KR20040012396A - 뇌신경성장인자 증강작용을 갖는 백강잠 추출물 및 이의활성성분을 함유하는 약학적 제제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백강잠 101A(Beauveria bassiana101A)의 추출물을 분획하여 여러 가지 활성 화합물을 분리하여, 이 분획물에서 얻어진 활성 화합물 중 신경세포 성장 및 분화와 관련된 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방하는 효능을 가지는 화합물을 분리, 정제하는 방법 및 그 약제학적 제제에 관한 것이다.

본 발명에서는 백강잠 101A의 추출물과 이의 활성성분에 대하여 퇴행성 뇌질환에 중요하게 관여하는 신경세포 축색돌기 성장촉진 및 신경영양인자 단백질 증강효과를 PC 12 세포를 이용하여 검색한 결과, 신경세포 성장 촉진에 탁월한 작용을 가지면서 세포독성은 없는 백강잠 101A 조추출물 및 그 분획물 또한 이로부터 분리된 활성 화합물을 제공함으로써 알쯔하이머, 파킨슨 및 중풍과 같은 퇴행성뇌질환에 의하여 유발되는 신경세포 위축 및 손상을 경감시켰으며, 아울러 국민건강 증진과 양잠농가의 새로운 소득원으로의 역할이 기대된다.

Description

뇌신경성장인자 증강작용을 갖는 백강잠 추출물 및 이의 활성성분을 함유하는 약학적 제제{Constituents of Beauveria bassiana 101A having enhancement of the neurite outgrowth and pharmaceutical composition containing the same}

본 발명은 백강잠 101A(Beauveria bassiana101A)의 추출물을 분획하여 여러 가지 활성 화합물을 분리하고, 이 분획물에서 얻어진 활성 화합물 중 신경세포 성장 및 분화와 관련된 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방하는 효능을 가지는 화합물을분리, 정제하는 방법 및 그 약제학적 제제에 관한 것이다.

누에(Bombyx mori, 누에과 Bombycidae) 유충의 피부에 백강균(Beauveria bassiana)을 접종한 후 적당한 온도와 습도 조건하에서 일정기간 사육하면 누에충체에 균사체가 형성되며 강직현상을 나타내고 결국에는 죽게되는데 이 죽은 충체를 백강잠(Bombycis corpus)이라고 한다. 백강잠은 고문헌 처방예로 보면 중풍으로 인하여 구안와사, 소아의 경기치료, 두통의 치료, 폐결핵의 치료 등에 이용되어 왔고¹⁾임상적 보고로는 당뇨병 및 급선유선염등에 이용된 예가 있다.

또한 백강잠은 미백효과가 뛰어나 화장료 조성물 등의 미백제의 성분으로 사용되고 있으며, 미생물 살충제의 주원료로도 사용되고 있다.

국내특허공개공보 제99-85202호에서는 치매병 예방 및 치료용 조성물을 제조하는데 백강잠을 여러 가지 한약재와 함께 첨가하여 사용하였다. 그러나, 백강잠이 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방하는 활성물질을 함유하고 있다는 사실을 밝혀내지는 못하였으며, 백강잠 추출물의 여러 활성물질 성분을 분리하고, 그 각각의 활성성분이 가지는 기능에 대한 보고가 현재까지는 이루어지지 않고 있었다.

또한 뇌신경 세포와 관련하여 세포독성이 없으면서 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방할 수 있는 기능을 가지는 물질의 필요성도 대두되었다.

신경세포영양물질 중 신경성장인자(nerve growth factor; 이하 "NGF"라 합니다)는 신경세포에서 신경돌기(neurites)의 성장을 자극하고 중추신경계의 신경의 생존과 유지에 중요한 역할을 하기 때문에 퇴행성 뇌질환의 치료에 좋은 효능을 가질 것으로 추측되고 있다. 또한 최근에는 NGF가 알츠하이머 병과 관련된 콜린성 전뇌의 퇴화의 진전을 정지시키거나 혹은 지연시킬 수 있다는 실험동물 결과들이 나오고 있다.^4,5)NGF를 포함하여 촉진인자(trophic factors)들은 신경분화와 세포의 사멸과 같은 과정에 관여함으로써 신경퇴화성 질병을 치료하는 가장 강력한 접근 방법으로 알려져 있다. 동시에 알츠하이머 병이 진행되는 동안 사멸하는 것으로 알려진 콜린성신경을 NGF가 자극함으로써 인지·행동 능력을 개선하고 신경계의 퇴화를 억제한다. 임상연구로는 NGF의 두개골을 통한 주입으로 환자의 언어담당 기억을 증진시킨다는 보고도 있다.^{6, 7)}그러므로 알츠하이머 병을 치료하는 수단으로 NGF나 신경활성 효과를 갖는 화합물을 선정하는 것은 합리적인 접근이라 할 수 있기 때문에 이러한 유사화합물에 의한 새로운 치료 가능성과 응용성도 점점 확대된다 할 수 있다. 그러나 내인성 NGF는 분자량이 매우 큰 펩티드 중합체(polypeptide)이기 때문에 BBB (blood brain barrier, 혈액뇌 장벽)를 통과하지 못한다. 그러므로 NGF 부족으로 인하여 뇌에 생기는 질병을 치료하기 위해서는 일차적으로 뇌에 직접 주사를 해야만 치료효과를 최대화할 수 있는데, 이는 이용하기 쉽지 않은 방법이다. 또한 복강주사 등의 방법으로 투여할 경우 단백질 분해효소에 의하여 쉽게 대사되기 때문에 그 효능을 기대할 수 없게 된다. 그러므로 천연물로부터 신경돌기 성장(neurite outgrowth) 증강작용과 더불어 신경활성을 갖는 저분자량 화합물의 도출은 퇴행성뇌질환 치료제의 탐색방법으로 의미가 있다고 할 수 있겠다.

이에 본 발명자들은 신경세포 성장에 관련된 연구를 수행한 결과 백강잠 101A가 독성은 거의 없으면서 신경세포 성장을 증강시킴을 확인하였으며, 본 발명은 이를 기초로 하여 완성되었다.

따라서 본 발명의 목적은 신경세포 성장 및 분화와 관련된 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료효과를 갖는 신규 활성 화합물들을 백강잠 101A 추출물로부터 분리, 정제하여 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 백강잠 101A 추출물로부터 분리, 정제한 퇴행성 뇌질환 예방 및 치료 효과를 가지는 신규 활성 화합물들을 유효성분으로 하는 약제학적 제제를 제공하는 것이다.

