KR102270000B1 - 백강잠 추출물을 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물 및 이를 이용한 수지상 세포의 성숙화 방법 - Google Patents

백강잠 추출물을 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물 및 이를 이용한 수지상 세포의 성숙화 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 백강잠 추출물을 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물 및 이를 이용한 수지상 세포의 성숙화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 백강잠 추출물을 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물; 0.01 내지 5 중량%의 항산화 물질을 포함하는 수용액에 백강잠을 침지하는 단계 및 백강잠이 침지된 수용액으로부터 백강잠 추출물을 획득하는 단계를 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물의 제조방법; 및 상기 수지상 세포 성숙화 조성물을 포함하는 배지 조성물에서 골수 세포를 배양하는 단계를 포함하는 수지상 세포의 성숙화방법에 관한 것이다.

Description

백강잠 추출물을 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물 및 이를 이용한 수지상 세포의 성숙화 방법{COMPOSITION FOR INDUCING MATURE DENDRITIC CELL COMPRISING BOMBYSIS CORPUS EXTRACT AND METHOD FOR INDUCING MATURE DENDRITIC CELL USING THE SAME}
본 발명은 백강잠 추출물을 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물 및 이를 이용한 수지상 세포의 성숙화 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 항산화 성분을 이용한 추출을 통해 수지상 세포의 성숙화 효과가 우수한 백강잠 추출물을 포함하는 조성물을 제조하고 이를 이용하는 기술에 관한 것이다.
랑게르한스(Langerhans)에 의해 처음 발견된 수지상 세포는 가장 강력한 항원제시세포(professional antigen presenting cells; APC)로서 면역 유도 및 면역 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 인체 내 수지상 세포는 극소량으로 존재하지만 대식 세포와는 구별되는 표현형을 지닌 이질적인 집단으로 구성되어 있다. 수지상 세포는 항원에 노출된 적이 없는 원시 T 세포 (naive T cell)를 자극시킬 수 있는 일차면역반응(primary immune response) 유도 능력을 지니며, 또한 면역기억을 유도할 수 있는 특성을 갖는 유일한 면역세포이다. 이와 같이 수지상 세포가 강력한 면역반응 활성화 기능을 할 수 있는 것은 항원제시세포(APC, Antigen Presenting Cell)로서 세포 표면에 MHC 분자 (I/II) 뿐만 아니라, 예컨대 CD80, CD86과 같은 보조자극분자(co-stimulatory molecules)와, 예컨대 ICAM-1 등과 같은 부착 분자(adhesion molecule)를 고농도로 발현하고 있으며, 여러 가지의 사이토카인(IFN-alpha, IL-12, IL-18 등)을 분비하기 때문인 것으로 알려져 있다.
수지상 세포의 분화는 말초 혈액 유래 단핵구(monocytes) 또는 말초 혈액, 제대혈, 골수의 조혈모세포로부터 사이토카인을 활용하여 체외 세포 배양(ex vivo culture)으로 이루어지고 있으며, 수지상 세포의 분화를 적절히 체외에서 조절하여 각종 면역질환 증상에 맞는 최적의 조건을 갖추는 것이 필요하며 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
예를 들어, 종래 암 치료법의 한계를 극복하기 위해 최근 항암 면역 치료 연구가 활발히 진행되고 있으며 최근 국내외적으로 임상에서의 사용 허가가 이루어지고 있다. 그러나 이러한 항암 면역 치료법은 제조 비용이 고가이며, 개인별 복잡한 면역체계로 인한 어려움이 있다. 보다 상세하게, 항암 면역 치료는 체내 면역세포의 특성들을 이용하여 암세포에 대한 면역 활성을 높이거나 암세포가 면역세포의 공격으로부터 회피하는 방법을 억제시킴으로써 암을 치료하는 방법으로 면역세포요법(Immune cell therapy), 면역관문 억제제(Immune checkpoint inhibitors), 치료용 암 백신(Therapeutic cancer vaccines), 항체 치료제(Therapeutic antibodies) 등이 있다. 또 다른 예로, 과도한 면역반응으로 유발되는 질환을 효과적으로 치료하기 위한 세포 치료제로서 수지상 세포를 이용하는 방법이 연구되고 있으며, KR 10-2015-0082836 A 에서는 겔솔린을 이용한 수지상세포 분화 유도용 조성물을 개시하고 있다.
