CN106659741A - 小尺寸干细胞的毛发生长促进功能及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防脱发和促进毛发生长的组合物、其制造方法及其用途，所述组合物含有小尺寸干细胞(特别是直径为8μm以下的小的干细胞)或其培养基作为活性成分；并且所述组合物的用途为通过直径为8μm以下的小尺寸干细胞保持毛发生长促进功能的用途，所述毛发生长促进功能显著地增高了休止期的毛囊干细胞的活化。

Description

小尺寸干细胞的毛发生长促进功能及其用途
技术领域
本发明涉及用于预防脱发和刺激毛发生长的组合物、其制造方法及其用途，所述组合物含有小尺寸干细胞(特别是直径为8μm以下的小尺寸干细胞)或其条件培养基作为活性成分。本发明涉及该组合物的用途，所述组合物利用直径为8μm以下的小尺寸干细胞的毛发生长刺激功能来显著增加处于休止期的毛囊干细胞的活性。
背景技术
随着工业发展、环境污染、压力、老龄化的进行，秃头症(Alopecia)或头发稀疏已逐渐显现，并且在福利时代，对生活质量和外观的关注日益增加。
秃头症(头发从头皮脱落)由于各种原因而发生，例如内在诱因(如遗传组成和雄性激素的作用)；日常生活中的精神压力；以及外部诱因(如头皮中的脂质过氧化物的积累)。已知脱发症状由非常复杂的过程引起。
光秃并不意味着通过掉落而缺少毛发，而是毛发逐渐稀疏，而且变成更细和更软的毛发，并且随着光秃的发展，毛发根部中的真皮乳头更小。随着真皮乳头更小，毛发更加稀疏，毛发周期更短，而且新生长的毛发进一步变得更稀疏。当光秃不断发展时，毛发更软，毛发周期进一步更短，且毛发生长一点而随后掉落。另外，还关注了已知由自身免疫性疾病所引起的斑秃，以及在躯体或精神的压力(例如内分泌疾病)、营养缺乏、药物或分娩后而发生的暂时性脱发。
最近，脱发(包括男性型脱发和女性的肥胖性脱发)正在年轻一代中逐渐增多。根据由韩国国民健康保险公司的健康福利政策研究所在2009年发布的消息，2008年的国内脱发患者的数量与2001年相比增加了60％以上，并且儿童和青少年脱发患者的数量从2006年的21,643例增加至2011年的23,025例，5年增加了约6.4％。
为了改善这种脱发，多种类型的毛发生长液是在商业上可得的。目前，根据Economy 21的研究，韩国的毛发护理服务市场规模的80％为化妆品和卫生用品，20％为药物，其中，去医院的脱发患者的数量仅为5％。目前，护发产品的使用者中的不满意者为72.7％。然而，仅有通过美国食品与药品监督管理局(FDA)批准的两种药物，例如在1998年(约15年前)公布的米诺地尔(minoxidil)和非那司提(finasteride)，因此，仅用这两种药物不能完全治愈各种原因的秃头症。特别地，由制成的是防脱发制剂，而不是毛发生长液。阻断5-α还原酶以抑制DHT的产生，并尽可能长地延缓男性型脱发。
由于市场上的毛发生长液(例如和)具有由激素药物的应用所引起的副作用，并仅对其中发根被激活的部分有效，它们在预防脱发中有效，但对处于长期休止期的毛发的生长没有显著效果，而且必须连续给予或施用。因此，有必要开发用于秃头症或头发稀疏的经济且稳定的技术。在韩国，相比发达国家，用于秃头症的药物的研发在技术上不足，涉及预防脱发、刺激毛发生长和毛发再生的研发是非常迫切的问题。然而，关于涉及脱发的研究，自1950年以来已经报道了涉及发根和毛发再生的文献，但由于缺乏再现性，在过去的50年中毛发再生被认为是不可能的。
然而，宾夕法尼亚大学医学院的Costarelis教授在1990年首次发现了毛囊干细胞(Cell，1990)，首次分离了人来源的毛囊干细胞(J.Clin.Invest，2006)，并报道了再生毛囊(其过去是不可能实现的)的可能性的结果(Nature，2007)，因此开辟了研究秃发的根本性治愈的可能性。
最近，正在开发使用基因治疗秃头症的方法以及使用干细胞治疗秃头症的方法。作为本发明的背景技术，在韩国专利号10-0771171(2007年10月29日)中公开了分离和增殖毛囊干细胞并将干细胞分化成毛囊细胞的方法以及用于治疗脱发的组合物，在韩国专利公开号10-2008-0097593(2008年11月06日)中公开了通过将脂肪来源的干细胞和毛囊细胞适当地混合而制造的细胞治疗产物。另外，在韩国专利号10-1218101(2013年1月3日)中公开了用于刺激毛发生长或预防脱发的组合物，该组合物含有羊水中的胎儿间充质干细胞的条件培养基作为活性成分。
然而，鉴于小尺寸干细胞的特定功效，尚未报道展示出色作用的用于刺激毛发生长或预防脱发的组合物。
因此，在培养间充质干细胞时，本发明人确认通常收集的各种尺寸的细胞，并基于取决于细胞尺寸的作用的可能性，根据来源于各种组织的间充质干细胞的尺寸，通过比较由毛囊干细胞的激活所引起的刺激毛发生长的能力，发现了具有特定尺寸的直径或更小直径的干细胞展示出非常出色的刺激毛发生长的作用，从而完成了本发明。
现有技术文献
专利文献
1.韩国专利号10-0771171(2007年10月29日)
2.韩国专利号10-1422559(2014年7月17日)
3.韩国专利申请公开号10-2013-0009117(2013年1月23日)
4.韩国专利申请公开号10-2014-0125735(2014年10月29日)
5.韩国专利申请公开号10-2008-0097593(2008年11月6日)
6.韩国专利号10-1218101(2013年1月3日)
非专利文献
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在整个申请文件中，参考了许多论文和专利，并且陈述了其引用。将所引用的论文和专利文献中公开的内容以其整体通过引用的方式并入本文，从而对本发明所属的技术领域的水平和本发明的内容进行更清楚地解释。
发明内容
技术问题
本发明使用具有非常出色的毛发生长刺激功能的一定尺寸的干细胞(刺激毛囊干细胞的活性)，并旨在提供用于预防脱发和刺激毛发生长的组合物，所述组合物含有直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基作为活性成分。
本发明还旨在提供使用所述组合物来预防脱发和刺激毛发生长的方法。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供了具有刺激毛发生长功能的小尺寸直径的干细胞及其各种用途。
作为本发明的示例性实施方式，提供了用于预防脱发和刺激毛发生长的组合物，所述组合物含有直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基作为活性成分。
