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Die
folgende Erfindung betrifft neue wirksame Verbindungen (Citrullimycine),
die durch Kultivierung von Streptomycetes sp., DSM 13309, erhältlich sind,
sowie deren pharmazeutisch unbedenkliche Salze und Derivate. Die
folgende Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung
der Citrullimycine, die Streptomycetes sp., DSM 13309, die Verwendung
der Citrullimycine als Arzneimittel, insbesondere ihre Verwendung
in Form von Substanzen mit einer Affinität für Neurotensinrezeptoren, sowie
Citrullimycin enthaltende Arzneimittel.
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Bei
Neurotensin handelt es sich um ein aus 13 Aminosäuren bestehendes Peptidhormon
des Gehirns und des Magen-Darm-Trakts, das an der Steuerung eines
breiten Spektrums physiologischer Aktivitäten als zentraler Neurotransmitter
oder Neuromodulator sowohl im zentralen als auch im peripheren Nervensystem beteiligt
ist. Dabei werden viele Aufgaben über ihre Wechselwirkung mit
spezifischen Rezeptoren erfüllt,
die in mehreren Geweben und Zellinien peripherer und zentraler Organe
charakterisiert wurden. In Untersuchungen mit Neurotensin wurde
ihre Beteiligung an Schizophrenie, Morbus Parkinson und Morbus Alzheimer
impliziert. Verbindungen mit einer Affinität für die Neurotensinrezeptoren
könnten
sich daher als Therapeutika für
diese Krankheiten eignen.
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Es
wurde nun festgestellt, daß der
Mikroorganismusstamm Streptomycetes sp., DSM 13309, in der Lage
ist, neue Wirkstoffe zu bilden, die die in Zellmembranen menschlicher
embryonaler Nierenzellen (HEK [Human Embryonic Kidney]-Zellen) exprimierten
menschlichen Neurotensinrezeptorproteine hemmen.
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Entsprechenderweise
betrifft die vorliegende Erfindung die von dem Stamm Streptomycetes
sp., DSM 13309, gebildeten Wirkstoffe (Citrullimycine) sowie deren
physiologisch unbedenkliche Salze, Ester, Ether und andere offensichtliche
chemische Äquivalente.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft dementsprechend Verbindungen der
Formel I
worin
R
1, R
2, R
3 und
R
4 unabhängig
voneinander jeweils für
Alkylreste mit 1 bis 6, vorzugsweise 2 bis 5, Kohlenstoffatomen
stehen,
sowie deren physiologisch unbedenkliche Salze und Derivate,
wie beispielsweise Ester, Etter und andere offensichtliche chemische Äquivalente,
mit allen ihren stereoisomeren Formen und allen ihren tautomeren
Formen.
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Die
Alkylreste in den Verbindungen der Formel I können geradkettig oder verzweigt
sein.
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Zu
Alkylresten gehören
beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Pentyl, Hexyl, Isopropyl,
Isobutyl, Isopentyl, sek.-Butyl, tert.-Butyl und Neopentyl.
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Die
Erfindung betrifft ferner
- 1) eine Verbindung
der obigen Formel I, bei der einer der Reste R1,
R2, R3 oder R4 ein linearer oder verzweigter Propylrest
ist und die übrigen
Reste lineare oder verzweigte Butylreste sind (= Citrullimycin A:
Molekülformel
C41H75N3O11, MW: 785), sowie deren physiologisch unbedenkliche
Salze und Derivate;
- 2) eine Verbindung der obigen Formel I, bei der entweder
a)
zwei der Reste R1, R2,
R3 oder R4 lineare
oder verzweigte Butylreste und zwei Reste lineare oder verzweigte
Propylreste sind; oder
b) R1, R2, R3 bzw. R4 für
einen Butyl-, einen Pentyl-, einen Ethyl- bzw. einen Propylrest
stehen, wobei die Reihenfolge beliebig ist und die Reste entweder
geradkettig oder verzeigt sind; (= Citrullimycin B: Molekülformel:
C40H73N3O11, MW 771), sowie deren physiologisch unbedenkliche
Salze und Derivate; und
- 3) eine Verbindung der obigen Formel I, bei der entweder:
a)
R1, R2, R3 und R4 für lineare
oder verzweigte Butylreste stehen; oder
b) zwei der Reste R1, R2, R3 und
R4 lineare oder verzweigte Butylreste sind,
einer ein linearer oder verzweigter Propylrest und einer ein linearer
oder verzweigter Pentylrest ist;
(= Citrullimycin C: Molekülformel:
C42H77N3O11, MW 799), und deren physiologisch unbedenkliche
Salze und Derivate.