따라서, 새로운 수지상 세포 성숙화 조성물이 제공되는 경우 항암 면역 유도 등 각종 질환의 치료와 관련하여 널리 적용될 수 있을 것으로 기대된다.
이에 본 발명의 한 측면은 백강잠 추출물을 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 측면은 상기 본 발명의 수지상 세포 성숙화 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 백강잠 추출물을 포함하는 조성물을 이용한 수지상 세포의 성숙화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 견지에 의하면, 백강잠 추출물을 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물이 제공된다.
본 발명의 다른 견지에 의하면, 0.01 내지 5 중량%의 항산화 물질을 포함하는 수용액에 백강잠을 침지하는 단계; 및 백강잠이 침지된 수용액으로부터 백강잠 추출물을 획득하는 단계를 포함하는, 수지상 세포 성숙화 조성물의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 견지에 의하면, 상기 본 발명의 수지상 세포 성숙화 조성물을 포함하는 배지 조성물에서 골수 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 수지상 세포의 성숙화방법이 제공된다.
본 발명에 의해 획득되는 수지상 세포 성숙화 조성물은 수지상 세포에 대한 활성 및 면역 분극화(polarization)를 효과적으로 유도할 수 있으며, 따라서 이를 이용하여 성숙화되는 성숙 수지상 세포는 다양한 암 또는 결핵, 살모넬라, 비결핵항산균 등과 같은 병원균(intracelluar pathogens)에 대한 효과적인 방어 효과를 유도하여 이들 질환에 대한 예방 및/또는 치료 효과를 나타낼 수 있을 것으로 기대될 뿐만 아니라, 나아가 국민의 건강을 도모할 수 있는 건강기능식품으로서의 활용도 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 실시예 및 비교예의 각 백강잠 추출물의 수지상 세포에 대한 표면발현인자 유도능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 및 비교예의 각 백강잠 추출물의 수지상 세포에 대한 사이토카인 유도능을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 그러나, 본 발명의 실시 형태는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의하면, 수지상 세포에 대한 활성 및 면역 분극화(polarization)를 효과적으로 유도할 수 있는 수지상 세포 성숙화 조성물이 제공된다.
특히 본 발명의 수지상 세포 성숙화 조성물은 백강잠 추출물을 포함하는 것이다.
본 발명에 있어서 상기 백강잠(Bombysis Corpus)은 누에(Bombyx mori L.)는 백강균(Batrytis bassiana BALS)에 감염되어 죽은 충체로 누에에 비해 쉽게 부스러져 가루화가 용이한 것으로, 그 수지상 세포 성숙화 효과에 대해서는 연구된 바 없는 물질이다.
본 발명에 사용되는 상기 백강잠 추출물은 상온의 물에 의해 추출된 것일 수 있으며, 예를 들어 정제수를 사용할 수 있고, 바람직하게 본 발명의 상기 백강잠 추출물은 0.01 내지 5 중량%의 항산화 물질을 포함하는 수용액을 추출 용매로 하여 획득된 것이며, 예를 들어, 0.05 내지 5 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 3 중량%의 항산화 물질을 포함하는 수용액을 추출 용매로 하여 획득된 것이다.
이때, 본 발명에 사용될 수 있는 상기 항산화 물질은 아스코르브산(ascorbic acid, 비타민 C), EDTA(disodium ethylenediaminetetracetic acid), 디칼슘 EDTA, 토코페롤, BHT(butylated hydroxytoluene), BHA(butylated hydroxyanisole), 인산염 및 시트르산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 아스코르브산(ascorbic acid)일 수 있다. 특히 아스코르브산은 비타민 C라고도 지칭할 수 있는 것으로, 수용성이며, 세포 내 항산화물질인 글루타티온에 의해 환원 형태로 존재하고 과산화수소와 같은 활성 산소를 제거하는 역할을 하며, 단백질의 겔화를 억제할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 아스코르브산을 추출 용매인 물에 추가하여 사용함으로써 활성산소의 형성을 통해 유도되는 단백질과 지방산의 산화를 억제하여 단백질의 변성을 예방할 수 있으며, 다양한 활성 산소를 제거함으로써 인체에 보다 안전적이며 효과적으로 적용할 수 있다. 또한, 예를 들어 추출용매로 인산염(phosphate salts)이 첨가된 버퍼가 사용될 수 있다.
