KR940004128B1

KR940004128B1 - 혈소판 활성화 인자 길항 물질인 "포막틴(phomactins)", 그의 제조방법 및 용도

Info

Publication number: KR940004128B1
Application number: KR1019890017327A
Authority: KR
Inventors: 아이야 사또; 미찌히로 스가노; 고우헤이 후루야; 다께시 오시마; 하루미쯔 구와노; 다다시 하따; 히데유끼 하루야마
Original assignee: 상꾜가부시끼가이샤; 가와무라 요시부미
Priority date: 1988-11-28
Filing date: 1989-11-28
Publication date: 1994-05-13
Also published as: ES2055104T3; CA2003956A1; DE68906248D1; DE68906248T2; ATE88707T1; EP0371762B1; EP0371762A3; US5151529A; EP0371762A2; KR900008048A

Abstract

내용 없음.

Description

혈소판 활성화 인지 길항 물질인 "포막틴(PHOMACTINS)", 그의 제조방법 및 용도

제1도는 포막틴 A의 적외선 흡수 스펙트럼.

제2도는 포막틴 B의¹H-핵자가 공명 스펙트럼.

제3도는 포막틴 A의¹³C-핵자기 공명 스펙트럼.

제4도는 포막틴 B의 적외선 흡수 스펙트럼.

제5도는 포막틴 B의¹H-핵자기 공명 스펙트럼.

제6도는 포막틴 B의¹³C의 핵자기 공명 스펙트럼.

본 발명은 "포막틴(PHOMACTINS)"이란 분류명으로 지정된 일련의 신규 화합물에 관한 것이다. 이들 화합물은 포마(PHOMA)속의 적당한 미생물(균류)을 배양시킴으로써 제조될 수 있다. 또한 본 발명은 포마속 미생물의 신규 균주 자체뿐만이 아니라 이 신규 균주를 이용하여 이들 화합물을 제조하는 발효방법을 제공하며, 혈소판 활성화 인자 길항 물질로서 본 발명의 신규 화합물을 이용하는 방법 및 조성물을 제공한다. "혈소판 활성화 인자"를 이하에서는 통상적으로 "PAF"라 약칭한다.

최소한 포유 동물 조직으로부터 분리된 천연 PAF는 원래 조직의 특성에 따라 2 내지 5개의 인지질이 혼합된 혼합물이다. PAF의 주요 성분은 하기 일반식(A)일 것이다 :

[상기식중, R은 포화 또는 불포화될 수 있는 장쇄의 지방족 탄화수소기이다].

천연 PAF는 좌선성이며, 천연 PAF의 각종 성분의 예로는

-C_{16: 0}(R이 헥사데실기인 일반식(A));

-C_{18: 0}(R이 옥타데실기인 일반식(A)); 또는

-C_{18: 1}(R이 9(Z)-옥타데실기인 일반식(A))가 있다. PAF의 성분을 확인하는데 사용되는 것으로는 먼저 회전성(상기 실시예에서는

을 들 수 있고, 다음으로는 탄소원자수, 마지막으로 이중 결합수를 들 수 있다.

PAF는 그의 명칭에서도 유래하듯이 강력한 혈소판 활성화 및 응집 효과를 나타낸다. 그러나 최근에는 이 PAF가 광범위한 병리학적 반응에서 효과적으로 결정적인 매개체임이 밝혀졌다. 따라서 이것은 저혈압 효과를 나타내며 혈관투과성이 상승한다; 또한 쇼크 상태(예를들면 내성독소-유발 쇼크)유발시 활성제이며, 염증 질환의 매개체로 작용한다고 알려졌다. 또한 이것은 심장 및 전신 아나필락시, 위 및 장궤양, 건선과 면역 및 신장 장애에서 작용함을 발견하였다.

그러므로 PAF 길항 물질을 상기 질병의 새로운 치료제 형태, 특히 새로운 형태의 쇼크 방지제 및 염증 방지제로서 연구 개발하는 것은 당연하다. 이에 따라, 그러한 PAF 길항 물질을 발견하기 위하여 여러가지 화합물에 대한 연구 개발이 시도되었으며, 그 결과 몇가지 화합물이 PAF 길항 물질로 공지되었다. 공지된 PAF 길항 물질의 화학적 구조가 매우 다양하며, 그들의 화학적 구조를 연관짓는 공통 인자도 명백하게 밝혀지지는 않았지만, 통상적으로 PAF-길항 활성을 갖는 공지된 물질들을 그들의 화학적 구조에 따라 PAF계 또는 비PAF계 화합물로서 분류할 수 있다. 공지된 화합물들 중에서, PAF계의 길항 물질은 대부분이 화학적 합성에 의해 제조되는 반면에, 비PAF계 길항 물질은 대부분이 식물 및 미생물의 2차 대사물질로부터 회수된다. 비PAF계 화합물의 예에는 긴크골리드(ginkgolide : Ginkgo biloba에서 분리), 카드주레논(kadzurenone : Piper futokadzura에서 분리), 베라구엔신(veraguensin : Magnolia acuminata에서 분리), 갈벤긴 및 갈브라빈(galbengin and galbrabin; Himantandra velgravena에서 분리), 넥탄드린 A 및 B(nectandrin A and B; Nectandra rigida에서 분리), 부르세란(burseran; Bursera microphylla에서 분리)[상기 화합물에 대한 상세한 내용은 문헌(Trends in Pharm Sci., Vol.7, p.397 et seq(1986); P.Braquet and J.J.Godfroid)에 기재되어 있다]. 글리오톡신 유도체[gliotoxin derivative; Penicillium terlikowskii에서 분리; M.Okamoto, Chem. Pharm.Bull.,34,340(1986)] 및 디케토피페라진 유도체[diketopiperazin derivative; Streptomycessp; S. Takase, J.Org.Chem.,52,3485(1987)]가 있다.

