KR20160055682A

KR20160055682A - 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 지방세포 분화유도 및 지방조직 재생용 조성물

Info

Publication number: KR20160055682A
Application number: KR1020150137635A
Authority: KR
Inventors: 조용우; 최지숙; 양성현; 이경수
Original assignee: 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2014-11-07
Filing date: 2015-09-30
Publication date: 2016-05-18
Also published as: KR101629151B1

Abstract

본 발명은 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화유도 및/또는 지방조직 재생용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 엑소좀은 지방세포로의 분화에 영향을 주는 생체활성인자의 발현율이 우수하고 줄기세포를 지방세포로 분화시키는 효과가 있다. 이에 따라, 본 발명은 줄기세포 분화유도제, 조직재생용 주사제, 미용 목적의 필러, 조직공학용 제제 등으로 적용할 수 있다.

Description

줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 지방세포 분화유도 및 지방조직 재생용 조성물{Composition including stem cell-derived exosome for inducing adipogenic differentiation and adipose tissue regeneration}

본 발명은 지방세포 분화유도물질을 함유하는 줄기세포 유래 엑소좀을 이용한, 줄기세포로부터 지방세포의 분화 유도 및/또는 지방조직 재생용 조성물에 관한 것이다.

지방조직에 대한 재생 치료방법으로 지방조직을 하이드로젤에서 3차원 배양한 후 이를 기질로 하여 배양된 줄기세포와 이 줄기세포에서 분비되는 성장인자 및 세포 외 기질을 포함하는 치료제를 이용하는 것이 있으나, 이를 주입형으로 사용하기 위해서는 배양용기로부터 막 형태의 하이드로젤을 떼어내어 분해효소 처리해야 하는 번거로움이 있었다. 이를 극복하기 위하여, 자가 지방이식 또는 직접적으로 줄기세포를 이식하는 조직재생 치료방법이 개발되었다.

자가 지방이식의 경우, 시술자의 신체 일부를 이용하기 때문에 거부감도 없을뿐더러, 면역반응이 나타나지 않는다. 하지만 지방조직은 산소의존성이 높고, 주위에 많은 혈관을 가지면서 이웃세포와 상호작용을 하는데 이식된 지방은 혈관생성능력이 거의 없으므로 저산소증으로 인해 세포사멸이나 세포괴사가 유발되며, 생착률이 높지 않아 여러 차례 시술을 받아야하는 단점이 있다.

줄기세포는 이전부터 수술이나 약물치료로 한계가 있는 손상된 조직을 복원하는데 많이 이용되고 있으며, 줄기세포 이식을 위해 히알루론산(hyaluronic acid), 콜라겐(collagen)과 같은 생체고분자가 사용된다. 줄기세포가 지방세포를 포함하는 다양한 세포로 분화 가능한 만큼 적용분야가 넓으나, 인체 내로 들어가면 생존율과 생착률이 저조하기 때문에 효율이 떨어지며, 미분화 줄기세포가 종양을 형성할 수 있는 위험성이 존재한다.

현재 조직재생을 위하여 일반적으로 줄기세포를 지방세포로 분화시키는 방법은 인슐린(insulin), 덱사메타손(dexamethasone) 또는 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine) 등의 분화유도물질을 줄기세포에 처리하여 장기간 배양하는 것이다. 그러나, 위와 같은 줄기세포 분화유도물질은 가격이 비싸고 단일 성분만으로는 분화 효과가 없어 여러 가지 물질의 혼합해 처리해야 하는 단점이 있으며 세포 분화 효율이 낮은 문제점이 있다.

한편, 인간을 포함한 다세포 생명체 내에 존재하는 다양한 세포에서 분비되는 생체나노입자는 그 크기와 분비기작의 차이에 따라 엑소좀(exosome)과 마이크로 베지클(microvesicle)로 구분할 수 있다. 엑소좀은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하고 이를 줄기세포의 분화 및 지방 조직 재생에 응용하기 위한 연구를 계속하여 본 발명을 완성하였다.

한국 등록특허 제1347190호

본 발명의 목적은 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 다른 목적은 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물을 포함하는 화장료 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 배지 조성물을 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물 및 하이드로젤을 포함하는 주사제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명의 일 구체예는 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물을 제공한다.

