KR102141641B1 - 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화방법 - Google Patents

인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 젤라틴을 포함하는, 분화유도용 세포 배양 플레이트에서 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화 유도 배지 조성물을 이용하여 분화시키는 방법 및 상기 배지 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 젤라틴을 포함하는 플레이트는 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 직접교차분화를 유도하는 효과를 발휘할 수 있고, 경제적인 소재를 사용함으로써 저비용으로 체외에서 대량 배양을 효율적으로 가능하게 하는 효과를 발휘할 수 있다. 또한, 본 발명의 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 모유두세포는 탈모 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물로 이용할 수 있다.

Description

인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화방법{Method for differentiation of dermal papilla cells from human adipose mesenchymal stem cells}
본 발명은 젤라틴을 포함하는 분화유도용 세포 배양 플레이트에서 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화 유도 배지 조성물을 이용하여 분화시키는 방법 및 상기 배지 조성물에 관한 것이다.
탈모의 종류는 남성형, 여성형, 휴지기, 원형탈모로 구분할 수 있다. 여러 요인에 의하여 모낭을 구성하는 모유두세포가 모낭 근처의 세포와 상호작용하며 모발의 형성과 성장에 영향을 미치고 성장 주기를 조절하는 역할을 담당하는데, 탈모의 원인이 되는 여러 요인에 의해 모낭이 퇴화하여 모발이 자라지 않아 털이 탈락하는 탈모가 발생한다.
최근 국민건강보험공단의 통계에 의하면, 탈모로 병원을 찾는 환자는 연 21만명이며, 그 중 약 44%가 2~30대이고, 여성 환자도 전체 환자의 45%에 이르러 탈모는 나이와 성별에 따른 연관성 없이 발생하고 있다. 또한, 10대 이하의 탈모 환자 비율도 점차 증가하는 추세이므로, 탈모는 더 이상 중, 장년층만의 문제만으로 치부할 수 없으며, 사회 전반에 걸쳐 탈모는 질병이라는 인식이 확산되고 있다.
탈모를 치료하기 위해 주로 자가모발이식, 약물치료를 시행하고 있으며, 자가모발이식의 경우 영구적인 치료가 가능하다는 장점이 있지만 비용이 높고, 탈모 부위가 넓은 경우 여러 횟수에 걸쳐 시술해야하는 단점이 존재한다. 또한, 약물치료의 경우 복용 및 투여가 간편하지만 탈모의 진행을 지연시키거나 현재 상태를 유지하도록 돕는 용도로 영구적인 치료 방법이 아니며, 약물로 인한 부작용도 존재한다는 한계가 있다. 이외에도 유전자 치료 등 여러 가지 방법이 개발되었지만 아직까지 안전성과 그 효과에 대한 입증이 완료되지 않아 임상적 적용까지는 시간이 소요될 것으로 보인다.
근래 들어서는 탈모의 치료에 줄기세포를 응용 및 적용하는 기술이 각광을 받고 있다. 두피의 곳곳에 지방유래줄기세포를 주입하는 방식, 줄기세포의 다분화능을 이용하여 모유두세포로의 분화를 유도한 후 이식을 통해 체내에서 모낭을 형성하는 방식 등에 대한 시도가 있어왔다. 하지만, 주입한 지방유래줄기세포의 경우 탈모의 근본적 치료인 새로운 모낭을 형성하는 것이 아니며, 모유두세포로의 분화를 유도하는 경우 유전자 조작을 통해 분화된 세포의 안정성, 유전자 조작에 대한 심리적 거부감 및 경제성을 해결해야하는 문제점을 가지고 있다. 따라서 안전하면서도 경제적이고 유전자 조작 없이 탈모 치료에 효과적인 방안을 개발하는 것이 필요한 실정이다.
대한민국 공개특허 제10-2019-0009716호(공개일자:2019.01.29.)는 인간유래 만능줄기세포에서 모유두전구세포로의 분화방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 인간 유래 만능줄기세포로부터 모유두전구세포로의 분화용 배지 조성물, 분화방법, 및 상기 분화된 모유두전구세포를 이용한 모낭신생 유도 용도에 관해 기재되어 있다.