상기 추출 용매인 수용액이 항산화 물질을 0.01 중량%의 미만으로 포함하는 경우에는 항산화제의 기능이 불충분한 문제가 있을 수 있다.
한편, 상기 백강잠 추출물은 추출물의 건조 형태일 수 있으며, 예를 들어 건조 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 수지상 세포 성숙화 조성물은 GM-CSF(Granulocyte-macrophage stimulating factor) 및 IL-4을 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들어 상기 수지상 세포 성숙화 조성물은 10 내지 50 ng/ml의 GM-CSF, 0.1 내지 1 ng/ml의 IL-4 및 전체 조성물 중량을 기준으로 1 내지 5 중량%의 백강잠 추출물의 건조 분말을 포함하는 것일 수 있다.
즉, 상기 GM-CSF은 10 내지 50 ng/ml 및 IL-4는 0.1 내지 1 ng/ml의 함량으로 포함되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게 GM-CSF은 15 내지 25 ng/ml 및 IL-4는 0.1 내지 0.5 ng/ml의 함량으로 포함되는 것이다. 상기 GM-CSF가 10 ng/ml 미만인 경우에는 수지상 세포의 성숙화율이 낮아지는 경향이 있으며, 50 ng/ml을 초과하는 경우에는 골수유래억제세포로의 분화 문제가 있다.
상기 본 발명의 수지상 세포 성숙화 조성물은 수지상 세포 성숙화용 배지 조성물, 즉 배양액일 수 있다.
나아가, 본 발명에 의하면 수지상 세포 성숙화 조성물의 제조방법이 제공되며, 상기 본 발명의 수지상 세포 성숙화 조성물의 제조방법은 보다 상세하게, 0.01 내지 5 중량%의 항산화 물질을 포함하는 수용액에 백강잠을 침지하는 단계; 및 백강잠이 침지된 수용액으로부터 백강잠 추출물을 획득하는 단계를 포함하는 것이다.
본 발명의 수지상 세포 성숙화 조성물의 제조방법에 있어서 수지상 세포 성숙화 조성물에 관한 내용은 상술한 바와 동일한 내용이 적용된다.
항산화 물질을 포함하는 수용액에 백강잠을 침지하는 단계는 1초 내지 6시간, 예를 들어 10초 내지 2시간, 바람직하게는 1분 내지 1시간일 수 있으며, 침지하는 단계는 상온, 예를 들어 0℃ 초과 내지 40℃ 미만의 온도, 바람직하게는 3℃ 내지 37℃의 온도, 즉 상온에서 수행될 수 있다.
후속적으로 백강잠이 침지된 수용액으로부터 백강잠 추출물을 획득하는 단계를 수행하며, 상기 단계는 고형물을 분리하고 액상의 추출물을 획득하는 단계로, 예를 들어 백강잠이 침지된 수용액을 원심분리하여 백강잠 추출물을 상층액으로 획득할 수 있고, 이때 원심분리는 상온에서 3000 내지 4000 rpm으로 수행될 수 있다.
한편, 백강잠을 침지하는 단계 전 혹은 후에 백강잠을 분쇄하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 백강잠을 분말 형태로 적용하는 경우 추출 효율이 보다 향상될 수 있다.
한편, 상기 백강잠 추출물을 여과하여 여과액을 획득하는 단계; 및 상기 여과액을 건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 이와 같은 여과 단계의 수행에 의해 불순물을 제거할 수 있고, 나아가 건조하는 단계에 의해 건조 형태의 추출물을 획득할 수 있으며, 예를 들어 건조 분말 형태의 추출물이 획득될 수 있다.
상기 여과 단계를 수행하는 방법은 특히 제한되는 것은 아니며, 필터, 여과지(filter paper) 등을 사용하여 수행될 수 있다.
한편, 건조하는 단계 역시 수행 방법이 특히 제한되는 것은 아니며, 상온 건조, 동결 건조 등에 의해 수행될 수 있으며, 바람직하게는 동결 건조에 의해 수행한다.
