KR20220160142A - 소 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 소 배양육 생산을 위한 근육세포 배양용 배지 조성물 및 배양 방법에 관한 것으로, 소 근육줄기세포를 대상으로, 성장 단계에서, 산소 농도의 저감을 통하여 세포수 증식을 촉진하고, 분화 단계에서, 세포의 단백질 및 비타민의 양을 증가시킴으로써 DMEM/F12 기본 배양액에서 저농도의 혈청으로 근섬유의 형성이 가능함을 확인함으로써, 동물 유래 혈청의 농도를 최소화하면서 최고의 배양을 달성할 수 있는 배양 조건 및 방법을 제공한다.

Description

소 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법{Method of culturing muscle cells for producing cattle cultured meat}
본 발명은 소 배양육 생산을 위한 근육세포 배양용 배지 조성물 및 배양 방법에 관한 것이다.
최근 국제연합식량농업기구(FAO)의 보고에 따르면, 세계 인류는 2018년 기준 76억 4천만명에서, 2050년 92억명으로 매년 0.6% 증가할 것으로 예측된다. 늘어나는 인구의 유지에 가장 주요한 영양소 중의 하나인 필수 아미노산은 체내에서 합성되지 않거나 합성이 되어도 양이 매우 적어 반드시 음식으로 섭취해야만 하는 영양분이다. 필수아미노산을 공급하기 위해 필요한 육류 소비량은 2018년 304만 톤에서 매년 1.3%씩 증가하여 2050년에는 455만 톤에 이를 것으로 전망된다. 그러나 이와 같은 단백질 수요의 증가를 전통적인 축산물 생산방식으로 감당하기에는 한계가 있으며, 이에 부족한 단백질 수요의 일부를 대체 축산물로 전환할 필요가 있다는 의견이 강하게 대두되고 있다.
한편 미래의 인구 증가에 따른 식량 부족은 그에 따르는 환경문제, 윤리문제 등 다양한 이슈를 포함하고 있어, 이 각 분야에 모두 대응할 수 있는 인공육이 필요하다. 대체 식량 가운데서 단백질 수요 충족을 위한 축산물을 대체할 수 있는 대체 축산물은 기존 육류 대비 자원 투입량과 온실가스 사용량이 전반적으로 낮고 악취 등 환경오염물질 발생이 적다는 장점이 있으며, 건강에 도움이 되는 요소를 가지고 있다.
대체축산물의 대표주자가 인공육 (artificial meat)이다. 인공육은 크게 식물성 원료를 가공하여 인공육의 맛과 영향을 흉내 내는 방식과 동물의 세포를 배양하여 특정한 공간과 조건에서 육류를 배양해내는 방식으로 나눌 수 있다. 이러한 인공육은 안전성 측면에서도 기존의 육류보다 일부 우수한 점이 있다고 알려져 있다.
전통적으로 인공육을 만들기 위한 재료로서 가장 주목을 받은 것은 콩이다. 최근 가장 각광받는 콩기반 육류 기업인 비욘드미트 (Beyond Meat)는 식물에서 추출한 단백질을 이용하여 고기와 비슷한 형태와 식감의 가공식품을 만든다. 또한 옴니포크 (OmniPork)사는 버섯과 콩을 원료로 인공 돼지고기를 만들고 이를 이용한 돼지고기 대체식품을 만들어 각광을 받고 있다.
한편, 식물성 원료와는 다른 기술을 이용하여 동물성 단백질을 모방한 인공육 중에서 배양육 (cultured meat)이 주목받고 있다. 배양육 생산의 생명주기평가 (life cycle assessment, LCA)에 따르면 배양육은 전통적인 축산방식으로 고기를 생산하는 경우보다 토지 사용량은 99%, 가스 배출량은 96%, 에너지 소비량은 45%를 줄일 수 있어 환경오염에 대한 부담을 덜 수 있을 것으로 보이며, 열악한 사육 환경, 도축과 관련된 동물 복지 측면에서도 이점이 있다.
배양육은 줄기세포를 분화시켜 근육 조직으로 배양하므로 장기, 뇌, 골격 같은 부차적인 기관이 필요 없어 배양 과정만 본다면 영양소와 에너지 소모량이 상대적으로 적은 특징이 있다. 그러나 현재의 세포배양 기술 수준에서는 세포 배양에 높은 수준의 위생 체계를 유지해야 하며, 그에 따른 에너지 투입을 생각해 볼 때 영양소와 에너지 소모량이 적다고 단정하기는 힘든 상황이다.
배양육이 기존 육류에 비해 가지는 다양한 장점이 현실화되기 위해서는 충분히 경제적이고 친환경적인 배지가 필수적이다. 배양육 배양용 배지는 다양한 영양성분을 함유하고 있을 뿐만 아니라 근아세포의 성장과 분화에 필요한 성장인자를 함유하고 근관 조직이 근육으로 발달하기에 적합해야 한다. 성장인자는 근세포가 성장하면서 합성되기도 하고 근세포 자체가 외부로 분비하기도 한다. 또한 주변에 존재하거나 (paracrine effect) 더 멀리 떨어진 다른 종류의 세포에서 제공받기도 (endocrine effect)한다.
