KR101459674B1

KR101459674B1 - 녹용 세포의 배양 방법

Info

Publication number: KR101459674B1
Application number: KR1020130059130A
Authority: KR
Inventors: 류범용; 이장희; 김기중; 김용희
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2013-05-24
Publication date: 2014-11-10
Also published as: KR20130132323A

Abstract

본 발명은 녹용 세포를 L-글루타민(L-glutamine), 2-ME(2-mercaptoethanol), NEAA(non-essential amino acid) 및 HEPES((4-(2-hydroxyethyl)-1-peperazine- ethanesulfonic acid))로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 첨가물 및 유사인슐린 성장 인자-1(insulin-like growth factor-1; IGF-1), 표피 성장 인자(epidermal growth factor; EGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor; FGF)에서 선택된 하나 이상의 성장인자를 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 녹용 세포의 배양방법에 대한 것이다.
본 발명에 따른 녹용 세포 배양 방법은 기존의 방법에 비해 녹용 세포의 증식률을 현저히 향상시킬 수 있으므로, 녹용 세포를 경제적으로 대량생산할 수 있다는 장점이 있다.

Description

녹용 세포의 배양 방법{Method for culturing deer antler cell}

본 발명은 녹용 세포를 녹용 세포의 증식을 촉진하는 배지 및 배양 조건 하에서, 높은 증식률을 가지고 효율적으로 배양하는 방법에 대한 것이다.

녹용은 사슴의 뿔이 딱딱하게 각질화 되기 전의 뿔로서, 일반적으로 봄에 딱딱하게 묵은 뿔이 떨어지고 새 뿔이 자라기 시작하여 약 60~90일 정도에 자른 뿔을 의미한다. 가을이 되면 뿔의 성장이 멈추는 시기가 되며, 혈류가 차단되고 표면의 털이 거칠어지면서 서서히 벗겨지기 시작하고, 이 시기의 뿔을 녹각이라고 한다. 또한, 채취시기를 놓쳐 칼슘화된 후 단단해져서 저절로 떨어진 사슴의 뿔을 낙각이라고 한다.

녹용의 외면은 자갈색을 나타내고 갈색의 가는 털과 광택이 있으며, 내부에 는 수용 혹은 혈용이라고 하는 혈관이 있다. 녹용에는 판토크린, 탄산암모늄, 단백질, 교질, 연골소, 칼슘 및 성장호르몬 등의 여러 가지 성분이 함유되어 있으며, 성질은 따뜻하고 독이 없으며 달고 짠 맛이 난다.

녹용은 보약의 재료로 주로 사용되는 고급 약용제로, 녹용의 효능은 광범위하지만 그 중에서 손꼽히는 것이 바로 원기회복에 대한 효과이다. 또한, 자양강장제로 허약한 사람에게 효과가 있는데, 밥을 잘 안먹고 성장이 더딘 아이들, 식사량이 적어 허약하고 자주 아픈 아이들의 경우 녹용의 효능을 기대해 볼 수 있다. 또한 녹용을 먹으면 면역력이 증가되어 질병에 대한 자체방어체계가 강해질 수 있으며, 위장운동촉진효과에 의한 입맛 회복 효과도 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 녹용으로 몸을 보할 경우 뼈를 튼튼히 하여 골격이 부실해지는 것을 예방할 수 있어 최근 중년층 이상에게 많이 발생하는 골다공증 예방에도 효과적이다. 더욱이, 녹용은 혈액 세포 형성에도 도움을 주어 빈혈 방지에 효과가 있으며, 몸 안의 독소를 없애주기 때문에 과다한 업무로 인한 스트레스나 잦은 회식 등으로 인하여 체내독소 함유가 높아졌을 경우에도 스트레스 개선에 효과를 볼 수 있다.

녹용의 성분 중에서 녹용정과 교질은 뇌세포의 활성화 촉진, 생식기능의 증강, 체력강화, 여성의 부정기 출혈 등의 생리작용 치료, 저혈압 및 빈혈 개선에 효능이 있는 것으로 알려져 있으며, 성장호르몬은 어린이의 발육촉진, 식욕증진, 골격의 발육불량개선, 유아의 이빨 돋기 지연개선, 유아의 보행지연 개선 등의 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 그리고, 탄산암모늄, 단백질, 연골소, 칼슘 등은 면역증강을 통한 질병 예방효과, 내분비장애 개선, 특히 갑상선 기능저하개선, 위장운동 촉진 및 식욕증진, 신경쇠약치료 및 개선, 병후회복, 노화방지와 기억력 증진의 효과를 가져오며, 뇌수를 보익하고 치아를 견고하게 하고, 정액과 혈액을 충족시키고 원기를 북돋는 효능이 있다.

