JP2826140B2 - 血小板活性化因子拮抗物質フォマクチンａ - Google Patents
血小板活性化因子拮抗物質フォマクチンａInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は血小板活性化因子（以下、PAFという）拮抗
作用を有する新規なジテルペン化合物およびその製法に
関する。
作用を有する新規なジテルペン化合物およびその製法に
関する。
（従来の技術） PAFに拮抗作用を有する物質は、PAF型と非PAF型に分
類されており、このうち、PAF型拮抗物質は主として化
学合成で得られ、非PAF型拮抗物質は化学合成品の他に
高等植物あるいは微生物の二次代謝産物から得られてい
る。高等植物由来の非PAF型拮抗物質としては例えばギ
ンコ・ビローバ（Ginkgo biloba）より得られたギンコ
ライド、パイパー・フトーカズラ（Piper Futokadzur
a）より得られたカズレノン、マグノリア・アキュミナ
ータ（Magnolia acuminata）より得られたベラグエンシ
ン、ヒマンタンドラ・ベルグラベナ（himantandra Velg
ravena）より得られたガンベンジンおよびガルブラビ
ン、ネクタンドラ・リジダ（Nectandra rigida）より得
られたネクタンドリンＡおよびＢ、ブルセラ・ミクロフ
ィラ（Bursera microphylla）より得られたブルセラン
等が知られている（P.Braquet and J.J.Godfroid,Trend
in Pharm.Sci.、７397,（1986））。
類されており、このうち、PAF型拮抗物質は主として化
学合成で得られ、非PAF型拮抗物質は化学合成品の他に
高等植物あるいは微生物の二次代謝産物から得られてい
る。高等植物由来の非PAF型拮抗物質としては例えばギ
ンコ・ビローバ（Ginkgo biloba）より得られたギンコ
ライド、パイパー・フトーカズラ（Piper Futokadzur
a）より得られたカズレノン、マグノリア・アキュミナ
ータ（Magnolia acuminata）より得られたベラグエンシ
ン、ヒマンタンドラ・ベルグラベナ（himantandra Velg
ravena）より得られたガンベンジンおよびガルブラビ
ン、ネクタンドラ・リジダ（Nectandra rigida）より得
られたネクタンドリンＡおよびＢ、ブルセラ・ミクロフ
ィラ（Bursera microphylla）より得られたブルセラン
等が知られている（P.Braquet and J.J.Godfroid,Trend
in Pharm.Sci.、７397,（1986））。
また、微生物の二次代謝物としてペニシリウム属（Pe
nicillium terlikowskii）からグルオトキシン誘導体
（M.Okamoto,Chem.Pharm.Bull.34（１）、340,（198
6））およびストレプトミセス属（Streptomyces sp.）
からジケトピペラジン誘導体（S.takase,J.Org.Chem.5
2、3485、（1987））が得られている。
nicillium terlikowskii）からグルオトキシン誘導体
（M.Okamoto,Chem.Pharm.Bull.34（１）、340,（198
6））およびストレプトミセス属（Streptomyces sp.）
からジケトピペラジン誘導体（S.takase,J.Org.Chem.5
2、3485、（1987））が得られている。
（発明が解決する課題） 本発明者らは、カニの甲殻から分離されたフォーマ属
に属するSANK 11486株の培養物からPAF拮抗作用を有す
る新規化合物フォマクチンＡ（Phomactin A）が生産さ
れることを見出して本発明を完成した。
に属するSANK 11486株の培養物からPAF拮抗作用を有す
る新規化合物フォマクチンＡ（Phomactin A）が生産さ
れることを見出して本発明を完成した。
（課題を解決するための手段） 本発明のフォマクチンＡは下記の構造式および性状を
有する。
有する。
１）構造式 ２）物質の性状：無色油状物質 ３）比旋光度：▲〔α〕25 D▼＝＋146.7゜ （c 0.75、クロロホルム） ４）元素分析値：（％） 実測値 Ｃ、71.65 Ｈ、9.10 計算値 Ｃ、71.82 Ｈ、9.04 ５）分子式:C20H30O4 （高分解能質量分析法により測定） ６）分子量:334（質量分析法により測定） 薄膜法で測定した赤外線吸収スペクトルは図１に示す
通りである。
通りである。