여러가지 PAF계 화합물이 공지되어 있으나, 이들은 본 발명과는 관련이 없다.

PAF 길항 물질의 특성 및 용도에 대한 검토가 문헌[Trends in Pharm.Sci., Vol.10,pp.23 et seq(1989); P.Braquet et al]에 기재되어 있으며, 그 기재 내용은 본 명세서의 참고 자료로서 인용되었다.

관행상 "포막틴"이라 명명되며, 포마종에 속하고 특정개의 껍질로부터 분리되는 SANK 11486으로 확인된 미생물을 배양시킴으로 제조될 수 있는 비PAF계의 일련의 신규 PAF 길항 물질 화합물을 발견하게 되었다.

본 발명에 따라서, 문제의 조성물로서 포막틴이라 명명되는 신규 화합물을 제공하게 되었다. 본 명세서에서 포막틴은 PAF 길항 활성을 가지며 포마 sp.SANK 11486의 발효에 의해 제조 가능한 화합물로서 기재되었다. 통상적으로 포막틴의 화학적 구조는 이중 결합의 탄소원자와, 그 자체가 브릿지될 수도 있는 9원 탄소 브릿지 구조에 의해 2위치가 제거된 탄소원자 사이가 브릿지된 시클로헥센 고리에 의해 특징 지워진다.

또한 본 발명은 포마 균주의 포막틴-생성 미생물을 배양하여 포막틴을 생성하고 배양된 브로스로부터 적어도 1종의 포막틴을 분리하는 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 정의된 적어도 1종의 포막틴인 PAF 길항 물질을 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 배합한 염증 또는 쇼크 치료용의 약학적 조성물을 제공한다.

추가로 본 발명은 포막틴, 특히 포막틴 A와 B로 구성된 군으로부터 선택된 PAF 길항 물질 유효량을 PAF-매개 질환에 감염 가능한 포유 동물에 투여함으로써 PAF-매개 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

또한 추가로 본 발명은 동물(포유동물, 예를들면 사람일 수 있다)에게 상기 정의된 적어도 1종의 포막틴인 PAF 길항 물질을 염증 또는 쇼크의 효과적인 치료 또는 예방에 충분한 양만큼 투여함으로써 천식, 염증 또는 쇼크를 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.

본 발명의 화합물 중에서 "포막틴 A"라 명명되는 화합물은 하기의 화학 구조 및 특성을 갖는다 :

1) 일반식(Ⅰ)의 화학식 :

2) 외관 : 무색의 유상 물질

3) 고유 광회전도 : [

]²⁵ _D=146.7°(c0.75,클로로포름)

4) 원소분석 :

실측치(%) : C; 71.65, H; 9.10.

계산치(%) : C; 71.82, H; 9.04.

5) 분자식 : C₂₀H₃₀O₄(고해상 질량 분광법으로 측정)

6) 분자량 : 334(질량 분광법으로 측정)

7) 적외선 흡수 스펙트럼, υ_max㎝^-1(액상필름) : 3395, 1580, 1450, 1380, 1230, 1050, 960 및 756.

액상 필름으로 측정된 적외선 흡수 스펙트럼을 첨부된 도면의 제1도에 나타내었다.

8)¹H-핵자기 공명 스펙트럼,

ppm :

내부 표준 물질로서 테트라메틸실란을 사용하여 과중수소화 메탄올에서 측정된 핵자기 공명 스펙트럼(500㎒)을 첨부된 도면의 제1도에 나타내었다.

9)¹³C-핵자기 공명 스펙트럼,

ppm :

내부 표준 물질로서 테트라메틸실란을 사용하여 과중수소화 메탄올에서 측정된 핵자기 공명 스펙트럼(126㎒)을 첨부된 도면의 제3도에 나타내었으며, 화학적 시프트 및 중복도는 하기에 나타내었다.

14.9(q), 16.5(q), 19.6(q), 21.9(q), 25.8(t), 27.8(d), 34.2(t), 34.5(t), 37.6(t), 38.0(s), 38.6(t), 62.6(d), 72.0(t), 74.6(d), 81.2(s), 110.0(s), 128.7(s), 131.3(s), 131.4(d), 144.6(s).

(q는 4중선, t는 3중선, d는 2중선이고, s는 단일선이다).

10) 자외선 흡수 스펙트럼

_max㎚ :

에탄올에서 측정된 자외선 흡수 스펙트럼은 최종 흡수치만을 나타낸다.

11) 용해성 :

메탄올, 에탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디메틸술폭시드, 벤젠 및 디에틸에테르에는 용해성이고; 물에는 불용성이다.

12) 색 반응 :

황산 및 요오드와의 색 시험은 양성이다.