통상적으로 녹용은 사냥을 통해 얻거나 집에서 인공 양식하는 방식으로 사슴으로부터 얻게되므로, 자연 환경과 양식 조건의 제한을 받아 녹용의 품질 유지가 어렵고 생산 수준, 즉 생산량이 제한되는 문제점이 있다. 또한, 녹용을 자르는 시기가 일반적으로 무더운 여름철이므로 녹용 건조 시 문제가 발생하고, 녹용을 냉동 상태로 보관할 경우, 법정 유통기한은 6개월이므로 8월 말에 잘랐더라도 다음해 2월이 넘으면 유통할 수 없어 유통 기한이 짧다는 문제점이 있다. 또한, 녹용은 국내 자급이 어려워 90% 가량을 수입에 의존하고 있다.

상기와 같이 녹용의 우수한 효과에도 불구하고, 현재와 같은 녹용의 생산 및 유통 시스템으로는 시장의 수요를 경제적이면서 양적으로 충분히 충족시키기에는 한계가 있는 실정이다.

따라서, 보다 효율적으로 녹용의 영양성분 공급을 위해서, 녹용 세포를 배양하는 연구가 제안되어 왔으나(한국등록특허 제876536호 둥), 여전히 높은 녹용 세포의 증식 속도를 가지면서 효율적으로 녹용 세포를 배양하고, 이로부터 녹용 조직을 재생할 수 있는 기술에 대한 수요가 절실한 상황이다.

발명자들은 상기와 같은 기존의 문제를 해결하기 위하여 노력한 결과, 적절한 세포 배양 첨가물(supplements) 및/또는 성장인자(growth factor)를 포함하는 배지에서 녹용 세포를 배양할 경우, 높은 녹용 세포 증식속도를 가지면서, 경제적이고 대량으로 녹용세포를 배양할 수 있다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서는 적절한 세포 배양 첨가물(supplements) 및/또는 성장인자(growth factor)를 포함하는 배지에서 녹용 세포를 배양하는 것을 포함하는 녹용 세포의 배양 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 녹용 세포의 배양을 위해 배지에 포함되는 세포 배양 첨가물은 L-글루타민(L-glutamine), 2-ME(2-mercaptoethanol), NEAA(non-essential amino acid) 및 HEPES((4-(2-hydroxyethyl)-1-peperazineethanesulfonic acid))로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 물질일 수 있으며, 바람직하게는 L-글루타민, 2-ME, NEAA 및 HEPES에서 선택된 2 종 이상, 더욱 바람직하게는 3 종 이상, 가장 바람직하게는 4 종 모두가 포함될 수 있다.

상기 세포 배양 첨가물은 각 첨가물의 배지 내 농도가 10 μM ~ 5 mM가 되도록 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 L-글루타민은 0.5~5 mM, 2-ME는 10~300 μM, NEAA는 0.01~0.3 mM, HEPES는 3~30 mM의 농도가 되도록 첨가될 수 있고, 더욱 바람직하게는 L-글루타민 1~3 mM, 2-ME 50~200 μM, NEAA 0.05~0.2 mM, HEPES는 5~20 mM의 농도가 되도록 첨가될 수 있다.

본 발명에서의 NEAA는 글리신(Glycine), L-알라닌(L-Alanine), L-아스파라긴(L-Asparagine), L-아스파틱산(L-Aspartic acid), L-글루타믹산(L-Glutamic Acid), L-프롤린(L-Proline) 및 L-세린(L-Serine)의 혼합용액으로, 통상적으로 상기 7 개의 아미노산이 pH 1.5~1.7 HCl 용액에 용해된 상태로 제공되는데, 10 mM(100X 용액) NEAA 용액에는 Glycine 750 mg/L, L-Alanine 890 mg/L, L-Asparagine 1320 mg/L, L-Aspartic acid 1330 mg/L, L-Glutamic Acid 1470 mg/L, L-Proline 1150 mg/L 및 L-Serine 1050 mg/L이 포함되는 것이 일반적이지만, 본 발명의 목적에 부합하는 한, 상기 아미노산 조성에서 일부 아미노산 함유량이 달라지더라도 본 발명의 권리범위에 속한다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.

본 발명에 따른 녹용 세포의 배양을 위해 배지에 포함되는 성장인자는 유사인슐린 성장 인자-1(insulin-like growth factor-1; IGF-1), 표피 성장 인자(epidermal growth factor; EGF), 섬유아세포 성장 인자(fibroblast growth factor; FGF), 신경 성장 인자(nerve growth factor; NGF), 형질전환 성장 인자(transforming growth factor; TGF), 혈소판유래성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF), 뼈유래 성장 인자(bone-derived growth factor; BDF), 콜로니 자극 인자-1(colony stimulation factor-1; CSF-1) 등에서 선택될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 각종 세포분열이나 생장 및 분화 기능을 수행할 수 있는 폴리펩티드라면 제한 없이 사용가능하다. 특히 섬유아세포 성장 인자는 기본 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF)가 사용되는 것이 바람직하다.

바람직하게는 본 발명에 따른 성장인자는 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF), 유사인슐린 성장인자-1(IGF-1), 표피 성장 인자(EGF)로 이루어진 군에서 선택된 1 종 이상의 성장인자일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF) 단독, 또는 기본 섬유아세포 성장인자에 유사인슐린 성장인자-1(IGF-1) 및/또는 표피 성장인자가 함께 사용될 수 있다.

