 4 . 4 Η ζ)； 4 . 94 (1Η , 多線 )； 4 . 72 (1Η , 多線 )； 4. 29 (1Η , 三傾雙線， J = 10 .1 > 10 .1 & 2.4 Η 經濟部中央標準局EC工消费合作杜印製先閲讀背 iff；' 之注事項填寫本 I、 25 本紙》尺度遑用中國國家楳毕(CNS) T4規格(210X297公；¢) 81. 2. 20,000 212182 Λ fi II 6 五、發明説明（24) 2.93-3 . 15 (2H ,多線 > ; 2.50-2.7U2H,多線）； 2.25(2H,三線，J=7.6 Hz); 2 . 1 6 (1 Η ,多線）； Ο .99-2 . 01 (18H ,多線）； 0.95(3H,三線，J = 7.6Hz)·; 0.89(6H,雙線，J=6.8Hz)。 ^^C-NMR光譜（d:pp·):於重甲酵，以三甲矽烷為内部樣準，可得下列 NMR光譜（270 MHz): 11.4(四線），22.7(三線）.22·9(四線）， 22 . 9 (四線），24.0 (三線）， 28.9 (雙線），32.4 (三線）， 34 . 3 (三線），35 . 7 (三線）， 37 . 1 (三線），39 . 4 (三線），40 . 6 (雙線 > ,40.6 (三線 > , 77 . 8 (單線）， 121. 1 (雙線）

Tk 先閲讀背而之意· 事項孙填寫本 Ά 經濟部屮央標準局GX工消费合作社印製 73 . 9 (雙線）， 82 . 3 («線 >， 124· 3 (雙線） 137 . 3 (雙線） 166 . 3 (單線〉 24.7 (四線）， 33 . 1 (三線）， 36. 1 (雙線）， 39 . 5 (三線）， 64.7 (雙線）， 78 . 5 (雙線）， 123.7(雙線）， 127 . 7 (雙線），135 . 3 (雙線）， 138.2 (雙線），152 . 7 (雙線）， 175 . 0 (單線）。 1 0 )溶解度：可溶於酵，如甲酵，乙醇或丁酵；並可溶於丙酮 -26- 本紙張尺度边用中a Η家標毕(CNS)肀4規格(210><297公;《：) 81. 2. 20,000

Λ 6 Η G

«仿，乙酸乙酯及二甲亞ΜΙ ;於水中有些許溶 212182 (請先閲請背而之注意事項#填^3 解度；不溶於己烷。 1 1)顔色反應：對硫酸，碘，節滿三酮及鉬酸銨-過氱酸反應呈陽性。 12)高解析度液層析：分離管柱：CosBosil 5C18-AR(管柱大小：4.6Χ 250j»b, Nakaraitesque Inc.之産品）溶劑：45S! v/v乙腈，其中含0.5S!三乙胺-磷酸鹽缓衝液（pH3) 溶速：1毫升/分波長：230ηιβ 滯留時間：9 . 0 6分與9 . 1 6分之間白斯妥逹辛B : 1)化學式：上述式（lb)。 2 )本質：酸性及脂溶性。 3 )顔色 •·淡黃色油狀物。