由于直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基具有激活毛囊干细胞的功能，因此获得了预防脱发和刺激毛发生长的作用，更特别地，具有以下作用：(i)减少用于将毛发周期中的休止期转变至生长期的时间；(ii)使毛发周期调节正常化；以及(iii)增加真皮乳头细胞的产生。
在本文中，直径为8μm以下的小尺寸干细胞可以是选自于由以下所组成的组中的至少一种类型的干细胞：骨髓来源的人成体干细胞、脐带血来源的人成体干细胞、脂肪来源的人成体干细胞、血液来源的人成体干细胞、肝脏和肠来源的人成体干细胞、皮肤来源的人成体干细胞、胃肠道来源的人成体干细胞、胎盘来源的人成体干细胞、神经来源的人成体干细胞、肾上腺来源的人成体干细胞、上皮来源的人成体干细胞和子宫来源的人成体干细胞以及胚胎干细胞；优选骨髓来源的成体干细胞、脐带血来源的成体干细胞或脂肪来源的成体干细胞；更优选脐带血来源的成体干细胞；最优选脐带血来源的间充质干细胞。此外，最优选使用人来源的脐带血。
另外，条件培养基可以是作为基础培养基适用于动物细胞生长的任何培养基，作为非限制性实例可以使用MEM(最低必需培养基)、DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute培养基)或K-SFM(角质形成细胞-无血清培养基)。优选地，使用α-MEM培养基。
可通过以药物组合物或化妆品组合物的形式制备来提供所述组合物。
同时，在本发明的另一示例性实施方式中，提供了使用用于预防脱发和刺激毛发生长的组合物的方法，所述组合物含有直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基作为活性成分。
在本发明的另一示例性实施方式中，还提供了使用直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基作为活性成分来治疗脱发的方法。
在上述方法中，最优选使用注射通过经皮给予来给予干细胞或其组合物。在本文中，通过将注射器针眼朝上放置将组合物给予到靶标的真皮中的方式，有效地进行注射。
因此，本发明是基于以下发现完成的：与其中混合了各种尺寸的干细胞的常规的异种细胞(heterogeneous cell)相比，直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基对于预防脱发和刺激毛发生长的作用而言具有最出色的能力；并且本发明提供了直径为8μm以下的小尺寸干细胞根据毛囊干细胞的激活来预防脱发并刺激毛发生长的出色作用及其各种用途。
将本文所使用的术语进行如下定义。
“刺激毛发生长”或“预防脱发”具有相似的含义，并且包括本领域中使用的另外的术语，例如刺激生发或毛发生长以及预防毛发劣化或脱发。
“干细胞”意为可以发育成任何组织的细胞。存在两个基础特征：通过重复分裂产生自我的自我更新；以及根据环境而分化成具有特定功能的细胞的多潜能性。
“间充质干细胞”是分离自人或哺乳动物组织且可来源于各种组织的一类未分化的成体干细胞。在成体干细胞中，造血干细胞通常是非粘附的，但是间充质干细胞通常是粘附的。特别地，间充质干细胞可以是脐带来源的间充质干细胞、脐带血来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞、脂肪来源的间充质干细胞、肌肉来源的间充质干细胞、神经来源的间充质干细胞、皮肤来源的间充质干细胞、羊膜来源的间充质干细胞或胎盘来源的间充质干细胞，并且优选脐带血来源的间充质干细胞。从各组织中分离干细胞的技术是本领域已知的。
“干细胞的条件培养基”是包含通过培养干细胞获得的培养基中含有的成分的物质，并且可不受限制地将任何类型的干细胞用于制备条件培养基。例如，用于制备条件培养基的干细胞可以是胚胎干细胞或成体干细胞。此外，成体干细胞可以来源于每种组织。在本发明的示例性实施方式中，使用脐带血来源的成体干细胞来制备条件培养基。
“分化”意为细胞的结构或功能在分裂、增殖和生长时特化的现象，即为了执行本职工作，生物体的组织或细胞的形态或功能方面的变化。通常，其是将相对简单的系统分化为至少两个的不同性质的部分系统的现象。
术语细胞的“增殖”或“生长”是指同种细胞通过分裂进行的扩增，即通常在多细胞生物体中的细胞数量的增加。当细胞的数量通过增殖(扩增)达到一定水平时，特征通常变化(分化)并同时受到控制。
“培养基”意为用于使细胞在生物体外生长和增殖的混合物，包含细胞的生长和增殖中所使用的必要因素，例如糖、氨基酸、各种类型的营养物、血清、生长因子和矿物质。特别地，本发明的培养基是用于干细胞的生长和增殖的培养基。
“基础培养基”是含有细胞存活所需的必要的糖、氨基酸、水等的混合物，而且所述混合物不包含营养物质和各种类型生长因子。本发明的基础培养基可以使用人工合成的培养基或商业上制备的培养基。商业上制备的培养基可以是但不限于例如DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)、EDM(内皮细胞分化培养基)、MEM(最低必需培养基)、BME(基础培养基Eagle)、RPMI 1640、F-10、F-12、α-MEM(α-最低必需培养基)、G-MEM(Glasgow最低必需培养基)或Iscove改良的Dulbecco培养基。
“治疗”意为获得有益或示例性的临床结果的方法。对于本发明的目的，有益或示例性的结果非限制性地包括可检测或不可检测的症状的缓解、疾病范围的缩小、疾病状态的稳定(即不恶化)、疾病进展的延缓或疾病进展速度的降低、疾病状态(部分或全部地)的改善或暂时缓解和减弱。“治疗”表示所有的治疗性处理和预防性或防治性方法。治疗包括可预防伤残和已经发生的伤残所需的治疗。疾病的“缓解(palliation/palliating)”意为非示例性临床症状和/或疾病状态范围减低和/或疾病的进展时程延缓或延长。
“有效量”是影响有益或示例性的临床结果或生化结果的合适的量。有效量可以一次给予或多次给予。有效量是暂时缓解、改善、稳定、恢复或延缓疾病进展的合适的量。在本发明中，有效量是适于减慢或延缓脱发进展或者刺激毛发生长的量。如果给定的动物耐受组合物的给予，或者该组合物适合给予动物，则意味着该组合物是“药学上或生理学上可用的”。当待给予的组合物的量在生理学上重要时，可以说制剂以“治疗学上有效量”给予。当制剂的存在在给定的患者中引起生理学上可检测的变化时，该制剂是生理上有意义的。