따라서 배지 제조단계에서 배지에 직접 첨가하는 방법 이외에도, 주변에서 다른 세포를 배양함으로써 필요한 성장인자를 공급받을 수 있다. 영양성분의 측면에서는 가장 중요한 것이 혈청 (serum)이다. 배양육을 생산하기 위한 배지의 주요 성분 가운데 송아지 혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 있다. FBS는 세포 배양 배지에서 보편적으로 사용되는 필수 성분이지만, 이를 수확하고 생산함에 있어서 송아지를 살육해야 하는데 따르는 심각한 과학적 및 윤리적 우려가 존재한다.
배양육 생산을 위한 세포 배양 배지에는 말이나 소의 태아 혈청이 필요하며, 이 혈청은 임신우를 도축하여 얻고 있어 배양육 생산이 증가할수록 가축 도축도 증가하는 구조이므로, 이는 배양육 개발의 원 취지와 맞지 않다. 따라서, 혈청의 농도를 최소한으로 하면서 최고의 배양을 달성할 수 있는 배양 환경의 구축이 필요한 실정이다.
배양육에 관한 연구로는 한국공개특허 10-2020-0071061 "배양된 육류 조성물"에 3차원 스캐폴드와 근아세포 또는 이의 전구세포, 세포외 매트릭스 (ECM)-분비 세포 및 내피 세포 또는 이의 전구세포를 포함하는 복수세포 유형을 인큐베이팅하는 단계 및 근아세포의 근관으로의 분화를 유도하는 단계를 포함하는 식용 조성물의 제조 방법이 개시되어 있다.
또한, 동물세포 배양을 위한 배양 조건 및 방법에 관한 연구로는, 한국공개특허 10-2014-0103759 "동물세포 배양용 무혈청 배지 및 이를 이용한 피부상태 개선용 조성물"에 동물세포 배양을 위한 무혈청 배지의 구성성분을 의약품 또는 화장품의 원료로 허용된 성분으로 구성하고 무기염, 아미노산, 비타민의 조성 성분과 함량을 변경함으로써 제형의 안정성을 증가시키며, 배지 조성에 사이토카인 조합을 첨가하여 피부 세포를 무혈청 배지 조건에서 혈청 함유 배지의 세포 성장율과 비슷한 정도로 배양시키는 방법을 개시하였고, 한국공개특허 10-2013-0008293은 저산소 조건에서 배양한 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 이용한 성장인자의 대량생산 방법 및 피부 재생용 조성물에 관한 것으로, 저산소 상태에서 양수 내 태아 유래 중간엽 줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 중간엽 줄기세포의 대량 증식 방법 및 이를 이용하여 제조한 컨디션드 배지 조성물, 인간 성장인자의 대량생산 방법 및 상기 조성물을 이용한 피부 재생용 조성물을 개시하였다.
본 발명은 소 배양육 개발을 위한 근육세포 배양용 배지 및 배양 방법에 관한 것으로, 본 발명자들은 동물 유래 혈청의 농도를 최소한으로 하면서 최고의 배양을 달성할 수 있는 배양 조건 및 방법을 연구하던 중, 산소 농도를 저감하여 근육줄기세포의 증식을 촉진시키고, 단백질, 비타민 등 영양소의 양을 증가시킴으로써 혈청의 사용을 감소시킨 조건에서 근육줄기세포를 근관으로 분화시키는 배양 방법을 확립함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 소 배양육 생산을 위한 근육세포 배양용 배지 조성물 및 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은
1) 소의 골격근 (skeletal muscle) 조직에서 근육줄기세포를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포를 산소 5 내지 20% 및 혈청 농도 5 내지 20 중량% 의 상태에서 배양하여 미분화 근육줄기세포를 증식 (proliferation) 시키는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 미분화 근육줄기세포를 산소 5 내지 20% 및 혈청 농도 0 내지 5 중량%의 배지 조건에서 배양하여 근섬유 (myofiber) 로 분화 (differentiation) 시키는 단계;를 포함하는, 소 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법을 제공한다.
본 발명은 동물 유래 혈청을 최소한으로 사용하면서 근육 세포를 증식 및 분화시킬 수 있는 배양용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 근육세포 배양 방법을 이용하여, 동물 유래 혈청을 최소한으로 사용하는 배양육 배양방법을 개발할 수 있다.
도1은 소의 골격근으로부터 근육줄기세포를 분리하는 과정을 보여주는 그림이다.
도2는 fibroblast like cell만을 3번 제거한 세포 (a) 와 CD56+/CD29+ 항체를 가지고 분별된 세포 (b)의 체외 분화능을 비교한 그림이다.
도3은 세포 성장 시, 배양액에 따른 세포의 증식능을 나타낸 그림이다.