3395、1580、1450、1380、1230、1050、960、756 ８）1H−核磁気共鳴スペクトル：δppm 重メタノール中、内部基準にテトラメチルシランを使
用して測定した核磁気共鳴スペクトル（500 MHz）は図
２に示す通りである。
用して測定した核磁気共鳴スペクトル（500 MHz）は図
２に示す通りである。
９）13C−核磁気共鳴スペクトル：δppm 重メタノール中、内部基準にテトラメチルシランを使
用して測定した核磁気共鳴スペクトル（126 MHz）は図
３に示す通りであり、以下にケミカルシフトおよび多重
度を示す。
用して測定した核磁気共鳴スペクトル（126 MHz）は図
３に示す通りであり、以下にケミカルシフトおよび多重
度を示す。
14.9（ｑ）,16.5（ｑ）,19.6（ｑ）,21.9（ｑ）,25.8
（ｔ）,27.8（ｄ）,34.2（ｔ）,34.5（ｔ）,37.6
（ｔ）,38.0（ｓ）,38.6（ｔ）,62.6（ｄ）,72.0
（ｔ）,74.6（ｄ）,81.2（ｓ）,110.0（ｓ）,128.7
（ｓ）,131.3（ｓ）,131.4（ｄ）,144.6（ｓ） 10）紫外線吸収スペクトル：λmax nm エタノール中で測定した紫外線吸収スペクトルは末端
吸収のみ。
（ｔ）,27.8（ｄ）,34.2（ｔ）,34.5（ｔ）,37.6
（ｔ）,38.0（ｓ）,38.6（ｔ）,62.6（ｄ）,72.0
（ｔ）,74.6（ｄ）,81.2（ｓ）,110.0（ｓ）,128.7
（ｓ）,131.3（ｓ）,131.4（ｄ）,144.6（ｓ） 10）紫外線吸収スペクトル：λmax nm エタノール中で測定した紫外線吸収スペクトルは末端
吸収のみ。
11）溶解性： メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロ
ロホルム、ジメチルスルホキシド、ベンゼン、エーテル
に可溶、水に不溶である。
ロホルム、ジメチルスルホキシド、ベンゼン、エーテル
に可溶、水に不溶である。
12）呈色反応： 硫酸、ヨードに陽性。
13）薄層クロマトグラフィー： Rf値:0.54 吸着剤；シリカゲルプレート（Kieselgel 60F254,メ
ルク社製） 展開溶媒;n−ヘキサン−酢酸エチル（1:2） 本発明のフォマクチンＡは種々の立体および幾何異性
体を有する。前記式においては、これらの異性体および
これらの異性体の混合物がすべて単一の式で示されてい
る。従って、本発明においてはこれらの異性体およびこ
れらの異性体の混合物をもすべて含むものである。
ルク社製） 展開溶媒;n−ヘキサン−酢酸エチル（1:2） 本発明のフォマクチンＡは種々の立体および幾何異性
体を有する。前記式においては、これらの異性体および
これらの異性体の混合物がすべて単一の式で示されてい
る。従って、本発明においてはこれらの異性体およびこ
れらの異性体の混合物をもすべて含むものである。
フォマクチンＡの生産菌であるSANK 11486株の菌学的
性状は次の通りである。
性状は次の通りである。
本菌は福井県沖で採取されたカニで甲殻が黒変し「ス
スガニ」と呼ばれているズワイガニ（Chinoecetes opil
io）の甲殻から分離された菌株で、その菌学的諸性状は
次の通りである。オートミール寒天倍地上、25゜での生
育は７日間で20mm、14日間で38mmに達する。両倍地上と
もコロニーは湿気のあるビロード状でその色は灰汁色
（Greenish gray）である。
スガニ」と呼ばれているズワイガニ（Chinoecetes opil
io）の甲殻から分離された菌株で、その菌学的諸性状は
次の通りである。オートミール寒天倍地上、25゜での生
育は７日間で20mm、14日間で38mmに達する。両倍地上と
もコロニーは湿気のあるビロード状でその色は灰汁色
（Greenish gray）である。
オートミール寒天倍地上では菌糸のみで胞子、分生子
の形成は見られないが、人工海水（商品名、Jamarin
s）で作ったオートミール寒天倍地上では分生子殻を形
成し、その中に分生子を形成する。
の形成は見られないが、人工海水（商品名、Jamarin
s）で作ったオートミール寒天倍地上では分生子殻を形
成し、その中に分生子を形成する。
分生子殻は暗褐色、亜球形ないし洋梨型で孔口を有
し、サイズは80〜120×80〜150μｍである。孔口の径は
５〜15μｍでその周辺に褐色で20〜50×２〜４μｍの剛
毛を有する。
し、サイズは80〜120×80〜150μｍである。孔口の径は
５〜15μｍでその周辺に褐色で20〜50×２〜４μｍの剛
毛を有する。
分生子柄はとくに分化せず殻壁最内層がフィアライド