术语“约”表示参比的量、水平、值、数量、频次、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度变化30％、25％、20％、25％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
在整个申请文件中，除非上下文另有需要，应当理解的是，“包括/包含/含有(include和/或including以及comprise和/或comprising)”明确说明步骤或元素或者步骤或元素的组的存在，但不排除一个或多个其它步骤或元素或者其它步骤或元素的组的存在或添加。
在下文中，将对本发明进行详细描述。
干细胞
本发明涉及具有小尺寸直径的干细胞预防脱发和刺激毛发生长的用途。
干细胞是具有自我更新能力以及分化成至少两种细胞的能力的细胞。根据来源，可以使用胚胎干细胞或成体干细胞，且在本发明中，优选可以使用来源于各种组织(来自各种来源)的成体干细胞，例如来源于诸如脂肪、子宫、骨髓、肌肉、胎盘、脐带血或表皮的组织的干细胞。更特别地，干细胞是间充质干细胞(MSC)。间充质干细胞通常是有助于造血作用的基质，并且具有分化成各种中胚层细胞(包括骨骼细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌肉细胞)的能力，并且容易增殖且同时保持未分化的状态。在本发明的一个示例性实施方式中，使用脂肪来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞和脐带血来源的间充质干细胞(MSC)。
最优选地，使用脐带血来源的间充质干细胞。
脐带血是出生后产生自脐带的血液，含有大量的形成白细胞、红细胞和血小板的造血干细胞以及内皮祖细胞，而且还含有形成软骨、骨骼、肌肉、神经的间充质干细胞，因此，其在医学领域具有极高的价值。相比于骨髓或外周血液中的造血干细胞，脐带血具有更高浓度的造血干细胞而且成熟度更低。因此，相比于骨髓中发现的造血干细胞，脐带血中的造血干细胞展现出更出色的增殖能力、自我更新能力和分化能力。另外，脐带血可以通过简单的医疗程序从丢弃的脐带中获得，并且由于脐带含有比起给定的量更多的造血干细胞和干细胞，因此在本发明的一个方面，使用分离自人脐带血的间充质干细胞(hUCB-MSC)。
特别地，脐带血来源的间充质干细胞：(i)当用于细胞治疗产品时，与其它组织来源的干细胞不同，其可大部分避免免疫排斥；(ii)其可获取自通常丢弃的胎盘和脐带，并因而当产生干细胞时，供体不会有任何病痛；以及(iii)当施用时，可以直接给予至病变。在本文中，当将该干细胞实际移植至相应病变时，旁分泌效应被激活，并分泌能够治疗、复原或恢复病变的分泌因子(蛋白质、细胞因子)，从而治愈病变。
同时，可以通过本领域已知的方法来增殖和培养本发明所述的干细胞。
合适的培养基可以是开发用于培养动物细胞(特别是哺乳动物细胞)的任何培养基，或者是可在体外制备的具有动物细胞生长所需的合适组分(例如可吸收的碳、氮和/或痕量营养物)的任何培养基。
培养基可以是适合于动物细胞生长的任何基础培养基，并且作为非限制性实例，通常可使用以下作为用于培养细胞的基础培养基：MEM(最低必需培养基)、DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)、RPMI(Roswell Park Memorial Institute培养基)或K-SFM(角质形成细胞-无血清培养基)。除此之外，可以不受限地使用本领域中使用的任何培养基。优选地，培养基可以选自于由如下所组成的组：α-MEM培养基(GIBCO)、K-SFM培养基、DMEM培养基(Welgene)、MCDB 131培养基(Welgene)、IMEM培养基(GIBCO)、DMEM/F12培养基、PCM培养基、M199/F12(混合物)(GIBCO)和MSC扩增培养基(MSC expansion medium；Chemicon)。
可以向此类基础培养基中加入痕量营养物、氮和碳的可吸收源，并且作为非限制性实例，可以加入血清源、生长因子、氨基酸、抗生素、维生素、还原酶和/或糖源。然而，显而易见的是，本领域普通技术人员可以选择或组合用于各种组织来源的干细胞的最合适的培养基，而且可对干细胞进行适当地培养。在一个示例性的实施方式中，使用α-MEM培养基和K-SFM培养基。
同样显而易见的是，本领域普通技术人员可以基于本领域的常识通过调节例如合适的培养环境、时间和温度的条件对干细胞进行培养。
在一个示例性的实施方式中，将间充质干细胞在α-MEM培养基中培养并增殖至细胞融合为约80％-90％、优选约90％，使用例如PBS漂洗，然后进一步在K-SFM培养基中培养约20小时至25小时、优选24小时。
术语“融合(％)”在本领域中常规地用于表示每面积的细胞浓度(饱和度)，而且是本领域普通技术人员在实验中常用的单位，以相对地表示细胞培养中的每单位面积的细胞数量(细胞密度)。本发明还包括制备直径为8μm以下的小尺寸干细胞及其条件培养基的方法。
同时，该方法可以进一步包括用胰蛋白酶对在根据本发明的培养基中培养的干细胞进行处理的操作。当用胰蛋白酶对经培养的干细胞进行处理时，可以获得单细胞类型的干细胞，而且在本文中，胰蛋白酶进行处理以抑制细胞之间的积聚并产生单细胞类型的干细胞。可以用能够抑制细胞之间形成积聚的物质来替换胰蛋白酶。
可以在常规已知的容器中进行干细胞的培养。例如，可以使用三维生物反应器或旋转器、或者在普通的粘附容器中培养干细胞。
刺激毛发生长的功能
本发明涉及直径为10μm以下、最优选8μm以下的小尺寸干细胞的预防脱发和刺激毛发生长的极其出色的功能的用途。
通过毛发周期的正常化引起直径为8μm以下的小尺寸干细胞的预防脱发和刺激毛发生长的功能，并且通过刺激毛囊干细胞的活性增加了毛囊的数量和厚度以减少用于将毛发周期中的休止期转变为生长期的时间并增加真皮乳头细胞的产生。
人毛发经历在其中生长期、退行期和休止期的周期得以重复的过程，并进行毛发掉落和再生，且毛发周期通过调节激素或各种生长因子来操作。毛发被埋在皮肤中并覆盖有称为毛囊的表皮和真皮。毛囊上存在真皮乳头(控制毛发的组织)，而且毛发母细胞直接在真皮乳头上形成毛发，以产生新的毛发，并且在分裂时推动毛发向上。真皮乳头细胞具有由生长期(其中细胞的生长是活跃的)、退行期(其中开始退化)和休止期所组成的周期。当在休止期后接收到来自相邻细胞的信号时，细胞重新进入生长期，并且进行细胞更新，并因此产生新的毛发。
毛囊是仅在哺乳动物中的皮肤器官，并且通过表皮和间充质之间的相互作用从产前期产生。