도4는 혈청 및 산소 농도에 따른 세포수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도5는 혈청 및 산소 농도에 따른 근육 줄기세포 전사 인자들의 발현을 나타낸 그래프이다.
도6은 1주간 배양된 근육 세포에서 혈청 및 산소 농도에 따른 증식 관련 인자의 발현을 나타낸 그래프이다.
도7은 2주간 배양된 근육 세포에서 혈청 및 산소 농도에 따른 증식 관련 인자의 발현을 나타낸 그래프이다.
도8은 F10 배양액에서 혈청 및 산소 농도에 따른 분화 관련 인자의 발현을 나타낸 그래프이다.
도9는 DMEM/F12 배양액에서 혈청 및 산소 농도에 따른 분화 관련 인자의 발현을 나타낸 그래프이다.
도10은 PROMOCELL 무혈청 배양액에서 산소 농도에 따른 분화 관련 인자의 발현을 나타낸 그래프이다.
도11은 PROMOCELL 무혈청 배양액에서 산소 농도에 따른 분화된 세포 (A), 전체 핵의 수 (B), 전체 근관세포의 수 (C) 및 근관세포 핵 융합률 (D)를 나타낸 것이다.
도 12a는 DMEM/F12 배양액에 20% 산소 조건에서, 혈청 농도에 따른 분화된 세포 , 도 12b는 전체 핵의 수 (B), 전체 근관세포의 수 (C) 및 근관세포 핵 융합률 (D)를 나타낸 것이다.
도 13은 배양육 배양을 위한 소 골격근 세포의 증식 및 분화 모식도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은
1) 소의 골격근 (skeletal muscle) 조직에서 근육줄기세포를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포를 산소 0 내지 5% 및 혈청 농도 5 내지 20 중량% 의 상태에서 배양하여 미분화 근육줄기세포를 증식 (proliferation) 시키는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 미분화 근육줄기세포를 산소 5 내지 20% 및 혈청 농도 0 내지 5 중량%의 배지 조건에서 배양하여 근섬유 (myofiber) 로 분화 (differentiation) 시키는 단계;를 포함하는, 소 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법을 제공한다.
배양육의 생산 방법은 근육 내의 세포를 근육으로부터 분리하고 (isolation), 증식시키고 (proliferation), 근육의 형태로 분화 (differentiation) 시키는 과정을 포함한다.
이때 사용되는 세포는 근육줄기세포 (Myosatellite cell)로, 상기 세포는 체내에서 근섬유 주변에 있다가 근육이 자극을 받거나 상처를 입으면 분열하고 근육을 만드는 역할을 한다.
근육줄기세포는 크게 근육위성세포(myosatellite cells, 비활성화 상태)와 근아세포 (myoblasts, 활성화 상태)로 나뉘며, 태아의 발생단계에서 근육 전구세포의 일부는 출생의 전후로 생장정지상태의 근육위성세포로 발달하여 근섬유의 기저판에 생착한다.
이 세포들은 상처 등 외부 자극에 의해 활성화되어 분열이 가능한 근아세포로 분화를 하여 최종적으로 근육 세포/조직을 형성하며, 두 근육줄기세포는 근육 생장을 위하여 적절하게 평형을 이루며 상호 변환이 가능하다.
근육 생성 유도 인자들은 근세포 내에서 PI3K(phosphatidylinositol-3 kinase)/ Akt 경로를 활성화시키고 그에 따라 하위 단계의 단백질을 인산화 함으로써 근육 단백질 합성을 유도한다.
근아세포의 분화와 근육 형성은 다양한 인자들에 의해 조절된다. 그 중, MyoD는 근아세포의 근육 분화와 관련된 특이적 유전자의 발현을 개시하여, 근아세포의 분화를 유도한다. MyoD에 의해 조절되는 미오게닌과 MHC(myosin heavy chain)은 근아세포의 융합(fusion)을 유도하여, 근관세포(myotube)와 근섬유가 형성되도록 한다. 이 같은 과정을 통해 형성된 근관세포 및 근섬유는 다발을 이루어 최종적으로 근육을 형성하게 된다.
현재 대부분의 배양육 생산을 위한 연구는 살아있는 가축 혹은 도축된 도체에서 채취한 근육 조직으로부터 근육줄기세포를 분리하여 진행이 되고 있다. 채취한 근육 조직을 절편하여 단백질분해효소를 이용해 단일 세포로 해리시킨 후에, 밀도구배 원심분리법, 세포 부착 시간차에 의한 분리법, 사이토카라신 B 처리법이나 근육줄기세포의 표면 마커인자 (integrin α7, SM/C-26, CD34, CD56, CD29 등)을 이용하여 근육줄기세포만을 분리하는 것이 보편적인 방법이다.
분리된 근육줄기세포는 배양접시에서 성장인자 (EGF, IGF, FGF, HGF 등)와 분화억제인자 (Rock 신호전달 억제, BMP 신호전달 억제, p38 신호전달 억제 등)를 포함한 배양액에서 증식된다.