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Dabei
versteht es sich selbstverständlich,
daß die
Verbindungen der Formel I in verschiedenen isomeren Konfigurationen,
einschließlich
Struktur- ebenso wie Stereoisomeren, vorliegen können. Weiter versteht es sich,
daß die
vorliegende Erfindung solche Verbindungen der Formel I in jeder
ihrer verschiedenen Struktur- und Stereoisomerkonfigurationen in
Form individueller Isomere und von Isomergemischen umfaßt.
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Die
Citrullimycine A bis C gemäß der vorliegenden
Erfindung werden allgemein in Form von Isomerengemischen isoliert.
In Bezug auf Citrullimycin A kann beispielsweise eine isolierte
Probe ein Gemisch aus mindestens zwei der folgenden Isomere umfassen:
- Isomer 1: R1, R2 und
R4 = -CH(CH3)CH2CH3, R3 =
-CH(CH3)CH3
- Isomer 2: R1, R2 und
R3 = -CH(CH3)CH2CH3, R4 =
-CH(CH3)CH3
- Isomer 3: R1, R3 und
R4 = -CH(CH3)CH2CH3, R2 =
-CH(CH3)CH3
- Isomer 4: R1 = -CH(CH3)CH3, R2, R3 und
R4 = -CH(CH3)CH2CH3
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Die
Isomere von Citrullimycin A können
im isolierten Gemisch in einem beliebigen Verhältnis vorliegen.
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Citrullimycine
A–C können über eine
oder mehrere ihre physikochemischen und spektralen Eigenschaften,
wie beispielsweise ihrer Massenspektrometrie- oder 1H-NMR- bzw. 12C-NMR-Spektroskopiedaten (siehe
Tabellen 1 und 2 unten), charakterisiert werden.
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Die
Verbindungen der Formel I können
in Form einer Abfolge von vier β-Hydroxysäuren mit
einem in der Mitte der Sequenz eingebauten Citrullinmolekül beschrieben
werden. Citrullimycine A–C
unterscheiden sich in der Länge
der Alkylkette der β-Hydroxysäuren. Die
Verbindungen der Formel I sind durch Kultivierung des Mikroorganismus
Streptomycetes sp. erhältlich.
Der genannte Mikroorganismus wurde am 14. Februar 2000 bei der deutschen
Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Braunschweig, Deutschland
unter der Zugangsnummer DSM 13309 hinterlegt.
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Somit
wird in der vorliegenden Erfindung ferner ein Verfahren zur Herstellung
der Verbindungen der Formel I bereitgestellt, bei dem man den Mikroorganismus
Streptomycetes species DSM 13309, seine Mutanten und Varianten unter
aeroben Bedingungen in einem Nährmedium,
das eine oder mehrere Kohlenstoffquellen sowie eine oder mehrere
Stickstoffquellen und gegebenenfalls anorganische Nährsalze
und/oder Spurenelemente enthält,
kultiviert und anschließend
die Verbindungen in üblicher
Weise isoliert und aufreinigt.
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Das
Nährmedium
enthält
vorzugsweise Quellen für
Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Nährsalze. Zu den Kohlenstoffquellen
gehören
beispielsweise Stärke,
Glucose, Saccharose, Dextrin, Fructose, Melasse, Glycerin, Lactose
oder GaLactose, vorzugsweise Glucose. Zu den Stickstoffquellen zählen beispielsweise Sojabohnenmehl,
Erdnußmehl,
Hefeextrakt, Rindfleischextrakt, Pepton, Malzextrakt, Maisquellwasser,
Gelatine oder Casaminosäuren,
vorzugsweise Sojabohnenmehl. Zu den anorganischen Nährsalzen
gehören
beispielsweise Natriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat,
Ammoniumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Calciumchlorid, Calciumcarbonat,
Kaliumnitrat, Ammoniumsulfat oder Magnesiumsulfat, vorzugsweise Calciumcarbonat
und Kobalt(II)-chlorid.
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Die
Kultivierung des Stamms DSM 13309 kann bei Temperaturen zwischen
20–35°C und pH-Werten zwischen
5,0 und 8,0 durchgeführt
werden. Vorzugsweise wird der Stamm DSM 13309 bei 27°C (± 1°C) und pH
6,8–7,0
kultiviert.