4) 分子式：C34H 56〇10 NP 經濟部屮央榀準局A工消伢合作社印製 5) 分子量：669,以PAB-MS方法測定得。 6) UV吸收光辑：234nB(於甲酵有極大吸收） 7) 紅外線吸收光进：红外線光譜有下列棰大吸收值 (液膜 ,vmax cm'1 ) ： 2927 2855 , 1 729 , 1463, 1380. 1 250, 1172 , 1 056 . 968 -27- 81. 2. 20,000 本紙Λ尺度边用中B «家標準（CNS) 4規格（210X297公;¢) 212182 Λ 6 η 6 經濟部中央櫺準局员工消#合作社印製五、發明説明（26) e^H-NMR光譜：於重甲酵中，使用三甲矽烷為内部榡準，可得下列NMR光譜（270 MHz)： 7.09UH,二锢雙線，J = 9.8 & 4.9 Hz); 6.21 -6.35 (2H，多線）； 6·07(1Η,二儀雙線，J=15.6 & 6.1 Hz); 6·02(1Η,二侮雙線，J=9.8 & 1.5 Hz); 5.94(1H,雙線，J=15.6 Hz>; 5.46 (1H,多線）； 5.31 (1H,多線）； 5 · 1 0 ( 1 H ,二鏟雙線，J = 6 . 1 & 4 . 4 H z ); 4.94 (1H ,多線）； 4.72(1H,多線）； 4 . 2 9 (1 H ,三傾雙線，J = 9.9 , 9 . 9 & 2 . 6 H z ); 2.93-3.15 (2H,多線）； 2 . 50-2 . 71 (2H ,多線）； 2 . 27 (2H ,三線，J = 7 . 3 Hz); 2.17UH,多線）； 1.00-2.01(22H,多線）； 0 . 95 (3H ,三線，J = 7 . 5 Hz); 0 . 87 (6H ,雙線，J = 6 . 8 Hz), 0.86 (3H ,雙線，J = 6.6 Hz)。 9 ) 13 C - N M R光辑（δ : p p ):於重甲酵中，使用三甲 -2 8 _ 各紙張尺度遑用中S國家楳毕(CNS)T4規格(210X297公激：） 81. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項洱填寫本裝· 訂 212182 Λ 6 Β 6 經濟部中央櫺準局员工消费合作社印製五、發明説明（27) 矽烷為内部標準，可得下列之HMR光譜（270 MHz)： 11.4(四線），11.7(四線），19·6(四線）， 22.7(三線），24.7(三線 26.4(三線 >, 27.6(三線），30.6(三線），32.4(三線 >, 33.1(三線），34.1(三線），35.5(三線）， 35.5(雙線），36.1(雙線），37.1(三線）， 37.3(三線），39.4(三線），40.6(雙線）， 40.6(三線），64.7(雙線），73.9(雙線）， 77.8(單線），78.5(雙線），82.3(雙線）， 121.0(雙線），123.7(雙線），124.3(雙線）， 127.7(雙線），135.2(雙線），137.4(雙線 >, 138.2(雙線），152.7(雙線），166.4(單線）， 175 · 1 (簞線）。 1 0 )溶解度：可溶於酵，如甲酵，乙酵或丁酵；並可溶於丙酮，氛仿，乙酸乙酯及二甲亞W;些許溶於水；不溶於己烷。 1 1)顔色反應：對硫酸，碘，茚滿三_及鮰酸銨-過氯酸反應呈曝性。 12)高解析度液層析：分離管柱：Cosaosil 5C18-AR (管柱大小：4.6X -29- (請先間讀背而之注意事項#填寫本貝) 本紙張尺度逍用中a B家榣毕(CNS) T4規格(210X297公货) 81. 2. 20,000 212182 82. 2· 1 8 Λ It c 經濟部屮央櫺準局A工消伢合作杜印5i 五、發明説明（28) 250πιβ, Nakaraitesque Inc.之産品）溶劑：45X v/v乙腈，其中含0.5X三乙胺-磷酸鹽缓衝液（PH3) 溶速：1毫升/分波長：230η·