响应于真皮的信号，毛囊的产生在产前期开始，并因此表皮变厚且在板中形成。产生自厚的表皮板(epidermal plate)的表皮信号诱导了间充质来源的真皮细胞的积聚，并且从所形成的积聚体再次产生真皮信号。该信号刺激了表皮细胞的增殖，并诱导表皮细胞侵入真皮，以包围积聚体，从而形成真皮乳头。因此，形成了第一毛囊结构，然后发生表皮细胞的增殖和分化，并导致发育成产生毛发的成熟毛囊。在成熟毛囊中，通过毛囊的基底膜的毛发基质细胞和真皮乳头细胞之间的相互作用，毛发基质细胞发生特定分化，从而使毛发产生并生长。另外，该相互作用产生了毛囊的周期、维持了器官、并确定了生物特性(例如毛发的厚度和形态)。
调节毛囊中的生物特性的两个重要因素是外根鞘(ORS)细胞(其为毛囊表皮)和间充质来源的真皮乳头(DP)，并且毛发通过重复毛发周期而生长和掉落。
角质层和毛发分别通过皮肤表面和毛囊的增殖和分化而产生和掉落，并且连续对它们进行补充、维持和再生的基本细胞源是干细胞。已知毛囊在膨大部(swelling part)中具有表皮干细胞的容器，其参与了毛囊的维持以及皮脂腺和毛干表皮的更新。另外，在毛囊下的真皮鞘(DS)中存在间充质来源的过渡扩增细胞(transit-amplifying cell)，以在生长期维持毛囊的真皮乳头，并且已知间充质来源的过渡扩增细胞是能够替代生物合成皮肤的真皮组分(即成纤维细胞)的细胞源，并且成为研究的对象。因此，可以看出，通过本发明的激活处于休止期中的毛囊干细胞的方法可对脱发进行有效治疗。
特别地，本发明的直径为8μm以下的小尺寸干细胞显著减少了用于将毛发周期中的休止期转变至生长期的时间。即，通过刺激处于休止期中的毛囊干细胞的激活，使毛发周期的调节正常化。
在下文中，将对本发明的直径为8μm以下的小尺寸干细胞的预防脱发和刺激毛发生长的功能的特征进行描述。
(i)本发明的直径为8μm以下的小尺寸干细胞激活了参与真皮乳头细胞的产生的干细胞以及参与毛发长度的延伸的干细胞。
已经报道，能够使毛发生长的常规源仅影响诱导毛发生长所需的各种因素的一部分。例如，在已知的现有文献中，参与毛发生长的毛囊干细胞的激活是以下干细胞的激活：参与真皮乳头(DP)的产生的干细胞或参与毛发长度的延伸的干细胞。
相反，根据本发明，由于除了该两种类型的干细胞之外的大多数与毛发相关的毛囊干细胞均被激活，因此毛囊的数量和厚度增加，并且组织的厚度也增加。即，本发明提供了同时影响各种因素的源，并将所述源用于脱发和刺激毛发生长的联合治疗。
(ii)本发明的直径为8μm以下的小尺寸干细胞大大减少了用于将毛发周期中的休止期转变至生长期的时间。
因此，通过使毛发周期调节正常化，本发明的直径为8μm以下的小尺寸干细胞展示出永久性的毛发生长作用，而不是对激素的暂时性作用。
包括的常规药物延缓了脱发的进行或有助于维持处于生长期中的现有毛发，而不进行永久性治疗，因此当停止使用药物时，立即发生脱发。
然而，由于毛囊的数量和厚度增加，并且通过使毛发周期正常化增加了真皮乳头(DP)的产生，本发明的小尺寸干细胞能够基于永久性的毛发生长作用从根本上治疗脱发。
在本发明的一个示例性实施方式中，确认了小尺寸的脐带血来源的间充质干细胞使转变成生长期的时间最短。此外，与广泛已知的作为用于毛发生长的药物的和PRP相比，小尺寸的脐带血来源的间充质干细胞更显著地增加了毛囊的数量和厚度，即它们显示出最高的毛发生长作用。
另外，确认了与其中混合有各种尺寸的干细胞的常规的异种干细胞相比，本发明的直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基通过激活毛囊干细胞展示出高的刺激毛发生长作用。
如常规所知的，当培养间充质干细胞时，将具有各种尺寸分布的干细胞混合。然而，在本发明中，当仅将本发明的直径为8μm以下的小尺寸细胞取出用于培养时，显著地展示出刺激毛发生长的作用。
也就是说，对于预防脱发和刺激毛发生长的作用而言，干细胞的“尺寸”是非常重要的因素，直径为8μm以下的小尺寸干细胞具有出色的减少黑色素的作用，而不论干细胞来源的组织类型(例如脂肪、骨髓或脐带血)，特别地，直径为8μm以下的小尺寸脐带血来源的干细胞具有最出色的作用。
组合物及其用途
因此，一方面，本发明提供了用于刺激毛发生长的组合物、其制备方法以及使用该组合物预防脱发和刺激毛发生长的方法，所述组合物含有直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基作为活性成分。
干细胞能够以如下的不显示出毒性的有效浓度范围而被包含，但本发明不限于此：10％(v/v)至30％(v/v)、优选15％(v/v)至25％(v/v)、最优选20％(v/v)。
作为本发明的示例性实施方式，本发明的组合物包括药物组合物和/或化妆品组合物。
药物组合物
另一方面，本发明提供了用于预防脱发或刺激毛发生长的药物组合物，所述药物组合物含有直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基作为活性成分。
脱发或秃头症主要分为瘢痕性秃头症和非瘢痕性秃头症，非瘢痕性秃头症包括先天性秃头症、男性类型秃头症和斑秃，在本发明中，包括所有上述类型，但本发明不限于此。
包含在本发明的药物组合物中的药学上可用的载体为在制备中常规使用的载体，包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钙、海藻酸盐/酯、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。除了上述成分之外，本发明的药物组合物还可以含有润滑剂、保湿剂、甜味剂、矫味剂、乳化剂、悬浮剂或防腐剂。
本发明的药物组合物的合适剂量由于各种原因而变化，所述原因例如制备方法、给予方法、患者年龄、体重、性别、疾病严重程度、饮食、给予时间、给予途径、排泄速率和反应灵敏度，并且普通的技术熟练的医生可以容易地确定期望治疗的有效剂量，并开出有效剂量的药物组合物。同时，本发明的药物组合物的剂量可以是但不限于每天0.01mg/kg(体重)至2000mg/kg(体重)。
本发明的药物组合物可以口服给予或肠胃外给予，且优选肠胃外给予并且，当肠胃外给予时，可以通过静脉内注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射或经皮给予来给予药物组合物。本发明的药物组合物的给予途径可以根据施用该药物组合物的疾病的类型来确定。
例如，最优选通过局部施用至皮肤来给予本发明的药物组合物。除了头皮以外，还可施用本发明的药物组合物的区域可以是需要毛发生长的躯体的任何区域。例如，可将药物组合物用于其中的毛发由于损伤造成的疤痕而损坏的区域上，或为了简单的美容作用而用于宽前额或M型前额、睫毛或眉毛，以及用于改善无毛症的状况。