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Die
Kultivierung des Stamms DSM 13309 erfolgt vorzugsweise über einen
Zeitraum von 48–240
Stunden, wenn eine optimale Ausbeute der erfindungsgemäßen Citrullimycine
erhalten wird. Besonders bevorzugt ist dabei die Durchführung der
Kultivierung mittels Fermentation über einen Zeitraum von 60–120 Stunden "unter Wasserbedingungen", beispielsweise
in Schüttelkolben
ebenso wie in Laborfermentern. Der Verlauf der Fermentation sowie
die Bildung der Citrullimycine läßt sich
mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC)
oder LC-MS sowie über
die Messung der Bioaktivität
der Kulturbrühe
nachweisen. In der erhaltenen Kulturbrühe sind die Citrullimycine
sowohl im Kulturfiltrat als auch im Mycel vorhanden. Sie lassen
sich mit bekannten Trenntechniken isolieren. So kann man sie aus
dem Kulturfiltrat mittels Extraktion mit einem mit Wasser nicht
mischbaren Lösungsmittel,
wie etwa Essigester, Dichlormethan, Chloroform oder Butanol, bei
pH 3–8 oder
mittels hydrophober Wechselwirkungschromatographie unter Verwendung
von Polymerharzen, wie beispielsweise "Diaion HP-20®" oder "MCI® Gel
CHP-20P" (Mtheirubishi
Chemical Industries Limited, Japan), "Amberlite XAD®" (Rohm and Haas Industries
U. S. A.), Aktivkohle oder Ionenaustauschchromatographie bei pH
3–8 gewinnen.
Die Chromatographie an MCI® Gel CHP-20P ist dabei
das bevorzugte Verfahren. Das aktive Material läßt sich auch aus dem Mycel
durch Extraktion mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel,
wie beispielsweise Methanol, Aceton, Acetonitril, n-Propanol oder
Isopropanol, oder einem nicht mit Wasser mischbaren Lösungsmittel,
wie beispielsweise Essigester, Dichlormethan, Chloroform oder Butanol,
bei pH 3–8
gewinnen, wobei hier die Extraktion mit Methanol das bevorzugte
Verfahren ist. Durch Einengen und Lyophilisierung der Extrakte erhält man das
aktive Rohmaterial.
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Die
Citrullimycine der vorliegenden Erfindung können beispielsweise aus dem
Rohmaterial wie folgt gewonnen werden:
mittels Fraktionierung
unter Verwendung einer der folgenden Techniken: Normalphasen-Chromatographie
(mit Aluminiumoxid- oder Siliciumdioxidgel als stationärer Phase
und Laufmitteln, wie beispielsweise Petrolether, Essigester, Methylenchlorid,
Aceton, Chloroform, Methanol oder Kombinationen davon sowie Zugaben
von Aminen, wie z. B. NEt3), Umkehrphasen-Chromatographie
(unter Verwendung von Umkehrphasen-Siliciumdioxidgelähnlichen
Dimethyloctadecylsilylsiliciumdioxid-Gel, auch als RP-18 bekannt,
oder Dimethyloctylsilylsiliciumdioxid-Gel, auch als RP-8 bekannt,
als stationärer
Phase und Laufmitteln, wie beispielsweise Wasser, Puffern wie etwa
Phosphat, Acetat, Citrat (pH 2–8)
und organischen Lösungsmitteln,
wie beispielsweise Methanol, Acetonitril, Aceton, Tetrahydrofuran
oder Kombinationen dieser Lösungsmittel),
Gelpermeationschromatographie unter Verwendung von Harzen, wie beispielsweise ®Sephadex
LH-20 (Pharmacia Chemical Industries, Schweden), TSKgel ®Toyopearl
HW (TosoHaas, Tosoh Corporation, Japan) in Lösungsmitteln, wie beispielsweise
Methanol, Chloroform, Aceton, Essigester oder deren Kombinationen,
oder ®Sephadex
G-10 und G-25 in Wasser; oder mittels Gegenstromchromatographie
unter Verwendung eines zweiphasigen Laufmittelsystems, das aus mindestens
zwei Lösungsmitteln
besteht, wie beispielsweise Wasser, Methanol, Ethanol, Isopropanol,
n-Propanol, Tetrahydrofuran, Aceton, Acetonitril, Methylenchlorid,
Chloroform, Essigester, Petrolether, Benzol und Toluol. Diese Techniken
können
wiederholt eingesetzt werden oder es kann eine Kombination der unterschiedlichen
Techniken verwendet werden. Als Verfahren bevorzugt ist die Chromatographie über Umkehrphasen-Siliciumdioxidgel
(RP-18).
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Bei
offensichtlichen chemischen Äquivalenten
("Derivaten") der erfindungsgemäßen Verbindungen handelt
es sich um Verbindungen, die einen leichten chemischen Unterschied
aufweisen, das heißt
die gleiche Wirkung aufweisen oder unter milden Bedingungen in die erfindungsgemäßen Verbindungen
umgewandelt werden. Zu diesen Äquivalenten
gehören
beispielsweise Ester, Ether, Komplexe oder Addukte der bzw. mit den
erfindungsgemäßen Verbindungen.
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Die
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in pharmazeutisch unbedenkliche
Salze und Derivate umgewandelt werden, die allesamt durch die vorliegende
Erfindung abgedeckt sind. Die Salze und Derivate lassen sich mit
dem Fachmann bekannten Standardverfahren herstellen.