본 발명의 수지상 세포 성숙화 조성물의 제조방법은 나아가 백강잠 추출물과 GM-CSF 및 IL-4을 혼합하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
나아가 본 발명에 의하면, 상술한 본 발명의 수지상 세포 성숙화 조성물을 포함하는 배지 조성물에서 골수 세포 또는 대식세포를 배양하는 단계를 포함하는 수지상 세포의 성숙화방법이 제공된다.
이때, 상기 배양은 6일 내지 10일 동안 수행되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 7일 내지 9일, 예를 들어 8일 동안 배양이 수행될 수 있다.
본 발명의 수지상 세포의 유도방법으로 유도된 성숙 수지상 세포는 염증 매개 사이토카인 TNF-알파 및 Th1 형 사이토카인 IL-12p70의 분비가 향상되고; T 세포와의 상호작용에 중요한 CD80, CD86, MHC-I 및 MHC-II을 높게 발현하는 것으로 확인되었다.
이하, 구체적인 실시예를 통해 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 예시에 불과하며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 백강잠 추출물의 제조
실시예 1
분쇄된 백강잠 분말을 다인솝(Cheongju, Korea)으로부터 구입하였다. 상기 백강잠 분말 100 g과 0.16% 아스코르브산 수용액(ascorbic acid in water) 600 mL 혼합하여 이 혼합물을 4℃에서 1시간 보관하였다. 그 후 상기 혼합물을 4℃, 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액을 분리하여 획득하였다. 분리된 상층액을 여과지(filter paper, No.4)로 감압여과한 후 여과액을 동결 건조하여 건조분말을 얻었다.
비교예 1: 열수 (Heat) 추출
실시예 1과 동일하게 백강잠 분말을 획득한 후, 분쇄된 백강잠 분말 20g에 증류수 400 mL을 첨가하여 90℃에서 3시간 열수 추출하였다. 그 후, 3500 rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 분리한 후 여과지(filter paper, No.4)로 감압여과한 후 여과액을 동결 건조하여 건조분말을 얻었다.
비교예 2: 헥산 (Hexane) 추출
실시예 1과 동일하게 백강잠 분말을 획득한 후, 분쇄된 백강잠 분말 20g에 99.5% n-헥산 400 mL을 첨가한 후 24시간 동안 교반하여 지방 성분을 추출하였다. 그 후, 여과지(filter paper, No.1)를 이용하여 감압여과 한 후 회전식증발농축기(rotary evaporator)를 이용하여 n-헥산 용매를 제거한 후 동결 건조하여 건조분말을 얻었다.
2. 백강잠 추출물을 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물에 의한 수지상 세포의 성숙화
상기 실시예 1 및 비교예 1에서 획득한 동결 건조 분말 100mg을 30mL의 PBS에 용해하여 시료를 제조하고, 비교예 2에서 획득한 동결 건조 분말 20mg을 10ml의 DMSO에 용해하여 시료를 제조하였다. 이들을 각각 제조예 1, 비교제조예 1 및 비교제조예 2라 한다.
마우스의 골수유래세포를 이용한 수지상 세포의 성숙화는 GM-CSF/IL-4 (수지상세포 growth factor)를 통하여 수행하였다. 보다 상세하게, C57BL/6 마우스로부터 골수 채취용 주사를 이용해 대퇴부 골수를 채취하였고, 채취한 골수를 세척한 후 적혈구를 염화암모늄을 이용하여 제거하였다. 분리한 세포를 6-웰(well) 플레이트에서 RPMI 1640(10% FBS, 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신, 20 ng/ml GM-CSF, 0.5 ng/ml IL-4)를 첨가하여 8일 동안 배양하였다.
3. 성숙화 유도된 수지상 세포의 면역 활성 평가
(1) 표면발현인자 확인
본 실험에서는 실시예 및 비교예에 의해 추출 분리된 성분들이 수지상 세포의 활성 인자인 표면발현인자들에 미치는 영향을 탐색하였다. 표면발현인자 CD80, CD86, MHC-I 및 MHC-II은 T 세포의 활성 및 분화에 중요한 인자로 알려져 있으며, 이러한 인자들의 높은 발현은 T세포의 활성 및 분화를 촉진 할 수 있다.
이러한 내용을 바탕으로 8일 동안 배양된 수지상 세포에 상기 제조예 1, 비교제조예 1 및 비교제조예 2의 시료를 각각 100 μg/mL의 농도로 24 시간 동안 처리하였다.