본 발명의 배양액은 in vitro 상에서 근육줄기세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 수득한 근육줄기세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함하며, 세포의 종류에 따라 배지 및 배양 조건을 선택할 수 있다.
배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium; CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소성분을 포함한다.
세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), A-DMEM, MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium) 및 IMEM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신 (streptomycin) 또는 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.
동물세포를 배양함에 있어서, 미생물 등에 의한 오염은 빈번하게 발생하고, 이러한 오염은 세포의 성장 및 생존율에 영향을 주기 때문에 반드시 차단해야 한다.
특히, 배양육 생산과 같이 가축의 도체로부터 세포를 추출하여 기초배양을 진행할 경우 더욱 주의를 요하며, 이에 다양한 균으로부터 오염을 차단하기 위하여 다양한 항생제 및 항진균제 등이 근육줄기세포 배양에 사용되어 왔다.
하지만 식품에 항생제 잔여 문제와 과도한 섭취시 발생하는 부작용이 있기 때문에 배양육 생산을 위한 근육줄기세포의 배양에 항생제를 사용하는 경우 세심한 주의가 필요하다.
상기와 같이 알려진 항생제 이외에도 마이코플라즈마 (mycoplasma)에 의한 오염을 방지하는 물질도 배양에 함께 사용된다.
마이코플라즈마의 경우, 일반적인 균과 다르게 세포벽이 없고, 항생제에 저항성을 지니고 있어 감염이 되면 세포에 큰 피해를 주기 때문에, 이를 방지하기 위하여 마이코플라즈마 특이적인 항생물질들이 (예: PlasmocinTM prophylactic) 시판되고 있다.
세포신호전달 물질(Cellular signaling molecules) 은 세포가 성장하고 유지되기 위하여 필수적인 인자이다.
상기 물질은 내분비기관과 주변 기질세포로부터 분비되는 물질로써, 세포의 막 혹은 세포질에 존재하는 수용체와 결합하여 세포의 성장과 분화에 관여하는 신호전달체계를 활성화시킨다. 따라서, 이들의 다양한 조합을 통하여 세포의 성장, 분화 등의 특성을 조절하고 유지할 수 있다.
상기 신호전달물질은 하기와 같지만, 이들로 한정되지 않는다.
PDGF, 예를 들면, PDGF AA, PDGF BB; IGF, 예를 들면, IGF-I, IGF-II;
섬유아세포 성장 인자(FGF), 예를 들면, 산성 FGF, 염기성 FGF, β-내피 세포 성장 인자, FGF 4, FGF 5, FGF 6, FGF 7, FGF 8 및 FGF 9;
형질전환 성장 인자(TGF), 예를 들면, TGF-P1, TGF β12, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β5;
골 형성 단백질(BMP), 예를 들면, BMP 1, BMP 2, BMP 3, BMP 4;
혈관 내피 성장 인자(VEGF), 예를 들면, VEGF, 태반 성장 인자;
표피 성장 인자(EGF), 예를 들면, EGF, 암피레귤린, 베타셀룰린, 헤파린 결합 EGF;
인터류킨, 예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14;
콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들면, CSF-G, CSF-GM, CSF-M;
신경 성장 인자(NGF); 줄기 세포 인자; 간세포 성장 인자, 및 모양체 신경영양인자를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
아미노산은 (amino acids) 단백질을 형성하는 기본 단위로 배양액에 첨가되는 필수 요소이다. 이들은 세포 배양액에 첨가되어 단백질의 합성에 사용되며 세포의 성장을 도울 뿐 아니라, 에너지 생산에 활용되기도 한다.
생체 내에서 활용되는 아미노산은 20종으로, 생체 내에서 합성이 가능한 비필수아미노산 (nonessential amino acids)과 합성이 불가능하여 음식으로 반드시 섭취하여야 하는 필수아미노산 (essential amino acids)이 존재한다.
일반적인 동물세포 배양용 무혈청 배지로 사용되는 아미노산 성분 중에서 글루타민(L-glutamine)은 배제된다.
글루타민(L-glutamine)은 비필수아미노산의 일종으로 단백질의 합성에도 이용될 뿐만 아니라 탄수화물과 함께 에너지원으로 사용이 가능하기 때문에 배양액에 필수적으로 첨가되는 요소 중 하나이지만, 글루타민이 산화되면서 배양액에 암모니아가 축적되어 세포 독성을 띄는 경우가 있고, 수용액 상태에서 반감기가 매우 짧아 사용 직전에 배양액에 첨가하여 사용하거나, 또는 독성 암모니아 축적을 최소화하고 넓은 온도 범위에서 안정적인 글루타민 대체품 (GlutaMAX™) 을 사용할 수 있으며, 글루타민 대체품이 첨가되어 있는 상태로 시판되는 배양 배지를 사용할 수도 있다.