13) 박막 크로마토그래피 :

Rf : 0.54

흡착제 : 실리카겔 플레이트(Kieselgel 60F₂₅₄, Merck)

전계 용매 : 헥산과 에틸 아세테이트의 1 : 2 부피비 혼합물.

포막틴 A의 계통명은 3, 3a-디히드록시-2, 6-(3'-메틸-3'-헥세노)-2, 6, 7-트리메틸-3a, 5, 6, 7, 8, 8a-헥사히드로푸로[2, 3, 4-데]크로만이다. "포막틴 B"라 명명되는 또다른 본 발명의 화합물은 하기의 화학식 및 특성을 갖는다.

1) 일반식(Ⅱ)의 화학식 :

2) 외관 : 무색의 침상, 180~182℃에서 용융

3) 고유 광회전도 : [

]²⁵=+175°(c0.70, 클로로포름)

4) 원소 분석 :

실측치(%) : C; 71.71, H; 9.09.

계산치(%) : C; 71.82, H; 9.04.

5) 분자식 : C₂₀H₃₀O₄(고해상 질량 분광법으로 측정)

6) 분자량 : 334(질량 분광법으로 측정)

7) 적외선 흡수 스펙트럼, υ_max㎝^-1(KBr) : 3420, 3380, 1669, 1630, 1460, 1392, 1250, 1200, 1080, 1000, 903 및 812

KBr 디스크상에서 측정된 적외선 흡수 스펙트럼을 첨부된 도면의 제4도에 나타내었다.

8)¹H-핵자기 공명 스펙트럼,

ppm :

내부 표준 물질로서 테트라메틸실란을 사용하여 과중수소화 메탄올에서 측정된 핵자기 공명 스펙트럼(500㎒)을 첨부된 도면의 제5도에 나타내었다.

9)¹³C-핵자기 공명 스펙트럼,

ppm :

내부 표준 물질로서 테트라메틸실란을 사용하여 과중수소화 메탄올에서 측정된 핵자기 공명 스펙트럼(126㎒)을 첨부된 도면의 제6도에 나타내었으며, 화학적 시프트 및 중복도는 하기에 나타내었다 :

14.5(q), 16.4(q), 19.7(2×q), 22.7(t), 23.2(q), 33.6(t), 36.7(t), 37.4(t), 41.5(s), 46.3(d), 62.8(s), 65.9(d), 71.4(d), 73.3(s), 120.3(d), 135.6(d), 136.8(s), 147.2(s), 200.1(s)

(약어는 상기와 같다).

10) 자외선 흡수 스펙트럼,

_max㎚ :

메탄올에서 측정된 자외선 흡수 스펙트럼은 240㎚(E=2,500)에서의 흡수치를 나타낸다.

11) 용해성 :

12) 색 반응 :

황산 및 요오드와의 색 시험은 양성이다.

13) 박막 크로마토그래피 :

Rf : 0.51

흡착제 : 실리카겔 플레이트(Kieslgel 60F₂₅₄, Merck)

전개 용매 : 헥산과 에틸아세테이트의 1 : 2 부피비 혼합된 포막틴 B의 계통명은 13, 15-디히드록시-3, 4-에폭시-2-옥소-4, 8, 11, 12, 15-벤타메틸비시클로[9, 3, 1] 펜타데카-7, 14-디엔이다.

포마속의 미생물에 의해 천연적으로 제조된 형태중에서, 본 발명의 화합물은 통상적으로 단일 이성질체로서 존재함에도 불구하고 본 발명의 포막틴은 여러가지 입체 이성질체 및 기하 이성질체의 형태로 존재할 수 있다. 상기한 일반식들에서, 각각의 이성질체 및 이성질체의 혼합물은 단일 일반식으로 표시된다.

그러나, 본 발명은 천연적으로 제조되었거나 화학적 조작에 의해 제조되었거나간에 각각의 이성질체 뿐만이 아니라 2개 이상의 이성질체의 혼합물도 또한 포함한다. 천연적으로 제조된 이성질체가 바람직한 것이 아닐 경우에, 바람직한 이성질체를 본 분야에서 이미 공지된 화학적 방법으로 제조할 수 있다.

포막틴 A 및 B의 배열은 각각 구조식(Ⅰa) 및 (Ⅱa)에서 나타낸 바와 같다.

균주 SANK 11486이라 분류된, 포마(균류)속의 미생물 균주를 배양시킴으로써 포막틴을 제조하였다. 본 발명에서 사용된 균주 SANK 11486의 포막틴-생성 미생물은 일본 후꾸이현의 해안 부근에서 채집된 게(Chinoecetes opilio); 통상적으로는 "스스가니(susugani)"라 불리우는 것으로서 껍질이 흑색으로 되는 게이다)의 껍질로부터 분리된다.

균주의 미생물학적 특성은 하기와 같다 :

25℃의 오오트밀 아가에서 7일간 20㎜, 14일간 38㎜가 되도록 생장시킨다. 생장 기간동안, 콜로니는 젖은 벨베트 같은 외관과 녹회색을 나타낸다.

오오트밀 아가상에서는 균사만이 발견되었고, 포자나 분생포자기는 발견되지 않았다; 그러나 인공 해수(상품명 : Jamarins)로 제조된 오오트밀 아가상에서는 분생 포자기가 생성된 분포자기가 형성되었다.