となる。分生子柄は無色、一細胞、楕円形ないし長楕円
形で2.5〜4.0×2.0〜2.5μｍである。
となる。分生子柄は無色、一細胞、楕円形ないし長楕円
形で2.5〜4.0×2.0〜2.5μｍである。
なお、本菌は37℃では生育しない。
以上の諸性状をもとにB.C.Sutton著“The Coelomycet
es"Commonwealth Mycological Institute,1980年発行お
よびJ.KohlmeyerおよびE.Kohlmeyer著“Marine Mycolog
y,the higher fungi"Academic Press,1979年発行を用い
て検索した結果、本菌を公知の属であるフォーマ属に属
するフォーマ・エスピー（Phoma sp.）と同定し、保存
番号としてSANK 11486株（微工研条寄第2598号,FERM BP
−2598）を付与した。
es"Commonwealth Mycological Institute,1980年発行お
よびJ.KohlmeyerおよびE.Kohlmeyer著“Marine Mycolog
y,the higher fungi"Academic Press,1979年発行を用い
て検索した結果、本菌を公知の属であるフォーマ属に属
するフォーマ・エスピー（Phoma sp.）と同定し、保存
番号としてSANK 11486株（微工研条寄第2598号,FERM BP
−2598）を付与した。
なお、色の表示はA.KornerupおよびJ.H.Wanscher著
〔Methuen Handbook of colour,第３版1978年、Eyre Me
theuen,London発行〕に従って行った。
〔Methuen Handbook of colour,第３版1978年、Eyre Me
theuen,London発行〕に従って行った。
以上、フォマクチンＡの生産菌について説明したが、
カビの諸性質は一定したものではなく、自然的、人工的
に容易に変化することは周知の通りであり、本発明で使
用しうる菌株はフォーマ属に属するフォマクチンＡを生
産するすべての菌株を包含するものである。
カビの諸性質は一定したものではなく、自然的、人工的
に容易に変化することは周知の通りであり、本発明で使
用しうる菌株はフォーマ属に属するフォマクチンＡを生
産するすべての菌株を包含するものである。
本発明の新規化合物フォマクチンＡを得るため、これ
らの微生物の培養は他の醗酵生産物を生産するために用
いられるような培地中で行う。培地には人工海水を用い
てもよいし、水道水を用いてもよい。このような培地中
には、微生物が資化できる炭素源、窒素源および無機塩
を含有する。
らの微生物の培養は他の醗酵生産物を生産するために用
いられるような培地中で行う。培地には人工海水を用い
てもよいし、水道水を用いてもよい。このような培地中
には、微生物が資化できる炭素源、窒素源および無機塩
を含有する。
一般に、炭素源としてグルコース、フラクトース、マ
ルトース、シュークロース、マンニトール、グリセロー
ル、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデ
ンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実
油、糖蜜、クエン酸、酒石酸などを単一に、あるいは併
用して用いることができる。一般には、倍地量の１−10
重量％で変量する。
ルトース、シュークロース、マンニトール、グリセロー
ル、デキストリン、オート麦、ライ麦、トウモロコシデ
ンプン、ジャガイモ、トウモロコシ粉、大豆粉、綿実
油、糖蜜、クエン酸、酒石酸などを単一に、あるいは併
用して用いることができる。一般には、倍地量の１−10
重量％で変量する。
窒素源としては、一般に蛋白質を含有する物質を醗酵
工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆粉、フス
マ、落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水分解物、
ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプト
ン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキ
ス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、等である。窒素源は、単一または併用して培地量
の0.2−６重量％の範囲で用いる。