아미노산의 바람직한 성분으로는 알지닌(L-Arginine), 시스테인(L-Cystine), 글라이신 (Glycine), 히스티딘(L-Histidine), 이소류신(L-Isoleucine), 류신(L-Leucine), 라이신(L-Lysine), 메치오닌 (L-Methionine), 페닐알라닌(L-Phenylalanine), 세린(L-Serine), 트레오닌(L-Threonine), 트립토판(LTryptophan), 타이로신(L-Tyrosine), 프롤린(L-Proline), 알라닌(L-Alanine), 아스파라긴(L-Asparagine), 발린(L-Valine) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 바람직하다.
상기 염으로는 염산염(HCl), 아세트산염(CH3COOH) 등이 사용될 수 있다.
비타민은 세포활성 유지에 필요하며, 바람직한 성분으로는 엽산(Folic Acid), 이노시톨(Myo-Inositol), 나이아신아마이드(Niacinamide), 피리독신(Pyridoxine), 바이오틴(Biotin), 리보플라빈(Riboflavin), 티아민(Thiamine) 및 이들의 염으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 바람직하다.
상기 염으로는 염산염(HCl), 아세트산염(CH3COOH) 등이 가능하다.
무기염은 세포의 기능 발현을 조절하는 역할을 하며, 바람직한 성분으로는 칼슘클로라이드(CaCl2, anhydrous), 포타슘클로라이드(KCl), 소듐클로라이드(NaCl), 카퍼셀페이트(CuSO4·5H2O), 페릭셀페이트(FeSO4·7H2O) 마그네슘클로라이드(MgCl2), 디소듐포스페이트(Na2HPO4), 징크설페이트(ZnSO4·7H2O) 및 소듐포스페이트 (NaH2PO4·H2O)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 바람직하다.
상기 단계 1)의 미분화 근육줄기세포를 분리하는 단계는 세포 성장 속도 및 분류기 (sorter)를 이용하여 진행된다.
상기 세포 성장 속도를 이용한 분리 방법은 Richler 등(1970, 이스라엘)이 고안한 세포의 특성 별로 배양 접시에 붙는 시간차를 이용하여 근육 조직에서 얻은 세포 군집에서 근육 줄기세포와 섬유아세포 및 상피세포를 분리하는 기법 (pre-plating 기법) 이다.
섬유아세포와 상피세포는 상대적으로 근육줄기세포보다 배양접시에 부착하여 성장하는 시간이 빠르기 때문에 트립신 등을 이용해 단일세포로 해리된 세포들을 새로운 배양 접시로 옮겨 계대배양을 진행하여 1 내지 2시간 후 배양 접시에 붙지 않은 세포와 배양액을 수거하면 근육줄기세포를 회수할 수 있다.
본 발명의 근육줄기세포는 살아있는 소의 엉덩이와 뒷다리 사이의 골격근과 등심에서 수득할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 수득한 근육줄기세포는 생체 외에서 배양할 수 있다.
상기 단계 2)는 일반적인 세포 배양 조건의 산소량보다 적은 양의 산소가 존재하는 저산소 (hypoxia) 상태를 의미한다.
상기 단계 2)의 저산소 상태는 산소 농도가 5 내지 20% 인 상태일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 2)의 저산소 상태는 7일 내지 15일 동안 유지될 수 있다.
상기 단계 2)의 세포는 근육줄기세포 인자인 MYF5, MYOD, MYOG 및 MYH1의 발현이 높게 나타날 수 있다.
상기 단계 2)의 세포는 근육세포 사멸 관련 인자인 P53 및 P21 의 발현이 낮게 나타날 수 있다.
상기 단계 2)의 세포는 증식 유전자인 C-MYC의 발현이 높게 나타날 수 있다.
분화(differentiation)란 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 세포의 구조나 기능이 특수화되는 현상을 의미한다.
상기 단계 3)의 저혈청 배지는 FBS를 배지의 0 내지 5 중량% 함유할 수 있고, 0 내지 3 중량% 함유할 수 있고, 바람직하게는 0 내지 2 중량% 함유할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 3)의 세포는 분화관련 인자인 MYF5, MYOG, MYH1의 발현이 높게 나타날 수 있다.
상기 단계 3)의 세포는 세포의 융합에 의해 다핵의 근관세포로 분화된 상태일 수 있다.
상기 근관세포는 핵융합율이 증가한 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것이며, 본 발명의 권리 범위는 이에 한정되는 것은 아니고 청구 범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리 범위에 속하는 것이다.
<실시예1> 소 근육줄기세포 분리
소의 골격근 유래 줄기세포를 회수를 위해 소의 엉덩이와 뒷다리 사이의 골격근과 등심, 골격근을 200g 을 회수하고 실험실로 이동하여 무균 상태에서 필요로 하는 조직만을 회수하였다.
세절된 조직에 collagenase를 첨가하여 30분간 인큐베이터 속에서 배양을 실시하였다. 효소가 처리된 조직은 피펫팅과 10ml의 주사기를 사용하여 반복적인 흡입과 방출을 통해 세포의 분리를 시도하였다. 세포가 충분히 분리된 후 FBS을 30% 첨가하여 효소를 불활성화 시키고 D-PBS를 사용하여 2회 수세를 원심분리기를 통해 실시하였다.