분포자기는 크기가 80-120×80-150㎛인 반구 또는 서양배(pear)형태로 관찰되었으며, 중앙에 구멍이 있다. 구멍의 직경은 5-15㎛이고, 가장자리에는 크기가 20-50×2-4㎛인 갈색 강모가 있다.

분생 포자병이 특별하게 분화되지는 않았지만, 포아(phore)벽의 최심층은 경자가 된다. 분생 포자병은 무색이며, 단세포이고 크기각 2.5-4.0×2.0-2.5㎛인 타원 또는 연신 타원형이다.

균주는 37℃에서는 생장하지 않는다.

상기의 설명을 기본으로 하고 표준 교재[B.C.Sutton, "The Coelomycetes", Comminwealth Mycological Institute, 1980; 및 J. Kohlmeyer and E.Kohlmeyer, "Marine Mycology, The Higher Fungi", Academic Press, 1979]를 참고로 하여, 본 균주가 공지의 포마 sp. 종의 신규 균주임이 확인되었으며, 균주 번호 SANK 11486(No.FERM P-10364)가 부여되었다. 여기에서 사용된 색상의 색조 및 코드는 문헌[Methuen Handbook of Color, 3 rd Ed(1978); A Kornerup and J.H.Wanscher; Eyre Methuen(London)에서 출판]에 기재된 바와 같이 지정되었다.

본 발명자들은 이 균주를 수탁번호 FERM P-10364로서[Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Tokyo, Japan]에 기탁하였으며, [Budapest Treaty]에 기재된 조건하에 1989, 9. 20일자로 수탁번호 FERM BP-2598로서 재기탁하였다.

균주 SANK 11486이 포막틴을 생산한다는 것이 확인되었다. 그러나 잘 알려진 것처럼 균류의 특성은 상당히 다양하며, 자연적으로나 인공적 조작에 의해서나 쉽게 돌연변이를 일으킬 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 포마속, 특히 포막틴 생산 능력을 갖는 신규 균주 SANK 11486가 속하는 포마속의 균주로 분류될 수 있는 모든 미생물의 사용을 포함한다. 포막틴의 특성, 특히 생물학적 특성에 관한 정보를 기본으로 하여, 수득된 균주가 어떠한 포막틴을 생성하는지, 또는 포막틴(들)을 충분량 생성하는 상업적으로 유용한 균주인지하는 것은 간단한 실험으로 측정된다.

이들 균류의 균주를 유사한 미생물들로부터 다른 발효 생성물을 생성하는데 통상적으로 사용되는 종류의 배양배지에서 배양함으로써 본 발명의 신규 화합물인 포막틴을 제조할 수 있다. 본 분야의 숙련자들에게는 이미 공지되었듯이, 그러한 배지는 무기염뿐만이 아니라 탄소와 질소와 미생물학적 동화원(source)을 반드시 함유하여야 한다. 그러나, 모든면에서, 본 발명에서 사용 가능한 배양 배지는 공지된 균류의 균주 배양용으로 공지된 것과 동일하다.

탄소원의 바람직한 예로는 글루코오스, 프락토우스, 말토오스, 슈크로오스, 만니톨, 글리세롤, 덱스트린, 오오트, 호밀, 옥수수 전분, 감자, 감자 전분, 옥수수 곡분, 대두 곡분, 면실 케이크, 면실유, 당밀, 시트르산, 타르타르산 등이 있으며, 바람직한 것은 글루코오스, 슈크로오스 또는 감자나 이들의 배합물이다. 그러하 화합물은 단독으로 또는 적당한 배합물로 사용될 수 있다. 통상적으로 사용량은 배양 배지 1 내지 10중량% 범위내에서는 변할 수 있다.

바람직한 질소원은 통상적으로는 질소-함유 물질이나, 발효 공정에서 통상적으로 사용되는 것과 같은 무기 물질을 포함하는 기타의 물질일 수도 있다. 그러한 질소원의 예로는 대두 곡분, 밀겨, 땅콩 곡분, 면실 케이크, 면실유, 면실 곡분, 카제인 가수분해물, 파르마민, 어류 곡분, 옥수수 침지액, 펩톤, 육즙, 효모, 효모 추출액, 맥아 추출액, 질산나트륨, 질산암모늄, 황산암모늄 등이 있으며, 바람직한 것은 펩톤 및/또는 육즙이다. 이들 질소원은 단독으로 또는 적당한 배합물로 사용될 수 있다. 통상적으로 배양 배지의 0.2 내지 6중량%의 농도로 사용되는 것이 바람직하다.

배양 배지에 첨가되어야 하는 영양 무기염은 미생물의 생장에 필수적인 각종 이온을 제공할 수 있는 통상적인 염이며, 그 예로는 나트륨, 암모늄, 칼슘, 포스페이트, 술페이트, 클로라이드 및 카르보네이트 이온이 있다. 또한 배지가 칼륨, 칼슘, 코발트, 망간, 철 및 마그네슘과 같은 기타의 필수 금속을 소량 함유하는 것이 바람직하다.

배양 배지의 수성 성분은 사기의 실시예에서 설명되듯이 천연 또는(바람직하게는) 인공 해수 형태로 공급될 수 있다; 그러나 통상의 물을 사용하여도 동일하게 우수한 결과를 얻을 수 있으며, 따라서 본 발명에서는 해수 형태를 사용해야 할 필요는 없다.