工程に用いる。適当な窒素源としては、大豆粉、フス
マ、落花生粉、綿実油、綿実粉、カゼイン加水分解物、
ファーマミン、魚粉、コーンスチープリカー、ペプト
ン、肉エキス、イースト、イーストエキス、マルトエキ
ス、硝酸ナトリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニ
ウム、等である。窒素源は、単一または併用して培地量
の0.2−６重量％の範囲で用いる。
培地中に取り入れる栄養無機塩は、ナトリウム、アン
モニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェー
ト、クロライド、カーボネート等のイオンを得ることの
できる通常の塩類である。また、カリウム、カルシウ
ム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の
金属も含む。液体培養に際しては、シリコン油、植物
油、界面活性剤等が消泡剤として使用される。
モニウム、カルシウム、フォスフェート、サルフェー
ト、クロライド、カーボネート等のイオンを得ることの
できる通常の塩類である。また、カリウム、カルシウ
ム、コバルト、マンガン、鉄、マグネシウム等の微量の
金属も含む。液体培養に際しては、シリコン油、植物
油、界面活性剤等が消泡剤として使用される。
フォーマ・エスピー（Phoma sp.）SANK 11486株を培
養し、フォマクチンＡを生産する倍地のpHは5.0−9.0、
好適には、6.5−8.5に変化できる。
養し、フォマクチンＡを生産する倍地のpHは5.0−9.0、
好適には、6.5−8.5に変化できる。
菌の生育温度は15℃から30℃までであるが更にフォマ
クチンＡの生産には、20℃から28℃、特に22℃から26
℃、が好適である。
クチンＡの生産には、20℃から28℃、特に22℃から26
℃、が好適である。
フォマクチンＡは、好気的に培養して得られるが通常
用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振とう培
養法、通気撹拌培養法等が用いられる。小規模な培養に
おいては、22℃〜26℃で数日間〜２週間、振とう培養を
行うのが良好である。培養は、バッフル（水流調節壁）
のついた三角フラスコ中で、１−２段階の種の発育工程
により開始する。種発育手段の倍地は、炭素源および窒
素源を併用できる。種フラスコは定温インキュベーター
中で22℃〜26℃、７日間振とうするか、または充分に成
長するまで振とうする。成長した種は第二の種倍地、ま
たは生産倍地に接種するのに用いる。中間発育工程を用
いる場合には、本質的に同様の方法で成長させ、生産倍
地に接種するためにそれを部分的に用いる。接種したフ
ラスコを一定温度で数日間振とうし、インキュベーショ
ンが終わったらフラスコの含有物を遠心分離またはろ過
する。大量培養の場合には、撹拌機、通気装置を付けた
適当なタンクで培養するのが好ましい。この方法によれ
ば、栄養培地をタンクの中で作成できる。栄養倍地を12
5℃まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌培地にあらかじ
め成長させてあった種を接種する。培養は22℃〜26℃で
通気撹拌して行う。この方法は、多量の化合物を得るの
に適している。
用いられる好気的培養法、例えば固体培養法、振とう培
養法、通気撹拌培養法等が用いられる。小規模な培養に
おいては、22℃〜26℃で数日間〜２週間、振とう培養を
行うのが良好である。培養は、バッフル（水流調節壁）
のついた三角フラスコ中で、１−２段階の種の発育工程
により開始する。種発育手段の倍地は、炭素源および窒
素源を併用できる。種フラスコは定温インキュベーター
中で22℃〜26℃、７日間振とうするか、または充分に成
長するまで振とうする。成長した種は第二の種倍地、ま
たは生産倍地に接種するのに用いる。中間発育工程を用
いる場合には、本質的に同様の方法で成長させ、生産倍
地に接種するためにそれを部分的に用いる。接種したフ
ラスコを一定温度で数日間振とうし、インキュベーショ
ンが終わったらフラスコの含有物を遠心分離またはろ過
する。大量培養の場合には、撹拌機、通気装置を付けた
適当なタンクで培養するのが好ましい。この方法によれ
ば、栄養培地をタンクの中で作成できる。栄養倍地を12
5℃まで加熱して滅菌し、冷却後、滅菌培地にあらかじ
め成長させてあった種を接種する。培養は22℃〜26℃で
通気撹拌して行う。この方法は、多量の化合物を得るの
に適している。