상기 "지방세포로 분화되는 줄기세포"란, 도 1과 같이 줄기세포가 지방조직 기원의 줄기세포(adipose tissue-derived stem cells, ASCs)로부터 지방세포로 분화하는 중에 있는 줄기세포를 의미한다. 이로부터 지방세포의 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 추출할 수 있다.

구체적으로, 줄기세포가 지방세포로 분화할 때 모양이 확연히 바뀌는데, 이때 엑소좀을 추출하는 것이다. 따라서 일반 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 것과 다르다고 볼 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "엑소좀"이란 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 엑소좀은 당업계에 알려진 엑소좀 추출 방법을 이용하여 제조할 수 있고, 예를 들어

1) 줄기세포를 배양 배지에 배양한 다음 무혈청 및 무항생제 배지에서 계대배양하는 단계;

2) 세포 배양 상층액을 회수하는 단계;

3) 회수한 세포 배양 상층액을 원심분리하는 단계; 및

4) 엑소좀을 분리 및 정제하는 단계에 의하여 제조될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 엑소좀은 20 내지 110 μg/mL의 농도로 줄기세포에 처리될 수 있으며, 구체적으로, 30 내지 100 μg/mL의 농도로 줄기세포에 처리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 지방세포로 분화되는 줄기세포는 지방세포로 분화 가능한 줄기세포로, 보다 구체적으로는 골수 줄기세포, 제대혈 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포일 수 있으며, 인체 유래 또는 동물이나 식물 유래 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용된 용어, "지방세포 분화 유도"란 줄기세포(stem cell)가 지방세포로 분화(differentiation)되도록 유도하는 것을 의미한다.

본 발명의 일 구체예에 따른 지방세포로부터 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물은 줄기세포를 지방세포로 분화시킨다. 따라서 상기 조성물은 지방세포 분화유도용 조성물로 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "지방조직 재생"이란 손상된 지방조직을 복원하거나 또는 부족한 지방조직의 생성을 유도하여 지방조직을 재생(regeneration)하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명의 일 구체예에 따른 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 함유하는 조성물은 지방조직을 재생할 수 있다. 따라서 상기 조성물은 지방조직 재생용 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 따른 상기 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물은 약학적 조성물로 사용될 수 있다. 구체적으로 상기 약학적 조성물은 전체 조성물 100 중량부에 대해 0.001 내지 10 중량부를 포함할 수 있다.

상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다.

상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴등이 사용될 수 있다.

상기 구체예에 따른 약학적 조성물의 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.

상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎, 1~100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 구체예에 따른 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으나 바람직하게는 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 약학적 조성물은 줄기세포를 지방세포로 분화시키기 위하여 인슐린(insulin), 덱사메타손(dexamethasone), 디하이드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), 히스타민(histamine) 및 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine) 등의 분화유도물질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

다른 측면에서, 본 발명의 또 다른 구체예는 상기 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 화장료 조성물은 지방세포 분화를 유도하여 지방조직 재생을 촉진할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 전체 조성물 100 중량부에 대해 0.0001 내지 10 중량부를 포함할 수 있다.

상기 구체예에 따른 화장료 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.

상기 구체예에 따른 화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로 제공될 수 있으며 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

상기 구체예에 따른 화장료 조성물은 마이크로 니들 등을 이용하여 피부 내부로 흡수되는 형태로 적용되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 화장료 조성물은, 줄기세포를 지방세포로 분화시키기 위하여 인슐린(insulin), 덱사메타손(dexamethasone), 디하이드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), 히스타민(histamine) 및 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine) 등의 분화유도물질을 추가로 포함할 수 있으나, 반드시 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에 따른 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하며 줄기세포를 지방세포로 분화하도록 유도하는 줄기세포 분화용 배지 조성물을 제공한다.

상기 엑소좀은 20 내지 110 μg/mL의 농도로 상기 배지 조성물에 포함될 수 있으며, 구체적으로, 30 내지 100 μg/mL의 농도로 상기 배지 조성물에 포함될 수 있으나 반드시 이로 한정되는 것은 아니다.