도 1은 PC 12 세포주에 백강잠 101A 추출물 또는 각 화합물을 처리한 후 신경세포 성장의 정도를 현미경으로 관찰한 사진이다.

도 2는 PC 12 세포주에 백강잠 101A로부터 분리된 화합물 1∼7을 처리한 후 신경세포 성장에 미치는 효과를 보여준다.

PC 12 cells in 6-well plates were treated with compound 1-7 and NGF, and neurite outgrowth was measured under a microscope at 6d-post treatment. Fresh medium with compounds or NGF was changed every day. Each value represents the mean+S.D. (n=30). **Significantly different from NGF value at the level of p<0.01. ***Significantly different from NGF value at the level of p<0.001.

도 3은 화합물 3∼7을 처리한 C6 astrocytoma 세포주에서의 NGF mRNA 발현량에 미치는 효과를 측정한 결과이다.

(모든 sample에서 나오는 GAPDH를 기준으로 발현된 NGF mRNA량을 %로 환산하여 나타낸 사진과 이를 수치화한 그래프 단위는 %)

도 4는 PC 12 세포주에 백강잠 101A 추출물 및 경동시장에서 구입한 국산 백강잠의 추출물을 처리한 후 신경세포 성장에 미치는 효과를 비교 측정한 결과이다.

101A-메탄올: 백강잠 101A의 메탄올 추출물

101A-헥산: 배강잠 101A 메탄올 추출물의 헥산분획

101A-클로로포름: 백강잠 101A 메탄올 추출물의 클로로포름 분획

101A-부탄올: 백강잠 101A 메탄올 추출물의 부탄올 분획

Commercial-메탄올: 경동시장에서 구입한 국산 백강잠의 메탄올 추출물

Commercial-헥산: 경동시장에서 구입한 국산 백강잠 메탄올 추출물의 헥산 분획

Commercial-클로로포름: 경동시장에서 구입한 국산 백강잠 메탄올 추출물의 클로로포름 분획

Commercial-부탄올: 경동시장에서 구입한 국산 백강잠 메탄올 추출물의 부탄올 분획

본 발명에서는 백강잠 101A(Beauveria bassiana101A)의 추출물을 분획하여 여러 가지 활성 화합물을 분리하여, 이 분획물에서 얻어진 활성 화합물 중 신경세포 성장 및 분화와 관련된 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방하는 효능을 가지는 화합물들을 제공한다.

또한 본 발명에서는 상기 퇴행성 뇌질환을 치료 및 예방하는 효능을 가지는 화합물들을 유효성분으로 하는 약제학적 제제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서 사용한 백강균 101A는 대한민국 농촌진흥청 잠사곤충부에서 백강균의 아종인Beauveria bassiana101A를 새로이 개발하여 유충의 피부에 접종하여 일정 조건하에서 사육하여 얻은 것이다.

본 발명자들은 백강잠 101A(Beauveria bassiana101A)의 메탄올 엑기스의 헥산 및 클로로포름 분획에서 2종의 스테롤 물질과 2종의 사이클로뎁시펩타이드 (cyclodepsipeptide)를 보고한 바 있다.^{2, 3)}

본 발명에 따른 백강잠 101A 추출물은 백강잠 101A를 물, 저급알코올, 헥산, 초산에틸 또는 이들의 혼합용매로 추출, 농축 및 동결건조하여 제조한 것이다. 이때 상기 저급알코올로는 메탄올, 에탄올, 부탄올 및 이소프로판올로 이루어진 군으로부터 선택하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올의 추출 및 농축효율이 가장 높으므로 메탄올로 추출, 농축하는 것이 좋다.

상기 백강잠 101A의 추출물을 제조하는 방법으로는 초음파 추출법, 여과법, 환류추출법 등을 사용할 수 있고, 이 밖에도 통상적으로 사용되는 추출법을 사용하여 제조할 수 있다. 또한 상기 추출물의 농축, 분획물 제조 및 동결건조 과정 역시 통상적으로 알려진 방법으로 수행할 수 있다.

이러한 백강잠 101A의 추출물은 물, 알코올 또는 물과 알코올 혼합용매로 추출한 후 세포독성 분획을 제외한 분획물로부터 분리한 생리활성 성분이며, 여기에서 분리, 정제한 뇌신경물질들은 총 7종류의 화합물이며, 그 중 2종류의 화합물이 지금까지 알려지지 않은 신규한 화합물이다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표현되는 화합물:

[화학식 1]

상기에서 R은 C₁₇또는 C₁₉의 알킬기이다;

을 제공한다.

상기 화학식 1에서 C₁₇인 경우에 본 발명은 하기 화학식 2로 표현되는 뇌신경활성 물질인 (4E, 2S, 3R)-2-N-옥타데카노일(Octadecanoyl)-4-테트라데카스핀게닌 (tetradecasphingenine)을 제공한다.

[화학식 2]

상기 화학식 1에서 C₁₉인 경우에 본 발명은 하기 화학식 3으로 표현되는 뇌신경활성 물질인 (4E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일(Eicosanoyl)-4-테트라데카스핀게닌 (tetradecasphingenine)을 제공한다.

[화학식 3]

또 본 발명은 상기 화학식 1로 표현되는 화합물을 유효성분으로 하는 약제학적 제제에 관한 것이다.

본 발명의 백강잠 101A의 추출물, 각 분획물 및 분리된 화합물은 신경영양 인자(neurotrophic factor)와 같이 신경세포 성장 증강효과와 더불어 이들의 역할을 대체하는 효과도 나타냄으로써 신경세포영양물질과 관련된 퇴행성뇌질환에 응용할 수 있다.

백강잠 101A의 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 뇌질환 치료 및 예방을 위한 약제학적 제제는 임상 적용시에 경구 또는 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있는데 제제화시에는 보통 사용되는 충진제, 증량제, 결합제. 붕해제, 계면활성제 등의 희석제나 부형제를 사용하여 조제되어질 수 있다. 이러한 고형제제는 정제, 산제, 환제, 과립제, 켑슐제 등이 포함되며 이러한 고형제제는 백감잠류의 시료에 적어도 한가지 이상의 부형제를 섞어 조제될 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러가지 부형제가 이용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골 tween 61.등이 사용될 수 있다.