培養終了後、培養液中の液体部分に存在するフォマク
チンＡは、菌体、その他の部分を珪藻土をろ過助剤とす
る、ろ過操作または遠心分離によって分別し、そのろ液
または上清中に存在するフォマクチンＡを、その物理化
学的性状を利用し抽出精製することにより得られる。例
えば、ろ液または、上清中に存在するフォマクチンＡ
は、中性pH条件下で水と混和しない有機溶剤、例えばエ
ーテル、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、液
化エチレン、塩化メチレンなどの単独または、それらの
組み合わせにより抽出精製することができる。あるいは
吸着剤として、例えば活性炭または吸着用樹脂であるア
ンバーライトΧAD−2,ΧAD−４（ローム・アンド・ハー
ス社製）等や、ダイヤイオンHP−10,HP−20,CHP−20P,H
P−50（三菱化成（株）製）等が使用される。フォマク
チンＡを含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて
不純物を吸着させて取り除くか、またはフォマクチンＡ
を吸着させた後、メタノール水、アセトン水、ｎ−ブタ
ノール水などを用いて溶出させることにより得られる。
チンＡは、菌体、その他の部分を珪藻土をろ過助剤とす
る、ろ過操作または遠心分離によって分別し、そのろ液
または上清中に存在するフォマクチンＡを、その物理化
学的性状を利用し抽出精製することにより得られる。例
えば、ろ液または、上清中に存在するフォマクチンＡ
は、中性pH条件下で水と混和しない有機溶剤、例えばエ
ーテル、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、クロロホルム、液
化エチレン、塩化メチレンなどの単独または、それらの
組み合わせにより抽出精製することができる。あるいは
吸着剤として、例えば活性炭または吸着用樹脂であるア
ンバーライトΧAD−2,ΧAD−４（ローム・アンド・ハー
ス社製）等や、ダイヤイオンHP−10,HP−20,CHP−20P,H
P−50（三菱化成（株）製）等が使用される。フォマク
チンＡを含む液を上記のごとき吸着剤の層を通過させて
不純物を吸着させて取り除くか、またはフォマクチンＡ
を吸着させた後、メタノール水、アセトン水、ｎ−ブタ
ノール水などを用いて溶出させることにより得られる。
このようにして得られたフォマクチンＡは、更にシリ
カゲル、マグネシウム−シリカゲル系のフロリジルのよ
うな担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、セフ
ァデックスLH−20（ファルマシア社製）などを用いた分
配カラムクロマトグラフィー、および順相、逆相カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製すること
ができる。
カゲル、マグネシウム−シリカゲル系のフロリジルのよ
うな担体を用いた吸着カラムクロマトグラフィー、セフ
ァデックスLH−20（ファルマシア社製）などを用いた分
配カラムクロマトグラフィー、および順相、逆相カラム
を用いた高速液体クロマトグラフィー等で精製すること
ができる。
本発明のフォマクチンＡは、文献未載の新規化合物で
あり、動物（例、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ等）に対し
てPAF拮抗作用を示し、例えば抗血栓剤としての使用は
もとより、喘息、消化性潰瘍、腎臓障害、高血圧等の予
防、治療剤として有用である。
あり、動物（例、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ等）に対し
てPAF拮抗作用を示し、例えば抗血栓剤としての使用は
もとより、喘息、消化性潰瘍、腎臓障害、高血圧等の予
防、治療剤として有用である。
本発明のフォマクチンＡを医薬として用いる場合、常
法に従ってそれ自体または適宜の薬学的に許容される担
体、賦形剤、希釈剤と混合し、粉末剤、顆粒剤、錠剤、
カプセル剤、注射剤などの形態で経口的または非経口的
に安全に投与することができる。投与量は対称疾患、投
与経路および投与回数などにより異なるが、例えば成人
に対しては１日1mgから1000mgを、症状に応じて１回ま
たは数回に分けて投与するのが好ましい。
法に従ってそれ自体または適宜の薬学的に許容される担
体、賦形剤、希釈剤と混合し、粉末剤、顆粒剤、錠剤、
カプセル剤、注射剤などの形態で経口的または非経口的
に安全に投与することができる。投与量は対称疾患、投