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Unter
physiologisch unbedenklichen Salzen der Verbindungen der Formel
I versteht man sowohl die organischen als auch die anorganischen
Salze davon, wie sie in Remington's Pharmaceutical Sciences (17. Auflage,
Seite 1418 (1985)) beschrieben sind. Salze, wie etwa Natrium- und
Kaliumsalze, können
beispielsweise durch Versetzen der erfindungsgemäßen Verbindungen mit entsprechenden
Natrium- oder Kaliumbasen hergestellt werden.
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Ester
der freien Carbonsäure
können
mit in der Literatur angegebenen Verfahren hergestellt werden, beispielsweise
durch Versetzen mit einem Alkohol in Gegenwart eines Dehydratisierungsmittels,
wie etwa Decyclohexylcarbodiimid (DCC), wie in Advanced Organic
Synthesis, 4. Auflage, J. March, John Wiley & Sons, 1992, Seite 395, beschrieben.
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Die
Estergruppen der Verbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung
können
zu Ethergruppen wie in der Literatur angegeben reduziert werden,
beispielsweise durch Behandlung mit BF3-Etherat,
LiAlH4, LiBH4 oder
NaBH4, wie in Advanced Organic Synthesis,
4. Auflage, J. March, Wiley & Sons,
1992, Seite 1213. Die Amidgruppe kann auf die gleiche Weise durch
Umsetzen mit LiAlH4 reduziert werden.
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Die
erfindungsgemäßen Citrullimycine
zeigen im Neurotensinrezeptor-Bindungstest eine Hemmung der in den
HEK-Zellmembranen exprimierten menschlichen Neurotensinrezeptorproteine.
In diesem Test zeigte Citrullimycin A einen IC50-Wert
von 16 μM.
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Die
Verbindungen gemäß der vorliegenden
Erfindung und ihre pharmazeutisch unbedenklichen Salze und Derivate
lassen sich an Tieren, vorzugsweise an Säuger und insbesondere an Menschen,
als eigenständige
Arzneimittel, in Gemischen miteinander und in Form pharmazeutischer
Zusammensetzungen, die die parenterale Verabreichung gestatten,
verabreichen. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung
auch Verbindungen der obigen Formel I und deren pharmazeutisch unbedenkliche
Salze und Derivate zur Verwendung als Arzneimittel, insbesondere
zur Verwendung als Neurotensinantagonist mit einer Affinität für den Neurotensinrezeptor.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen,
die eine wirksame Menge einer oder mehrerer der Zielverbindungen
und/oder eines oder mehrerer pharmazeutisch unbedenklicher Salze
und/oder Derivate davon zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen
Träger enthalten.
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Die
erfindungsgemäßen Verbindungen
lassen sich oral, intramuskulär,
intravenös
oder mit anderen Verabreichungsformen verabreichen. Pharmazeutische
Zusammensetzungen, die diese Verbindungen oder ein pharmazeutisch
unbedenkliches Salz oder Derivat davon, gegebenenfalls mit anderen
pharmazeutisch wirksamen Substanzen, enthalten, lassen sich herstellen,
indem man die wirksamen Verbindungen mit einem oder mehreren pharmakologisch
unbedenklichen Hilfsmitteln und/oder -stoffen mischt. Das Gemisch
kann dann in eine geeignete pharmazeutische Form, wie beispielsweise
Tabletten, Dragees, Kapseln, Granulat, Pulver, Emulsionen, Suspensionen
oder Lösungen, überführt werden.
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Als
Beispiele von Hilfsmitteln und/oder -stoffen zu nennen sind hier
Füllstoffe,
Emulgatoren, Schmierstoffe, geschmacksverbessernde Stoffe, Farbstoffe
und Puffersubstanzen, Tragakant, Lactose, Talkum, Agar-Agar, Polyglykole,
Ethanol und Wasser. Für
die parenterale Verabreichung sind Suspensionen oder Lösungen in
Wasser geeignet und bevorzugt. Ebenso besteht die Möglichkeit,
die Wirkstoffe als solche, ohne Vehikel oder Verdünnungsmittel,
in einer geeigneten Form, beispielsweise in Kapseln, zu verabreichen.
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Die
Erfindung betrifft ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels,
bei dem man wenigstens eine der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einem
pharmaneutisch geeigneten und physiologisch unbedenklichen Träger und
gegebenenfalls weiteren geeigneten Wirkstoffen, Zusatzstoffen oder
Hilfsstoffen in eine geeignete Dosierungsform umwandelt.
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Wie üblich hängt die
galenische Formulierung und das Verabreichungsverfahren ebenso wie
der Dosierungsbereich, die sich bei einem bestimmten Fall eignen,
von der zu behandelnden Spezies sowie vom Zustand des jeweiligen
Leidens bzw. der jeweiligen Krankheit ab, wobei zur Optimierung
im Fachgebiet bekannte Verfahren verwendet werden können.