最优选地，经注射通过经皮给予来给予本发明的组合物。
在本文中，为了使组合物在充分扩散入皮肤的真皮中之后流经毛细血管，即，为了防止组合物未经充分扩散而短暂地穿过真皮并立即流入体内，可以在将注射器针眼朝上放置时注射组合物。
化妆品组合物
在另一方面，本发明提供了用于预防脱发或刺激毛发生长的化妆品组合物，所述化妆品组合物含有直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基作为活性成分。
本发明的化妆品组合物能够以本领域中常规制备的任何产品形式制备，例如，乳液、面霜、化妆水、面膜、粉底、洗液、美容液或发用化妆品，但本发明不限于此。
可以通过加入常规添加剂将组合物制备成如下的类型：洗发香波、润发剂、生发油、发胶、洗发剂、发膜、喷发剂、发用摩丝、焗油膏、染发剂、护发素、其混合物(例如洗发香波和润发剂的混合物、润发剂和焗油膏的混合物)或用于刺激毛发生长的液体型毛发生长液，并且还可以包括气溶胶类型的组合物。
当本发明的化妆品组合物的产品形式为膏剂、面霜或凝胶时，作为载体组分，可以使用动物油、植物油、蜡、石蜡、淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅酮、膨润土、二氧化硅、滑石或氧化锌。当本发明的化妆品组合物的形式为粉剂或喷雾剂时，作为载体组分，可以使用乳糖、滑石、二氧化硅、氢氧化铝、硅酸钙或聚酰胺粉末，特别地，当本发明的化妆品组合物的形式为喷雾剂时，可以额外地包含推进剂，例如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚。当本发明的化妆品组合物的形式为溶液剂或乳剂时，作为载体组分，可以使用溶剂、增溶剂或乳化剂，例如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或脱水山梨糖醇脂肪酸酯。当本发明的化妆品组合物的形式为悬浮剂时，作为载体组分，可以使用液相稀释剂，例如水、乙醇或丙二醇；悬浮液，例如乙氧基化异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇酯或聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯；微晶纤维素；偏氢氧化铝；膨润土；琼脂或黄蓍胶。当本发明的化妆品组合物的形式为含表面活性剂的清洁剂时，作为载体组分，可以使用脂族醇硫酸酯/盐、脂族醇醚硫酸盐/酯、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、牛磺酸甲酯、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐/酯、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、羊毛脂衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯。
除了活性成分以外，本发明的化妆品组合物中包含的成分可包括在化妆品组合物中常用的组分，例如常规助剂(包括抗氧化剂、稳定剂、增溶剂、维生素、色素和矫味剂)和载体。
可以通过任何常用的方法来制备化妆品组合物。
用于预防脱发和刺激毛发生长的化妆品组合物可以通过例如直接施用或者注射至头皮或毛发的经皮给予来使用。
基于成人体重，本发明的组合物中包含的混合提取物(其为活性成分)的施用量可以为40mg/kg以下、优选20mg/kg-40mg/kg。
可以使用本领域已知的将组合物施用至皮肤的所有方法。可以通过单次施用或重复施用、或者单独施用或与另一化妆品组合物组合施用来使用本发明的化妆品组合物。另外，可以根据常规方法来使用具有出色的皮肤保护作用的本发明的化妆品组合物，并且使用次数可以根据使用者的皮肤状况或品味而变化。
此外，从不同的观点出发，本发明还涉及使用直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基作为有效成分的治疗脱发的方法。
在上述方法中，所使用的干细胞或其组合物与先前所述相同。
在治疗脱发的方法中，特别地，优选使用注射通过经皮给予来给予干细胞或其组合物。在本文中，为了使组合物在充分扩散入皮肤的真皮中之后流经毛细血管，即，为了防止组合物未经充分扩散而短暂地穿过真皮并立即流入体内，可以在将注射器针眼朝上放置时注射组合物。
如上所述，基于药物组合物和化妆品组合物，对根据本发明的直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基进行了描述，但是，对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，本发明包括具有预防脱发和刺激毛发生长作用的各种类型的组合物以及使用该组合物的方法，所述组合物包含直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基作为活性成分。
也就是说，根据本发明的直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基刺激了毛囊干细胞的激活，以缩短用于将毛发周期中的休止期转变至生长期的时间，并增加了真皮乳头细胞的产生，因此具有非常出色的预防脱发和刺激毛发生长的作用，而且本发明还包括基于此类作用的各种用途。
有益效果
根据本发明，直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基刺激了毛囊干细胞的激活，以减少用于将毛发周期中的休止期转变至生长期的时间，并增加了真皮乳头细胞的产生，从而展现出非常出色的脱发预防作用和毛发生长刺激作用，因此在可施用的领域中非常有用。
附图说明
图1是说明了当获取小鼠组织来观察毛囊时，制造用来有效地观察毛囊的长度或数量的片段的方法的示意图；
图2是显示C3H小鼠的hUCB-MSC组和对照组的毛发生长作用(用裸眼观察)的图像；
图3是显示在C3H小鼠的皮肤组织的hUCB-MSC组和对照组中的毛囊的数量和长度以及皮肤厚度的比较的显微图像；
图4是在第5周至第7周用裸眼观察到的分离自对照以及脂肪来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞和脐带血来源的间充质干细胞的小尺寸细胞在C3H小鼠中的毛发生长作用的比较的图像；