상기 줄기세포 분화용 배지 조성물은 줄기세포 배양 배지를 추가로 포함할 수 있으나, 반드시 이로 한정되지 않는다.

상기 줄기세포 분화용 배지 조성물은 줄기세포를 지방세포로 분화시키기 위하여 인슐린(insulin), 덱사메타손(dexamethasone), 디하이드로에피안드로스테론(dehydroepiandrosterone, DHEA), 히스타민(histamine) 및 아이소부틸메틸젠틴(isobutylmethylxanthine) 등의 분화유도물질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예는 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물; 및 하이드로젤;을 포함하는 주사제를 제공한다.

상기 하이드로젤은 젤라틴, 알지네이트, 키토산, 피브린, 엘라스틴, 히알루론산, 콜라겐, 메틸셀룰로오즈와 같은 하나 이상의 하이드로젤일 수 있으며, 콜라겐 및 메틸셀룰로오즈 하이드로젤인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 주사제는 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 주사제일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 즉, 본 발명의 주사제를 동물에 주사하는 방법으로 투여하는 경우, 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생 효과가 나타날 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 하이드로젤은 콜라겐 용액에 메틸셀룰로오즈 분말을 첨가하여 제조하였다. 구체적으로, 0.02 N 아세트산(acetic acid)에 3 mg/mL의 농도로 용해된 콜라겐 용액에, 메틸셀룰로오즈의 최종농도가 6중량%가 되도록 메틸셀룰로오즈 분말을 첨가한 후, 4 ℃에서 1시간 동안 교반하여 콜라겐 및 메틸셀룰로오즈 하이드로젤을 제조하였다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 주사제는 콜라겐 및 메틸셀룰로오즈 하이드로젤(콜라겐/메틸셀룰로오즈 하이드로젤)에 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 담지하여 제조하였다. 구체적으로, 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 최종농도가 50 μg/mL이 되도록 하이드로젤에 담지한 후, 피펫팅을 통해 하이드로젤 안에 분산시켰다.

상기 구체예에 따른 주사제는 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀에 비하여 본 발명에 따른 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 지방세포로의 분화에 영향을 주는 생체활성인자의 발현율이 우수하였다(도 4 및 5).

또한, 줄기세포를 지방세포로 분화시키는 실험에서 본 발명에 따른 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 및 이의 대조군으로써 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 첨가 시, 본 발명에 따른 엑소좀 처리 시에는 7일째에 분화배지에서 배양된 줄기세포와 유사한 수준으로 지방세포가 분화되고 이에 따라 오일이 생성된 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 처리한 줄기세포의 경우 지방세포로 분화되지 않고 증식만 이루어지는 것을 확인하였다(도 6 및 7).

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 콜라겐/메틸셀룰로오즈 하이드로젤에 담지한 주사제는 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 담지한 주사제보다 지방조직 재생 효과가 우수하였다(도 9 및 10).

본 발명의 일 구체예에 따른 줄기세포 분화 및 지방조직 재생용 조성물은 지방세포의 분화와 관련된 지방세포의 유전정보, 단백질, 성장인자를 함유하고 있는 엑소좀을 포함한다. 이로 인하여, 분화를 위한 복잡하고 다양한 성장인자를 추가하지 않아도 되므로 줄기세포 분화에 효과적으로 응용이 가능하다. 본 발명의 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀에 의해 줄기세포가 지방세포로 분화되어 생체 내에 적용 시 지방조직의 재생에 유리한 효과가 발휘된다. 본 발명의 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀은 세포 유래 물질로써 생체적합하여 기존 세포치료제의 부작용을 최소화할 수 있고, 엑소좀 자체가 캐리어 역할을 할 수 있어 이에 담지한 성분을 인체에 쉽게 적용할 수 있으므로, 줄기세포 분화유도제, 조직재생용 주사제, 미용 목적의 필러, 조직공학용 제제 등으로 적용할 수 있다.