본 발명은 경제적으로 체외에서 대량 배양을 효율적으로 가능하게 하는 효과를 발휘할 수 있는, 젤라틴을 포함하는 분화유도용 세포 배양 플레이트에서 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화 유도 배지 조성물을 이용한 분화 방법 및 상기 배지 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 플레이트 내부에 젤라틴이 코팅된 것을 특징으로 하는 모유두세포 분화 유도용 플레이트를 제공한다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 플레이트는, 바람직하게 폴리스티렌(Polystyrene) 플레이트인 것일 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 플레이트는, 바람직하게 인간지방 유래 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화를 유도하기 위한 것일 수 있다
또한, 본 발명은 내부에 젤라틴이 코팅된 플레이트에 동물세포배양용 배지를 첨가하고, 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 로딩하여 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계 (a); 상기 단계 (a)의 동물세포배양용 배지에서 배양된 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 1차 분화용 배지로 교체하여 배양하는 단계 (b); 상기 단계 (b)의 1차 분화용 배지에서 배양된 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 2차 분화용 배지로 교체하여 배양하는 단계 (c);를 포함하되, 상기 단계 (b)의 1차 분화용 배지는, 동물세포배양용 배지에 레티노익산(retinoic acid), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가되어 조성된 것이며, 상기 단계 (c)의 2차 분화용 배지는, 동물세포배양용 배지에 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3′-oxime), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가되어 조성된 것을 특징으로 하는 인간지방 유래 중간엽 줄기세포의 모유두세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.
본 발명의 젤라틴을 포함하는 플레이트는 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 직접교차분화를 유도하는 효과를 발휘할 수 있고, 경제적인 소재를 사용함으로써 저비용으로 체외에서 대량 배양을 효율적으로 가능하게 하는 효과를 발휘할 수 있다.
또한, 본 발명의 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 분화된 모유두세포는 탈모 예방 또는 치료를 위한 세포치료제 조성물로 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 분화시킨 인간지방 유래 중간엽 줄기세포(dADSC)에 대하여 모유두세포 특이적 유전자의 유전자 발현 양상을 확인한 실험 결과 그래프이다. 비교를 위해 모유두세포(DPC)와 분화시키지 않은 인간지방 유래 중간엽 줄기세포(ADSC)를 사용하였다.
도 2는 본 발명의 본 발명의 분화시킨 인간지방 유래 중간엽 줄기세포(dADSC)에 대하여 모유두세포 특이적 유전자에 대한 유세포분석(FACS)을 수행한 실험 결과이다. 비교를 위해 모유두세포(DPC)와 분화시키지 않은 인간지방 유래 중간엽 줄기세포(ADSC)를 사용하였다. a)는 유세포분석 결과이고 이를 수치화하여 b)의 그래프로 나타내었다.
본 발명은 플레이트 내부에 젤라틴이 코팅된 것을 특징으로 하는 모유두세포 분화 유도용 플레이트를 제공한다. 본 발명의 '젤라틴'이 코팅된 플레이트를 이용할 경우, 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 직접교차분화를 유도하는 효과를 발휘할 수 있고, 경제적인 소재를 사용함으로써 저비용으로 체외에서 대량 배양을 효율적으로 가능하게 하는 효과를 발휘할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 플레이트는, 바람직하게 폴리스티렌(Polystyrene) 플레이트인 것일 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 플레이트는, 줄기세포의 분화 및 증식을 위해 적절한 세포외기질 분자를 사용하여야 한다. 사용할 수 있는 세포외기질 분자로는, 콜라겐(collagen), 피브로넥틴(Fibronectin), 마트리겔(Matrigel), 젤라틴(Gelatin) 등이 있으며, 본 발명에서는 바람직하게 세포의 분화 및 증식률이 가장 높았던 젤라틴을 사용하였고, 피더세포(feeder cell)를 포함하지 않고, 젤라틴이 코팅된 배양 플레이트를 사용하였다. 