图5是显示分离自对照以及脂肪来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞和脐带血来源的间充质干细胞的小尺寸细胞在C3H小鼠中的毛发生长作用(第7周)的动物组织学分析的结果组合的图像；
图6是显示分离自对照以及脂肪来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞和脐带血来源的间充质干细胞的小尺寸细胞的条件培养基在C3H小鼠中的毛发生长作用(第8周)的动物组织学分析的结果组合的图像；
图7是显示CCk-8实验结果的图表，以确认小尺寸hUCB-MSC随时间对HaCaT细胞增殖的作用；以及
图8是通过活/死细胞染色显示出在对照以及脂肪来源的间充质干细胞、骨髓来源的间充质干细胞和脐带血来源的间充质干细胞中增殖真皮乳头(DP)细胞的作用的图像。
具体实施方式
在下文中，将参照实施例对本发明进行进一步的详细描述。仅提供实施例用于解释本发明，并且对于本领域的普通技术人员来说显而易见的是，不应解释为本发明的范围限于所述实施例。
本发明人分离了来源于各种组织的各种尺寸的干细胞，以观察对毛发细胞生长的作用并确认刺激毛发生长的作用。这是基于小尺寸干细胞使细胞的衰老延缓的事实；并且细胞变得越老，细胞的尺寸变得越大并且增殖速率越低。
材料和方法
1.干细胞的制备
(1)干细胞的分离
在本发明中，使用Medipost Co.,Ltd.(韩国)提供的人脐带血来源的间充质干细胞。可以通过获取脐带血、从脐带血分离间充质干细胞并对干细胞进行培养来获得所述细胞，如下是对操作的详细描述：
在获取脐带血的操作中，在正常的阴道分娩中，在出生后，从取出的脐带静脉中获取脐带血，而胎盘仍保留在子宫中；或者在剖宫产中，在出生后，从脐带静脉中获取脐带血，而胎盘也从子宫中取出。
在本发明中，当从出生后自子宫取出的脐带静脉中获取脐带血时，在出生后，通过无菌操作从将胎盘连接至胎儿的脐带静脉中获取脐带血。首先，获得脐带静脉，然后使用收集针将脐带血放进含有抗凝血剂的脐带血储袋中。
从获取的脐带血中分离和培养间充质干细胞的方法可以是包括韩国专利号10-0494265中公开的方法在内的任何常用的方法(Pittinger MF，Mackay AM等，Science，284：143-7，1999；Lazarus HM，Haynesworth SE等，Bone Marrow Transplant，16：557-64，1995)。
通过离心从所获得的脐带血中分离出单核细胞，漂洗数次以除去残渣，并以合适的密度接种在培养容器中并进行培养。在细胞以单层增殖后，使用相差显微镜将以集落形式增殖的均匀的纺锤体形状的细胞识别为间充质干细胞。另外，当细胞生长至融合时，通过传代培养将细胞增殖为需要的细胞数量。
同时，用作对照的各种细胞为HEK293细胞、脂肪细胞(ATCC，USA)、骨髓(LONZA，USA)、hDPC和HaCat(由韩国中央大学给予)。
(2)条件培养基的制备
从hUCB-MSC、BM-MSC和Adipo-MSC制备条件培养基。在37℃下含有5％CO2的培养箱中，将处于储存状态的细胞(储存在LN2槽中)解冻并进行培养，并在含有2％FBS的α-MEM(GIBCO)培养基中增殖，以具有约90％的细胞融合。
然后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)将细胞洗涤3次，在不向其中添加酚红的角质形成细胞-无血清培养基(K-SFM)中孵育24小时，以获得条件培养基，并将上述程序重复3天。另外，将获得的条件培养基过滤(Top Filer System，Nunc)，然后储存在冷藏设备中并冷冻。
2.共培养
将hUCB-MSC(5000个细胞/顶部腔室、10,000个细胞/顶部腔室、15,000个细胞/顶部腔室、20,000个细胞/顶部腔室)在顶部腔室(孔径：1μm)中与transwell腔室(Falcon，USA)中的毛发相关细胞(DP和HaCat)一起进行共培养。
3.小尺寸细胞的分离
在37℃下的5％CO2的培养箱中，将处于储存状态的细胞(储存在LN2槽中)解冻并进行培养，以及使用8μm和20μm的膜过滤器分离并获得小尺寸干细胞。
在本文中，使用20μm的膜过滤器，然后使用8μm的膜过滤器获得直径为8μm至20μm的细胞。
另外，通过将干细胞分为以下三个组来进行测试，包括：在分离前的其中混合有各种尺寸的干细胞的异种干细胞的组1、直径为8μm以下的干细胞的组2以及直径为20μm以上的干细胞的组3。
4.用于观察毛发生长的C3H小鼠的制备
作为实验地点，使用Medipost Co.,Ltd(IRB批准编号：131021-1)和GyeonggiBiocenter(IACUC项目编号：IACUC2014-4-10)，C3H小鼠购自Saeronbio Inc.，并在Jackson实验室制备。
特别地，在本发明的实验中使用的C3H小鼠(Jackson lab，日本)是用作毛发生长作用模型的小鼠模型，其中当毛发被除去时开始休止期，并且不同于其它物种，C3H小鼠需要极长的时间以转变至生长期。即，不同于其它种的小鼠，在不进行休止期诱导药物处理时，由于休止期非常长，因此C3H小鼠是用于确认毛发生长作用的出色的动物模型(Journalof Investigative Dermatology(2005)124，288-289)。
C3H小鼠皮肤的表面在毛发生长的生长期变成黑色，在退行期变成粉红色，因此可以通过观察小鼠的皮肤颜色来检测毛发生长的时间。
本发明人获得了7周龄C3H小鼠，并使小鼠通过1周的适应来适应环境。另外，本发明人打算通过将脐带血来源的间充质干细胞注射到小鼠模型中，以观察从毛发周期的休止期转变成生长期的时间。在该实例中，将向其注射PBS的小鼠模型用作阴性对照。
同时，对小鼠进行麻醉以除去毛发。通过将3.36ml甲苯噻嗪(Bayer Korea Ltd.，2094L，韩国)混入5ml舒泰(zoletil)(条形码#3UHC，韩国)中并加入7.47ml盐水(JWPharmaceutical，REG#10055，韩国)来制备15.83ml溶液以作为麻醉剂，并使用胰岛素注射器(BD Ultra-FineTM II，韩国)用20μl所述溶液对小鼠进行麻醉。
另外，在麻醉后，使用毛发修剪器除去小鼠的毛发。将小鼠置于干净的纸上，以与毛发生长方向相反的方向进行首次毛发去除。在使小鼠维持24小时后，然后重新检查以将剩余毛发除去。
5.本发明的干细胞的注射
为了防止本发明的干细胞穿过皮肤中的真皮直接流入小鼠体内，将注射器针眼朝上放置，并将其放入麻醉小鼠的真皮中，以防止未经充分扩散而短暂地穿过真皮并立即流入体内。在本文中，当注射脐带血来源的间充质干细胞时，紧紧地抓住皮肤以使干细胞不向外泄漏，并且通过摩擦皮肤以将针从皮肤拔出而完全注射干细胞。