본 발명의 방법을 액상 배양 기법에 의해 수행할 경우에, 실리콘 오일, 식물성 오일과 같은 기포 방지제 또는 표면 활성제를 배양 배지에 사용하는 것이 바람직하다.

포마 sp.SANK 11486을 배양시켜 포막틴을 생산하는 배양 배지의 pH는 5.0~9.0, 보다 바람직하게는 6.5~8.5의 범위내에서 변하는 것이 바람직하다.

양호한 생장을 위해서는 20~28℃의 온도가 바람직하지만 배양은 15~30℃ 범위이내의 온도에서 수행될 수 있으며, 포막틴의 생산에 최적인 온도는 22~26℃이다.

포막틴은 호기 배양 조건하에 생산되며, 고체 배양법, 진탕 배양법 및 통기-교반(심부) 배양법과 같은 통상의 호기 배양법이 사용될 수 있다. 소규모의 배양일 경우에는 적당한 온도(22~26℃)에서 수일~2주 동안 진탕 배양하는 것이 전형적인 방법이다. 그러한 소규모 배양 방법에서 배양 1 또는 2중식 단계로 시작될 수 있으며, 예를들면 액상 유동 조절제로서 작용하는 저판이 장치된 엘렌마이어 플라스크에서 종자 배양액을 생성한다. 종자 배양 단계용 배지는 바람직하게는 상기 배양 단계에서 설명되었듯이 탄소 및 질소원을 모두 함유한다. 소규모 배양의 바람직한 조작 순서에서 종자 배양 플라스크를 일정 온도,(예, 22~26℃)의 항온기에서 7일 동안 또는 충분한 생장이 이루어질 때까지 진탕한다. 이어서 생장한 종자 배양액을 2차 종자 배지 또는 생성 배지로 옮긴다. 중간 생장상을 사용할 경우에는 반드시 상기의 방법을 사용하여 생장시키고, 생성된 중간 생성물의 부분 표본을 생성 배지에서 접종한다. 접종된 플라스크를 적당한 온도(22~26℃)에서 진탕하면서 수일간 항온 처리한 후, 항온 처리가 완결되면 플라스크의 내용물을 원심분리 또는 여과한다.

대규모 생산인 경우에는, 교반기와 통기 장치가 부착된 적당한 발효기를 사용하는 것이 바람직하다. 이 경우에는 영양 배지를 발효기 내부에서 제조할 수 있다. 바람직하게는 먼저 125℃의 충분히 높은 온도로 승온시킨 후 냉각시켜 배지를 살균하고, 살균된 배지에 미리 제조된 종자 배양액을 접종할 수 있다. 이어서 적당한 온도(예, 22~26℃)에서 교반 및 통기하면서 배양을 진행한다. 이 방법은 본 발명의 화합물을 다량으로 수득하는데 적당한 방법이다.

배양을 진행시키고 배양의 진행에 따른 포막틴의 생산량을 본 분야에서 통상적으로 사용되는 여러가지 기존의 공지 기법에 의해 측정한다. 예를들면, 배양 브로스의 항-PAF 활성 증가를 하기에서와 같이 관찰할 수 있다. 통상적으로 포막틴의 총 생산량은 발효 개시 후 10~14일 사이에 최대치에 도달하지만, 정확한 시간은 온도 및 기타 발효 조건에 따라 변한다; 그러나 상기에서 제안되었듯이 포막틴의 생산 과정을 관찰함으로써 주어진 조건에서의 정확한 최적 시간을 쉽게 측정할 수 있다.

배양이 완결된 후, 배양물의 액상 분획중에 존재하는 포막틴을 바람직하게는 규조토와 같은 여과 보조물을 사용하여 여과하거나 원심분리 또는 기타의 표준 기법에 의해 분리할 수 있다. 여과물 또는 상층액중에 존재하는 포막틴은 이러한 여과물로부터 추출 회수될 수 있고/거나 포막틴의 물리 화학적 특성을 이용하여 정제될 수 있다. 예를들어, 하나 이상의 수 불혼화성 유기 용매(예, 디에틸에테르, 에틸아세테이트, 헥산, 클로로포름, 에틸렌클로라이드 또는 메틸렌클로라이드)를 사용하여 여과물 또는 상층액중에 존재하는 포막틴을 중성 pH에서 추출할 수 있으며, 이 용매는 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

이와는 다른 방법은 활성탄과 같은 흡착제, 또는 암벨라이트(Amberlite; 상품명) XAD-2 또는 XAD-4 수지(Rohm and Haas Co., Ltd.)또는 다아이온(Diaion; 상품명) HP-10, HP-20, CHP-20P 또는 HP-50수지(Mitsubishi Kasei Corporation)와 같은 흡착 수지를 사용하는 것이다. 포막틴을 함유하는 유체를 이들 흡착제 중 하나의 층을 통해 통과시켜 흡착 불순물을 제거하거나, 흡착 포막틴을 수성 메탄올, 수성 아세톤 또는 수성 부탄올과 같은 적당한 용리액으로 용출한다. 이로써 생성된 거의 대부분의 포막틴이 배양배지로 방출되며, 극히 소량만이 세포내에 남게된다; 그러나 세포내에 남아 있는 포막틴을 회수할 필요가 있을 경우에는 통상의 방법에 따라 수행할 수 있다.