이를 통해 증식 및 분화를 위한 공배양 단계를 거치지 않기 때문에, 분화에 소요되는 시간을 단축하여 환자에게 신속한 적용이 가능하며, 피더세포(feeder cell)의 배양 과정에서 오염으로 인한 질병 전염 가능성을 낮추어 분화세포의 안정성을 높이는 효과를 얻게 된다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 플레이트를 코팅하는 젤라틴은 다양한 농도의 젤라틴을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 ~ 0.2 중량%인 것이 좋다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 플레이트는, 바람직하게 인간지방 유래 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화를 유도하기 위한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 내부에 젤라틴이 코팅된 플레이트에 동물세포배양용 배지를 첨가하고, 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 로딩하여 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계 (a); 상기 단계 (a)의 동물세포배양용 배지에서 배양된 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 1차 분화용 배지로 옮겨 배양하는 단계 (b); 상기 단계 (b)의 1차 분화용 배지에서 배양된 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 2차 분화용 배지로 옮겨 배양하는 단계 (c);를 포함하되, 상기 단계 (b)의 1차 분화용 배지는, 동물세포배양용 배지에 레티노익산(retinoic acid), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가되어 조성된 것이며, 상기 단계 (c)의 2차 분화용 배지는, 동물세포배양용 배지에 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3′-oxime), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가되어 조성된 것을 특징으로 하는 인간지방 유래 줄기세포의 모유두세포로의 분화 유도 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 인간지방 유래 줄기세포의 모유두세포로의 분화 유도 방법은, '젤라틴'이 코팅된 플레이트에 인간지방 유래 줄기세포를 로딩한 후, 동물세포배양용 배지, 1차 분화용 배지, 2차 분화용 배지를 순차적으로 교환하여 줌으로써 모유두세포로의 분화를 유도하는 방법인데, 상기 동물세포배양용 배지는 당업계에서 동물세포배양을 위해 사용되는 것이라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 다만, 바람직하게는 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가되어 조성된 것을 사용하는 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 상용되는 DMEM/HIGH GLUCOSE 배지에 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가되어 조성된 것을 사용하는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 동물세포배양용 배지에 있어서, 상기 우태아혈청은, 바람직하게 5 ~ 15 %인 것이 좋으며, 더욱 바람직하게는 10 %인 것이 좋다.
또한, 본 발명의 1차 분화용 배지에 있어서, 상기 레티노익산은, 바람직하게 0.001 ~ 1 mM인 것이 좋으며, 더 바람직하게는 0.001 ~ 0.1 mM인 것이 좋다.
또한, 본 발명의 2차 분화용 배지에 있어서, 상기 섬유아세포성장인자-2는, 바람직하게 1 ~ 1000 ng/ml인 것이 좋으며, 더 바람직하게는 1 ~ 40ng/ml인 것이 좋다. 또한, 본 발명의 2차 분화용 배지에 있어서, 상기 골형성단백질 2는, 바람직하게 1 ~ 1000 ng/ml인 것이 좋으며, 더 바람직하게는 1 ~ 400ng/ml인 것이 좋다. 또한, 본 발명의 2차 분화용 배지에 있어서, 상기 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제는, 바람직하게 1 ~ 100 uM인 것이 좋으며, 더 바람직하게는 1 ~ 10uM인 것이 좋다.
한편, 본 발명의 분화 유도 방법에 있어서, 상기 단계 (a) 내지 (c)는 바람직하게 3 ~ 7 % CO2 및 35~39℃의 온도로 배양하는 것이 좋으며, 본 발명에서는 5% CO2 및 37℃의 온도로 배양하였다. 이때, 세포 배양을 위한 최적 온도는 주로 세포가 분리된 숙주의 체온에 의존한 조건이고, 5% CO2는 세포 대사와 생장을 모니터링하기 위하여 양분이 한정된 배지에서 양분의 소모시기를 파악하기 위해 첨가한 pH 지시약인 페놀 레드(Phenol red)의 정상적인 작용을 위해 세포 대사 과정에서 발생한 배지 중 CO2가 인큐베이터(Incubator) 내부로 기화되지 않게 하기 위한 조건이다.