이하 실시예 및 제조예를 통하여 본 발명을 구체적으로 살펴볼 수 있지만 이에 본 발명의 범주가 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 백강잠 101A 추출물의 제조

백강잠 101A는 농촌진흥청 잠사곤충부에서 공급받아 사용하였다.

백강잠 101A 건조분말 1.5 kg을 메탄올로 상온에서 5회 반복추출하고 60℃에서 3회 추출하여 얻어진 추출액을 감압농축하여 120g의 메탄올 추출물을 얻었다. 평균수득률은 8%이상이었다.

[실시예 2] 백강잠 101A 현탁액의 분획물 제조

감압농축된 메탄올 추출물을 H₂O에 현탁시킨후 헥산(800㎖×3), 클로로포름 (800㎖×2) 및 부탄올(800㎖×2)로 분획하여 각각 55g, 6g 및 30g을 얻었다. 각 분획에 대한 NGF 활성을 측정한 결과, 헥산 및 부탄올 분획에서 활성이 우수함을 확인할 수 있었으며 각 분획으로부터 활성 성분 분리를 수행하였다.

[실시예 3] 백강잠 101A로부터 단일 화합물 분리

헥산분획 55g에 대하여 헥산-초산에틸-메탄올 혼합용매(5:1:0, 3:1:0, 1:1:0, 10:10:1, 5:5:1, 2:5:1 및 0:5:1) 메탄올 함량을 높여가며 실리카겔 크로마토그래피를 수행하여 4개의 소분획으로(H-1∼H-4) 나눈 다음, H-1 분획(30g)을 헥산-초산에틸(3:1)을 유출용매로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에 적용하여 3개의 소분획(H-11∼H-13)을 얻었다. H-13 분획(4.6g)에 대하여 디클로로메탄-메탄올(1:1)을 유출용매로 한 세파덱스 LH-20 크로마토그래피를 수행한 후 역상 Lobar^?A 컬럼 크로마토그래피(90% MeOH)를 수행하여 화합물 1(3mg)과 화합물 2(15mg)를 얻었다.

부탄올 분획 30g을 헥산-초산에틸-증류수(8:5:2)에서 메탄올까지 순차적으로 용매극성을 높여가며 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 4개의 소분획 B1-B4을 얻었다. B2 분획(1g)에 대하여 80% 메탄올을 유출용매로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후 초산에틸-메탄올-증류수(9:3:1)를 유출용매로 한 아민 Sep-Pak으로 정제하여 화합물 3(100 mg)을 얻었다. B3 분획(7g)을 초산에틸-메탄올-증류수(9:5:2)를 유출용매로 한 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 이용하여 4개의 소분획 B31-B34으로 나누었다. B31 분획에 대하여 80% 메탄올을 유출용매로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후 초산에틸-메탄올-증류수 (9:3:1)를 유출용매로 한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 화합물 4(40 mg)를 얻었다. B32 분획에 대하여 80% 메탄올을 유출용매로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후 초산에틸-메탄올-증류수(9:3:1)를 유출용매로 한 아민 Sep-Pak으로 정제하여 화합물 5(300mg)을 얻었다. B34 분획에 대하여 80% 메탄올을 유출용매로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행한 후 초산에틸-메탄올-증류수(9:5:2)를 유출용매로 한 아민 Sep-Pak으로 정제하여 화합물 6 (120mg)을 얻었다. B4 분획(700mg)에 대하여 80% 메탄올을 유출용매로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 얻은 백색결정을 메탄올로 세척하여 화합물 7(150 mg)를 얻었다.

[실시예 4] 단일화합물의 기기분석

¹H- 및¹³C-NMR 스펙트럼은 Brucker AMX 500 분광계로, MS 스펙트럼은 VG70-VSEQ(VG Analytical, UK)로 측정하였다. 추출 및 컬럼 크로마토그래피용 용매는 1급시약을, 기타 시약은 1급 또는 특급을 사용하였다. 컬럼 크로마토그래피용 실리카겔은 Kiesel gel 60(70-230 and 230-400mesh, ASTM Art. 7734 and 9385, Merck)을 사용하였고, 역상(reverse phase) 컬럼 크로마토그래피용 충진제는 LiChroprep RP-18(40-63㎛, Art. 13900, Merck)를 사용하였다. LPLC는 LiChroprep Si60 Lobar-B column(Art. 10401, Merck)을 사용하였다. TLC plate는 Kiesel gel 60 F₂₅₄precoated plate(Art. 5554, Merck)를 사용하였다.

이러한 기기분석을 통하여 구조는 다음과 같이 결정하였다.

[실시예 4-1] (4E, 2S, 3R)-2-N-옥타데카노일(Octadecanoyl)-4-테트라데카스핀게닌(tetradecasphingenine)

White powder, mp. 94℃, [α]_D ²⁰+ 3.5。 (c. 0.012, CHCl₃),cm^-1: 3330, 2920, 2850, 1650, 1617, 1550, 1465, 1050, EI-MS m/z (rel. int.) : 509 (M⁺, 0.5), 491 (6), 461 (6), 360 (4), 326 (35), 309 (100), 278 (23), 267 (16),226 (11), 208 (18), 60 (97),¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) : 0.88 (6H, t,J=7.0 Hz, H-14 and H-18), 1.20-1.39 (42H, m, H-7∼H-13, H-4∼H-17), 1.62 (2H, br. sep,J≒7.5 Hz, H-3), 2.05 (2H, br.q,J=7.0 Hz H-6), 2.23 (2H, t,J=7.5 Hz, H-2), 2.65 (2H, br.s, OH), 3.71 (1H, br.d,J=11.0 Hz, H-1), 3.91 (1H, ddd,J=11.5, 4.0, 3.0 Hz, H-1), 3.96 (1H, d br.t,J=11.5, 3.5 Hz, H-2), 4.32 (1H, br.s, H-3), 5.53 (1H, dd,J=15.7, 6.5 Hz, H-4), 5.79 (1H, dt,J=15.7, 6.5 Hz, H-5), 6.26 (1H, br.d,J=7.2 Hz, NH),¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) : 14.81 (C-14, C-18), 23.39 (C-13, C-17), 26.47 (C-3), 29.81, 30.06, 30.36, 30.40 (C-7∼C-11, C-4∼C-15), 32.60 (C-12, C-16), 32.97 (C-6), 37.56 (C-2), 55.18 (C-2), 63.22 (C-1), 75.27 (C-3), 129.52 (C-4), 135.06 (C-5), 174.70. (C-1)