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Folgend
stehen illustrierende Beispiele der vorliegenden Erfindung, die
deren Umfang jedoch nicht beschränken:
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BEISPIEL 1
-
Haltung des Produktionsstamms Steptomycetes
species, DSM 13309
-
Zusammensetzung des Haltungsmediums
-
Der
Produktionsstamm DSM 13309 wurde auf dem folgenden Medium gehalten:
| Malzextrakt: | 10,0
g |
| Glucose: | 4,0
g |
| Hefeextrakt: | 4,0
g |
| Agarpulver: | 15,0
g |
| Entmineralisiertes
Wasser: | 1
Liter |
| pH-Wert: | 7,0–7,5 |
-
Nach
dem vollständige
Auflösen
der Inhaltsstoffe durch Erwärmen
wurde die erhaltene Lösung
in Teströhrchen
verteilt und 20 Minuten bei 121°C
sterilisiert. Die Teströhrchen
wurden abgekühlt
und zum Verfestigen in einer geneigten Position stehengelassen.
Die abgeschrägte
Agaroberfläche
wurde mit der gewachsenen Kultur von Streptomycetes sp., DSM 13309,
mittels einer Drahtöse
bestrichen und bei 28°C
(± 1°C) solange
inkubiert, bis gutes Wachstum beobachtet wurde. Die gutgewachsenen
Kulturen wurden im Kühlschrank bei
+8°C aufbewahrt.
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Herstellung einer Glycerin-Arbeitsanimpfkultur
-
Zusammensetzung
des Mediums
| Hefeextrakt: | 4
g |
| Lösliche Stärke: | 15
g |
| K2HPO4: | 1
g |
| MgSO4 × 7
H2O: | 0,5
g |
| Entmineralisiertes
Wasser: | 1
Liter |
| pH-Wert: | 7,0 |
-
Das
obige Medium wurde in Portionen von jeweils 100 ml in 300-ml-Erlenmeyerkolben
verteilt und 20 Minuten bei 121°C
autoklaviert. Die Kolben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt und
mit dem oben erwähnten
Schrägagar
angeimpft. Die Inkubation wurde über
einen Zeitraum von 5 Tagen auf einem Rotationsschüttler bei 180
UpM und 28°C
durchgeführt.
1,5 ml dieser Kultur wurde mit 1,5 ml Glycerin (99%) gemischt und
bei –20°C aufbewahrt.
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BEISPIEL 2
-
Fermentation des Stamms Streptomycetes
sp., DSM 13309, im Schüttelkolben
-
Zusammensetzung
des Animpfmediums:
| Glucose: | 20
g |
| Sojabohnenmehl: | 10
g |
| CaCO3: | 0,02
g |
| CoCl2 × 6
H2O: | 0,001
g |
| Entmineralisiertes
Wasser: | 1
Liter |
| pH-Wert: | 6,8–7,0 |
-
Das
obige Medium wurde in Mengen von jeweils 100 ml in 500-ml-Erlenmeyerkolben
verteilt und 20 Minuten autoklaviert. Die Kolben wurden auf Raumtemperatur
abgekühlt
und dann jeweils mit einer Impföse der
oben erwähnten
gutgewachsenen Kultur aus Beispiel 1 angeimpft und auf einem Rotationsschüttler 72 Stunden
bei 240 UpM und 27°C
(± 1°C) unter
Erhalt der Animpfkultur geschüttelt. Zusammensetzung
des Produktionsmediums:
| Glucose: | 20
g |
| Sojabohnenmehl: | 10
g |
| CaCO3: | 0,02
g |
| CoCl2 × 6
H2O: | 0,001
g |
| Entmineralisiertes
Wasser: | 1
Liter |
| pH-Wert: | 6,8–7,0 |
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Das
Produktionsmedium wurde in Mengen von jeweils 100 ml in 500-ml-Erlenmeyerkolben
verteilt und 20 min bei 121°C
autoklaviert. Die Kolben wurden auf Raumtemperatur abgekühlt und
mit der oben erwähnten Animpfkultur
angeimpft (2 Vol.-%). Die Fermentation wurde 72 Stunden auf einem
Rotationsschüttler
bei 240 UpM und 27°C
(± 1°C) durchgeführt. Die
Produktion der Inhibitoren Citrullimycin A–C wurde durch Testen ihrer Bioaktivität bestimmt.