滞留時間：20.62分與20.87分之間白斯妥逹辛C 1)化學式：上述式（Ic)。 2 )本質：酸性及脂溶性。 3) 顔色：淡黃色油狀物。

4) 分子式：C34H 5601QNP 5) 分子量：669,由FAB-MS方法測得。 6) UV吸收光譜：234nB(於甲酵有極大吸收） 7) 紅外線吸收光譜：紅外線光譜有下列極大吸收值 (液膜 'vmax cm'1 ):2930 , 2856 , 1728 , 1 464 , 1 382 , 1 252, 1172, 1 056 . 968 ejiH-NMR光譜：於重甲酵中，使用三甲矽烷為内部擦準，可得下列NMR光譜（270 MHz )： 7 . 0 8 (1 Η ,二傾雙線.J = 9 . 8 & 4 . 9 Η z ); 6.21-6.35(2Η,多線）； 6.07UH,二傾雙線，J = 15.6 & 6.1 Hz); -30- 本紙5IL尺度边用中國國家楳準(CNS) T4規格(210X297公；a：) 61. 2. 20,000 (請先閲讀背而之注意事項再填i 々頁一裝- 212182 Λ 6 Β 6 五、發明説明（29) 6.02(1Η,二悔雙線，J=9.8 & 1.5 Hz); 5·94 (1H ,雙線，J = 15 . 6 Hz);5.46 (1H,多線）；經濟部中央標準局员工消费合作杜印製 5.31UH,多線）； 5.10(1H,二催雙線 4.94 (1H ,多線）； 4.72 (1H ,多線）； 4.28<1H,三翻雙線，』=1〇.1,1〇.1&2.41^); 2.93-3 . 15 (2H ,多線）； 2 . 50-2 . 71 (2H，多線）； 2 · 27 (2H ,三線，J = 7.3 Hz); 2.16(1H,多線）； 1 . 00-2 . 0 1 (22H ,多線）； 0 . 95 (3H ,三線，J = 7.3 Hz); 0 . 88 (6H ,雙線，J = 6.3 Hz)。 9)13(：-«»41?光薄（5吖1)1«):於重甲酵中，使用三甲矽烷為内部禳準，可得下列之NMR光譜（270 MHz): 11.4(四線），22.7(三線），23.1(四線）， 23.1(四線），24.7(三線），26.2(三線）， 28.2(三線），29.1(雙線 >,30.4(三線）， 32.4(三線），33.1(三線），34.2(三線）， 35.4(三線），36.1(雙線），37.1(三線）， J = 6. 1 8. 4.9 Hz)； $ 先閲讀背. 而之注事項填 31 衣紙張尺度遑用中a明家標毕(CNS)T4規格(210X297公:》> 81· 2. 20,000 212182 Λ 6 Η 6 經濟部屮央櫺準局βχ·消件合作杜印製五、發明説明（30) 39.4(三線），40.0(三線），40.6(雙線）， 40.6(三線），64.6(雙線），73.9(雙線）， 77.8(單線），78.4(燹線），82.3(雙線）， 121.1(雙線），123.7(雙線），124.3(雙線）， 127.7(雙線），135.2(雙線），137.3(雙線）， 138.2(雙線），152.7(雙線 166.4(單線）， 175.0 (單線 >。 10) 溶解度：可溶於酵.如甲酵，乙酵或丁酵；並可溶於丙酮，氛仿，乙酸乙酯及二甲亞踽；些許溶於水；不溶於己烷。 11) 顔色反應：對硫酸，碘，節谋三酮及鉬酸銨-過氛酸反應呈陽性。 12) 高解析度液層析：分離管柱：Cos^osil 5C18-AR(管柱大小：4.6X 250b·, Hakaraitesque Inc.之産品）溶劑：45X v/v乙脯，其中含0.5X三乙胺-¾酸鹽缓衝液（PH3) / 溶速：1毫升/分波長：2 3 0 η 滯萤時間：21.90分與22. 19分之間生物活性 -32-

(請先閱讀背而之注意事項乂頁U 裝· 線本紙Λ尺度遑用中a a家楳準(CNS) Τ4規格(210x297公龙) 81. 2. 20,000 212182 Λ 6 Π 6 五、發明説明（）經濟部屮央標準局员工消#合作社印製由下列試驗例子可詳盡地解釋本發明化合物效用。試驗例1 刺激GM-CSF之産生使用 Kohamsi 等人[Experimental Haaatology 16 , 6 0 3 -6 0 8 ( 1 9 8 8 )]及 K i t a b u r a 等人[J o u r* n a 1 o f C e 1 1 u 1 a r Physiology 1 40, 323-334 ( 1 989)]之組合方法製量由本發明化合物所剌激GM-CSF之生成。更詳細地説，将作為生成GM-CSF之源自人骨«基質細胞的KM-102細胞與稀釋至適當濃度的樣本溶液混合（"GM-CSF産生糸統”）。培餐 24小時後，取出部份培養上淸液並加人依賴GM-CSF之人 TF-1細胞之培養条中。於48-72小時後，由TF-1細胞之生長來測量GM-CSF之量（"GM-CSF分析条统”）可测得所刺激生成之GM-CSF的量。使用氚-胸腺嘧啶間歇擦定4小時以测量TP-1細胞之生長。由MTT組（Che^icon International Inc. 美國）之方法以分析 TF-1 細胞生長及使用 ELISA組（Genzyne Inc.美國）分析GM-CSF可得相似結果。不管GM-CSF産生条統正常蓮作與否，皆使用重組間白質（IL-1/3: Genzyne Inc.美國）之方法分析〇 IL-1/3於依賴劑量方式所引發GM-CSF産生為1-100單位/毫升，且所引發GM-CSF之最大置較無IL-1/9所産生者為10-20倍。表示實驗条統正常蓮作。當將白斯妥逹辛A, B或C以某種濃度加入KM-102細胞後，則可發現以依賴劑量之方式引發GM-CSF之産生。 -33 本紙張尺度逍用中a Β家標準(CNS) Τ4規格(210父297公龙） 81. 2· 20,000