6.获取小鼠的组织
为了检查根据本发明的作用，从向其注射了脐带血来源的间充质干细胞的小鼠中获取皮肤组织。
准备6孔板、钳子、手术剪、干净的纸和毛发去除器，首先，除去小鼠先前生长的毛发。使用钳子选取最接近头部的背部皮肤，使用手术剪切开皮肤组织，将经切割的组织贴在纸上并再次以六边形形状切开。在本文中，小心地进行切割而不损坏待拍照的组织部分，并且在将纸与组织的端部匹配以容易地彼此粘附的同时进行切割。
图1是示出了制备用于观察毛囊的长度和厚度的片段的方向(上部)以及制备用于观察毛囊的数量和尺寸的片段的方向(下部)的示意图。当以这些方向获取组织时，可以对毛囊的纵向横截面和数量横截面进行观察。
7.H&E染色
将获得的组织储存在-80℃下，用PBS漂洗15分钟用于观察，再用含有4％蔗糖的PBS漂洗三次，每次15分钟。然后，使所得产物在4℃下与含有30％蔗糖的PBS反应过夜。第二天，将所得产物用其中溶解有30％蔗糖的水性洗涤用品再漂洗三次，每次15分钟，并将皮肤组织切割成10μm的厚度。
将所制备的组织在25℃下用Harris苏木精染色30秒，并用水漂洗10分钟。另外，将所得组织在25℃下用曙红染色1分钟，并在25℃下用95％乙醇漂洗两次，每次10秒。随后，用100％乙醇漂洗组织两次，每次10秒，并使其在25℃下与二甲苯反应2分钟，使用显微镜(Nikon，ECLIPS E600W，日本)对组织进行观察。能够通过H&E染色观察毛囊的形态，并确认毛发生长周期。
8.免疫组织化学
通过与4％多聚甲醛(PFA，Sigma，USA)在25℃下反应15分钟来固定样品。15分钟后，用冷的PBS漂洗样品，使用PBS加入0.3％Triton X-100(Sigma，USA)，并在25℃下与样品反应10分钟，以便使免疫抗体容易地渗透到样品中。
然后，将样品漂洗3次，每次5分钟，并在25℃下在含有1％BSA的PBS中封闭1小时。其后，将小鼠PCNA(1:250，Abcam，Cambridge，UK)和兔Ki-67(1:250，Abcam，Cambridge，UK)的一抗在4℃下与样品反应过夜。另外，加入小鼠Alexa488(1:400，Jackson实验室，California，USA)和兔Cy3(1:400，Jackson实验室，California，USA)的二抗，以在25℃下进行30分钟和1小时的另外的反应。
随后，将二抗丢弃，并在不暴露至光的暗处用PBS漂洗三次。将样品的细胞核在25℃下用1μg/ml的DAPI(1:1000；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)染色5分钟，并置于荧光显微镜(Nikon)和共聚焦显微镜(ZEISS，LSM700/德国，Nikon Eclipse TE2000-U/日本)上进行观察。
9.CCK8分析
为了检测细胞增殖，将400μl的培养基和40μl的细胞计数试剂盒的试剂(CCK-8，Dojindo，USA)在37℃和5％CO2下处理1小时，将培养基转移至96孔板，以使用分光光度计在450nm下对光密度(OD)进行检测。
10.使用活/死细胞染色的定量分析
活/死细胞染色是使用两种颜色的荧光探针对活细胞和死细胞进行染色的方法。由于溴乙啡啶二聚体(EthD)，死细胞在565nm至605nm的通道波长下显示红色，由于钙黄绿素，活细胞在440nm至480nm的通道波长下显示绿色。
除去条件培养基的上清液，将沉淀物用PBS漂洗一次或两次，然后在室温下用以下混合物染色30分钟：其中，在10ml的PBS中混合2mM的活/死细胞存活力/细胞毒性试剂盒的试剂(Invitrogen)、20μl的EthD-1和5μl的4mM钙黄绿素AM。
通过IncucyteTM FLR(Essen Bioscience Inc.USA，ZEISS，LSM 510META)荧光图像，将所述染色用于观察活细胞或死细胞。
实施例
实施例1：人脐带血来源的间充质干细胞(hUCB-MSC)对毛发生长的作用
1-1.用裸眼观察毛发生长
在C3H小鼠中诱导休止期，将PBS注射到小鼠的半个背部中以作为阴性对照，并分别以1×106个细胞/100μl和5×105个细胞/100μl，将hUCB-MSC 3组和HEK293细胞组一次注射到小鼠的另一半背部的一个点中以作为测试组。
然后，对小鼠的毛发生长观察5周，结果示于图2。
如图2所示，仅在hUCB-MSC组中，C3H小鼠通过将毛发周期从休止期转变至生长期而显示出毛发生长。在本文中，与以1×106个细胞注射时相比，当以5×105个细胞注射细胞时，毛发更长且在更宽的范围生长，并且第2组的干细胞的直径为8μm以下。即，当以5×105个细胞/100μl注射直径为8μm以下的hUCB-MSC时，展示出最出色的毛发生长作用。
1-2.毛囊的观察
接下来，本发明人试图在C3H小鼠组织状态中观察hUCB-MSC对毛发生长的作用，以及参与毛发生长的毛囊。
为此，通过上述方法制造组织片段，并通过H&E染色进行染色，以观察毛囊的数量和长度以及皮肤组织的厚度。
结果，如图3所示，在根据本发明注射hUCB-MSC的组中，观察到相当高数量的毛囊，毛囊的长度长，而且皮肤组织的厚度厚两倍以上。在本文中，当注射5×105个直径为8μm以下的hUCB-MSC细胞时，获得最大数量和最大长度的毛囊以及最大厚度的皮肤。
1-3.条件培养基的毛发生长作用的观察
通过相同的方法，将通过上述方法(制备的实施例1-(2))制备的条件培养基给予小鼠，观察8周后小鼠的毛发生长，结果示于图6。
如从示出了对于hUCB-MSC而言的小鼠和毛囊图像的图6看出的，并且特别地，与直径为20μm以上的hUCB-MSC的条件培养基相比，当给予直径为8μm以下的hUCB-MSC的条件培养基时，显示出色的毛发生长作用，从毛囊图像还可以看出毛囊的数量和长度有显著差异。
根据该结果，可以确认直径为8μm以下的干细胞及其条件培养基具有最出色的毛发生长作用。
实施例2.各种组织来源的干细胞的毛发生长作用
2-1.用裸眼观察毛发生长
本发明人比较了脂肪来源的间充质干细胞(脂肪细胞-MSC，AD-MSC)、骨髓来源的间充质干细胞(骨髓-MSC，BM-MSC)和脐带血来源的间充质干细胞细胞(hUCB-MSC)的毛发生长作用，以检查干细胞的组织来源对毛发生长的影响。
为此，在休止期诱导C3H小鼠后，以5×105个细胞的量将AD-MSC、BM-MSC和hUCB-MSC一次注射到一个点中，在第5周、第6周和第7周观察毛发生长。