与経路および投与回数などにより異なるが、例えば成人
に対しては１日1mgから1000mgを、症状に応じて１回ま
たは数回に分けて投与するのが好ましい。
（実施例） 次に実施例をあげて本発明を更に具体的に説明する。
実施例1.フォマクチンＡの採取 Ａ）培養 フォーマ・エスピーSANK 11486株をそのスラントか
ら、減菌した後述の組成の培地100mlを含むバッフルの
付いた500mlの三角フラスコ（種フラスコに一白金耳接
種した。
ら、減菌した後述の組成の培地100mlを含むバッフルの
付いた500mlの三角フラスコ（種フラスコに一白金耳接
種した。
培地組成 シュークロース 20g ジャガイモ 100g ペプトン 10g リン酸一カリウム 5g 人工海水（商品名、Jamarin S 1000ml ジャマリンラボラトリー社製） pH 8.5 次いでこれを26℃で７日間、200rpm（7cmの回転半
径）のロータリー振とう機で培養した。種培地と同じ組
成の培地を、各々100mlづつバッフルの付いた500mlの三
角フラスコ120本に入れ、滅菌後、種フラスコから3mlづ
つ成長菌を取って接種した。この120本の三角フラスコ
を種培養と同じ条件で７日間振とう培養した。
径）のロータリー振とう機で培養した。種培地と同じ組
成の培地を、各々100mlづつバッフルの付いた500mlの三
角フラスコ120本に入れ、滅菌後、種フラスコから3mlづ
つ成長菌を取って接種した。この120本の三角フラスコ
を種培養と同じ条件で７日間振とう培養した。
Ｂ）単離 培養液全体を吸引ろ過し、そのろ過13Lを同量の酢酸
エチルで２回抽出した。得られた酢酸エチル層を水5Lで
洗浄し、更に無水流酸ナトリウムで乾燥した後、ロータ
リーエバポレーターで減圧下濃縮、乾固して油状物360m
gを得た。得られた油状物を30倍のシリカゲルを用いた
吸着カラムクロマトグラフィー（Art.9385、230〜400メ
ッシュ、メルク社製）に付し、ｎ−ヘキサン−酢酸エチ
ル（1:1）の混合溶剤で溶出する分画を集めた。この分
画より溶剤を減圧下で留去すると油状物130mgが得られ
た。得られた油状物を更に逆相液体カラムクロマトグラ
フィーに対して精製した。即ち、逆相液体カラムクロマ
トグラフィー（ローバーRP−８、サイズＢ、メルク社
製）に付し、80％含水メタノールで溶出する部分を集
め、この分画より溶剤を留去した。得られた油状物を高
速液体クロマトグラフィー（センシューパック ODS−2
251−Ｓ、センシュー科学（株）製）に付し、40％含水
アセトニトリルで溶出する部分を集め、この分画より溶
剤を減圧下で留去すると無色油状の目的化合物フォマク
チンＡ〔化学名：（３′Ｅ）−3,3a−ジヒドロキシ−2,
6−（３′−メチル−３′−ヘキセノ）−2,6,7−トリメ
チル3a5,6,7,8,8a−ヘキサヒドロフロ〔2,3,4−de〕ク
ロマン3mgが得られた。
エチルで２回抽出した。得られた酢酸エチル層を水5Lで
洗浄し、更に無水流酸ナトリウムで乾燥した後、ロータ
リーエバポレーターで減圧下濃縮、乾固して油状物360m
gを得た。得られた油状物を30倍のシリカゲルを用いた
吸着カラムクロマトグラフィー（Art.9385、230〜400メ
ッシュ、メルク社製）に付し、ｎ−ヘキサン−酢酸エチ
ル（1:1）の混合溶剤で溶出する分画を集めた。この分
画より溶剤を減圧下で留去すると油状物130mgが得られ
た。得られた油状物を更に逆相液体カラムクロマトグラ
フィーに対して精製した。即ち、逆相液体カラムクロマ
トグラフィー（ローバーRP−８、サイズＢ、メルク社
製）に付し、80％含水メタノールで溶出する部分を集
め、この分画より溶剤を留去した。得られた油状物を高
速液体クロマトグラフィー（センシューパック ODS−2
251−Ｓ、センシュー科学（株）製）に付し、40％含水
アセトニトリルで溶出する部分を集め、この分画より溶
剤を減圧下で留去すると無色油状の目的化合物フォマク
チンＡ〔化学名：（３′Ｅ）−3,3a−ジヒドロキシ−2,
6−（３′−メチル−３′−ヘキセノ）−2,6,7−トリメ
チル3a5,6,7,8,8a−ヘキサヒドロフロ〔2,3,4−de〕ク
ロマン3mgが得られた。
実施例2.フォマクチンＡの採取 実施例1.A）培養の項において、人工海水に代わりに
水道水を用いて55本の三角フラスコを23℃で11日間培養
した。
水道水を用いて55本の三角フラスコを23℃で11日間培養
した。
得られた培養ろ液5.4Lを等量の酢酸エチルで２回抽出