본 발명의 구체예에 따른 엑소좀은 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀에 비하여 지방세포로의 분화에 영향을 주는 생체활성인자의 발현율이 우수하고 줄기세포를 지방세포로 분화되는 효과가 있다. 이에 따라, 본 발명은 줄기세포 분화유도제, 조직재생용 주사제, 미용 목적의 필러, 조직공학용 제제 등으로 적용할 수 있다.

도 1은 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀과 이의 응용에 대한 모식도이다.
도 2는 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하는 방법에 대한 모식도이다.
도 3은 추출된 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 엑소좀의 특성에 대한 도이다; A: 엑소좀의 구조 및 모양(투과전자현미경, transmission electron microscope), B: 엑소좀의 크기(나노입자분석기, dynamic light scattering), C: 엑소좀 막 표면 마커(western blot).
도 4는 마이크로어레이를 통한 엑소좀 내 지방 관련 생체활성인자를 나타낸 도이다; A: 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(hASC-EXO), B: 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO), C: 아디포카인 어레이 맵(Adipokine array map).
도 5는 지방세포로의 분화에 영향을 미치는 인자의 발현율을 나타낸 도이다; 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(hASC-EXO), 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO).
도 6은 인간 지방 유래 줄기세포를 지방세포로 분화유도한 결과이다; A: 인간 지방 유래 줄기세포(hASCs), B: 양성대조군(DM), 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO), 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(hASC-EXO).
도 7은 지방세포로 분화유도된 줄기세포를 오일-레드 오 염색(Oil red O staining)한 결과이다; A: 인간 지방 유래 줄기세포(hASCs), B: 양성대조군(DM), 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO), 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(hASC-EXO).
도 8은 콜라겐과 메틸셀룰로오즈를 혼합한 하이드로젤에 엑소좀을 담지하고 누드마우스의 피하에 주입하여 3주 동안 지방조직 생성을 유도한 결과이다; A: 콜라겐/메틸셀룰로오즈 하이드로젤(Gel), B: 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(hASC-EXO)를 담지한 하이드로젤, C: 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO)를 담지한 하이드로젤.
도 9는 누드마우스의 피하에 주입한 젤과 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(hASC-EXO)과 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO)이 담지된 젤을 헤마톡실린-에오신 염색(Hematoxylin-eosin staining)한 결과이다; A, C, E: 40 배율; B, D, F: 100 배율.
도 10은 누드마우스의 피하에 주입한 젤과 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(hASC-EXO)과 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO)이 담지된 젤을 오일-레드 오 염색(Oil red O staining)한 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 이 기술분야의 통상의 기술자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.

<실시예 1> 엑소좀(exosome) 추출

지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 엑소좀을 추출하기 위하여, 줄기세포를 분화배지에서 배양함으로써 지방세포로 분화를 유도하였다. 지방세포로 분화가 이루어지는 것은 줄기세포가 점차 비대해지면서 세포질에 지방 방울(Lipid droplet)이 생기는 것으로 확인하였다. 분화되고 있는 줄기세포를 무혈청 배지로 교체하고 48 시간 동안 유지한 후, 세포 배양 상층액을 회수하였다. 회수한 세포 배양 상층액을 300 xg에서 10분간 원심분리하여 세포를 제거하고 2,000 xg에서 30분간 원심분리하여 세포 분비물을 제거하였다. 이후, 분자량 3,000의 필터가 장착된 원심분리 튜브(molecular weight cut off=3,000, amicon tube)를 이용하여 5,000 xg에서 60분간 원심분리를 하여 농축하였다. 농축 후 수득한 상층액은 엑소좀 분리 시약(exosome isolation reagent)과 1:0.5 비율로 혼합하고 4 ℃에서 하루 동안 보관하였다. 그 후, 10,000 xg에서 60분간 원심분리를 통해 엑소좀 침전물을 얻은 후, 분자량 3,000 필터(Exosome spin column)를 통해 여과하였고 인산완충식염수(Phosphate-buffered saline, PBS)로 세척하였다. 세척한 엑소좀 침전물은 10,000 xg에서 60분간 원심분리한 후 인산완충식염수에 재현탁하였다(도 2).