Tk 先閲讀背而· 之. • «場 ϊί-意* 項再填寫 1 裝 π 線 212182 Λ 6 II 6 五、發明説明（32) 經濟部中央櫺準局貝工消费合作杜印52. 所産生GM-CSF之最大量為無加入所産生者的10-20倍。其白斯妥達辛A, B , C之EDso值分別為180 + 50 , 50 + 15 及 50+15ng/^l〇試驗例2 刺激G-CSF之産生将試驗例1所用GM-CSF分析条統以G-CSF分析条統[如 Shirafuji等人：Experiiental Hematology 17, 116- 119(1989)]取代以作為分析剌激G-CSF産生董的条統，更詳盡地説。將作為産生G-CSF且源自人骨讁基質細胞的KM-102細胞加入已稀穋至適當澳度的白斯妥逋辛溶液中（"G-CSF産生条統”）。培養24小時後，取出部份上淸液並加入依雜G-CSF的NFS-60細胞的培養条统中。24至 48小時後，由HFS-60细胞之生長可分析G-CSF的量（”G-CSP分析条”）而_出所剌瀲産生G-CSP之悬。以m-胸脒嘛啶間欧橛定4小時可测出HFS-60細胞之生長。使用 MTT組以分析HFS-60細胞之生長及以ELISA組以分析 G-CSF可得相似的结果[Motoji*a等人：Journal of I u η ο 1 o g y c a 丨 M e t h o d s 11 8 , 18 7 - 1 9 2 (1 9 8 9 )]。無論 G- CSF産生引發条统是否正常建作，皆可用重組間白質 l/3(IL-l/8:Genzy^e Inc.(美囲）。IL-13 可以依賴劑董之方法引發GM-CSF之産生且其量為1-100犟位/毫升，且所引發産生之G-CSP的最大置為無U-1/9所産生者的 10-20倍，表示實驗条統正常邇用。 -34- 本紙張尺度边用中a Η家標準(CNS)肀4規格(210X297公¢) 81.. 2. 20,000 212182 Λ 6 Π 6 經濟部中央櫺準局员工消伢合作杜印製五、發明说明（33) 當將白斯妥達辛冉，B及0以適笛濃度加人1^·*102細胞中後，則可以依雜_量之方式引發G-CSF之産生。所産生G-CSF之最大量為不加人者的10-20倍。白斯妥達辛 A , B 及 C 之 EDso 值分別為 200 + 50, 50 + 15 及 50 + 15ng/ η 1 〇試驗例3 刺激HGF之産生 Pur>Ukawa等人報導瀕自老思結締組嫌的可形成成細胞之L-M细胞可産生並分泌大量的NGP ，且兒茶I»胺可刺激此分泌[J. Biol. Chen. 261， 6039-6047(1986)] 。並澜試白斯妥逹辛是否能剌激HGF之分泌。使用含0.5X腺的199培餐液培養L-M細胞。於24#培養板中各加入5X104L-M細胞，並於C02垴餐器（37Ό， 5!KC02)中培餐直到群集。除去培餐液並将細胞以含0.5X BSA(SigBa)的199培餐液洗一次。於含0.5XBSA的199 培養液中加入某濃度的白斯妥逹辛，並將L-M細胞處理以此混合液。再將L-M細胞於CO 2培餐器中培餐2 4小時。收榘培餐液並分析液體中的NGF 。以酵素免疫財析法[Pr〇c. Hatl· Acad. Sci. USA 80 ,35 1 3-35 16 ( 1 983)]分析NGP。於含96井之聚苯乙烯平板的每籲井中，倒人75·1抗老鼠HGF抗饅（Boehringer) 溶液（0.3wg/«l, PH9.6)。並於室租下靜置1小時。除去抗臁後，以清洗液洗3次。加入50 w 1檩準办HGF (Vako -35- (請先閲讀背而之ίϊ意事項再填寫本頁) 本紙》•尺度遑用中B Η家橒準(CNS)甲4規格(210X297公龙) 81. 2. 20,000 五、發明説明（34) 經濟部中央標準局员工消伢合作社印製