최종적으로 세포의 펠렛들은 세포 배양액으로 희석 하고 collagen coated 25 T flask에 seeding 하였다. 2시간 후 상층액을 모두 회수하여 새로운 collagen coated 25 T flask로 이동 하였다.
빠르게 부착되는 세포인 섬유아세포가 대부분인 Rapid adhering cell (RAC)과 섬유아세포에 비하여 상대적으로 천천히 부착되는 myoblast, satellite cells (muscle derived stem like cells (MDSCs) 로 명명함)로 이루어진 slowly adhering cell (SAC)을 부착 기간별 세포의 특성을 검정하여 세포를 분리 (Wu 등, 2010, Cell Tissue Res)하였다.
그 후 16-18 시간 간격으로 같은 방법으로 총 4번을 추가적으로 실시하였다. 상층액이 회수되고 남은 flask들은 새로운 배양액을 5 ml 넣어주고 추가적인 배양을 인큐베이터 속에서 실시하였다.
CD56+/CD29+ 단클론 항체를 이용하여 분리된 세포와 fibroblast like 세포를 3번 제거하는 방법을 이용하여 분리된 세포에서 체외 근섬유 분화능력을 관찰 및 비교한 결과, 두군 간에 체외에서 7일간 분화 시 분화능에 차이가 없음을 확인하였고 (도2 a 및 b), 경제성과 효율성 측면에서 fibroblast like cell을 3번 제거하는 방법으로 실험을 진행하였다.
<실시예2> 소 근육줄기세포 증식
2-1. 배양액에 따른 근육줄기세포의 증식증 비교
소 근육세포의 성장시(proliferation), 배양액에 따른 근육줄기세포의 증식능을 확인하였다.
저농도 혈청 promocell 배양액 (+ 5% 혈청과 혈청대체물의 조합) 으로 배양시, 세포의 형태 변화와 빠른 노화가 관찰되었고, DMEM/F12 배양액 (+ 20% 혈청)은 정상적인 세포의 형태 및 빠른 성장을 보였으므로, DMEM/F12 배양액을 성장용 배양 배지로 사용하였다 (도3).
2-2. 혈청 및 산소 농도에 따른 근육줄기세포 증식능 확인
저농도 혈청 (5% 혈청 또는 혈청대체물 조합) 상태 및 저산소 (5% 산소)에서 세포의 증식능을 확인하였다.
24 well에 1000 muscle cell/well을 seeding 후 2주간 배양하고 2일 간격으로 세포를 회수하여 세포수를 측정하였다. 배지는 기본 배양액으로 DMEM/F12에 혈청과 항생제 등을 첨가하여 배양하였다.
그 결과, 같은 혈청 농도 내에서 5% 산소는 세포의 성장을 약 2배 이상 증가시켰고, 20% 산소에서 10%와 20% 혈청 첨가는 세포 수 증식에 동등한 효과를 보였으며, 5% 혈청/20% 산소는 20% 혈청/5%산소 조건보다 4배 낮은 세포수 감소 효과를 보였다 (도4).
상기 결과는 세포의 증식 단계에서, 근육세포는 산소보다 혈청 농도에 더 많은 영향을 받고, 같은 혈청 농도에서는 산소의 저감이 세포의 성장을 촉진시킴을 의미한다.
2-3. 혈청 및 산소 농도에 따른 근육줄기세포 표지인자의 발현량 확인
체외에서 7일간 배양시 혈청 및 산소 농도에 따른 근육 줄기세포(Satellite cell) 표지인자의 발현량을 정량 PCR을 통해 확인하였다.
이하 실험에 사용된 PCR 프라이머를 하기 표 1에 기재하였다.
Primer Name Sequence
bGAPDH_F TGCCGCCTGGAGAAACC
bGAPDH_R CGCCTGCTTCACCACCTT
bPAX3_F CCCAGAGGGCAAAGCTTACA
bPAX3_R ACGGCGGTTGCTAAACCA
bMyoD_F CACGTCTAGCAACCCAAACCA
bMyoD_R ATGGCGTTGCGCAGGAT
bMYF5_F CAGCCTCTCTCTCCCCAGTTG
bMYF5_R AGGCCCCTGGAGTTGCA
bBeta-actin_F CCTGCGGCATTCACGAA
bBeta-actin_R GCGGATGTCGACGTCACA
b MyoG_F CCGCCACGCTGAGAGAGA
b MyoG_R GGCCTCGAAGGCTTCATTC
bvimentin_F TCACCTGCGCGAATACCA
bvimentin_R CGATGTCGAGCGCCATCT
bMYH1 F GCCAGACTGTAGAGCAGGTATATAACG
bMYH1 R GCAACCATCCACAGGAACATC
bTERT F GCAGGTCCTACATCCAGTGTCA
bTERT R TCCATGTCCCCATAGCAGAAG
p21(CDKN1A) F CTCCCAGGGCCGGAAA
p21(CDKN1A) R GCGTTTGGAGTGGTAGAAATCTG
bTP53 F TTACGCGCGGAGTATTTGG
bTP53 R GGCACCACCACACTGTGTCTA
bMYC F CATCCTGTCGGTCCAAGCA
bMYC R CTCTTCTGCAACACGTCTATTTCTG
도 5에서와 같이, 3가지 산소농도(20 vs. 10 vs. 5%)와 3가지 혈청(20 vs. 10 vs. 5%) 농도 조건에서,
미분화 근육 줄기세포 특성 유지에 관련된 PAX3, PAX7, MYOD1의 발현량은 1-1.5 수준으로 산소와 혈청 농도에 큰 영향을 받지 않았다.