<실시예 2> 엑소좀의 현미경 분석

실시예 1로부터 추출한 엑소좀을 투과전자현미경(transmission electron microscope)과 나노입자분석기(dynamic light scattering)를 사용하여 크기 및 모양을 확인하고, 특정 단백질을 검출하는 웨스턴 블롯 (western blot)을 이용하여 엑소좀의 표면 단백질을 확인하였다.

그 결과, 도 3A과 같이 추출된 엑소좀을 투과전자현미경으로 확인할 수 있었으며, 크기는 도 3B로부터 평균적으로 약 50.75-58.77 nm인 것을 확인하였다. 또한, 도 3C와 같이 엑소좀 막 표면에서 발현되는 엑소좀 특이적 마커를 항체반응을 통해 확인하였다.

<실시예 3> 엑소좀 내 단백질 및 지방세포 분화 관련 생체활성인자 분석

지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 및 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 내에 존재하는 지방 관련 생체활성인자를 분석하기 위하여, 마이크로어레이(microarray)를 이용하였다. 마이크로어레이는 항원-항체반응을 통해 이루어지며, 레이저 스캐너(GenePix 4000B)를 통해 형광(Streptavidin-Cy3)발현정도를 측정하였다.

또한, 마이크로어레이 분석에서 발현된 인자 중에서 지방세포로의 분화에 영향을 주는 생체활성인자인 대식세포콜로니자극인자(macrophage colony stimulating factor, MCSF), 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 렙틴(leptin), 인슐린(insulin), 안지오포이에틴1(angiopoietin1, ANGPT1), 지방세포 보체 관련 단백질30(adipocyte complement-related protein of 30 kDa, Acrp30)을 확인하였고, 이에 대하여 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 및 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀의 상대적인 발현량을 비교하였다.

그 결과, 도 4 및 하기 표 1과 같이 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(hASC-EXO) 및 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO) 내에 존재하는 지방 관련 생체활성인자의 종류에 차이가 존재하는 것을 확인하였으며, 지방세포로의 분화에 영향을 주는 생체활성인자의 발현율에 현저한 차이가 있음을 확인하였다(도 5).

<실시예 4> 엑소좀을 이용한 지방세포 분화유도

엑소좀을 이용하여 줄기세포의 지방세포 분화를 유도하기 위하여, 증식하는 줄기세포 배양 배지로부터 추출된 엑소좀 및 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 각각을 포함하는 배지 조성물을 이용하였다. 상기 배지 조성물은 엑소좀 30, 50, 100 μg/mL 농도를 줄기세포 배양 배지에 추가하여 사용하였다. 상기 배지 조성물을 각각 배양된 인간 지방 유래 줄기세포(hASCs)에 처리한 후, 상기 배지 조성물을 3일에 한 번씩 14일간 교체하였다. 양성대조군은 5% 소태아혈청(fetal bovine serum), 1 μM 덱사메타손(dexamethasone), 1 μg/mL 인슐린(insulin), 100μM 인도메타신(indomethacin), 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴(3-isobutyl-1-methylxanthine)이 포함된 DMEM 고농도 글루코오스(Dulbecco's Modified Eagle's Medium high glucose) 배지에서 배양된 줄기세포를 사용하였다. 양성대조군은 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 처리한 줄기세포를 사용하였다. 이후, 14일 동안, 지방세포로의 분화가 유도된 줄기세포에 대하여 현미경과 오일-레드 오 염색(Oil-red O staining)을 이용하여 세포 모양 및 분화 여부를 분석하였다.

그 결과, 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO)을 처리 시 7일째에 인간 지방 유래 줄기세포와 유사한 수준으로 지방세포가 분화되고(도 6) 이에 따라 오일이 생성된 것을 확인할 수 있었다(도 7). 그러나, 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(hASC-EXO)을 처리한 줄기세포의 경우 지방세포로 분화되지 않고 증식만 이루어지는 것을 확인하였다.