Pure Chen. Ind.)或檫準溶液，並於室溫下靜置6-8小時。除去標準/3NGF或標準溶液並將所有井清洗三次。r 於毎傾井中加入5 0/z丨已標定之抗泠-NGF單株抗醱 (Boel^ringer)溶液 UOOnU/ml, pH7.0),並於 4t：下靜置 15-18小時。除去已用酵素檫定之抗體，再將所有的井清洗三次。倒人100ϋ 1氱酚- /3-D -半乳耱甘（Boehringer) 溶液（l*g/Bl, PH7.3)。當逹到適當顔色後（於室溫下2-3小時）。澜量57〇nB的趿光值。由標準曲線可澜得NGF 的量，且其為不處理以白斯妥達辛所分泌NGF量之百分比。可發現所有白斯妥逹辛皆可以依賴劑量形式刺檄NGF 之生成。當白斯妥連辛濃度為5w /ml,則可較無處理者産生2倍以上NGF 。試驗例4 抗真菌活性為了測試白斯妥達辛對動物致病真菌的抗真_活性，刖測試對黷髮癖豳的活性。於每倨白斯妥達辛中，則可發現抑制琛為lw g /鬭盤之濃度。試驗例5 急性毒性依傳統方法，於5雙ddy鼠（雄）澜試其急性毒性。當由腹腔内投予0.2ng/kg的白斯妥達辛A ,於5天後仍無任何毒性。同樣地，當投予白斯妥達辛B ,白斯妥逹辛 -36- 請先閲背而— 之 ίχ 意· 事項 # 填 % 本 ϊ\ 本紙张尺度逍用中國國家標準(CNS)甲4規格(210X297公Λ) 81. 2. 20,000 Λ 6 Η 6 21218¾ 五、發明説明（35) C及其相關衍生物後，無任何毒性産生。由上述結果發現白斯妥逹辛A , B及C可剌激生血素之生成，如粒狀細胞菌落剌激因子及粒狀巨噬鳢围落剌激因子。因此，可使用白斯妥達辛為治療_以降低由癌症化學療法及同位素療法所引起的副作用。其亦可預防感染且可由活化巨噬醱而産生抗癌症效力。此外，亦可使用白斯妥逹辛刺激HGF之生成而改良腦的代謝。此外，白斯妥逹辛因對黷髮癖g有抗真菌效力而可作為抗真菌剤。先閲 ifi 背而之注· 意事項寫本 % 經濟部中央橾準局貝工消费合作杜印製 37 本紙張尺度逍用中a Β家樣準(CNS)甲4規格(210x297公货) 81. 2. 20,000

Claims

212182 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範園第81102373號「新穎化合物白斯妥逹辛（Leustroducsins) 其製法及其治療用途j專利案够2^ 7月24日修巧申誚専利範圔公告本* : U本年月日補充 1. 一捶如式（I)之白斯妥逹辛化合物或其鹽：访一 ~ 正） H0、// 0

(請先閱讀背面之注意事項再填窝本頁) 式中R為5-甲基己醯氣基· 6-甲基辛醯氣基或7-甲基辛醯氧基。 2.如申鵠專利範園第1項之白斯妥達辛化合物，其為式 (la)所示化合物或其鹽： H〇^ // 0

,ch3 'CH-, 經濟部中央標準局印製 3.如申誚専利範圃第1項之白斯妥達辛化合物*其為式肀 4(210X 297 公沒) 212182 A7 B7 C7 D7 六、申請專利範園 (I b )所示化合物或其鹽 H0、//