그러나 근섬유로의 분화 및 성숙에 관련된 유전자인 MYF5, MYOG, MYH1의 경우 혈청 농도 감소 시 유전자 발현량이 증가함을 확인 하였다. 근관섬유들에서 과 발현되는 MYF6는 변화가 없었다.
상기 결과는 성장 배지에서 근육세포는 산소보다 혈청 농도에 더 많은 영향을 받고 같은 혈청 농도에서는 산소 저감이 세포의 성장촉진에 따른 myocyte로 가는 유전자를 활성화시킴을 의미한다.
2-4. 혈청 및 산소 농도에 따른 근육줄기세포(Satellite cell)의 세포 수명 관련 및 증식 관련 유전자 발현량 확인
체외에서 14일간 배양 시 혈청 및 산소 농도에 따른 근육줄기세포(Satellite cell)의 세포 수명 관련 및 증식 관련 유전자 발현량을 확인하였다.
성장 배양 7일차에, 혈청 농도의 저감은 세포사 경로 관련 인자인 CDKN1A(P21), TP53, BAX, BCL2의 발현을 감소시켰다 (도6).
성장 배양 14일차에는, 혈청 농도의 저감은 cell cycle arrest 유전자 P21의 발현을 감소시켰으며, 20% 혈청은 세포 수명에 관여하는 telomere length의 복구 효소 TERT 발현을 감소시켰다 (도7).
또한, 혈청 농도 감소 의존적으로 p21의 감소와, 20% 혈청군내에서 산소 농도 저감 의존적 P21 감소를 확인할 수 있었다. 혈청 농도와 상관없이 증식 유전자인 MYC는 5% 산소 농도에서 유지가 되었다.
상기 결과는 20% 혈청은 세포의 증식을 활발하게 유도하여 세포의 노화로 이끌지만 10%와 5% 혈청은 상대적으로 낮은 증식력으로 인해 TERT와 P21이 보존되며, 20% 혈청군 내에서는 5% 산소군에서 P21과 MYC가 보존된다는 것을 의미한다.
<실시예3> 소 근육줄기세포 분화
3-1. 분화 배양액의 성분 및 혈청 농도에 따른 근육줄기세포 분화능 확인
근육줄기세포 분화 시, F-10 기본 배양액에 TGFB1를 첨가하는 경우 분화가 거의 되지 않았고, dexamethasone을 첨가하는 경우 역시 분화에 도움이 되지 않음을 확인하였다. 또한, IGF1 (Insulin like growth factor1) 첨가 시, 근육줄기세포 성숙에 긍정적인 효과가 있음을 확인하여 이후 진행되는 근육줄기세포 분화에는 기본 배양액에 IGF1을 첨가한 배양액을 사용하여 실험을 진행하였다.
Ham's F-10 분화 배양액(differntiation medium, DM)과 DMEM/F12 분화배양액(DM)을 이용하여 체외에서 7일간 분화유도 후 비교하였다.
DMEM/F12 (10565)배양액은 F-10 (11550) 배양액 보다 glucose, amino acid, vitamine을 2배 이상 함유하지만 두 배양액 모두 단백질과 성장 인자는 포함하고 있지 않았다.
근육세포들은 체외에서 5-7일간 분화 후 근섬유 발달과 근섬유의 융합에 따른 다핵 세포 분포를 확인하였다. 항체로는 monoclonal antimyosin heavychain (1:100, Sigma, Cat# M4276)를 사용하여 1:200 으로 염색하였고, 이차 항체로는 goat anti mouse IgG를 사용하여 1:200으로 염색하였다. 다음 결과 같이 세포들은 융합을 통해 다핵을 가짐을 확인할 수 있었다.
Ham's F-10 분화 배양액으로 배양한 경우,
5 VS. 2 VS. 0.5 % 혈청군을 비교한 결과, 혈청 농도는 분화에 크게 영향이 없음을 확인하였고, 산소 농도 저감도 근육의 분화에 영향을 미치지 못하지만, 5% 혈청, 5% 산소 상태에서는 myostatin (MSTN) 발현이 감소되었다 (도8).