한편, 본 발명의 분화 유도 방법에 있어서, 상기 단계 (a)는 세포부착을 안정화시키는 단계로, 바람직하게 1 ~ 2일 동안 배양하는 것이 좋으며 본 발명에서는 1일 배양하였다. 또한, 상기 단계 (b)는 세포분화촉진인자를 처리하는 단계로, 바람직하게 1 ~ 7일 동안 배양하는 것이 좋으며 본 발명에서는 3일간 배양하였다. 또한, 상기 단계 (c)는 모유두세포 특성 유발 인자를 처리하는 단계로, 바람직하게 1 ~ 14일 동안 배양하는 것이 좋으며 본 발명에서는 4일간 배양하였다.
한편, 본 발명의 분화 유도 방법에 있어서, 상기 단계 (b) 및 (c)에서 사용하는 배지는 매일 한번씩 교체하였다. 이는 배지의 신선함(fresh)을 유지하기 위한 목적이며, 분화배지에 같이 처리하는 인자의 경우 높은 온도에서 오래 유지될 시, 활성이 떨어지기 때문에 배지를 교체하여 사용하는 것이 좋다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 인간지방 유래 줄기세포는, 바람직하게 인간지방 유래 중간엽 줄기세포인 것이 좋다. 이때, 상기 중간엽 줄기세포는, 바람직하게 골수, 지방조직 또는 탯줄에서 유래된 것일 수 있다.
한편, 기존 연구들에서는 다른 기원의 세포를 IPS 세포(IPS cell)로 유도한 뒤, 분화시키는 방법을 사용하였다. 하지만 본 발명은 상기 인간지방 유래 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화 유도 방법에 있어서, 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로 직접교차분화(Direct conversion, Trans-differentiation)시킨다는 점에서 특장점이 있다.
한편, 본 발명에 있어서, 상기 모유두세포로 분화된 중간엽 줄기세포는, 바람직하게 모유두세포 특이적 유전자인 LEF-1, Corin, Wnt5a로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 발현하는 것일 수 있다
한편, 하기 실험에 의하면, 본 발명의 분화시킨 인간지방 유래 중간엽 줄기세포는 인간지방 유래 중간엽 줄기세포와 비교하여 모유두세포의 특이적 유전자인 LEF-1, Corin, Wnt5a의 유전자 발현양상이 증가하였고, 유세포 분석에 있어서도, 모유두세포의 특이적 유전자인 LEF-1, Corin, Wnt5a에 대해 양성인 세포의 비율이 90% 이상인 것으로 확인되었다. 이는 모유두세포와 유사하게 나타낸 결과였다.
따라서, 본 발명은 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 직접교차분화를 시키기 위한 분화용 배지 조성물 및 이를 이용한 분화 방법을 통해 저비용으로 체외에서 대량 배양을 효율적으로 가능하게 하는 효과를 발휘할 수 있는 모유두세포의 대체소재를 제공할 수 있다. 또한, 이러한 대체소재를 이용하여 탈모 예방 및 치료에 탁월한 세포치료제 조성물을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 내용에 대해 하기 실시예 또는 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.
[실시예 1 : 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화 및 특성 확인
본 실시예에서는 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화 유도 및 모유두세포의 특성을 확인하였다.
1) 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화 유도
인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 기존 6 well plate (costar 사)와 젤라틴이 코팅된 폴리스티렌(polystyrene, PS) 플레이트 (6 well clear TC-treated Multiple Well Plates, 3516, Costar, Corning, NY, USA) (1 X 105 cells per well)에 배양하였다. 이때, 사용된 배지는 10% 우태아혈청(FBS) 및 1×페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)이 포함된 DMEM/HIGH GLUCOSE 배지 ((Dulbecco's Modified Eagle's Medium - High Glucose Liquid media (SH30243, Hyclone, UT, USA), 상세 배지 조성은 하기 표 1 참조)로 5% CO2 및 37℃의 온도조건에서 세포를 1일 배양하였다.