상기 기재된 바와 같이 수득된 포막틴을 여러가지의 통상의 기법, 특히 실리카겔 또는 마그네시아-실리카겔(예, Florisil; 상품명)과 같은 담체를 이용하는 흡착 컬럼 크로마토그래피, 세파덱스(Sephadex; 상품명) LH-20(Pharmacia Fine Chemicals)을 이용하는 분배 컬럼 크로마토 그래피 또는 통상의 컬럼 또는 역상 컬럼을 이용하는 고성능 액체 크로마토그래피와 같은 각종 크로마토그래피 기법에 의해 추가로 정제할 수 있다.

상기 공정중 적당한 단계에서, 통상의 방법(이중에서도 크로마토그래피 기법, 특히 컬럼 크로마토그래피가 가장 효과적이다)에 의해 여러가지 포막틴을 서로 분리할 수 있다. 그러므로, 상기 약술된 정제 공정의 과정에서 포막틴을 분리하는 것이 통상적이다.

본 발명의 포막틴은 이제까지 문헌에 기재된 적이 없는 신규 화합물이다. 이것은 실험 동물에서 PAF 길항 작용을 나타내었으며, 따라서 다른 동물(예, 인간, 개, 고양이 및 토끼)들에서도 유사한 활성을 나타낼 것으로 기대된다. 그러므로 이들은 항혈전성 약제로서 유용할 것으로 기대되며, 염증, 쇼크, 천식, 소화성 궤양, 신부전증, 고혈압, 허혈 및 PAF 길항 물질의 투여에 의해 치유될 수 있는 유사 질병의 예방 및 치료에 유용할 것이라 기대된다.

이것이 확실하게 입증되지도 않았고 어떠한 이론에 의해 한정되는 것을 원하지도 않지만, 포막틴이 PAF 자체 대신에 PAF 수용체에 결합함으로써 PAF 길항 물질로서 작용한다는 것은 통상적으로 인정된다. 이러한 작용 형태는 그들간의 화학 구조가 매우 다름에도 불구하고 여러 종류의 PAF 길항 물질에서 공통적으로 나타나는 것이다.

본 발명의 하나 이상의 포막틴을 치료 또는 예방 약제로서 단독으로 사용할 수 있거나, 본 분야에서 이미 공지된 바와 같이 그(들)을 의도하는 투여 경로에 적당하도록 약학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 부형제 및/또는 희석제와 혼합할 수 있다.

예를들어, 경구 투여용으로서는 분말, 과립, 타블렛 또는 캡슐 형태로 사용될 수 있고; 비경구 투여용으로서는 주사액 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물의 투여량은 질병 또는 장애의 정도 및 특성, 환자의 나이, 체중 및 상태, 및 투여 경로, 투여 주기 및 투여 기간에 따라 달라진다. 그러나 성인의 경우, 본 발명의 포막틴(들)을 장에 투여할때 적당한 1일 용량은 1㎎~1,000㎎이며, 이것을 하루에 한번 또는 1~수회에 나누어 투여할 수 있다.

본 발명의 화합물의 제법을 하기의 실시예들에서 상세히 설명할 것이며, 이들 실시예는 본 발명을 제한하지 않는다.

[실시예 1]

a) 배양

사면 배양물로부터 수득된 포마 sp SANK 11486 1 백금이를 저지(baffles)가 설치되어 있고 하기 기재된 조성을 갖는 종자 배양 배지 100㎖을 함유하는 500㎖ 엘렌마이어 플라스크(seed flask)에 접종한다.

배지의 조성

슈크로오스 20g

감자100g

펩톤10g

1염기성 인산칼륨5g

인송 해수 1,000㎖

(상품명 : Jamarin S, Jamarin Laboratories Co.,Ltd.) pH 8.5

이어서 생성된 배양 브로스 전체를 200rpm 회전 진탕기(관성 반경 7㎝)상에서 26℃에서 7일간 배양한다(종자 배양 배지와 동일한 조성을 갖는다). 배양 배지 120×500㎖ 엘렌마이어 플라스크에 각각 넣고, 각 플라스크내의 배지를 살균한다. 이어서 종자 배양액 3㎖을 각 플라스크에 접종한다. 120개의 플라스크내의 물질을 7일간 종자 배양액에 적용하였던 것과 동일한 조건하에 각각 진탕 배양시킨다.