상기와 같은 처리 24 시간 후 각 시료가 처리된 수지상 세포들을 항-CD11c-V450, 항-CD80-FITC, 항-CD86-PE, 항-MHC-I-APC, 항-MHC-II-PE-Cy7 항체들을 이용하여 염색한 후 유세포분석기 FACSverse로 분석하였다.
그 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 실시예 1의 추출물이 포함된 제조예 1의 시료로 처리된 군에서 비교제조예 1 및 비교제조예 2의 다른 추출법에 의해 추출된 성분들에 비하여 수지상 세포의 CD80, CD86, MHC-I 및 MHC-II의 발현이 강력하게 유도됨을 확인하였다.
(2) 사이토카인(Cytokine) 측정
수지상 세포의 활성 시 유도되는 염증성 사이토카인 TNF-alpha와 T 세포의 Th1 분극화에 중요한 IL-12p70는 Th1-형 세포의 분화에 중요한 지표인자로 알려져 있다. 따라서 이러한 지표인자들의 증가 패턴 분석은 암, 결핵, 비결핵 항산균 등과 같은 다양한 질환을 제어할 수 있는지의 여부를 예측할 수 있는 중요한 자료가 될 수 있다.
이러한 내용을 바탕으로 8일 동안 배양된 수지상 세포에 상기 제조예 1, 비교제조예 1 및 비교제조예 2의 시료를 각각 100 μg/mL의 농도로 24 시간 동안 처리하였다. 한편, 100 ng/ml의 LPS는 수지상 세포의 성숙에 대한 양성 대조군(positive control)으로 사용하였다.
처리 24 시간 처리 후 배양액에서 TNF-alpha와 IL-12p70을 ELISA를 통하여 분석하였고, 그 결과 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이 본 발명의 실시예 1의 추출물이 포함된 제조예 1의 시료로 처리된 군에서 비교제조예 1 및 비교제조예 2의 다른 추출법에 의해 추출된 성분들에 비하여 TNF-alpha와 IL-12p70이 높게 유도된 것을 확인할 수 있었으며, 비교제조예 1 및/또는 비교제조예 2의 결과가 도시되지 않은 경우는 효능이 발현되지 않았음을 의미한다.
이상에서 본 발명의 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능하다는 것은 당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게는 자명할 것이다.

Claims (10)

  1. 0.01 내지 5 중량%의 항산화 물질을 포함하는 수용액을 추출 용매로 하여 획득된 백강잠(Bombysis Corpus) 추출물을 포함하는, 수지상 세포 성숙화 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 항산화 물질은 아스코르브산(ascorbic acid), EDTA(disodium ethylenediaminetetracetic acid), 디칼슘 EDTA, 토코페롤, BHT(butylated hydroxytoluene), BHA(butylated hydroxyanisole), 인산염 및 시트르산으로이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인, 수지상 세포 성숙화 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 수지상 세포 성숙화 조성물은 전체 조성물 중량을 기준으로 1 내지 5 중량%의 백강잠 추출물의 건조 분말을 포함하는, 수지상 세포 성숙화 조성물.
  5. 0.01 내지 5 중량%의 항산화 물질을 포함하는 수용액에 백강잠을 침지하는 단계; 및
    백강잠이 침지된 수용액으로부터 백강잠 추출물을 획득하는 단계
    를 포함하는, 수지상 세포 성숙화 조성물의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 백강잠을 침지하는 단계 전 혹은 후에 백강잠을 분쇄하는 단계를 추가로 포함하는, 수지상 세포 성숙화 조성물의 제조방법.
  7. 제5항에 있어서, 백강잠 추출물을 여과하여 여과액을 획득하는 단계; 및
    상기 여과액을 건조하는 단계를 추가로 포함하는, 수지상 세포 성숙화 조성물의 제조방법.
  8. 삭제
  9. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 수지상 세포 성숙화 조성물을 포함하는 배지 조성물에서 수지상 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 수지상 세포의 성숙화방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 배양은 6일 내지 10일 동안 수행되는, 수지상 세포의 성숙화방법.
KR1020200005157A 2020-01-15 2020-01-15 백강잠 추출물을 포함하는 수지상 세포 성숙화 조성물 및 이를 이용한 수지상 세포의 성숙화 방법 KR102270000B1 (ko)

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