화합물 1은 무정형 백색분말상으로서 EI-MS 스펙트럼에서 분자이온피크가 m/z 509에서 관찰되었다. IR 스펙트럼에서는 1650 cm^-1의 아미드 흡수대를 관찰할 수 있었다. δ 1.20∼1.39 (42H, m)에서 관찰되는 피크의 면적을 제외하면¹H- 및¹³C-NMR 스펙트럼은 화합물 2와 매우 유사하였다. 즉 화합물 1은 화합물 2와 거의 같은구조를 가지며 단지 지방산 사슬의 길이만이 차이가 있음을 추정할 수 있었다. 화합물 1에 염산 및 메탄올을 처리하여 얻어진 지방산 에스테르를 GC-MS로 분석한결과 옥타데카노익산 메틸 에스테르(octadecanoic acid methyl ester)로 확인되었다. 화합물 1의 optical rotation값은 +3.5°로서 이는 화합물 2 (+4.0°)의 입체구조와 동일함을 입증하였다. 이상의 자료를 통하여 화합물 1의 구조는 (4E, 2S, 3R)-2-N-옥타데카노일(octadecanoyl)-4-테트라데카스핀게닌(tetradecasphingenine)으로 확정하였다.

[실시예 4-2] (4E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일(Eicosanoyl)-4-테트라데카스핀게닌(tetradecasphingenine)

White powder, mp. 96℃, [α]_D ²⁰+ 4.0 (c. 0.082, CHCl₃),cm^-1: 3332, 2920, 2851, 1650, 1615, 1550, 1465, 1045, EI-MS m/z (rel. int.) : 537 (0.6), 519 (10), 489 (12), 388 (5), 354 (18), 337 (100), 306 (22), 280 (10), 195 (15), 60 (66), HR-FAB-MS: C₃₄H₆₈NO₃Found : 538.5195 Calcd. : 558.5121, FAB-CID MS m/z (rel. int.): 560 (100), 539 (1.9), 530 (0.9), 516 (0.7), 502 (0.7), 488 (1.0), 474 (0.9), 460 (1.1), 446 (0.8), 432 (1.0), 418 (0.8), 404 (0.7), 390 (0.8), 376 (1.0), 360 (1.2), 334 (1.0), 320 (2.0), 208 (0.6),¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) : 0.88 (6H, t,J=7.0 Hz, H-14 and H-20), 1.20-1.39 (46H, m, H-7∼H-13, H-4∼H-19), 1.64 (2H, br. sep,J7.5 Hz, H-3), 2.05 (2H, br.q,J=7.5 Hz H-6), 2.22 (2H, t,J=7.5 Hz, H-2), 2.84 (1H, br.s, OH), 2.85 (1H, br.s, OH), 3.70 (1H, m, H-1), 3.90 (1H, ddd,J=11.3, 4.0, 3.5 Hz, H-1), 3.94 (1H, d br.t,J=11.3, 3.5 Hz, H-2), 4.31 (1H, br.q like, J5.0 Hz, H-3), 5.52 (1H, ddt,J=15.5, 6.3, 1.2 Hz, H-4), 5.79 (1H, dtd,J=15.5, 6.3, 1.2 Hz, H-5), 6.26 (1H, br.d,J=7.2 Hz, NH),¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) : 14.82 (C-14, C-20), 23.38, 23.40 (C-13, C-19), 26.47 (C-3), 29.82, 29.92, 29.99, 30.04, 30.07, 30.08, 30.19, 30.22, 30.28, 30.35, 30.36, 30.38, 30.41 (C-7∼C-11, C-4∼C-17), 32.60, 32.63 (C-16, C-18), 32.98 (C-6), 37.55 (C-2), 55.19 (C-2), 63.21 (C-1), 75.26 (C-3), 129.48 (C-4), 135.01 (C-5), 174.65 (C-1)

화합물 2는 무정형의 백색분말로서 HR-FAB-MS 스펙트럼을 ([M+Na]⁺m/z 558.4874) 통하여 분자량이 C₃₄H₆₇NO₃임을 확인하였다. 화합물 2의 메탄화(methanolysis)를 통하여 얻어진 지방산 에스테르를 GC-MS로 분석한 결과 아이코사노일 메틸 에스테르(eicosanoyl methyl ester)임을 확인할 수 있었다. 화합물 2의 FAB-MS에서 [M+Na]⁺이온의 CID 스펙트럼은 m/z 320 (298+Na-H)의 주이온 피크를 나타내었다. 이를 통하여 화합물 2 또한 C₁₄아미노 알코올의 지방산 아미드 유도체임을 추정할 수 있었다.¹¹⁾따라서 화합물 2의 구조는 (4E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일(eicosanoyl)-4-테트라데카스핀게닌(tetradecasphingenine)으로 확정하였다.

C₁₈스핑고신(sphingosine)의 아이코사노일 아미드(eicosanoyl amide) 치환형 물질은 GC-MS를 통하여 Krivit와 Hammarstrom가⁹⁾이미 규명된 바 있으나 C₁₄2-아미노-1,3-디올 측쇄형인 화합물 2는 천연에서 처음 보고되는 바이다.

[실시예 4-3] 1,7-디메틸(Dimethyl)-크산틴(xanthine)

백색분말, mp 290 ℃, EI-MS m/z (rel. int.) : 179 ([M-1]⁺, 100), FAB-MS m/z (rel. int.) : 180 (M⁺, 100),¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ : 3.30 (3H, s, 7-CH₃), 3.51 (3H, s, 1-CH₃), 7.62 (1H, s, H-2),¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ : 29.17 (1-CH₃), 30.23 (7-CH₃), 116.72 (C-9), 139.39 (C-4), 150.76 (C-2), 155.30 (C-6), 157.66 (C-8)

화합물 3은 녹는점 290℃의 백색분말상 물질로서 FAB-MS에서 분자이온피크가 m/z 180에서 관찰되었다.¹H-NMR 스펙트럼에서는 δ 3.30 (3H, s) 및 3.51 (3H, s)에서 2개의 NCH₃피크와 δ 7.62 (1H, s)에서 이중결합수소 피크를 관찰할 수 있었고,¹³C-NMR 스펙트럼에서는 δ 29.17 및 30.23에서 2개의 NCH₃피크와 δ 116.72, 139.39, 150.76, 155.30 및 157.66에서 이중결합탄소의 피크들을 관찰할 수 있었다. 화합물 3의¹H- 및¹³C-NMR 스펙트럼은 디메틸 크산틴(dimethyl xanthine) 유도체의 형태로서 화합물 3의 구조는 1,7-디메틸크산틴으로 추정하였고 표품 1,7-디메틸크산틴(Aldrich, 27,151-9)의 녹는점 및 NMR 자료와 비교하여 완전히 일치함을 확인하였다.

[실시예 4-4] 우라실(Uracil)

무색침상결정, mp. 310 ℃¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d₆) δ : 5.43 (1H, dd,J=7.6, 2.4 Hz, H-5), 7.37 (1H, dd,J=7.6, 2.7 Hz, H-6), 10.81 (1H, br.s, 1-NH), 10.97 (1H, br.s, 3-NH),¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d₆) δ 101.37 (C-5), 143.32 (C-6), 152.66 (C-2), 165.48 (C-4)

화합물 4는 무색검상 물질로서¹H-NMR 스펙트럼에서는 δ 5.43 (1H, dd,J=7.6, 2.4 Hz) 및 7.37 (1H, dd,J=7.6, 2.7 Hz)에서 cis-이중결합 수소 피크와δ 10.81 (1H, br.s) 및 10.97 (1H, br.s)에서 아미드의 NH 피크를 관찰할 수 있었다.¹³C-NMR 스펙트럼에서는 δ 101.37 및 143.32에서 α,β-불포화 케톤의 이중결합 수소피크와 152.66 및 165.48에서 아미드의 탄소 피크를 관찰할 수 있었다. 이상의 자료를 통하여 화합물 4의 구조는 우라실로 추정하였으며 표품(Aldrich, 13,078-8)과의 비교를 통하여 그 구조를 확정하였다.

[실시예 4-5] 우레아(Urea)

무색결정, mp 131℃, element analysis: CH₄N₂O (C 20.4%, H 6.76%, N 45.6%, O 27.24%), ESI-MS m/z (rel. int) : 83 ([M+Na]⁺, 100), 61 ([M+H]⁺, 12)¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) δ : 5.71 (br.s, NH2),¹³C-NMR (125 MHz, CD₃OD) δ : 162.90 (C=O)

화합물 5는 녹는점 131 ℃의 무색결정상 물질이다. 원소분석자료 (C 20.4%, H 6.76%, N45.6%, O 27.24%) 와 ESI-MS 스펙트럼을 ([M+Na]⁺m/z 83) 통하여 분자식을 CH₄N₂O로 결정하였다. 화합물 5의¹H-NMR 스펙트럼에서는 δ 5.71 (4H, br.s)에서 NH₂피크와¹³C-NMR 스펙트럼에서는 δ 162.90에서 아미드 탄소만이 관찰되었다. 분자식과 NMR 자료를 기초로 하여 화합물 5의 구조는 우레아로 추정하였으며,표품(Aldrich, 20,888-4)과의 비교를 통하여 그 구조를 확정하였다.

[실시예 4-6] 베타인(Betaine)

백색분말, mp. >300℃, element analysis : C₅H₁₁NO₂(C 50.49 % H 9.81 % N 11.70 % O 30.60 %) IRcm^-1: 3485, 3378, 3018, 2269, 1622, 1482, 1444, 1394, 1332, HR-FAB-MS m/z 118.0869 ([M+H]⁺, 100 Calcd for C₅H₁₂NO₂118.0868),¹H-NMR (500MHz, DMSO-d₆+TFA) : δ 3.19 (9H, br.s, N⁺-CH₃), 4.14 (2H, br.s, H-2),¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d₆+TFA) (DEPT) : δ 53.8 (N⁺-CH₃; q), 64.67 (C-2; t), 167.35 (C-1; s)

화합물 6은 백색분말상 물질로서 드라겐돌프 시약에서 적색으로 발색되었다. IR 스펙트럼에서 1622 cm^-1에서 카르복실 음이온기와 2135 cm^-1에서 암모늄 양이온기에 의한 흡수대를 관찰할 수 있었고¹⁴⁾, m/z 118.0869 의 유사분자이온 피크 ([M+H]⁺)가 관찰된 HR-FAB-MS 스펙트럼과 원소분석 자료 (C 50.49 % H 9.81 % N 11.70 % O 30.60 %)를 통해서 화합물 6의 분자식은 C₅H₁₁NO₂임을 확인할 수 있었다.¹H-NMR 스펙트럼에서는 δ 3.19 (9H, br.s) 및 δ 4.14 (2H, br.s) 에서 2개의 broad singlet 피크만이 관찰되었다.¹³C-NMR 및 DEPT 스펙트럼에서는 δ 53.8에서 아미노메틸 탄소, δ 64.67에서 아미노메틸렌 탄소 및 δ 167.35에서 카르보닐 탄소에 의한 피크를 관찰할 수 있었다. 이상의 자료를 통하여 화합물 6은 3개의 아미노 메틸기가 같은 자장환경에 존재하며 한분자내에 암모늄 이온과 카르복실 이온을 모두 가지는 양쪽성 이온 (zwitterion)으로서 즉 N,N,N-트리메틸(trimethyl)-아미노산 유도체임을 추정할 수 있었다. DEPT 자료에서 아미노메틸탄소와 카르보닐 탄소에 의한 피크를 제하면 아미노산의 α-탄소로서 CH₂(δ 64.67, t) 만이 관찰되었다. 따라서 화합물 6은 N,N,N-트리메틸-글리신 구조로서 베타인임을 확인할 수 있었고 기존 문헌 자료를^{15, 16)}통하여 그 구조를 확정하였다.

[실시예 4-7] 타이로신(Tyrosine)

백색분말, EI-MS m/z (rel. int.) : 181 (M⁺, 15), 107 (100) 1H-NMR (500MHz, DMSO-d₆+TFA) δ : 2.98 (2H, m, H-3), 4.09 (1H, br.s, H-2), 6.71 (2H, d,J=8.0 Hz, H-3', 5'), 7.04 (2H, d, J=8.0 Hz, H-2', 6'), 8.20 (2H, br.s, NH₂),¹³C-NMR (125 MHz, DMSO-d₆+TFA) δ : 36.21 (C-3), 54.56 (C-2), 116.54 (C-3', 5'), 125.72 (C-2', 6'), 131.64 (C-1'), 157.80 (C-4'), 171.67 (C-1)

화합물 7은 백색분말상 물질로서 닌히드린 (ninhydrin) 시약에 적색으로 발색되어 아미노산 유도체임을 추정할 수 있었다. 화합물 7의 EI-MS 스펙트럼에서는 분자이온피크가 m/z 181에서 관찰되었다.¹H- 및¹³C-NMR 스펙트럼에서는 페닐기의 존재를 확인할 수 있었다 [¹H : δ 6.71 (2H, d,J=8.0 Hz) 및 7.04 (2H, d,J=8.0 Hz);¹³C : δ 116.54, 125.72, 131.64, 157.80]. 따라서 화합물 7의 구조는 tyrosine으로 추정하였고, 화합물 7의 NMR 자료와 표품 DL-타이로신(tyrosine) (Aldrich, 14,572-6)의 자료를 비교하여 완전히 일치함을 확인하였다.

[시험예 1]

<세포 배양>

100mm 배양 접시(TPP, Switzerland)에 3X10⁴PC12 cells을 접종한 후, 2g/L 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 5% 말 혈청(Horse serum), 10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS) 및 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)(10000U/㎖) 1%가 포함된 RPMI1640 배지 하에서 배양하였다. 이때 사용한 FBS는 사용하기 전 56 ℃에서 30분간 열비활성화(heat-inactivation)시켜 사용하였다. 또한 5% CO₂와 O₂95% 배양기에서 70% 습도와 37 ℃ 온도 조건이 유지되게 한 후 배양하였다. 배지는 10㎖씩 매일 새로운 배지로 교체하였고, 세포 배양에사용한 모든 시약은 GIBCO BRL 제품을 사용하였다

<시료의 처리>

100mm 배양용기에서 세포들이 1x10⁷cells/well이 되면 0.25% 트립신(Trypsin)-EDTA(Gobco BRL, USA) 용액을 500㎕ 처리함으로써 세포들을 배양용기로부터 이탈시킨 후 10㎖의 신선한 배지로 트립신-EDTA용액을 중화시키고 세포현탁액을 얻었다. 세포현탁액 20㎕에 0.4% 트리판 블루(Tryphan blue)(in PBS buffer) 10㎕을 가하여 염색한 후 혈구계(Hemocytometer)를 이용하여 살아있는 세포수를 계산하였다. Poly-D-리신(Sigma, USA, 50 ug/㎖)을 DPBS로 희석한 다음, 6 well 배양기에 2㎖씩 가하여 37℃에서 1시간 이상 방치하였다. 1시간 후 DPBS(pH.4)로 세척한 다음 건조된 6 well에 1x10⁵cells/well의 농도로 배양용기에 접종하여 배양하였다. 시료는 DMSO(Dimethylsulfoxide, Sigma, USA)에 녹여 이의 최종농도가 0.1% 이하가 되도록 한 후 0.22μM 멸균용 필터를 이용하여 여과하였다. 접종한 지 24시간 후에 화합물의 최종농도는 각각 10 μM, NGF는 50 ng/ml의 농도로 처리하였다. 5% CO₂와 95% O₂혼합공기 하에서 온도와 습도가 일정하게 유지되는 배양기에서 6일동안 배양하면서 신경돌기 성장 정도를 관찰하였고 2일에 한번씩 새로운 배지로 가해주었다.

<신경돌기 성장 측정>

접종한지 24시간 후에 1% FBS, 2% HS이 첨가된 신선한 배지로 교체하였다. 24시간이 지난 후부터 매일 일정한 시간에 위상차 현미경을 이용하여 신경세포체(cell body)로부터 성장한 신경돌기의 정도를 관찰하였고 위상차 현미경을 이용하여 현미경 사진을 찍은 후에 인화된 사진을 이용하여 그 길이를 측정하였다. 신경돌기 성장에 미치는 효과는, 신경돌기 길이가 보이지 않으면 0으로, 신경세포체의 직경과 그 길이가 같으면 +로, 신경세포체 직경의 2배 길이로 성장하였으면 ++로 정하고, 그 이상의 길이가 되면 +++으로 수치화 하였다. 각 well당 10개의 세포를 선정하여 세포의 신경돌기 성장 정도를 측정하였다.

[표 1] PC12 세포주에 백강잠 101A(Beauveria bassiana101A) 추출물을 처리한 후 신경세포 성장에 미치는 효과를 측정한 결과

시료		신경세포성장정도
백강잠 101A B. corpus 101A	NGF(50ng.ml)	+++
	메탄올(10μg/ml)	+
	헥산분획	++
	클로르포름	+
	부탄올분획	++

PC12 cells in 6 well plates were treated with subfraction and NGF, and neurite outgrowth was measured under a microscope at 6 days post treatment. Fresh medium with compounds or NGF was changed every 2 days. Randomly selected fields were taken by the camera attached to light microscope. +; Processes with lengths equivalent to one diameters of the cell body, ++; Processes with lengths equivalent to two diameters of the cell body, +++; Processes with lengths equivalent to three diameters of the cell body

PC12 세포주는 쥐의 크롤친화성세포종(pheochromocytoma) 기원의 노르아드레날린성의 세포계(noradrenergic cell line)로 NGF에 민감하게 반응하여 정상적인 교감신경 뉴런(sympathetic neuron)의 많은 특징을 가지므로 NGF 작용기전 연구의 시험관내 모델로 이용되고 있다. 즉 PC12 세포주는 혈청(serum)이 포함된 배지에서 분열하고 NGF가 배지에 첨가되면 신경축색성장을 보이나, 혈청이 없는 상태에서 배양하면 사멸로 죽게되는데 이러한 세포사멸은 또한 NGF에 의해 억제되는 것으로 알려지고 있다.⁸⁾백강잠 101A의 메탄올 추출물과 이를 극성에 따라 분획한 소분획물, 즉 헥산, 클로로포름 및 부탄올 분획물 각각을 PC12 세포에 처리한 결과 헥산 및 부탄올 분획물이 유의적인 신경세포 성장 촉진효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

본 발명은 신경영양적(neurotrophic) 활성이 우수한 헥산 및 부탄올 분획물로부터 활성성분연구를 수행하여 2종의 스핑고신 유도체 및 5종의 아민성 화합물을 분리하여 구조를 규명하였고, 각 화합물에 대하여 신경세포성장 촉진효과를 검색한 결과, 분리된 7종의 화합물 모두 신경세포성장 촉진효과를 나타내었다.

화합물 5는 NGF(50ng/㎖, 신경세포성장인자)보다 우수한 신경세포성장 촉진작용을 나타내었다. 또한 C6 성상세포종 세포계(astrocytoma cell line)에서 NGF의 mRNA 수치를 증가시켰다(도 2 및 도 3).

도 4에서는 국내에 유통되는 국산 백강잠을 백강잠 101A에서와 동일한 방법으로 메탄올로 추출하고 헥산, 클로로포름 및 부탄올로 용매분획하여 각 분획에 대하여 신경세포성장활성을 측정한 결과를 보여준다. 신경돌기 성장 효과는 시료처리이후 6일 후에 현미경 상에서 신경세포의 축색돌기의 길이로 측정하였다. NGF(50ng/㎖)를 처리한 신경세포의 성장길이를 100%로 환산하여 각 시료의 신경세포성장 효과를 나타낸 것으로, 국산 백강잠이 백강잠 101A에서와 유사하게 헥산 및 부탄올 분획이 활성을 나타내었다. 그러나 농촌진흥청에서 개발한 배양법으로 대량생산된 백강잠 101A는 균질한 진균인Beauveria bassiana101A를 이용하여 균일한 조건에서 제조되었기에 국내에 유통되는 백강잠에 비하여 품질이 균일하며 규격화가 용이하다.

<NGF 유전자 발현 확인>

RNA 분리

Total cellular RNA는 트리졸 용액(Trizol solution; Gibco BRL)을 이용하여 분리하였다. 1㎖의 트리졸 용액을 처리하여 세포를 용해시킨 후 세포 스크랩퍼(cell scraper)(TPP, switzerland)로 스크랩하여 얻은 세포 용해물을 1.5㎖ 마이크로튜브(microtube)에 모아 21G 주입기(syringe)로 균질화하였다. 세포 균질액을 4℃에서 12,000rpm으로 10분간 원심분리 함으로써 얻은 상층액에 클로로포름을 동량으로 첨가한 다음 15분 동안 상온에 방치한 후 다시 4℃, 12,000rpm에서 15분 동안 원심분리 하였다. 상층액 즉 RNA층만 취하여 새로운 마이크로원심분리 튜브(microcentrifuge tube)에 이행시키고 동량의 100% 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)을 가하여 혼합한 뒤 4℃, 12,000rpm에서 15분 동안 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 RNA 펠렛(pellet)을 1.5㎖ 75% 에탄올로 세척하고 4℃에서 12,000rpm으로 5분동안 원심분리하였다. 10분간 상온에서 완전히 건조시킨 후, 100㎕의 DEPC(diethylpyrocarbonate) 용액에 RNA를 녹인 다음 분광광도계(Hewlett Packard, U.S.A.)를 사용하여 UV 260㎚과 240㎚에서 측정하였다.

<역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)>

cDNA 합성(Reverse Transcription)은 M-MLV 역전사 효소(Gibco BRL Co., U.S.A.)를, PCR은Taq폴리머라아제(TaKaRa, Japen)를 사용하였다. 1㎍의 RNA를 65℃에서 15분동안 처리하여 변성(denaturalization)시킨 후 반응용액(4ul 5×Buffer, 1㎕ 10mM 데옥시뉴클레오티드 혼합물(Deoxynucleotide mixture), 1㎕ 20μM oligo(dt)₁₅프라이머, 0.2㎕ 200U/㎕ M-MLV 역전사 효소, 2㎕ 0.1M 디티오트레이톨(Dithiothreitol), DEPC water로 최종부피 20㎕로 제조)과 혼합한 후, 37℃ 60분, 72℃ 15분동안 반응시켜 cDNA를 합성(Reverse Transcription)했다. PCR은 위에서 합성한 1㎕ cDNA을 반응액 (10×Buffer 2.5㎕, 2.5 mM 데옥시뉴클레이티드 혼합물 2㎕, 5 U/㎕Taq폴리머라아제 0.2㎕, 10μM 센스(sense) 프라이머 1㎕, 10 μM 안티센스(anti-sens) 프라이머 1㎕, DEPC water로 최종부피 25㎕로 만듬)과 혼합하여 어닐링 온도(annealing temperature)를 60℃로 고정하여 PCR(Perkin Elmer, U.S.A.) 반응시켰다(표 2). 반응된 NGF 유전자의 PCR 증폭산물은 전기영동 (Electrophoresis)을 수행하여 gel-DOC 2000 시스템(Bio-Rad)으로 U.V 상에서 확인하였다. 사용한 프라이머는 870bp인 NGF 프라이머이다(표 3).

[표 2] PCR 조건

	95℃	3분	1 cycle
Denature	95℃	30초	30 cycles
Annealing	62℃ (IL-6)	30초
Extension	72℃	1분
	72℃	7분	1 cycle

[표 3] 세미정량 PCR에 사용되는 NGF 프라이머의 서열

Primers	Sequences
NGF (860 bp)sensanti-sens	5' Tgg-CCA-gTg-gTC-gTg-CAg-TC 3' 5'AAg-TCA-gCC-TCT-TgC-AgC 3'
GAPDH (307 bp)sensanti-sens	Cgg AgT CAA Cgg ATT Tgg TCg TAT AgC CTT CTC CAT ggT ggT gAA gAC

백강잠 101A의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물이 신경세포 성장증강 효과를 갖는지를 확인하기 위하여 일차적으로 PC12 세포주에서 백강잠 101A와 분획물은 각각 10㎍/㎖의 농도로 처리하였고 분리된 7종의 화합물 10μM씩 처리한 후 신경돌기 성장 정도를 측정하였다. 백강잠 101A 분획물 중 헥산분획물, 부탄올분획물이 우수한 활성을 나타내었고 헥산분획물로부터 화합물 1-2, 부탄올분획물로부터 화합물 3-7 분리하여 각각의 화합물을 모두 PC12 세포주에서 10μM의 농도로 처리한 결과 화합물 5은 50ng/㎖의 NGF보다 우수한 신경돌기 신장 효과를 나타냈다. 또한 백강잠에서 분리된 화합물 5은 단순히 신경돌기의 길이를 증가시키는 작용 이외에도 망상구조를 이루면서 신경돌기가 성장되는 시기가 12시간이 지나면서부터 시작됨으로써 NGF와 같은 양상을 보였는데 이는 지금까지 보고된 천연물 유래의 화합물의 경우 24시간이 지나야만 신경돌기 성장이 시작되는 것과는 차이를 나타냈다.¹⁷⁾신경돌기가 성장되는 형태 또한 복합적 신장(multiple extension)을 보이고 시간이 지남에 따라 네트워크를 이루면서 성장되는 것을 현미경을 통하여 관찰할 수 있었다(도 1). NGF 유전자의 total mRNA의 양을 측정하기 위하여 C6 성상세포종 세포계에 각각의 화합물을 처리한 경우 모두 NGF mRNA 발현을 증가시켰고 화합물 5는 50 ng/㎖의 NGF를 처리한 경우보다 더욱 많은 양을 발현시켰다(도 3). 이러한 결과로부터 백강잠 101A으로부터 분리된 화합물들의 신경돌기 성장의 효과는 직접적으로 NGF 합성을 증가시킴으로써 나타나는 결과로 추정되어진다. 이러한 결과를 기초로 하여 화합물들이 선택적으로 NGF의 합성뿐만이 아니라 다른 신경영양 인자에도 영향을 동시에 영향을 미치는지를 확인하기 위해서 신경영양 인자를 유리시키는 세포주에서의 NGF, NT3, BDNF 및 GDNF 단백질 레벨을 측정한 결과 NGF 및 BDNF는 유사한 결과를 얻었다.