b) 분리

120개의 플라스크로부터 수득된 배양 브로스를 모두 합하고 흡인 여과하여 여과액 13ℓ를 수득한다. 이것을 동일한 부피의 에틸아세테이트로 2회 추출한다. 에틸아세테이트 추출액을 합하고 5ℓ의 물로 세척한다; 이어서 무수황산나트륨상에서 건조시킨 후, 회전 증발기를 사용하여 감압하에 증발건조시켜 유상의 물질 360㎎을 수득한다. 실리카겔 자체 부피의 30배를 통과시킨는 흡착 컬럼 크로마토그래피(Art.9385,230-400 Tyler Standard mesh, Merck; 용리액은 헥산과 에틸아세테이트의 1 : 1 부피비 혼합물)로 상기 유상 물질 전부를 정제한다. PAF 길항 활성을 나타내는 분획을 수거하고 용매를 감압하에 증류 제거하여 유상 물질 130㎎을 수득한다. 이 유상 물질 전부를 역상 컬럼 크로마토그래피(Lobar RP-8column, size B Merck)로 추가 정제한다. 80부피%의 수성 메탄올로 용출된 분획을 수거하고 용매를 증류 제거한다. 생성된 잔류 유상 물질을 고성능 액체 크로마토그래피(Senshu pack ODS-2251-S, Senshu Kagaku Co., Ltd.; 용리액은 40부피%의 수성 아세토니트릴)로 정제한다. 수거된 분획을 감압하에 증류시켜 용매를 제거하여 목적 화합물인 포막틴 A{화합물명 : (3'E)-3, 3a-디히드록시-2, 6-(3'-메틸-3'-헥세노)-2, 6, 7-트리메틸-3a, 5, 6, 7, 8, 8a-헥사히드로푸로[2, 3, 4-데]크로만}3㎎을 무색 오일로서 수득한다.

[실시예 2]

480개의 플리스크내의 종자 배양액을 실시예 1에 기재된 바와 같은 조건하에 배양시켜 수득한 배양 브로스 전부를 흡인 여과하고, 생성된 48ℓ의 여과액을 동일한 부피의 에틸아세테이트로 2회 추출한다. 합해진 에틸아세테이트 추출액을 20ℓ의 물로 세척하고 무수황산나트륨상에서 건조시킨 후, 회전 증발기를 사용하여 감압하에 증발 건조시켜 유상 물질을 수득한다. 실라카겔 자체 부피의 30배를 통과시키는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Art.9385, 230-400 mesh Tyler, Merck; 제1용액은 헥산과 에틸아세테이트 1 : 1 부피비 혼합물이고, 제2용액은 헥산과 에틸아세테이트의 2 : 3 부피비 혼합물)로 상기 유상 물질을 크로마토그래피한다. 제1분획을 감압하에 증발 농축시키고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 역상 컬럼 크로마토그래피(Lobar RP-8 column, B, Merck) 및 고성능 액체 크로마토그래피(Senshu pack ODS-2251-S, Senshu Kagaku Co., Ltd.)로 정제하여 포막틴 A 9.4㎎을 무색 오일로서 수득한다. 2 : 3 혼합물로 용출된 제2분획을 감압하에 증발 농축시켜 유상 물질 78.2㎎을 수득하고, 이것을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Lobar Si60 column, size A, Merck; 용리액은 헥산과 에틸아세테이트 1 : 1 부피비 혼합물)로 추가 정제한다. 이어서 생성된 활성 분획을 역상 컬럼 크로마토그래피(Lobar RP-8 column, size B, Merck; 용리액은 60부피%의 수성 메탄올)로 정제하여 포막틴 B{화합물명 : (7E)-13, 15-디히드록시-3, 4-에폭시-2-옥소-4, 8, 11, 12, 15-펜타메틸비시클로[9, 3, 1]펜타데카-7, 14-디엔}15.9㎎을 무색 침상으로서 수득한다.

[실시예 3]

인공 해수 대신에 수도물을 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1에서 기재된 바와 유사한 방법으로 종자 배양액을 23℃에서 11일 동안 55개 플라스크에서 배양한다. 생성된 배양 브로스 전부를 흡인 여과하고, 생성된 여과액 5.4ℓ를 동일한 부피의 에틸아세테이트로 2회 추출한다. 합해진 에틸아세테이트 추출액을 물로 세척하고, 무수황산나트륨상에서 건조시킨 후, 회전 증발기를 사용하여 감압하에 증발 건조시켜 유상 물질 636㎎을 수득한다. 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Art.9385,230-400 mesh Tyler ,Merck; 용리액은 헥산과 에틸아세테이트 1 : 4 부피비 혼합물)로 상기 유상 물질 전부를 크로마토그래피한다. 활성 분획을 감압하에 증발 농축시켜 유상 물질 274㎎을 수득한다. 이것을 6㎖/min의 유속으로 고성능 액체 크로마토그래피(Senshu pack ODS-2251-S, Senshu Kagaku Co.,Ltd; 용리액은 80부피%의 수성 메탄올)로 추가 정제하여 보유 시간이 22.5인 포막틴 A 14.0㎎을 수득한다. 포막틴 A-함유 분획보다 선행하는 분획을 감압하에 증발 농축하고, 6㎖/min의 유속으로 고성능 액체 크로마토그래피(Senshu pack ODS-2251-S, Senshu Kagaku Co.,Ltd; 용리액은 70부피%의 수성 메탄올)로 정제하여 보유 시간이 18분인 포막틴 B 14.4㎎을 수득한다.

[실험예 1]

상기와 같은 수득된 포막틴 A를 사용하여 항혈소판 응집 시험을 행한다. 혈액을 토끼 심장에서 채혈한 즉시 혈액 부피의 9배의 3.8%W/V 시트르산나트륨 수용액과 혼합한다. 이어서 실온에서 15분 동안 150×g으로 혈액 혼합물을 원심분리하여 혈소판이 풍분한 혈장(PRP)을 상층액으로서 수득한다. 혈액 혼합물로부터 잔류 침전 분획을 10,000×g으로 추가로 15분간 원심분리하여 혈소판이 결핍된 혈장(ppp)을 상층액으로서 수득한다. PRP와 ppp를 적당한 비율로 혼합하여 6×10⁵/㎕의 혈소판 수를 갖는 혈장을 수득한다.