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BEIPSIEL 3
-
Isolierung und Aufreinigung der Citrullimycine
A–C
-
Die
Kulturbrühe
(3 Liter) wurde geerntet und gefriergetrocknet. Das Lyophilisierungsprodukt
wurde mit Methanol (3 Liter) extrahiert, und die aktiven Extrakte
wurden vereinigt und unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet,
so daß 25
g Rohmaterial erhalten wurden. Dieses Rohmaterial wurde mittels
präparativer
HPLC unter Verwendung der folgenden Bedingungen aufgereinigt: 1)
Säule:
MCI
® Gel
CHP-20P (600 × 40
mm; Kronlab)
| Laufmittel: | A)
H2O | | B)
MeOH |
| Gradient: | min | %
A | %
B |
| | 0 | 100 | 0 |
| | 17,5 | 100 | 0 |
| | 17,6 | 80 | 20 |
| | 40 | 80 | 20 |
| | 40,1 | 50 | 50 |
| | 55 | 50 | 50 |
| | 55,1 | 30 | 70 |
| | 67,5 | 30 | 70 |
| | 67,6 | 15 | 85 |
| | 72,5 | 15 | 85 |
| | 72,6 | 10 | 90 |
| | 77,5 | 10 | 90 |
| | 77,6 | 0 | 100 |
- Fließgeschwindigkeit:
20 ml/min
- Nachweis: 358 nm
-
Die
aktiven Fraktionen eluierten nach 75 min. Die vereinigten Fraktionen
wurden unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet.
-
Die
Endreinigung erfolgte mittels präparativer
HPLC unter Verwendung der folgenden Bedingungen: 1)
Säule:
Nucleosil 100-RP 18-AB (5 μ,
250 × 21
mm, Macherey & Nagel)
| Laufmittel: | A)
H2O | | B)
CH3CN |
| Gradient: | min | %
A | %
B |
| | 0 | 70 | 30 |
| | 22 | 70 | 30 |
| | 38 | 52 | 48 |
| | 44 | 52 | 48 |
| | 92 | 0 | 100 |
| | 110 | 0 | 100 |
- Fließgeschwindigkeit:
10 ml/min
- Nachweis: 360 nm
-
Die
aktiven Fraktionen wurden mittels LC-MS analysiert. Die Fraktionen
mit den Citrullimycinen A–C eluierten
nach 87 min (A), 97 min (B) bzw. 98 min (C). Die vereinigten Fraktionen
wurden unter vermindertem Druck eingeengt und gefriergetrocknet.
Die Gesamtausbeute aus 3 l Kulturbrühe betrug jeweils 1 mg pro
Substanz.
-
Die
physikalisch-chemischen bzw. spektralen Eigenschaften der Citrullimycine
A–C sind
in den Tabellen 1 und 2 angegeben. TABELLE
1
| Aussehen: | Farblose Feststoffe |
| Löslichkeit: | Methanol,
DMSO |
| LC-MS
(Liquid Chromatography | |
| Mass
Spectrometry [= | |
| Flüssigkeitschromatographie- | |
| Massenspektrometrie] | Säule: Purospher |
| | STAR
RP.18e (Merck, |
| | 30 × 2 mm,
3 μm) |
| | Laufmittel:
CH3CN/ |
| | 10
mM NH4Ac (pH 4,5) |
| Gradient: | Zeit
% CH3CN |
| 0,00 | 5,0 |
| 6,00 | 100,0 |
| 6,50 | 100,0 |
| 7,50 | 5,0 |
| 8,00 | 5,0 |
| 9,00 | 100,0 |
| 9,50 | 100,0 |
| 10,50 | 5,0 |
| 13,00 | 5,0 |
- Fließgeschwindigkeit:
0,25 ml/min
- Temp.: 40°C
- Nachweis: 210 nm, 230, 250, 320, 400 (UV); 100–2000 amu
(MS).
| Citrullimycin
A: | |
| Retentionszeit: | 7,3
min |
| ESI-MS
(Electrospray | 784,7
amu (M-H) |
| Ionisation
Mass | |
| Spectrometry
[= | |
| Elektrosprayionisierung- | |
| Massenspektrometrie]): | |
| HR-FAB-MS
(High Resolution | 786,546536 |
| Fast
Atom Bombardment Mass | [Berechnet
für C41H76N3O11: |
| Spectrometry
[= Hoch)auf | 786,547986
(M+H)+] |
| lösende Massenspektrometrie | |
| mit
schnellem Atombeschuß] | |
| Molekülformel: | C41H75N3O11 |
| MSn-Experimente: | Instrument:
Finngan LCQ |
| | Einbringen
der Probe (5 |
| | μL/min) mit
Spritze |
- ESI+:
- MS2: 786 amu (M+H+)
ergibt 769 amu (-NH3)
- MS3: 769 amu ergibt 751 amu (-H2O)
- ESI–:
- MS2: 784 amu (M-H)– ergibt
624 amu (-C8H16O3), 610 amu (-C9H18O3), 468 amu (-C17H32O5),
454 amu (-C18H34O5).