Inorganic salts mg/L mmol/L
Calcium chloride 200 1.8021
Ferric nitrate-9H2 0 0.1 0.0002
Potassium chloride 400 5.3655
Magnesium sulfate 97.67 0.8112
Sodium chloride 6400 109.514
Sodium phosphate monobasic H20 125 0.9059
Amino acids mg/L mmol/L
L-Arginine-HCl 84 0.3987
L-Cystine-2HCl 62.57 0.1998
L-Glutamine 584 3.9959
Glycine 30 0.3996
L-Histidine-HCl-H20 42 0.2004
L-Isoleucine 104.8 0.7989
L-Leucine 104.8 0.799
L-Lysine-HCl 146.2 0.8004
L-Methionine 30 0.2011
L-Phenylalanine 66 0.3995
L-Serine 42 0.3997
L-Threonine 95.2 0.7992
L-Tryptophan 16 0.0783
L-Tyrosine-2Na-2H20 103.79 0.3974
L-Valine 93.6 0.799
Vitamins mg/L mmol/L
Calcium D-pantothenate 4 0.0084
D-Pantothenic acid Na salt 0 0
Choline chloride 4 0.0286
Folic acid 4 0.0091
Myo-inositol 7 0.0389
Niacinamide 4 0.0328
Pyridoxine-HCl 4 0.0195
Riboflavin 0.4 0.0011
Thiamine-HCl 4 0.0119
Other mg/L mmol/L
D-Glucose 4500 24.9778
HEPES 0 0
Phenol red-Na 15.9 0.0422
Sodium pyruvate 110 0.9996
Sodium bicarbonate 3700 44.0424
기존 및 젤라틴이 코팅된 플레이트(plate)에서 배양된 세포를 모유두세포로 분화를 유도시키기 위해, 0.01 mM 레티노익산, 10% 우태아혈청 및 1×페니실린/스트렙토마이신 등이 첨가된 DMEM/HIGH GLUCOSE 분화배지를 5% CO2 및 37℃의 온도에서 6 well plate 기준 2 ml 취하여 3일간 배양하였다. 이때, 3일간 매일 한번씩 교체해주었으며, 기존 배양배지를 제거(suction)한 뒤, 파이펫을 이용하여 DMEM/HIGH GLUCOSE 분화배지 2 ml로 교체하였다.
그 후, 20 ng/ml 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 200 ng/ml 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 1 μM 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3′-oxime), 10% 우태아혈청 및 1×페니실린/스트렙토마이신 등이 첨가된 DMEM/HIGH GLUCOSE 분화배지를 5% CO2 및 37℃의 온도에서 6 well plate 기준 2 ml 취하여 4일간 배양하였다. 이때, 4일간 매일 한번씩 교체해주었으며, 기존 배양배지를 제거(suction)한 뒤, 파이펫을 이용하여 DMEM/HIGH GLUCOSE 분화배지 2 ml로 교체하여 분화를 유도하였다.
2) 유전자 발현 양상을 통한 인간지방 유래 중간엽 줄기세포 유래 모유두세포 특성 확인
상기 방법에 따라 분화시킨 인간지방 유래 중간엽 줄기세포에 대하여 모유두세포와 특성이 유사한지 확인하기 위해 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)을 통해 모유두세포의 특이적 유전자인 LEF-1, Corin, Wnt5a의 유전자 발현양상을 검증하였다.
인간지방 유래 중간엽 줄기세포, 모유두세포 및 분화시킨 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 클로로포름(Chloroform), 이소프로판올(Isopropanol)을 이용하여 총 RNA를 분리하였다. 상기 RNA를 주형으로 Maxima First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher)를 이용해 cDNA를 합성하였다. 이후 EmeraldAmp® GT PCR Master Mix (Takara Bio)를 이용해 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응 분석을 실시하였으며, 사용한 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
유전자 방향 서열 (5'-3')
LEF-1 Forward GAGAGCGAATGTCGTTCGTG
Reverse GGGTGCTGATGGATAGCTGGT
Corin Forward GTCATTTCAAGTGCCGCTCA
Reverse GGTTTGCACATTCCAGCTCA
Wnt5a Forward TGAACCTGCACAACAACGAG
Reverse TGACCTGTACCAACTTGCCC
β-actin Forward GAGCACAGAGCCTCGCCTTT
Reverse AGAGGCGTACAGGGATAGCA
그 결과, 도 1과 같이 인간지방 유래 중간엽 줄기세포(ADSC)와 비교하여, 모유두세포(DPC) 및 상기 방법으로 분화시킨 인간지방 유래 중간엽 줄기세포(dADSC)에서 모유두세포의 특이적 유전자인 LEF-1, Corin, Wnt5a의 유전자 발현양상이 증가하는 것을 확인하였다.