,ch2ch3 、CH, Ο 4如申請専利範圍第1項之白斯妥逹辛化合物·其為式 (Ic)所示化合物或其鹽： HO、// 0

,ch3 、CK (請先閲請背面之注意事Jfi再填寫本頁) •裝· •訂. .線· 經濟部中央標準局印製 5. —種製備至少一種如申誚専利範園第1項至第4項中任一項之白斯妥達辛化合物或'其鹽的方法，其包括培餐如普拉斯鏈徽® S A N K 6 0 1 9 (F E R Μ B P - 3 2 8 8 )之可産生白斯妥逋辛化合物的撖生物，並由培餐液中收集一種以上的白斯妥逋辛化合物。 f 4(21〇Χ 297公尨） Λ _ Α7 212182 Β7 C7 D7 六、申請專利範® 6. —種防治由硌症化學療法或同位索療法所引起之不良 2D 4 容之第藥染至製感項合菌 1 混真第，及園鹽 j 範其足利或不專物能請合功申化部如辛腦種逹 , 1 妥症少斯。癌至白劑 , 含示釋染，所稀感物項或 , 成一饈應組任載反藥項許 ..............................^ ....................¾...............................々··:-·........................^ (請先閲讀背面之注意事續再填窝本頁) 經濟部中央操準局印¾ 甲4(210X297 公沒) 中華民國八十三年十二月二十一Θ 中華民國專利公報更正說明書及团式或圖說更正公告 (2件） (專利法第六十七條第二項，第一百零五條準用第六十七條第二項，第一百二十條第二項）專利申請案號原公告曰期專利權証字號專利權人‘ 專利名稱 81102373 82.09.01 212182 發明63503 三共股份有限公司新潁化合物白斯妥達辛（Leustroducsins) 其製法及其治療用途更正事項：發明名稱：新穎化合物白斯妥達辛(Leustroducsins)，其製法及其治療用途第一百零五條準用第六十七條第二項，第一百二十條第二 $利法第六十七條第二項專利申請案® 原公告日期專利權証字猇專人專利名稱 80202686 \ ΝξΟ.11.01 1>23ή3 新型69613 / >徳興長简保護套管塞頭說明：本案舉發㈢業經本厣審笔舉發成應撤銷其專利權，惟專利權人得提起行政救濟· 申請專利範圔：更正事項：一種長简保護套管塞y*係在^1^體一側具有一封閉面，並由封閉面延設一較小直徑之柱^該柱《的外而內側則鑽設可供旋轉定位之不等形狀的套/又在中空简«另一側，而其特徴乃在，中空简徑比水管接頭之外徑爲大，且其面完工後仍可讓螺體凸出<赌面之外者。 — 3675 — 修正中華民困專利公報中華民國八十三年+二月二十一曰說明書及圖式或圖說修正公告 (專利法第四十四條，第一百零五條準用第四十四條，第—百十六條） _專嗣請案號原公告曰期專利權証字號專利權人專利名稱 81217903 82.10.11 214722 簡源培花瓣球與球拍、球套之結梅甲請專利範困：修正事項：1·—種花瓣球與球拍、球套之結構，其包括花瓣球，其爲球形體而其表面佈滿數支固定柱，並於每根固定柱上設有一吸盤，該吸設有吸盤、頸部、套頭’並使其連爲一體，於適當位置處設有氣孔；f 球套，其主要係將盤面置於框架上，再於該盤面（2/)上方置放彈性體；最後將後套與框架卡套成一體，使框架與後套將盤 <、彈性體固定後，該盤面可作伸縮活動； \ / 球拍’其由二個本體相套接\並於中央位置設有面，彈性件與平壓板，使其組合後粗糙之一面可打擊\另一光滑弧形#可接球；藉上述組合，使花瓣球可投於球球拍上藉A有光滑面之盤面予接收吸著，藉球拍之粗糙面作棒球之擊/ 2. 如上述申請專利範圍第2項所述之?^^與¥拍，球套結構，其中花瓣球之套頭較球形體之固定柱長，使固定後^^氣室，於撞擊時藉氣孔配合頸部作消除撞擊之慣性力者· 3. 如上述申請專利範圔第2項m述之花瓣球與結構其中吸盤設有頸部以增強吸盤著地吸著地面之《活性y消除慣性力者· 4. 如上述申請專利範圍第2項所述之花瓣球Dji球拍、球套之結構，其中花瓣球之球形髏係包括以二半球體相套組合，^令內部爲中空並設有揚聲孔，使其可裝配響鈴或音樂1C者。丨 5. 如上述申請專利範圔第1項所述之花瓣球_球拍、球套之結構，其中球形體上之固定柱係包括以卡槽之設計配合固定體與倒鉤使吸盤固定其上者》 6. 如上述申請專利範圍第1項所述之花瓣球與球拍、球套之結構•其中球套係藉框架，盤面、彈性體、後套結爲一體，使盤面具有伸縮活動·以消除撞擊之慣性力者· 7. 如上述申請專利範圈第6項所述之花瓣球與球拍、球套之結構，其中彈性體包括以海棉、彈性塑膠、彈性橡膠，金羼彈片，彈簧等使盤面受搲及可作後退以消除慣性力者。 8. 如上述申請專利範圍第6項所述之花瓣球與球拍球套之結構•其中盤面係設有缺槽以配合框架之間係固定柱，使盤面於活動時，不產生轉動者。 9. 如上述申請專利範困第6項所述之花瓣球與球拍、球套之結構•其中框架 — 3676—