-
Die
Produkte bei 624 amu und 610 amu werden in einem Verhältnis von
25 zu 75 gebildet.
- MS3: 624 amu
ergibt 468 amu (-C9H16O2)
- MS3: 610 amu ergibt 468 amu (-C8H14O2),
454 amu (-C9H16O2). Die Produkte werden in einem Verhältnis von 33
zu 66 gebildet.
- MS3: 468 amu ergibt 425 amu (-HNCO),
330 amu (-C9H14O),
312 amu (-C9H16O2), 269 amu (-C10H17NO3)
- MS4: 425 amu ergibt 287 amu (-C9H14O), 269 amu (-C9H16O2)
- MS4: 312 amu ergibt 269 amu (-HNCO)
- MS5: 269 amu ergibt 225 amu (-CO2), 131 amu (-C9H14O)
- MS3: 454 amu ergibt 411 amu (-HNCO),
330 amu (-C8H12O),
316 amu (-C9H14O),
312 amu, (C8H14O2), 298 amu (-C9H16O2)
- MS4: 411 amu ergibt 287 amu (-C8H12O), 273 amu (-C9H14O), 269 amu (-C8H14O2),
255 amu (-C9H16O2)
- • Lediglich
nominale Massen sind angegeben. Alle angegebenen Formeln für neutrale
Verluste beruhen auf Interpretation und sind nicht mit HR-MS verifiziert.
- 1H-NMR: siehe Tabelle 2
- 13C-NMR: siehe Tabelle 2
Struktur
von Isomer 1 von Citrullimycin A | Citrullimycin
B: | |
| Retentionszeit: | 7,1
min |
| Molekülformel: | C40H73N3O11 |
| ESI-MS
(Electrospray | |
| Ionisation | |
| Mass
Spectrometry): | 770
amu (M-H) |
-
MSn-Experimente
-
- ESI–:
- MS2: 770 amu (M-H)– ergibt
610 amu (-C8H16O3), 596 amu (-C9H18O3), 468 amu, 454
amu, 440 amu.
-
Die
Produkte bei 610 amu und 596 amu werden in einem Verhältnis von
1:1 und die Produkte bei 468 amu, 454 amu und 440 amu in einem Verhältnis von
15:58:27 gebildet.
- MS3: 610 amu
ergibt 468 amu (-C8H14O2), 454 amu (-C9H16O2), 440 amu (-C10H18O2).
-
Die
Produkte werden in einem Verhältnis
von 21:62:17 gebildet.
- MS3: 596
amu ergibt 468 amu (-C7H12O2), 454 amu (-C8H14O2), 440 amu (-C9H16O2)
Verhältnis:
6:51:43.
- MS3: 468 amu ergibt 425 amu (-HNCO),
330 amu (-C9H14O),
312 amu (-C9H16O2), 298 amu (-C10H18O2)
- MS3: 454 amu ergibt 411 amu (-HNCO),
330 amu (-C8H12O),
316 amu (-C9H14O),
312 amu, (C8H14O2), 298 amu (-C9H16O2)
- MS3: 440 amu ergibt 397 amu (-HNCO),
316 amu (-C8H12O),
298 amu (-C8H14O2), 284 amu (-C9H16O2)
Struktur
von Citrullimycin B (Gemisch von Isomeren mit MW = 771 amu) | Citrullimycin
C: | |
| Retentionszeit: | 7,4
min |
| Molekülformel: | C42H77N3O11 |
| ESI-MS
(Electrospray | |
| Ionisation | |
| Mass
Spectrometry): | 798
amu (M-H)– |
-
MSn-Experimente
-
- ESI–:
- MS2: 798 amu (M-H)– ergibt
638 amu (-C8H16O3), 624 amu (-C9H18O3), 610 amu (-C10H20O3).
Die Produkte werden im Verhältnis
von 5:90:5 gebildet.
- MS3: 624 amu ergibt 482 amu (-C8H14O2),
468 amu (-C9H16O2), 454 amu (-C10H18O2), 440 amu (-C11H20O2).
Verhältnis:
1,6:96:2:0,4.