DMEM/F12 분화배양액으로 배양한 경우,
5 VS. 2 VS. 0.5 % 혈청군 중 2% 혈청에서 Miogenesis의 마지막 단계 및 근 성숙에 관여하는 myog, myh1의 발현이 증가되었고, 근세포(myocyte)에서 분비되며 근세포의 성장을 저해하는 myostatin (MSTN) 발현이 감소되었다 (도9).
Ham’s F-10분화배양액으로 배양한 경우와 DMEM/F12 분화 배양액으로 배양한 경우를 비교해보면,
F10 배양액과 비교하여 DMEM/F12 배양액은, MYF5는 최대값들 비교하여 51배가 증가, Myog 3.7배 증가, MSTN최대값 비교하여 0.6 배 감소, myh1의 경우 44.8 배 증가시켰다.
이는 분화 배양액 조성이 중요하고(아미노산, 글루코스, 비타민량의 증가 in DMEM/F12)는 근세포의 분화 성숙에 기여하고, 혈청 농도는 5%에서 2%로 감소 가능함을 규명한 것이다.
3-2. 산소 농도에 따른 근육줄기세포 분화능 확인
무혈청 분화배양액에서 산소농도(5, 10, 20%)의 효과를 확인한 결과,
산소농도의 증가는 근섬유로의 분화와 성숙에 기여 하지 못함을 확인하였고 (도10), Myotube(핵이 3개이상 있는 것을 계산)에서 핵융합율 [myotube내에 핵수/전체핵수)X100] 에도 영향을 주지 못함을 확인하였다 (도11).
또한, DMEM/F12 분화배양액에서 20% 산소 및 0 내지 5% 혈청 농도에서 분화능을 확인한 결과, 무혈청(0%) 의 경우 융합율은 증가하지만 분화가 안된 세포들이 많이 사라져 전체 핵수의 감소로 인하여 융합율이 증가하였고, 20% 산소의 경우 혈청 5%-2%가 안정적인 융합율을 가짐을 확인하였다 (도12a 및 b).
상기 결과는 산소 농도의 증가는 근섬유로의 분화와 성숙에 기여하지 못하며, 분화 배양액 조성이 더 영향을 준다는 것을 의미한다.
상기 결과들을 바탕으로 최적의 성장 배양액과 분화 배양액 및 산소 조건을 정리하여 표 2에 나타냈다.
Medium Component company Final Concentration O2 %
Growth medium (GM) DMEM/F12 Thermo fisher 10565 5%,
FBS 20%
bFGF
Fibroblast growth factor		 Invitrogen 132560290-10 ug 10 ng/ml
HGF Gibco PHG0254-10 ug 10 ng/ml
IGF1
(Insulin like growth factor1)		 Sigma I3769-50 ug 10 ng/ml,
TGFB1 Sigma h8541-5ug 2 ng/ml
Dex
dexamethasone		 D8893-1MG
Gibco 10mM		 10 nM
Epidermal Growth Factor (EGF)
(recombinant human)		 10 ng / ml
Penicillin-Streptomycin sigma-p4533 1X
Differntiation medium (DM) DMEM/F12 Thermo fisher 10565 5-20%
FBS 0-2%
IGF1
(Insulin like growth factor1)		 Sigma I3769-50 ug 10 ng/ml,
Penicillin-Streptomycin sigma-p4533 1X

Claims (11)

1) 소의 골격근 (skeletal muscle) 조직에서 근육줄기세포를 분리하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 세포를 산소 5 내지 20% 및 혈청 농도 5 내지 20 중량% 의 상태에서 배양하여 미분화 근육줄기세포를 증식 (proliferation) 시키는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 미분화 근육줄기세포를 산소 5 내지 20% 및 혈청 농도 0 내지 5 중량%의 배지 조건에서 배양하여 근섬유 (myofiber) 로 분화 (differentiation) 시키는 단계;를 포함하는, 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 1)의 근육줄기세포는 소의 골격근 (skeletal muscle) 조직에서 추출하는 것을 특징으로 하는, 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 1)은 세포 성장 속도 및 분류기 (sorter)를 이용하는 것을 특징으로 하는, 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 2)는 7일 내지 15일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는, 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 2)의 세포는 줄기세포 특성 유지 관련 인자 (PAX3, PAX7 및 MYOD1)의 발현이 높아진 것을 특징으로 하는, 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 2)의 세포는 근육세포 사멸 관련 인자 (P53 및 P21)의 발현이 낮아진 것을 특징으로 하는, 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 2)의 세포는 증식 관련 인자 (C-MYC)의 발현이 높아진 것을 특징으로 하는, 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 3)의 배지는 IGF1 (Insulin like growth factor1)을 5 내지 20 ng/ml 의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는, 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 3)는 5일 내지 7일 동안 유지되는 것을 특징으로 하는, 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 3)의 세포는 분화 관련 인자 (MYF5, MYOG, MYH1)의 발현이 높아진 것을 특징으로 하는, 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 3) 세포는 핵융합율이 증가한 것을 특징으로 하는, 배양육 생산을 위한 근육세포 배양 방법.


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