< 실시예 5> 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 포함하는 화장료 조성물

상기 실시예 1에 따라 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 포접된 리포좀을 제조하였다. 구체적으로, 상온(15℃)에서 레시틴 3중량%를 상기 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 0.01 중량%가 포함된 수상에 분산시킨 뒤 초임계 이산화탄소를 이용하여 역마이셀(reverse micelle) 에멀젼(수상/저온공정 이산화탄소)을 형성시켰다. 그 다음 상기 반응을 중지하고 초임계 이산화탄소를 감압 기화시켜 초임계 이산화탄소 상을 제거하고 상기 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀이 포접된 저온공정 리포좀 현탁액을 얻었다. 이때 반응 공정의 온도는 4℃이하로 진행하였다.

상기 엑소좀이 포접된 리포좀을 이용하여 하기 표 2에 기재된 조성으로 화장료 조성물을 제조하였다.

배합성분	함량 (중량%)
스테아린산	2
세틸알코올	2
라놀린 알코올	2
액상파라핀	7
사이클로메치콘	5
폴리옥시에틸렌 모노올레익산 에스테르	2
헥산디올	2
글리세린	3
트리에틸아민	5
카보머	0.2
본 발명의 실시예에 따른 엑소좀이 포접된 리포좀	5
정제수	to 100

< 실시예 6> 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 이용한 지방조직 재생 유도

지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 생체 내에 주입 시 지방조직 재생 효과를 확인하기 위하여, 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 및 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 각각 콜라겐/메틸셀룰로오즈 하이드로젤에 담지하였다.

구체적으로, 상기 하이드로젤은 콜라겐 용액에 메틸셀룰로오즈 분말을 첨가하여 콜라겐/메틸셀룰로오즈 하이드로젤을 제조하였다. 즉, 0.02 N 아세트산(acetic acid)에 3 mg/mL의 농도로 용해된 콜라겐 용액에, 메틸셀룰로오즈의 최종농도가 6중량%가 되도록 메틸셀룰로오즈 분말을 첨가한 후, 4 ℃에서 1시간 동안 교반하여 제조하였다. 이렇게 제조한 콜라겐/메틸셀룰로오즈 하이드로젤에 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 또는 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 담지하였다. 구체적으로, 상기 엑소좀을 콜라겐/메틸셀룰로오즈 하이드로젤에 최종농도가 50 μg/mL이 되도록 담지한 후, 피펫팅을 통해 하이드로젤 안에 분산시켰다. 그리고 엑소좀이 담지된 하이드로젤을 누드 마우스의 피하에 주입한 후, 3주동안 관찰하였다. 음성대조군은 엑소좀이 포함되지 않은 하이드로젤(Gel)을 사용하였고, 양성대조군은 증식하는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(hASC-EXO)을 포함하는 하이드로젤을 사용하였다(도 8). 3주 후, 이식된 하이드로젤 내부에 지방조직 재생 여부를 확인하기 위하여 헤마톡실린-에오신 염색(Hematoxylin-eosin staining)과 오일 레드 오 염색(Oil red O staining)을 실시하였다.

그 결과, 음성 및 양성대조군에 비해 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀(D-EXO)이 포함된 젤 안에는 많은 양의 마우스 세포가 유입되어 있었고(도 9), 오일이 생성된 지방 세포들이 많이 관찰되었다(도 10). 이러한 결과로부터 지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀 또는 상기 엑소좀을 담지하고 있는 콜라겐/메틸셀룰로오즈 하이드로젤은 지방조직 재생 유도 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.

Claims

지방세포로 분화되는 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 엑소좀은 20 내지 110 μg/mL의 농도로 줄기세포에 처리되는 것인 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 지방세포로 분화되는 줄기세포는 지방세포로 분화 가능한 줄기세포인 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 지방세포로 분화 가능한 줄기세포는 골수 줄기세포, 제대혈 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포인 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 골수 줄기세포, 제대혈 줄기세포 또는 지방 유래 줄기세포는 인체, 동물 또는 식물 유래 줄기세포인 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물을 포함하는 화장료 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물을 포함하는 지방세포 분화 유도용 배지 조성물.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 따른 지방세포 분화 유도 또는 지방조직 재생용 조성물; 및 하이드로젤;을 포함하는 주사제.
제 8항에 있어서, 상기 하이드로젤은 젤라틴, 알지네이트, 키토산, 피브린, 엘라스틴, 히알루론산, 콜라겐 및 메틸셀룰로오즈로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 주사제.