した。得られた酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーターで減圧下
濃縮、乾固して油状物636mgが得られた。得られた油状
物を10gのシリカゲルを用いた吸着カラムクロマトグラ
フィー（Art.9385,230〜400メッシュ、メルク社製）に
付し、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（2:8）の混合溶剤で
溶出する分画を集めた。得られた分画より溶剤を減圧下
で留去すると油状物274mgが得られた。得られた油状物
を高速液体ウロマトグラフィー（センシューパック OD
S−2251−S,センシュー科学（株）製）に付し、80％メ
タノールで毎分6mlで溶出すると保持時間22分30秒でフ
ォマクチンA14.0mgが得られた。更に、前留部分につい
ては、溶剤を留去し得られた残留物を再度、同一カラム
に付し、70％メタノールで毎分6mlで溶出すると保持時
間18分でフォマクチンB14.4mgがえられた。
した。得られた酢酸エチル層を水洗し、無水硫酸ナトリ
ウムで乾燥した後、ロータリーエバポレーターで減圧下
濃縮、乾固して油状物636mgが得られた。得られた油状
物を10gのシリカゲルを用いた吸着カラムクロマトグラ
フィー（Art.9385,230〜400メッシュ、メルク社製）に
付し、ｎ−ヘキサン−酢酸エチル（2:8）の混合溶剤で
溶出する分画を集めた。得られた分画より溶剤を減圧下
で留去すると油状物274mgが得られた。得られた油状物
を高速液体ウロマトグラフィー（センシューパック OD
S−2251−S,センシュー科学（株）製）に付し、80％メ
タノールで毎分6mlで溶出すると保持時間22分30秒でフ
ォマクチンA14.0mgが得られた。更に、前留部分につい
ては、溶剤を留去し得られた残留物を再度、同一カラム
に付し、70％メタノールで毎分6mlで溶出すると保持時
間18分でフォマクチンB14.4mgがえられた。
（実施例の効果） 得られたフォマクチンＡは下記の生物学的性状を示
す。
す。
試験例1.PAFによる血小板凝集の抑制作用 家兎より心臓採血し、この血液を直ちに1:9容の3.8％
のクエン酸ソーダと混合した。室温下で、150×ｇにて1
5分間遠心し、上層より多血小板血漿（platelet poor p
lasma:ppp）を得た。PRPとPPPとを適量混合し、PRPの血
小板数を60万個／μｌになるように調製した。
のクエン酸ソーダと混合した。室温下で、150×ｇにて1
5分間遠心し、上層より多血小板血漿（platelet poor p
lasma:ppp）を得た。PRPとPPPとを適量混合し、PRPの血
小板数を60万個／μｌになるように調製した。
血小板凝集は、Bornの方法（Nature,vol..194,pp.927
−929（1962））により、アグリコメーターを用いて、
透過光の増加により測定した。
−929（1962））により、アグリコメーターを用いて、
透過光の増加により測定した。
即ち、PRP（250μｌ）に被検薬のDMSO溶液（３μｌ）
を加え、１分後にC16PAFの生理食塩水溶液（25μl,PAF
の終濃度１〜３×10-8M）を添加した。
を加え、１分後にC16PAFの生理食塩水溶液（25μl,PAF
の終濃度１〜３×10-8M）を添加した。
被検薬の溶液の代わりに生理食塩水を加え、１分後に
C16−PAF添加による凝集を対照値とした。その結果、フ
ォマクチンＡのIC50＝17μＭであった。
C16−PAF添加による凝集を対照値とした。その結果、フ
ォマクチンＡのIC50＝17μＭであった。
（発明の効果） 本発明のフォマクチンＡはPAF拮抗作用を有し、医薬
として有用である。
として有用である。
図１はフォマクチンＡの赤外線吸収スペクトルを示し、
図２は同物質の1H−核磁気共鳴スペクトルを示し、図３
は同物質の13C−核磁気共鳴スペクトルを示す。
図２は同物質の1H−核磁気共鳴スペクトルを示し、図３
は同物質の13C−核磁気共鳴スペクトルを示す。
フロントページの続き (72)発明者 大島 武史 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 桑野 晴光 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (72)発明者 畠 忠 東京都品川区広町１丁目２番58号 三共 株式会社内 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 17/00 - 17/18 C07D 493/08 A61K 31/35 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)