- MS4: 468 amu ergibt 425 amu (-HNCO),
330 amu (-C9H14O),
312 amu (-C9H16O2), 287 amu (-C10H15O2N), 269 amu (-C10H17O3N)
- MS5: 425 amu ergibt 287 amu (-C9H14O), 269 amu (-C9H16O2)
- MS5: 312 amu ergibt 269 amu (-HNCO)
- MS5: 269 amu ergibt 225 amu (-CO2), 131 amu (-C9H14O)
-
Struktur
von Citrullimycin C (Isomerengemisch, MW = 799 amu)
-
Tabelle
2
1H- und
13C-NMR-Spektroskopiedaten
von Citrullimycin A in MeOD bei 300 K
a) | | 1H | 13C |
| HCA1-1a) | - | 171,58a) |
| 2 | 2,59 | 40,30 |
| 3 | 5,18 | 72,21 |
| 4 | 1,62 | 32,90 |
| 5 | b) | b) |
| 6 | b) | b) |
| 7 | 0,87 | 19,45 |
| 8 | 1,35/1,15 | 30,51 |
| 9 | 0,87 | 11,73 |
| HCA2-1a) | - | 171,44a) |
| 2 | 2,58 | 40,24 |
| 3 | 5,16 | 72,61 |
| 4 | 1,62 | 32,90 |
| 5 | b) | b) |
| 6 | b) | b) |
| 7 | 0,87 | 19,45 |
| 8 | 1,35/1,15 | 30,51 |
| 9 | 0,87 | 11,73 |
| CIT3-1 | - | 175,81 |
| 2 | 4,33 | 53,99 |
| 3 | 1,87/1,68 | 30,25 |
| 4 | 1,55 | 27,73 |
| 5 | 3,12 | ~40,6
(a) |
| 6 | - | - |
| 7 | - | 162,21 |
| HCA4-1 | - | 172,31 |
| 2 | 2,55/2,48 | 41,51 |
| 3 | 5,19 | 73,35 |
| 4 | 1,63 | 32,54 |
| 5 | 1,22 | 35,45 |
| 6 | 1,54 | 29,05 |
| 7 | 0.89 | 23,00 |
| 8 | 0,89 | 23,00 |
| HCA5-1 | - | 172,85 |
| 2 | 2,44 | 43,74 |
| 3 | 3,94 | 69,65 |
| 4 | 1,47 | 35,69 |
| 5 | 1,36 | 33,40 |
| 6 | b) | b) |
| 7 | 0,87 | 19,45 |
| 8 | 1,35/1,15 | 30,51 |
| 9 | 0,87 | 11,73 |
- a) die Daten von HCA1 und HCA2 sind gegeneinander
austauschbar.
- b) Keine Zuordnung möglich.
-
BEISPIEL 4:
-
Bioaktivitätstest
-
SPA-[3H]-Neurotensinrezeptor-Bindungstest:
-
Verbindungen
mit einer Affinität
für den
Neurotensinrezeptor verdrängen
die Bindung von [3H]- Neurotensin,
was zu einem verminderten radioaktiven Signal führt. Bei dem SPA-Verfahren
sollten Rezeptoren, die direkt an mit PVT WGA (Wheat Germ Agglutinin
[= Weizenkeimagglutinin]) beschichteten SPA-Kügelchen (Amersham Pharmacia)
immobilisiert sind, den radioaktivmarkierten Liganden binden. Der
Liganden-Rezeptor-Komplex
wird in hinreichend großer
Nähe gehalten,
so daß die
Kügelchen
zur Lichtemission angeregt werden. Alle nichtgebundenen Radioliganden
sind vom Kügelchen
zu weit entfernt, um Energie zu übertragen, und
werden daher nicht nachgewiesen. Die Proben wurden 1:5 mit Testpuffer
(50 mM Tris-HCl-Puffer mit 1 mM EDTA, 0,2 mM Bacitracin und 0,1%
BSA, pH 7,4) in Platten mit tiefen Löchern vorverdünnt. Die
Endverdünnung
im Test betrug 1:20.
-
Für das Screening
wurden 96-Loch-Isoplatten von Wallac verwendet. In die einzelnen
Löcher
wurden jeweils 50 μl
Probe, 50 μl
Membran in Testpuffer (Endkonzentration 16 μg/Loch), 50 μl PVT-VGA-Kügelchen (Endkonzentration 0,75 μg/Loch) und
50 μl 4
nM [3H]-Neurotensin gegeben. Die Platten
wurden verschlossen und 2 Stunden auf einem Schüttler (1100 UpM) bei Raumtemperatur
inkubiert. Vor dem Zählen
(MicroBeta Trilux, Wallac) ließ man
die Kügelchen
mindestens 20 Minuten lang absetzen.
-
Auf
jeder Platte wurden vier Löcher
ohne Proben verwendet, um die Rezeptor-Liganden-Gesamtbindung zu
bestimmen, wobei weitere vier Löcher
mit 1 μM
(L-α,γ-Diaminobutyryl)-Neurotensin
zur Bestimmung der nichtspezifischen Bindung verwendet wurden. Die
Hemmaktivitäten
werden wie folgt ausgedrückt: [1-(dpm Probe – dpm unspezifisch)/(dpm Gesamtbindung – dpm unspezifisch)] × 100(%)
-
Die
Aktivität
der Citrullimycine liegt im Bereich von 16–30 μM. Für Citrullimycin A wurde ein
IC50-Wert von 16 μM bestimmt.