응집계(aggregometer)를 사용하여 시험 샘플을 통과하는광투과율의 증가를 측정하는, 문헌[Nature, 194,927-929(1962), Born등] 기재의 방법에 의해 혈소판 응집율을 측정한다.

적당한 농도에서 시험될 화합물을 함유하는 디메틸술폭시드 용액 3㎕를 상기 혈장 250㎕에 가한다. 1분후, 합성 C_{16 : 0}PAR의 염수 용액(1×10^-8-3×10^-8M의 최종 농도를 수득하기에 충분한 농도) 25㎕을 가하고, 5분간 응집율을 관찰한다. 시험 화합물을 먼저 첨가하지 않고 PAF 만을 첨가하였을때 생성되는 응집율을 100%로 한다.

시험 용액 대신에 생리 식염수를 가하고, 1분후 C₁₆-PAF를 가한 응집물을 대조용으로 사용한다. 그 결과, 포막틴 A가 10g/㎖의 농도에서 약 91.7%까지 혈소판 응집을 억제하는 것을 발견하게 되었는데, 이것은 17μM의 IC₅₀(즉, 50%까지 응집을 억제하는데 필요한 농도)에 상응하는 것이다.

포막틴 B에 대해서도 동일한 시험을 행한 결과, 포막틴 B도 역시 17μM의 IC₅₀을 나타내었는데, 이로써 혈소판 응집 억제능력이 우수함을 알 수 있다.

Claims

하기 일반식(Ⅰ)의 화합물.
하기 일반식(Ⅱ)의 화합물.
하기 일반식(Ⅰa)의 화합물.
하기 일반식(Ⅱa)의 화합물.
균주 포마(phoma)의 포막틴-생성 미생물을 배양시키고, 적어도 1종의 포막틴을 배양 브로스로부터 분리함을 특징으로 하는, 포막틴으로부터 선택된 PAF 길항 물질 화합물의 제조방법.
제5항에 있어서, 포막틴의 구조가 이중결합의 탄소원자와, 그 자체가 브릿지 또는 브릿지되지 않을 수 있는 9원 탄소 브릿지 구조에 의해 2위치가 제거된 탄소원자 사이가 브릿지된 시클로헥센 고리에 의해 특징지워지는 방법.
균주 포마의 포막틴 A-생성 미생물을 배양하고, 포막틴 A를 배양 브로스로부터 분리함을 특징으로 하는, 제1항 기재의 일반식(Ⅰ)을 갖는 포막틴 A의 제조방법.
균주 포마의 포막틴 B-생성 미생물을 배양하고, 포막틴 B를 배양 브로스로부터 분리함을 특징으로 하는, 제2항 기재의 일반식(Ⅱ)를 갖는 포막틴 B의 제조방법.
균주 포마의 포막틴 A-생성 미생물을 배양하고, 포막틴 A를 배양 브로스로부터 분리함을 특징으로 하는 제3항 기재의 일반식(Ⅰa)를 갖는 포막틴 A의 제조방법.
균주 포마의 포막틴 B-생성 미생물을 배양하고, 포막틴 B를 배양 브로스로부터 분리함을 특징으로 하는, 제4항 기재의 일반식(Ⅱa)를 갖는 포막틴 B의 제조방법.
제5 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 미생물이, 균주 SANK 11486(No.FERM BP-2598)이 속하는 종의 균사의 균주인 방법.
제11항에 있어서, 미생물이 균주 SANK 11486(No.FERM BP-2598)인 방법.
제5 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 배양을 약 15 내지 약 30℃ 범위의 온도에서 수행하는 방법.
제13항에 있어서, 배양을 약 20 내지 약 28℃ 범위의 온도에서 수행하는 방법.
제13항에 있어서, 배양을 약 22 내지 약 26℃ 범위의 온도에서 수행하는 방법.
제5 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서, 배양을 pH가 약 5.0 내지 약 9.0인 배양 배지에서 수행하는 방법.
*제16항에 있어서, 배양을 pH가 6.5 내지 약 8.5인 배양 배지에서 수행하는 방법.
적어도 1종의 포막틴인 PAF 길항 물질을 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 배합한 염증 또는 쇼크 치료용 약학적 조성물.
제18항에 있어서, 포막틴이 포막틴 A인 조성물.
제18항에 있어서, 포막틴이 포막틴 B인 조성물.
PAF-매개 질환에 감염 가능한 인간을 제외한 포유동물에 포막틴으로부터 선택된 PAF 길항 물질 유효량을 투여함으로써 PAF-매개 질환을 치료하는 방법.
제21항에 있어서, 포막틴이 포막틴 A인 방법.
제21항에 있어서, 포막틴이 포막틴 B인 방법.
적어도 1종의 포막틴인 PAF 길항 물질을 염증 또는 쇼크의 치료 또는 예방에 충분한 양만큼 인간을 제외한 동물에 투여함을 특징으로 하는 천식, 염증 또는 쇼크의 치료 또는 예방 방법.
제24항에 있어서, 포막틴이 포막틴 A인 방법.
제24항에 있어서, 포막틴이 포막틴 B인 방법.