Claims (6)
- 【請求項１】式 を有するフォマクチンＡ（Phomactin A）。
- 【請求項２】以下の性状を有するフォマクチンA: １）物質の性状：無色油状 ２）比旋光度：［α］D 25＝＋146.7゜（c 0.75、クロロ
ホルム） ３）元素分析値：（％） 実測値 Ｃ、71.65 Ｈ、9.10 計算値 Ｃ、71.82 Ｈ、9.04 ４）分子式:C20H30O4（高分解能質量分析法により測
定） ５）分子量:334（質量分析法により測定） ６）赤外線吸収スペクトル：νmax cm-1 薄膜法で測定した赤外線吸収スペクトルは以下の通りで
ある； 3395、1580、1450、1380、1230、1050、960、756 ７）13C−核磁気共鳴スペクトル：δppm 重メタノール中、内部基準にテトラメチルシランを使用
して測定した核磁気共鳴スペクトル（126 MHz）は以下
の通りである； 14.9（ｑ）,16.5（ｑ）,19.6（ｑ）,21.9（ｑ）,25.8
（ｔ）,27.8（ｄ）,34.2（ｔ）,34.5（ｔ）,37.6
（ｔ）,38.0（ｓ）,38.6（ｔ）,62.6（ｄ）、72.0
（ｔ）,74.6（ｄ）,81.2（ｓ）,110.0（ｓ）,128.7
（ｓ）,131.3（ｓ）,131.4（ｄ）,144.6（ｓ） ８）溶解性：メタノール、エタノール、アセトン、酢酸
エチル、クロロホルム、ジメチルスルホキシド、ヘンゼ
ン、エーテルに可溶、水に不溶 ９）呈色反応：硫酸、ヨードに陽性、 10）薄層クロマトグラフィー： Rf値:0.54 吸着材；シリカゲルプレート （Kieselgel 60f254,メルク社製） 展開溶媒;n−ヘキサン−酢酸エチル（1:2）。 - 【請求項３】フォーマ属に属する請求項1.または2.に記
載のフォマクチンＡ生産菌を培養し、その培養物よりフ
ォマクチンＡを採取することを特徴とする請求項1.また
は2.に記載のフォマクチンＡの製造法。 - 【請求項４】フォーマ属に属するフォマクチンＡ生産菌
がフォーマ・エスピー SANK11486株（微工研条寄第259
8号;FERM BP−2598）である請求項3.記載の製造法。 - 【請求項５】請求項1.または2.に記載のフォマクチンＡ
を有効成分として含有する血小板活性化因子拮抗剤。 - 【請求項６】請求項1.または2.に記載のフォマクチンＡ
を有効成分として含有する抗血栓剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1307167A JP2826140B2 (ja) | 1988-11-28 | 1989-11-27 | 血小板活性化因子拮抗物質フォマクチンａ |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30027888 | 1988-11-28 | ||
| JP63-300278 | 1988-11-28 | ||
| JP1307167A JP2826140B2 (ja) | 1988-11-28 | 1989-11-27 | 血小板活性化因子拮抗物質フォマクチンａ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02256679A JPH02256679A (ja) | 1990-10-17 |
| JP2826140B2 true JP2826140B2 (ja) | 1998-11-18 |
Family
ID=26562281
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1307167A Expired - Fee Related JP2826140B2 (ja) | 1988-11-28 | 1989-11-27 | 血小板活性化因子拮抗物質フォマクチンａ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2826140B2 (ja) |
-
1989
- 1989-11-27 JP JP1307167A patent/JP2826140B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH02256679A (ja) | 1990-10-17 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |