KR100602430B1 - 백강균 동충하초 균사체 및 자실체의 열수추출방법 및상기의 방법으로 얻은 열수추출물의 면역활성물질의규명방법 - Google Patents

백강균 동충하초 균사체 및 자실체의 열수추출방법 및상기의 방법으로 얻은 열수추출물의 면역활성물질의규명방법 Download PDF

Info

Publication number
KR100602430B1
KR100602430B1 KR1020050037395A KR20050037395A KR100602430B1 KR 100602430 B1 KR100602430 B1 KR 100602430B1 KR 1020050037395 A KR1020050037395 A KR 1020050037395A KR 20050037395 A KR20050037395 A KR 20050037395A KR 100602430 B1 KR100602430 B1 KR 100602430B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
water
supernatant
bacillus
volume
mycelium
Prior art date
Application number
KR1020050037395A
Other languages
English (en)
Inventor
찬 이
윤철식
박현수
송혁환
신광순
Original Assignee
중앙대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 중앙대학교 산학협력단 filed Critical 중앙대학교 산학협력단
Priority to KR1020050037395A priority Critical patent/KR100602430B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100602430B1 publication Critical patent/KR100602430B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/06—Fungi, e.g. yeasts
    • A61K36/062—Ascomycota
    • A61K36/066—Clavicipitaceae
    • A61K36/068—Cordyceps

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Natural Medicines & Medicinal Plants (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Alternative & Traditional Medicine (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 백강잠의 원료 곰팡이인 백강균(Beauveria bassiana) 균사체 및 자실체의 추출방법 및 상기의 방법으로 얻은 추출물을 정제하여 면역 활성물질을 규명하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명에서는 백강균의 균사체 및 자실체에 물을 가하여 끊인 후 끊는 물의 부피가 반이 되면 거어즈를 이용하여 잔사와 상등액을 분리한 다음, 다시 잔사에 물을 가하여 끊이고 다시 부피의 반이되면 잔사를 분리한 후, 처음 부피의 반이되면 거어즈를 이용하여 잔사와 상등액을 분리하는 열수(hot-water)추출법으로 추출하고, 상기의 방법을 얻은 열수추출물을 정제, 분석하여 면역활성물질을 규명하는 것이다.
백강균 * 열수추출 * 정제 * 균사체 * 자실체

Description

백강균 동충하초 균사체 및 자실체의 열수추출방법 및 상기의 방법으로 얻은 열수추출물의 면역활성물질의 규명방법{Hotwater extracting method from mycelium Beauveria bassiana and the method for finding the immunostimulant of the hotwater extract obtained therefrom}
도 1은 본 발명의 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출물의 임파구활성측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출물의 대식세포활성측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출물의 조다당획분의 임파구활성측정의 결과를 나타내느 그래프이다.
도 4는 본 발명의 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출물의 조다당획분의 대식세포활성측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출물 중 활성분획의 HPLC 크로마토그램이다.
도 6은 본 발명의 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출물 중 b분획의 겔여과 크로마토그래피의 결과이다.
도 7은 본 발명의 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출물 중 e분획의 겔여과 크로마토그래피의 결과이다.
도 8은 본 발명의 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출물 중 겔여과 크로마토그래피로 얻은 분획들의 대식세포활성측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명의 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출물 중 겔여과 크로마토그래피로 얻은 분획들의 임파구활성측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출물 중 h분획을 HPLC로 정제한 분획들의 임파구활성측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 11은 본 발명의 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출물 중 h분획을 HPLC로 정제한 분획들의 대식세포활성측정의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 HPCL로 분자량 결정을 위해 작성한 표준곡선이다.
본 발명은 백강잠의 원료 곰팡이인 백강균(Beauveria bassiana) 균사체 및 자실체의 추출방법 및 상기의 방법으로 얻은 추출물을 정제하여 면역 활성물질을 규명하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명에서는 백강균의 균사체 및 자실체에 물을 가하여 끊인 후 끊는 물의 부피가 반이 되면 거어즈를 이용하여 잔사와 상등액을 분리한 다음, 다시 잔사에 물을 가하여 상기의 과정을 반복하여 분리하는 열수(hot-water)추출법으로 추출하고, 상기의 방법을 얻은 열수추출물을 정 제, 분석하여 면역활성물질을 규명하는 것이다.
동충하초를 포함하는 곤충병원성곰팡이는 전세계적으로 약 100속 750여종이 분포하는 것으로 알려져 있다(Kobayashi 등 1983, Samson 등 1988). 그 중 완전세대사, 즉 자실체를 형성하며 자낭균류(Ascomycetes)에 속하는 곤충병원성 곰팡이로는 코디셉스(Cordyceps)속, 시미즈마이세스(Shimizuomyces)속, 토루비엘라(Torrubiella)속 등 3속이 알려져 있지만, 동충하초라고 할 수 있는 대표적인 속은 코디셉스속이다(Kobayashi, 1982). 코디셉스속에는 현재 전 세계적으로 300여종이 분포하는 것으로 알려져 있으며, 백강균(Beauveria bassiana), 녹강균(Metarhizium anisopliae) 같은 불완전균강(Deuteromycetes)에 속하는 대부분의 곤충병원성 곰팡이가 코디셉스속의 불완전세대로 알려져 있다.
자실체를 형성하는 일부 코디셉스속 동충하초와 불완전균류인 백강잠(Beauveria bassiana)은 중국, 한국, 일본 등지에서 예로부터 훌륭한 한방제로 이용되어 왔다(Jianzhe 등, 1989). 자실체를 형성하는 대표적인 종으로는 코디셉스 시넨시스(C. sinensis)가 있는데, 박쥐나방의 유충을 기주로 자실체를 형성하며 중국에서만 발견된다. 이 밖에도 코디셉스 밀리타리스(C. militaris), 코디셉스 마티아리스(C. martialis), 코디셉스 오피오글로소이디스(C. ophioglossoides), 코디셉스 소보리페라(C. soborifera), 코디셉스 호케스(C. hawkesii), 톨리포클래디엄속(Tolypocladium sp.), 보베리아 바시아나(B. bassiana) 등이 약용으로 이용되고 있다(Cunningham 등, 1950).
최근에는 생명공학의 발달로 이러한 동충하초 또는 한방제로부터 생리활성물 질 탐색에 관한 연구가 수행되고 있으며, 일부 연구에서 항암효과 등 다양한 생리활성을 나타내는 뉴글레오사이드(nucleoside) 유도체인 코디세핀[Cordycepin(3'-deoxyadenosin)]의 이화학적 특성이 구명되었다(Cunningham 등, 1950, 1951 Hubbel 등 1985). 또한 코디셉스 시넨시스(C. sinensis)로부터 디-만니톨(D-mannitol), 스테아르산(stearic acid), 마이코스(mycose), 에고스테롤(ergosterol), 우라실(uracil), 아데닌(adenine), 아데노신(adenosine)이 확인되었고, 코디셉스 시카데(C. cicadae)로부터 사코마(sarcoma) 180의 성장을 억제하는 다당류인 갈락토만난(galactomannan)이 분리되었다. 이 외에도 코디셉스 오피오글로소이디스(C. ophioglossoides)로부터도 항암 활성이 있는 다당류가 분리되었다(Ohmori 등 1986). 상기와 같이 코디셉스속 동충하초에 관한 연구는 일부 수행이 되었지만, 동의보감에서 항암제, 중풍치료제, 항생제, 강장제로 특효가 있다고 전하는 백강잠(B. bassiana)에 대한 연구는 전무한 실정이다.
이에, 상대적으로 좁은 국토면적과 빈약한 부존자원을 지닌 우리나라에서는 세계적인 개방화 흐름에 적극적으로 대응할 수 있는 신자원의 개발이 국가 경쟁력을 극대화시키는 최선의 방안이며, 이 같은 측면에서 국내 자생의 유용곰팡이자원을 탐색, 발굴하여 자원화 시키는 기술 개발의 중요성이 강조가 되고 있는 실정이다. 특히, 현재 국내외에서 연구가 전무한 백강균의 자실체 형성 및 유용물질의 분리, 정제, 특성분석 및 대량생산을 실시함으로써 국내 동충하초자원의 부가가치를 증대하는 것이 절실히 요구되고 있다.
또한, 국내에서는 전통적으로 백강균이 감염된 누에인 백강잠이 전통적인 생 약으로 이용되고 있어 백강균이 갖고 있는 많은 잠재력에 대한 연구가 집중되고 있다. 그러나, 실제로 생리작용을 나타내는 물질에 대한 규명이 아직 미흡한 실정이다.
한편, 곤충병원성 곰팡이의 분류 전문가 및 지원 부족으로 국내 곤충병원성곰팡이자원 정보 및 분류체계 미흡하며, 현재 농가에서 생산하고있는 동충하초는 번데기동충하초(C. militaris)와 누에동충하초(P. tenuipes)에만 국한되어있다. 또한, 상기 동충하초의 생리활성물질에 관한 연구로는 누에동충하초(P. tenuipes)가 면역력 증강, 항피로, 항노쇠 및 항암작용 등이 있음을 확인되었으나, 구체적인 활성물질에 대해서는 구체적으로 규명되지 않는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 백강균 동충하초로부터 면역활성물질을 규명하기 위해 예의 연구한 결과, 백강균 동충하초를 열수추출(hot-water extract)법으로 추출하여 정제함으로써 기능성 식품의 소재, 의약품 소재 등으로 활용할 수 있는 면역활성물질을 규명할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 동충하초의 불완전세대이며 백장감의 원료로 곤충병원성 곰팡이인 백강균 균사체 및 자실체의 추출방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기의 방법으로 얻은 추출물을 정제, 분석하여 면역활성물질을 규명하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 백강균 동충하초 균사체 및 자실체의 추출방법은 (1) 백강균 동충하초 균사체 및 자실체에 20배 부피의 물을 가하여 끊인 후, 넣은 물의 부피가 반이 되면 거어즈를 이용하여 잔사와 상등액을 분리하는 단계; (2) 상기의 잔사에 다시 20배 부피의 물을 가하여 끊인 후 넣은 물의 부피가 반이 되면 거어즈를 이용하여 잔사를 분리하고, 다시 처음 부피의 반이되면 거어즈를 이용하여 잔사와 상등액을 분리하여 처음 분리된 상등액과 합치는 단계; 및 (3) 상기에서 회수한 상등액을 약 1/3 부피로 농축하고 원심분리하여 상등액을 회수하여 동결건조하는 단계;를 포함하는 열수추출법임을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
백강균에 감염되어 죽은 누에나방의 새끼벌레를 건조시킨 것을 한방에서는 예로부터 백강잠이라고 하여 어린이들의 경련, 간질, 뇌졸중, 마비된 목의 치료를 위한 약재로 이용하여 왔으며, 담이나 가래를 삭이고 파상풍, 두통, 후두염, 편도선염, 실선증, 피부가려움증, 단독(丹毒), 당뇨병 등의 치료에도 이용하여 왔다.
백강균(Beauveria bassiana)은 하늘소 등 약 700여 종의 곤충을 감여시킬 수 있을 정도로 곤충병원성 곰팡이 중 기주범위가 가장 넒은 것으로 알려져 있다. 백강균은 기주의 표면에서 붕생포자를 형성하고, 분생포자는 균사에서 분생자병을 형성한 다음, 그 위에 둥근 플라스크 모양의 파이어라이드(phialide)를 만들며 파이얼라이드 상단에 긴 목을 형성하여 여러개의 마디를 형성한다. 이러한 마디의 끝부 분에 각각 1개씩의 분생포자가 지그재그 모양으로 발달하여 포도송이와 유사한 형태를 지니며 색깔은 무색이다. 배지상에서 많은 양의 포자가 생성되기 때문에 육안으로는 밀가루처럼 보이는 것이 특징이다.
본 발명에서는 백강균으로 모든 종류의 기주곤충으로부터 분리한 백강균을 이용할 수 있으며, 예를들면 누에로부터 분리한 백강균을 이용할 수 있다.
본 발명에 의한 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출법은 하기의,
(1) 백강균 동충하초 균사체 및 자실체에 20배 부피의 물을 가하여 끊인 후, 넣은 물의 부피가 반이 되면 거어즈를 이용하여 잔사와 상등액을 분리하는 단계;
(2) 상기의 잔사에 다시 20배 부피의 물을 가하여 끊인 후 넣은 물의 부피가 반이 되면 거어즈를 이용하여 잔사를 분리하고, 다시 처음 부피의 반이되면 거어즈를 이용하여 잔사와 상등액을 분리하여 처음 분리된 상등액과 합치는 단계; 및
(3) 상기에서 회수한 상등액을 약 1/3 부피로 농축하고 원심분리하여 상등액을 회수하여 동결건조하는 단계;
를 포함한다.
상기 (3)단계의 원심분리는 4℃에서 7000 rpm으로 30분동안 시행한다.
한편, 상기 (1)~(3)의 방법으로 얻은 백강균 균사체 및 자실체의 열수추출물의 구체적인 면역활성물질을 규명하기 위해 하기의 과정으로 정제, 분석한다.
먼저, 상기 열수추출물의 일반적인 성분은 각각 페놀-황산(phenol-sulfuric acid)법(Dubois M., et. al., 1954.), m-히드록시디페닐(hydroxydiphenyl)법(Blumenkrantz N. et. al., 1973), 및 브레드포드(bradford)법으로 정량, 분석한 다.
다음, 음이온크로마토그래피(anion exchange chromatography), 겔크로마토그래피(gel chromatography), 및 HPLC로 분획별로 분리, 정제하고 분자량을 측정하고 임파구활성(mitrogen 활성) 및 대식세포활성(macrophage 활성)을 측정한다.
다음, 상기의 정제된 분획에서 면역활성이 확인된 물질의 분자량을 측정하여 백강균 균사체 및 자실체의 면역활성물질을 규명한다. 이때, 상기의 면역활성물질은 구성당 분석을 통하여 탄수화물 성분임을 규명하였으며, 상기의 면역활성 탄수화물은 기능성 식품소재, 의약품소재로 활용가능하다.
이하, 시험예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
[제조예] 백강균 균사체 또는 자실체의 면역활성 물질의 추출
① 열수 추출법
백강균 균사체 및 자실체의 20배에 달하는 물을 가하여 끓인 후 끓는 물이 넣은 물의 부피에 반이 되면 거어즈를 이용하여 잔사와 상등액을 분리하였다. 다음, 잔사에 다시 20배의 부피에 해당하는 물을 가하여 끊이고 다시 부피의 반이 되면 잔사를 분리한 후, 처음 부피의 반이 되면 거어즈를 이용하여 잔사와 상등액을 분리하여 처음 분리된 상등액과 합하였다. 다음, 회수한 상등액을 약 1/3 부피로 농축하여 4℃에서 7000rpm으로 30분동안 원심분리하여 상등액을 회수하여 동결건조 하였다.
② 조다당 획분의 조제
상기 동결건조된 열수추출물을 모두 녹일 수 있는 최소한의 물을 가하여 용해시킨 후, 물에 4배 부피에 해당하는 에탄올을 서서히 첨가하면서 하룻밤동안 교반한 다음 원심분리(7000rpm, 30min, 4℃)하여 상등액을 분리하고 침전물을 회수하였다. 다음, 회수된 침전물에 최소한의 물을 첨가하여 완전 용해한 후, 투석막(M.W 10,000)에 넣고 5일간 투석(3일간 수돗물, 2일간 증류수)하였다. 투석이 완료되면 투석 내액을 회수하여 농축한 후, 원심분리(7000rpm, 30min, 4℃)하여 상등액을 회수한 다음 동결건조하였다.
[시험예 1]
상기 백강균 균사체 및 자실체 열수추출물의 조다당획분의 면역활성을 확인하기 위해, 하기의 임파구 활성측정 및 대식세포 활성측정을 이용하였다. 이때, 열수추출물은 1㎎/㎖의 농도로 사용하였으며, 양성대조군으로는 LPS (Lippolysaccharide), 음성대조군으로는 염류(saline)를 사용하였다. 그 결과를 하기 도 1에 나타내었다.
1-1. 임파구 활성측정(Mitogen 활성능)
1) 6주령의 ICR 쥐를 경구 탈구하여 70% 에탄올로 피부를 살균하고 복막을 절개하여 비장을 적출하여 RPMI 1640배지(우태아혈청(Fetal bovine serum : FBS) 없음)에 넣는다.
2) 비장에 붙어있는 지방을 제거한 후 다른 RPMI 1640 배지로 세척을 2번 더 한 후에 바늘을 이용하여 비장에 수많은 구멍을 뚫어서 비장세포를 추출한다.
3) 추출한 비장세포를 원심 분리하여(1,500rpm, 10min, 4℃) 상등액을 제거한다.
4) 적혈구 제거 : 0.2% NaCl 5㎖을 넣고 15~20초 동안 섞은 후에 RPMI 1640 배지 45㎖을 첨가한 후에 원심 분리하여 상등액을 제거한다.
5) RPMI 1640 배지로 2회 반복하여 세척한다.
6) 헤마사이토미터(Hemacytometer)를 이용하여 20㎕의 시료와 20㎕의 트라이판 블루(Trypan blue) 용액을 섞어서 세포수를 측정한 후에 5×106 cell/㎖ RPMI 1640(10% FBS)로 희석한다.
7) 96웰 판에 희석한 5× 106 cell/㎖ RPMI 1640(10% FBS) 90㎕와 시료 10㎕씩 분주하다.
8) 5% CO2 배양기(incubator)에서 3일간 배양하여 생세포 측정(MTT assay)을 통해 비장세포의 증식를 측정한다.
9) MTT법은 각 웰에 MTT용액 50㎕(1㎎/㎖ saline)을 첨가하여 5시간동안 배양(5% CO2 배양기)후, 상등액을 수류펌프(aspirator)로 제거하고 0.04N HCl/이소프로판올(isoprophanol)을 100㎕씩 분주한 후 5분 동안 상온에서 배양한다. 다시 D.W. 100㎕ 분주한 후 혼합하여 효소반응 흡광측정기(microplate reader(Molecular Devices, USA))를 이용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하여 비장세포의 증식을 측정한다.
1-2. 대식세포 활성측정(Macrophage 활성능)
하기 실험에 사용된 열수추출물은 1㎎/㎖의 농도로 사용하였으며, 양성대조군으로는 LPS (Lippolysaccharide), 음성대조군으로는 염류(saline)를 사용하였다. 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.
1) 6주령된 ICR 쥐 복강에 5% 티오글리콜레이트(Thioglycollate) (가압멸균(autoclave)하여 암소에 2주동안 방치한 후 사용)를 주사하여 3일 방치 후, 복강에 RPMI 1640배지(without FBS)를 주사하여 대식세포를 회수한다.
2) 대식세포를 1× 106 cell/㎖ RPMI 1640배지(without FBS)로 희석하여 96웰 판에 200㎕씩 분주한 후 5% CO2 배양기에서 2시간 배양한다.
3) 배지를 털어내어 버리고 RPMI 1640배지로 세척한 다음 시료 20㎕와 RPMI 1640배지(10% FBS)를 180㎕씩 분주한 후 5% CO2 배양기에서 하루 동안 배양한다.
4) 상등액을 털어내어 버린 후 0.1% Triton X-100을 25㎕씩 분주한다.
5) 합성기질인 p-니트로페닐 포스페이트(Nitrophenyl phosphate)(바로 만들어 사용)를 200㎕를 분주한다. 상기 p-니트로페닐 포스페이트는 p-니트로페닐 포스페이트 0.02g + D.W. 15㎖ + pH 5.0의 0.1M 구연산완충용액(citrate buffer) 5㎖를 혼합하여 사용한다.
6) 37℃, 5% CO2 배양기에서 15분동안 배양 한 후 0.2M 붕산염 완충용액(borate buffer)(pH9.8)를 50㎕씩 분주하다.
7) 효소반응 흡광측정기(microplate reader)(Molecular Devices, USA)를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정한다.
하기 도 1 및 도 2의 결과에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 백강균 균사체 및 자실체 열수추출물은 양성대조군인 LPS와 유사한 정도의 활성을 나타냄을 확인하였다.
[시험예 2]
상기 백강균 균사체 및 자실체 열수추출물의 하기의 과정으로 분리, 정제하여 면역활성을 측정하였다.
2-1. 음이온 교환 크로마토그래피(Anion exchange chromatography)
열수추출(hot-water extract)법으로 추출된 조다당획분 분말을 증류수에 녹인 후, 증류수로 평형화된 DEAE-Sepharose Fast Flow(10×3.0㎝, Amersham Pharmacia Biotech)에 흡착시킨 다음 증류수, 및 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 1.0, 및 2.0M의 NaCl의 용액으로 각각 1㎖/min의 속도로 단계적으로 용출시켰다. 이때, 얻어진 각 분획은 농축 및 투석 후 동결건조하여 1개의 비흡착분(a 분획)과 8개의 흡착분(b~i 분획)을 얻었다.
상기에서 분리된 8개의 분획들의 활성을 상기 시험예 1의 임파구활성측정 및 대식세포 활성측정법으로 면역활성을 측정하였다. 이때, 양성대조군으로는 LPS (Lippolysaccharide), 음성대조군으로는 염류(saline)를 사용하였으며, 그 결과를 하기 도 3 및 도 4에 나타내었다.
하기 도 3 및 도 4의 결과로부터 임파구 활성은 8개의 분획 중 b, c, e, h 및 i에서 활성을 보였으며, 대식세포 활성은 b, e, h 및 i에서 높은 활성을 나타냄을 확인하였다.
[시험예 3]
상기 시험예 2의 음이온교환 크로마토그래피로 분리된 8개의 분획들의 성분을 하기의 방법으로 일반적인 성분 및 구성당 성분을 분석하였다. 그 결과를 하기 표 3 및 표 4에 나타내었다.
3-1. 일반성분 분석
상기 백강균 균사체 및 자실체의 일반성분 분석은 하기의 방법으로 측정하였다. 총당 함량은 갈락토오스(galactose)를 표준물질로 하여 페놀-황산(phenol-sulfuric acid)법(Dubois M., et. al., 1954.)으로, 산성당 함량은 D-갈락투론산(galacturonic acid)을 표준물질로 하여 m-히드록시디페닐(hydroxydiphenyl)법(Blumenkrantz N. et. al., 1973)으로, 단백질 함량은 소알부민(bovine albumin)을 표준물질로 하여 브레드포드(bradford)법으로 각각 정량, 분석하였다.
3-2. 구성당 분석
다당시료를 2M 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)으로 121℃에서 1.5시간 가수분해시켜서 중성당(aldose)과 산성당(aldonic acid)으로 전환시킨 후, NaBH4를 이용하여 각각 알디톨(alditol) 및 산성당(aldonic acid)으로 환원시켰다. 이렇게 생성된 알디톨은 무수초산(acetic anhydride)을 이용하여 알디톨 아세트산염(alditol acetate)유도체로 전환시키고 가스 크로마토그래피(gas chromatography)로 구성당을 분석하였다. GC의 분석 조건은 하기에 나타냈으며, 표준 구성당들의 머무름시간(retention time)과 비교하여 시료중의 구성당을 분석하였다. 이때, 구성당의 몰(mol)%는 피크의 면적비와 각 구성당의 알디톨 아세트산염(alditol acetate) 유도체의 분자량으로부터 계산하였다.
[구성당 분석에서의 가스크로마토그래피의 분석조건]
기기 GC M600D (Young-Lin Co. Ltd., Korea)
검출기 Flame ionization detector (Young-Lin Co. Ltd., Korea)
컬럼 SP-2380 capillary column I(Supelco USA)
컬럼크기 0.25㎜ × 30m ×0.2㎕ film thickness
오븐 온도 60℃(1min)→220℃(12min)→250℃(15min)
주입기 온도 250℃
검출기온도 250℃
운반기체 N2 (1.5㎕/min)
기록계 D520B Intergrator (Young-Lin Co. Ltd., Korea)
음이온교환 크로마토그래피로 분리된 다당류(polysaccharide) 분획의 화학조성(%)
화학조성 a b c d e f g h i
구성당류 98.16 97.96 94.39 83.97 82.38 83.69 85.98 96.16 84.94
우론산 당류 (Uronic acid sugar) 1.84 2.04 5.61 16.03 17.62 16.31 14.02 3.84 15.06
단백질 0 0 0 0 0 0 0 0 0
구성당 성분 b e h i
람노오스(Ramnose) 0.51 3.30 2.26 0.00
푸코오스(Fucose) 0.23 1.32 0.00 6.68
아라비노오스(Arabinose) 5.04 15.08 8.04 0.00
크실로오스(Xylose) 1.20 4.08 4.55 11.42
만노오스(Mannose) 42.33 27.48 34.70 20.82
글루코오스(Glucose) 10.69 6.08 11.82 34.36
갈락토오스(Galactose) 40.01 42.66 38.64 26.67
상기 표 3의 결과로부터, 활성 획분 중 b 및 h에서는 낮은 산성당의 함량을 나타냄을 확인하였다. 또한, 표 4의 면역활성을 보이는 분획의 구성당분석의 결과에서 b 분획은 만노오스(mannose)와 갈락토오스(galactose)가 82%를 넘게 차이하고 있었고, i 분획의 경우 크실로오스(xylose), 만노오스(mannose), 글루코오스(glucose)와 갈락토오스(galactose)가 대부분을 차지하고 있음을 확인하였다. 상기 구성당 분석을 통하여 백강균 균사체 및 자실체의 면역활성 물질은 탄수화물 성분임을 확인할 수 있었다.
[시험예 4]
4-1. HPLC에 의한 순도확인, 정제 및 분자량 측정
상기 시험예 2의 음이온교환 크로마토그래피의 활성분획의 순도를 확인하기 위하여 하기의 분석조건으로 HPLC(high performance liquid chromatography)를 행하고, 활성분획 중 양이 적고 단 2개의 피크만 보이는 h 분획을 HPLC 과정을 통해 정제하였다. 분자량 측정시에는 표준물질로 풀루란(pullulan) 시리즈(P800, 400, 200, 100, 50, 20, 10 및 5, Showa Denko, Japan)를 이용하여 각각의 머무름시간(retention time)을 구한 후, 분자량에 대한 Kav값을 산출하여 얻은 표준곡선(하기 도 12)으로부터 환산하여 결정하였다. 그 결과를 하기 도 5에 나타내었다.
[HPLC의 분석조건]
기기 HPLC-9500(Young-Lin Co. Ltd., Korea)
검출기 Refractive Index (RI, Waters, USA)
컬럼 Shodex GS520+GS320+GS220 Packed Column (Asahi Chemical Industry Co. Ltd., Japan)
컬럼크기 φ7.6×300㎜
유속 0.5㎖/min
용리액 0.2 M NaCl
기록계 Autochro data module (Young-Lin Co. Ltd., Korea)
주입 부피 10㎕
하기 도 5의 결과로부터 b 분획의 경우는 20,800 Da에서 5,000 Da이하의 물질이 혼합되어 있고, e 분획의 경우 340,000 Da에서 5,000 Da이하의 다양한 분자량을 가진 물질이 혼합되어 있음을 확인할 수 있었다.
4-2. 겔여과 크로마토그래피(Gel filtration chromatography)
상기 시험예 2의 음이온 교환 크로마토그래피의 정제 시료 중 면역활성을 나타내면서 정제과정이 더 필요한 b와 e 분획을 대상으로 겔크로마토그래피를 시행하였다. 증류수로 평형화된 Superdex G-200 column(50× 1.5㎝, Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 1㎖/min의 속도로 b-1, b-2와 e-1, e-2, e-3으로 분리한 후, 농축 및 동결건조하여 이후의 실험에 사용하였다. 그 결과를 하기 도 6 및 도 7에 나타내었다.
[시험예 5]
상기 시험예 4에서 분리한 b-1, b-2와 e-1, e-2, e-3의 면역활성을 측정하였다. 면역활성은 상기 시험예 1의 임파구활성측정 및 대식세포 활성측정의 방법과 동일하게 시행하였다. 그 결과를 하기 도 8 및 9에 나타내었다.
하기 도 8의 결과에서 대식세포활성(Macrophage phosphatase activity)은 b-1 및 e-1인 고분자 분획에서 보다 높은 활성을 나타냄을 확인하였으며, 하기 도 9의 임파구활성측정에서는 농도가 1㎎/㎖에서 e-2를 제외한 모든 분획에서 활성을 나타내었고, 0.1㎎/㎖에서 e-1의 경우가 상대적으로 높은 활성을 나타냄을 확인하였다.
[시험예 6]
상기 시험예 2에서 확인된 활성획분 중 양이 적고 단 2개의 피크만을 보이는 h분획을 상기 4-1의 HPLC(high performance liquid chromatography) 과정을 통해 정제하여 얻은 분획 h-1 및 h-2의 면역활성을 측정하였다. 면역활성은 상기 시험예 1의 임파구활성측정 및 대식세포 활성측정의 방법과 동일하게 시행하였다. 그 결과를 하기 도 10 및 11에 나타내었다.
또한, 하기 도 12의 표준곡선으로 h-1분획 및 i분획의 분자량을 측정하여 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
정제된 면역활성 성분 h-1 및 i 분획의 분자량 측정
분획 시간(분) Kav M.W(log value) M.W
h-1 27.752 0.0062 5.3986 250,000 Da
i 46.592 0.7129 2.7410 550 Da
하기 도 10 및 도 11의 결과에서 h-1분획이 공통적으로 면역 활성을 나타내었고, h-2는 면역 활성을 나타내지 않음을 확인하였다. 또한, 상기 표 5의 결과에서 정제된 h-1 분획은 250,000 Da, 및 i 분획은 550 Da의 분자량을 가진 물질임을 확인할 수 있었다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에서는 열수추출법으로 백강균 동충하초 균사체 및 자실체를 추출하여 그 추출물을 정제, 분리함으로써 면역활성 성분을 구체적으로 규명하여 기능성 식품 소재, 의약품 소재 등으로의 활용을 가능하게 하며, 자원이 부족한 우리나라에서 곤충병원성곰팡이의 자원화를 유도할 수 있다. 또한, 이러한 면역활성 성분의 개발은 국내토착 유용 곰팡이자원의 발굴 및 자원화로 이어져 미생물자원의 경제적 가치를 증대하고 국내 토착 동충하초자원 이용관련 새로운 산업군의 창출이 가능할 것이라고 예상된다.

Claims (3)

  1. (1) 백강균 동충하초 균사체 및 자실체에 20배 부피의 물을 가하여 끊인 후, 넣은 물의 부피가 반이 되면 거어즈를 이용하여 잔사와 상등액을 분리하는 단계;
    (2) 상기의 잔사에 다시 20배 부피의 물을 가하여 끊인 후 넣은 물의 부피가 반이 되면 거어즈를 이용하여 잔사를 분리하고, 다시 처음 부피의 반이되면 거어즈를 이용하여 잔사와 상등액을 분리하여 처음 분리된 상등액과 합치는 단계; 및
    (3) 상기에서 회수한 상등액을 약 1/3 부피로 농축하고 원심분리하여 상등액을 회수, 동결건조하여 열수추출물을 얻는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 백강균 동충하초 균사체 및 자실체의 추출방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 단계(3)의 원심분리는 4℃에서 7000 rpm으로 30분동안 수행하는 것임을 특징으로 하는 백강균 동충하초 균사체 및 자실체의 추출방법.
  3. (1) 상기 제 1항의 방법으로 얻은 열수추출물을 모두 녹일 수 있는 최소한의 물을 가하여 용해시킨 후, 물에 4배 부피에 해당하는 에탄올을 서서히 첨가하면서 하룻밤동안 교반한 다음 원심분리하여 상등액을 분리하고 침전물을 회수한 후 회수된 침전물에 최소한의 물을 첨가하여 완전 용해하여 투석막에 넣고 5일간 투석하고, 투석이 완료되면 투석 내액을 회수하여 농축한 다음 원심분리하여 상등액을 회 수한 다음 동결건조하여 조다당 획분을 조제하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계에서의 조다당 획분을 음이온교환 크로마토그래피(Anion exchange chromatography)로 분획별로 분리하는 단계;
    (3) 상기 (2)단계에서 분리된 분획의 임파구활성 및 대식세포 활성을 측정하는 단계;
    (4) 상기 (2)단계에서 분리된 분획의 구성당을 분석하는 단계; 및
    (5) 상기 (3)단계에서 활성을 갖는 분획을 HPLC(high performance liquid chromatography)로 정제하고 분자량을 측정하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 상기 제 1항의 방법으로 얻은 추출물의 면역활성 물질을 규명하는 방법.
KR1020050037395A 2005-05-04 2005-05-04 백강균 동충하초 균사체 및 자실체의 열수추출방법 및상기의 방법으로 얻은 열수추출물의 면역활성물질의규명방법 KR100602430B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050037395A KR100602430B1 (ko) 2005-05-04 2005-05-04 백강균 동충하초 균사체 및 자실체의 열수추출방법 및상기의 방법으로 얻은 열수추출물의 면역활성물질의규명방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050037395A KR100602430B1 (ko) 2005-05-04 2005-05-04 백강균 동충하초 균사체 및 자실체의 열수추출방법 및상기의 방법으로 얻은 열수추출물의 면역활성물질의규명방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR100602430B1 true KR100602430B1 (ko) 2006-07-20

Family

ID=37184316

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050037395A KR100602430B1 (ko) 2005-05-04 2005-05-04 백강균 동충하초 균사체 및 자실체의 열수추출방법 및상기의 방법으로 얻은 열수추출물의 면역활성물질의규명방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100602430B1 (ko)

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101013061B1 (ko) * 2008-07-08 2011-02-14 한림대학교 산학협력단 피부 소양증 및 아토피 피부염 예방 및 치료용 노랑다발 동충하초의 알콜 추출물
WO2012128418A1 (ko) * 2011-03-22 2012-09-27 성균관대학교산학협력단 노랑다발 동충하초로부터 추출된 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 추출물 및 그를 포함하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물
KR101452833B1 (ko) 2012-06-28 2014-10-22 환인제약 주식회사 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제조하는 방법 및 상기 추출물을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물
KR101604034B1 (ko) 2014-02-18 2016-03-17 충북대학교 산학협력단 백강잠 생성에 유용한 보베리아 바시아나 jn19m2w1 및 jn15r2w1 균주 및 이의 용도
KR102066265B1 (ko) 2019-09-05 2020-01-14 이재성 화장품 원료의 추출방법
KR102235096B1 (ko) 2020-11-30 2021-04-02 이성기 식물 병충해 방지 효과를 가지는 페니실리움 파실리 균주 및 이의 용도
KR102270000B1 (ko) * 2020-01-15 2021-06-28 한국원자력연구원 백강잠 추출물을 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물 및 이를 이용한 수지상 세포의 성숙화 방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010093364A (ko) * 2000-03-28 2001-10-29 김영호 동충하초 배양 균사체로 부터 분리한 추출물 및 그 용도
KR20040012396A (ko) * 2002-08-03 2004-02-11 대한민국(관리부서:농촌진흥청) 뇌신경성장인자 증강작용을 갖는 백강잠 추출물 및 이의활성성분을 함유하는 약학적 제제
KR20040053906A (ko) * 2002-12-16 2004-06-25 주식회사 마이코플러스 백강균의 균사체로부터 분생자병속을 형성하는 방법
KR20050095010A (ko) * 2004-03-24 2005-09-29 주식회사 티지 바이오텍 백강잠 추출물을 유효성분으로 하는 의약 조성물

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010093364A (ko) * 2000-03-28 2001-10-29 김영호 동충하초 배양 균사체로 부터 분리한 추출물 및 그 용도
KR20040012396A (ko) * 2002-08-03 2004-02-11 대한민국(관리부서:농촌진흥청) 뇌신경성장인자 증강작용을 갖는 백강잠 추출물 및 이의활성성분을 함유하는 약학적 제제
KR20040053906A (ko) * 2002-12-16 2004-06-25 주식회사 마이코플러스 백강균의 균사체로부터 분생자병속을 형성하는 방법
KR20050095010A (ko) * 2004-03-24 2005-09-29 주식회사 티지 바이오텍 백강잠 추출물을 유효성분으로 하는 의약 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
논문

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101013061B1 (ko) * 2008-07-08 2011-02-14 한림대학교 산학협력단 피부 소양증 및 아토피 피부염 예방 및 치료용 노랑다발 동충하초의 알콜 추출물
WO2012128418A1 (ko) * 2011-03-22 2012-09-27 성균관대학교산학협력단 노랑다발 동충하초로부터 추출된 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 추출물 및 그를 포함하는 아토피성 피부염 예방 또는 치료용 조성물
KR101452833B1 (ko) 2012-06-28 2014-10-22 환인제약 주식회사 코디세핀이 고농도로 함유된 동충하초 균사체 배양여액의 추출물을 제조하는 방법 및 상기 추출물을 함유하는 혈관질환의 치료 또는 예방용 조성물
KR101604034B1 (ko) 2014-02-18 2016-03-17 충북대학교 산학협력단 백강잠 생성에 유용한 보베리아 바시아나 jn19m2w1 및 jn15r2w1 균주 및 이의 용도
KR102066265B1 (ko) 2019-09-05 2020-01-14 이재성 화장품 원료의 추출방법
KR102270000B1 (ko) * 2020-01-15 2021-06-28 한국원자력연구원 백강잠 추출물을 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물 및 이를 이용한 수지상 세포의 성숙화 방법
KR102235096B1 (ko) 2020-11-30 2021-04-02 이성기 식물 병충해 방지 효과를 가지는 페니실리움 파실리 균주 및 이의 용도

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100602430B1 (ko) 백강균 동충하초 균사체 및 자실체의 열수추출방법 및상기의 방법으로 얻은 열수추출물의 면역활성물질의규명방법
Yan et al. Recent advances in Cordyceps sinensis polysaccharides: Mycelial fermentation, isolation, structure, and bioactivities: A review
Wang et al. Optimization for the production of water-soluble polysaccharide from Pleurotus citrinopileatus in submerged culture and its antitumor effect
Liu et al. First report of a xylose-specific lectin with potent hemagglutinating, antiproliferative and anti-mitogenic activities from a wild ascomycete mushroom
KR101467903B1 (ko) 흑미의 담자균류균사 발효 및 생물전환공정을 통해 생산된 면역증강제
US10835552B2 (en) Method for preparing linseed polysaccharide having antiviral activity and immunological activity, and use of the linseed polysaccharide
KR101774564B1 (ko) 효소처리 인삼유래 면역기능 증강용 다당분획물 및 이의 제조방법
Liu et al. Oligopeptide derived from solid-state fermented cottonseed meal significantly affect the immunomodulatory in BALB/c mice treated with cyclophosphamide
CN107541533A (zh) 一种药食真菌菌丝多糖多肽免疫增强剂的制备方法
Wei et al. Dendrobium sonia polysaccharide regulates immunity and restores the dysbiosis of the gut microbiota of the cyclophosphamide-induced immunosuppressed mice
CN104672339A (zh) 一种蝉花菌素及其制备和用途
Zhang et al. An Inulin‐Specific Lectin with Anti‐HIV‐1 Reverse Transcriptase, Antiproliferative, and Mitogenic Activities from the Edible Mushroom Agaricus bitorquis
Zheng et al. Polysaccharides from spores of cordyceps cicadae protect against cyclophosphamide-induced immunosuppression and oxidative stress in mice
Yin et al. Gastrointestinal digestion, probiotic fermentation behaviors and immunomodulatory effects of polysaccharides from Sanghuangporus vaninii
CN104262500B (zh) 一种具有免疫活性的新型红托竹荪多糖及其制备方法和应用
Cao et al. Chemical characterization and structure of exopolysaccharides from submerged culture of new medicinal mushroom from China, Phellinus mori (higher Basidiomycetes)
Song et al. The effect of pectinase-assisted extraction on the physicochemical and biological properties of polysaccharides from Aster scaber
KR19990081593A (ko) 신규한 면역증강활성 다당류물질 및 그 제조방법
Kim et al. Immunomodulating and antitumor activities of Panellus serotinus polysaccharides
KR101434741B1 (ko) 페실로마이세스 바리오티 바라이어티 브른네오러스 ｇｐｐ１１０１ｂ 균주 및 이를 이용한 제제
KR101421615B1 (ko) 헛개나무 열매로부터 암페롭신을 분리하는 방법
JP2004091780A (ja) Ａｎｔｒｏｄｉａｃａｍｐｈｏｒａｔａ菌体の多糖類
CN113105567B (zh) 一种蝉拟青霉甘露聚糖及其制备和用途
KR20120019311A (ko) 면역기능을 증진시키기 위하여 조제한 인삼의 상황버섯 균사체 발효물로부터 분리된 다당류를 유효성분으로 포함하는 면역활성용 조성물
Xu et al. Antioxidant and immunomodulatory activities of polysaccharides from fermented wheat products of Grifola frondosa: in vitro methods

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
N231 Notification of change of applicant
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131121

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140703

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160527

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180628

Year of fee payment: 13

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190627

Year of fee payment: 14