3) 유세포 분석(FACS)을 통한 인간지방 유래 중간엽 줄기세포 유래 모유두세포 특성 확인
상기 방법에 따라 분화시킨 인간지방 유래 중간엽 줄기세포에 대하여 모유두세포의 특이적 유전자인 LEF-1, Corin, Wnt5a를 통해 분화능을 확인하고자 하였다.
분화시킨 인간지방 유래 중간엽 줄기세포(dADSC) 및 모유두세포(DPC)를 0.05% 트립신/0.02% EDTA를 처리하여 세포를 떼어낸 후, 2 x 105 세포/ml의 농도로 맞추었으며, 세포용액을 Fc receptors blocking하였다. 그 뒤, Fixation/Permeabilization solution kit (BDCytofix/Cytoperm™ 社) kit의 고정 용액(Fixation solution)을 이용하여 세포를 고정시켰으며, 모유두세포 특이적 유전자인 LEF-1, Corin, Wnt5a를 삼투성 용액(Permeabilization solution)을 이용하여 염색시켰다. 염색시킨 세포를 착색 용액(Staining solution)으로 세척하여 새로운 착색 용액(Staining solution)으로 세포를 현탁시킨 뒤, 유세포 측정기(FACScalibur, BD science) 및 셀퀘스트(CELLQUEST software; BD science)로 세포를 분석하였다.
그 결과, 도 2와 같이 분화시킨 인간지방 유래 중간엽 줄기세포(dADSC)가 원래의 인간지방 유래 중간엽 줄기세포(ADSC)와 비교하여 모유두세포 특이적 유전자인 LEF-1, Corin, Wnt5a에 대해 양성인 세포의 비율이 90% 이상으로 확인되었고, 이는 모유두세포와 유사하였다.

Claims (4)

  1. 플레이트 내부에 젤라틴이 코팅되되, 1차 분화용 배지와 2차 분화용 배지를 이용하여 인간지방 유래 중간엽 줄기세포로부터 모유두세포로의 분화를 유도하기 위한 것이고,
    상기 1차 분화용 배지는, 동물세포배양용 배지에 레티노익산(retinoic acid), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가되어 조성된 것이며,
    상기 2차 분화용 배지는, 동물세포배양용 배지에 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3′-oxime), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가되어 조성된 것을 특징으로 하는 모유두세포 분화 유도용 플레이트.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 플레이트는,
    폴리스티렌(Polystyrene) 플레이트인 것을 특징으로 하는 모유두세포 분화 유도용 플레이트.
  3. 삭제
  4. 내부에 젤라틴이 코팅된 플레이트에 동물세포배양용 배지를 첨가하고, 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 로딩하여 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계 (a);
    상기 단계 (a)의 동물세포배양용 배지에서 배양된 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 1차 분화용 배지로 교체하여 배양하는 단계 (b);
    상기 단계 (b)의 1차 분화용 배지에서 배양된 인간지방 유래 중간엽 줄기세포를 2차 분화용 배지로 교체하여 배양하는 단계 (c);를 포함하되,
    상기 단계 (b)의 1차 분화용 배지는, 동물세포배양용 배지에 레티노익산(retinoic acid), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가되어 조성된 것이며,
    상기 단계 (c)의 2차 분화용 배지는, 동물세포배양용 배지에 섬유아세포성장인자-2(fibroblast growth factor-2; bFGF), 골형성단백질 2(human recombinant BMP2), 글리코겐 합성카이네이즈 3α/β억제제(6-bromoindirubin-3′-oxime), 우태아혈청(FBS), 페니실린(penicillin) 및 스트렙토마이신(streptomycin)이 첨가되어 조성된 것이며,
    분화된 인간지방 유래 중간엽 줄기세포는 모유두세포의 유전자인 LEF-1, Corin 및 Wnt5a의 유전자 발현이 증가하는 것을 특징으로 하는 인간지방 유래 중간엽 줄기세포의 모유두세포로의 분화 유도 방법.
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