[시험예 2] 급성독성 실험

상기 실시예에서 제조한 백강잠 101A를 사용하기 전에 뜨거운 냄비에서 밀기울을 넣어 누렇게 될 때까지 초한다음 꺼내어 체로 쳐서 밀기울을 제거하고 이용하는 경우에는 쥐를 대상으로 경구투여 및 복강투여하여 독성을 나타내는지 여부를 알아보았다.

1. 경구투여

ICR 마우스와 SD rat을 각각 10마리씩 나누어 백강잠 101A 추출물을 100,250, 500 및 1000mg/kg의 용량으로 경구투여하였다. 경구투여 후 2주간 독성 여부를 관찰한 결과 모든 군에서 한 마리도 사망하지 않았으며 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

2. 복강투여

경구투여 ICR 마우스와 SD rat을 각각 10마리씩 나누어 백강잠 101A 추출물을 25, 100, 250 및 500mg/kg의 용량으로 복강투여하였다. 복강투여 후 24시간 독성 여부를 관찰한 결과 500mg/kg에서 2마리가 사망하였고 살아남은 동물의 경우 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없었다.

상기에서 전술한 결과를 통하여 확인된 백강잠 101A의 추출물 및 그 성분의 신경세포 성장 촉진 효과는 매우 뛰어난 것이었다.

본 발명은 백강잠 101A의 추출물과 이의 활성성분에 대하여 퇴행성 뇌질환에 중요하게 관여하는 신경세포 축색돌기 성장촉진 및 신경영양인자 단백질 증강효과를 PC12 세포를 이용하여 검색한 결과 증강 및 신경세포 성장 촉진에 탁월한 작용을 가지면서 세포독성은 없는 백강잠 101A 조추출 및 그 분획물 또한 이로부터 분리된 신규화합물을 포함한 7종의 화합물을 제공함으로써 알쯔하이머, 파킨슨 및 중풍과 같은 퇴행성 뇌질환에 의하여 유발되는 신경세포 위축 및 손상을 경감시키는 목적으로 사용될 수 있으며 국민건강 증진과 양잠농가의 새로운 소득원으로의 역할이 기대된다.

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7) Lindavall, O., Kokaia, Z., Bengzon, J., Elmer, E., Kokaia, M. : Neurotrophins and brain insults.Trends Neurosci., 17, 490 (1994)

8) Li P, Matsunaga K, Ohizumi Y. : Enhancement of the nerve growth factor-mediated neurite outgrowth from PC12D cells by Chinese and Paraguayan medicinal plants.Biol Pharm Bull. 22, 752 (1999)

9) Krivit, W., Hammarstrom, S., Identification and quantitation of free ceramides in human platelets.Journal of Lipid Research13, 525-530 (1972)

10) Mori, K., Fumaki, Y., Synthesis of (4E, 8E, 2S, 3R, 2'R)-N-2'-hydroxyhexadecanoyl-9-methyl-4,8-sphingadienine. The ceramide portion of the fruiting-inducing cerebroside in a basidiomycete Schizophyllum commune and its (2R, 3S)-isomer.Tetrahedron41, 2369-2377 (1985)

11) Isobe R., Inagaki M., Harano, Y., Sakiyama H., Higuchi R., Structural elucidation of glycosphingolipids by collision-induced dissociation of sodium ion complex.Chemical & Pharmaceutical Bulletin45, 1611-1614 (1997)

12) Higuchi R., Harano, Y., Mitsuyuki, M., Isobe, R., Yamada, K., Miyamoto, T., Komori, T., Isolation and structure of cerebrosides from the starfish Stellaster equestris.Liebigs Annalen, 593-599 (1996)

13) Jiang, H., Huang, X., Nakanishi, K., Berova, N., Nanogram scale absolute configurational assignment of ceramides by circular dichroism.Tetrahedron Letters40, 7645-7649 (1999)

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17) Mizuta, I., Ohta, M., Ohta, K., Nishimura, M., Mizuta, E., Hayashi, K. and Kuno, S. : Selegiline and Desmethylselegiline Stimulate NGF, BDNF, and GDNF Synthesis in Cultured Mouse Astrocytes.Biochemi Biophys Res Commu., 751, 279 (2000)

Claims (6)

1. 화학식 1로 표현되는 화합물:

   [화학식 1]

   상기에서, R은 C₁₇또는 C₁₉의 알킬기
2. 제 1항에 있어서, 상기 R은 C₁₇의 알킬기로서 화학식 2로 표현되는 (4E, 2S, 3R)-2-N-옥타데카노일(Octadecanoyl)-4-테트라데카스핀게닌(tetradecasphingenine).

   [화학식 2]
3. 제 1항에 있어서, 상기 R은 C₁₉의 알킬기로서 하기 화학식 3으로 표현되는 (4E, 2S, 3R)-2-N-아이코사노일(Eicosanoyl)-4-테트라데카스핀게닌 (tetradecasphingenine).

   [화학식 3]
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 의한 화합물을 유효성분으로 하는 뇌신경 활성 촉진 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 유효성분은 백강잠 101A(Beauveria bassiana101A)로부터 유래한 것임을 특징으로 하는 뇌신경 활성 촉진 조성물.
6. 백강잠 101A로부터 추출된 1,7-디메틸-크산틴, 우라실, 우레아, 베타인 및 타이로신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 뇌질환 치료용 약제학적 제제.