结果示于图4。
如图4所示，注射了hUCB-MSC的C3H小鼠具有最出色的毛发生长作用。在注射了UCB-MSC的组中，在第5周首先观察到毛发生长现象，在至少第7周观察到毛发在小鼠的90％以上的总面积中生长的现象。
另外，与用作阳性对照的组和PRP组相比，当注射hUCB-MSC时，观察到明显更高的毛发生长作用。
2-2.毛囊的观察
另外，在额外的细胞移植后的第8周，对C3H小鼠皮肤组织中的毛囊进行观察。
作为通过H&E染色来分析毛囊的数量和长度以及皮肤组织的厚度的结果，如图5所示，与AD-MSC和BM-MSC相比，当使用hUCB-MSC时，观察到毛囊的最大数量和最大长度，而且皮肤组织的厚度厚两倍以上。
2-3.来源于其它组织的干细胞的条件培养基
通过与上述相同的方法，将通过上述方法(制备的实施例1-(2))制备的条件培养基给予小鼠，以观察第8周的毛发生长，结果示于图6。
如从图6的图像看出的，与AD-MSC条件培养基和BM-MSC条件培养基相比，当使用hUCB-MSC条件培养基时，观察到毛囊的最大数量和最大长度，而且皮肤组织的厚度更大。
实施例3：真皮乳头细胞产生的观察
已知毛发生长与真皮乳头(DP)部分的细胞增殖密切相关。基于这一事实，本发明人打算使用PCNA和Ki67抗体来确认DP部分的细胞增殖。
结果，如图5所示，在来源于各种来源的成体干细胞中，当注射hUCB-MSC时，在DP部分中观察到显著的细胞增殖作用。
另外，如图6所示，在来源于各种来源的成体干细胞的条件培养基中，当注射hUCB-MSC时，在DP部分中观察到显著的细胞增殖作用。
根据上述结果，在来源于各种组织的间充质干细胞中，可以看出脐带血来源的间充质干细胞及其条件培养基是显示出最高的毛发生长作用的来源。
对比实施例1：小尺寸hUCB-MSC的毛发生长作用
(1)体外实验
为了根据尺寸比较干细胞的毛发生长作用，将直径为8μm以下的小尺寸hUCB-MSC、直径为20μm以上的大尺寸hUCB-MSC以及其中混合有各种尺寸的细胞的异种细胞用于分析。在异种细胞状态中，制备AD-MSC和BM-MSC。将和PRP用作阳性对照，并将HEK293细胞和原始培养基用作阴性对照。
另外，为了观察对HaCaT细胞和DP细胞的增殖的作用，使用并行培养系统在顶部腔室中对细胞进行体外处理。对细胞处理总计96小时以进行观察，每24小时通过细胞计数检测CCK-8中的细胞增殖。
结果示于图7和图8
确认DP和HaCaT细胞的增殖水平在72小时时最高，并且hUCB-MSC显示比异种细胞高两倍以上的细胞增殖。
另外，就取决于hUCB-MSC的尺寸的增殖方面的差异而言，在直径为8μm以下的小尺寸hUCB-MSC中，DP细胞的增殖比起对照组的增殖高4.8倍以上(图7)。
另外，以5,000个细胞至20,000个细胞的不同数量，对接种在并行培养系统的顶部腔室中的干细胞进行培养，而当干细胞的数量为15,000个时，显示出最高的细胞增殖(图8)。
另外，通过活/死细胞染色确认了直径为8μm以下的小尺寸hUCB-MSC具有最高的DP细胞增殖作用(图8)。
(2)体内实验
与根据细胞尺寸来观察毛发生长的上述体外结果类似，在图5和图6中示出了通过向C3H小鼠注射细胞来确认体内毛发生长作用而获得的结果。
根据通过H&E染色获得的结果，直径为8μm以下的小尺寸hUCB-MSC及其条件培养基在毛囊的数量和长度以及皮肤厚度方面展示出色的作用。通过使用PCNA和Ki67荧光染色检查比较产生相同的结果。
根据这些结果，可以看出具有8μm以下的小直径的干细胞、特别是直径为8μm以下的小尺寸的脐带血来源的干细胞及其条件培养基刺激了DP细胞增殖和毛囊的生长以及由此刺激毛发生长，从而展示出最出色的预防脱发和刺激毛发生长的功能，并且与常规情况中所示的未根据尺寸进行分离而对异种干细胞进行简单培养时相比，展示出特别突出的作用。
另外，当使用直径为20μm以上的大尺寸细胞及其条件培养基时，对刺激毛发生长没有显著的作用，因此，可以看出干细胞的尺寸极大地影响了干细胞的脱发预防作用和毛发生长刺激作用。

Claims (14)

1.一种用于预防脱发和刺激毛发生长的组合物，所述组合物包含直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基作为活性成分。
2.如权利要求1所述的组合物，其中，所述直径为8μm以下的小尺寸干细胞包括选自于由以下所组成的组中的至少一种：骨髓来源的人成体干细胞、脐带血来源的人成体干细胞、脂肪来源的人成体干细胞、血液来源的人成体干细胞、肝脏和肠来源的人成体干细胞、皮肤来源的人成体干细胞、胃肠道来源的人成体干细胞、胎盘来源的人成体干细胞、神经来源的人成体干细胞、肾上腺来源的人成体干细胞、上皮和子宫来源的人成体干细胞，以及胚胎干细胞。
3.如权利要求2所述的组合物，其中，所述直径为8μm以下的小尺寸干细胞来源于骨髓、脐带血或脂肪。
4.如权利要求3所述的组合物，其中，所述直径为8μm以下的小尺寸干细胞来源于脐带血。
5.如权利要求4所述的组合物，其中，所述直径为8μm以下的小尺寸干细胞是脐带血来源的间充质干细胞。
6.如权利要求4所述的组合物，其中，所述脐带血来源于人。
7.如权利要求1所述的组合物，其中，所述条件培养基包括角质形成细胞-无血清培养基(K-SFM)。
8.如权利要求1所述的组合物，其中，所述直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基激活毛囊干细胞。
9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基具有以下功能：
(i)减少用于将毛发周期中的休止期转变至生长期的时间；
(ii)使毛发周期调节正常化；以及
(iii)增加真皮乳头细胞的产生。
10.如权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物是药物组合物或化妆品组合物。
11.一种使用权利要求1至10中任一项所述的组合物的方法，所述组合物使用注射通过经皮给予。
12.如权利要求11所述的组合物，其中，所述注射是在将注射器针眼朝上放置时将组合物给予至靶标的真皮的方法。
13.一种治疗脱发的方法，所述方法使用直径为8μm以下的小尺寸干细胞或其条件培养基作为活性成分。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述直径为8μm以下的小尺寸干细胞来源于脐带血。
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