상기 성장인자들은 배지에 각 성장인자의 농도가 1 내지 50 ng/mL가 되도록 첨가되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 각 성장인자의 농도가 5 내지 40 ng/mL가 되도록 첨가할 수 있다. 특히, 기본 섬유아세포 성장인자 및 유사인슐린 성장인자-1은 5 내지 20 ng/mL, 표피성장인자는 10~30 ng/mL가 되도록 첨가하는 것이 가장 바람직하다.

본 발명에 따른 녹용 세포의 배양을 위해 사용될 수 있는 배지는 DMEM-S(Gibco Cat. No.12100-046, Biol. Reprod. 82:1162-1169 (2010)), DMEM/F12(Gibco Cat. No.11320-033, Biol. Reprod. 61:225-230 (1999)), MEM-α(Gibco Cat. No.12000-022, PLoS One 8:e54889 (2013)), MSC(Stemcell Cat. No.05501, Stem Cells 25:1166-1177 (2007)), StemPro(Gibco Cat. No.10640-019, Biol. Reprod. 86:148 (2012)), mSFM(Hum Reprod 27:1249-1259 (2012)), rSFM(Hum Reprod 27:1249-1259 (2012)), BGJb(Gibco Cat. No.12591-038, Exp. Cell. Res. 25:41-58 (1961)), RPMI(Gibco Cat. No.22400-089, J. Biol. Chem. 277:22847-22899 (2002)) 및 IMDM(Gibco Cat. No.12440-053, Blood 95:2275-2358 (2000))으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하지만, 이에 제한되는 것은 아니며, 통상적인 동물세포 배양을 위한 어떠한 배지라도 사용될 수 있고, 본 발명의 목적에 부합하는 한, 상기 배지에서 하나 이상의 성분을 추가 또는 삭제하거나, 그 조성을 달리한 경우도 본 발명의 권리범위에 속한다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명한 것이다.

바람직하게는 MEM-α 또는 MSC 배지를 이용하여 배양할 수 있다. 상기 MEM-α(minimun essential medium-a) 배지는 최소 필수 배양 배지로서, 세포 배양 시 널리 사용되는 배지로서, 최소 필수 배지이므로, 해당 배지의 성분을 변화시키거나, 조성을 추가하여 세포 배양 조건을 변화시킬 수 있으며 이를 통한 세포의 증식 촉진 효과를 기대할 수 있다.

본 발명에 따른 녹용 세포의 배양은 25~45℃, 바람직하게는 30~40℃, 가장 바람직하게는 35~39℃에서 수행될 수 있으며, 배양기(incubator) 내의 산소 농도는 3~40%, 바람직하게는 10~35%, 가장 바람직하게는 7~25%인 조건 하에서 수행될 수 있다.

또한, 상기 배지에는 혈청(serum)이 포함될 수 있으며, 바람직하게는 우태아 혈청(FBS: Fetal Bovine Serum) 또는 사슴 혈청(Deer Serum)에서 선택된 하나 이상의 혈청이 사용될 수 있다. 혈청은 각 배지 내에 3~30 중량%, 바람직하게는 5~25 중량%, 가장 바람직하게는 10~20 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.

본 발명에 따른 녹용 세포의 배양을 위해 사용되는 반응기는 배양용 접시, 배양병, 쉐이킹 플라스크, T-플라스크, 발효조(fermentor), 일회용 세포 배양 백(disposable cell culture bag) 등 세포 배양에 사용되는 반응기라면 어떤 것이라도 제한없이 사용가능하며, 본 발명의 목적을 달성하기에 적합한 생물반응기로서, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 채택가능할 수 있는 어떠한 반응기라도 사용될 수 있다. 특히, 상기 배양병은 세포부착이 용이한 폴리에틸렌 재질로, 투관침으로 채취된 조직 및 세포를 직접 꽃아 사용할 수 있는 고무마개를 구비하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 녹용 세포 배양 방법은 기존의 방법에 비해 녹용 세포의 증식률을 현저히 향상시킬 수 있으므로, 녹용 세포를 경제적으로 대량생산할 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 분리된 녹용 세포의 현미경 사진을 나타낸 도면.
도 2는 배지 종류에 따른 녹용 세포의 생존율을 나타낸 도면.
도 3은 배지 종류에 따른 녹용 세포의 증식률을 나타낸 도면.
도 4는 배지에 첨가된 혈청 종류에 따른 녹용 세포의 증식률을 나타낸 도면.
도 5는 배양기내 산소 농도에 따른 녹용 세포의 증식률을 나타낸 도면.
도 6은 배양 온도에 따른 녹용 세포의 증식률을 나타낸 도면.
도 7은 세포 배양 첨가물 및 성장인자 처리에 따른 녹용 세포의 증식률을 비교한 결과를 나타낸 도면.
(Control : MEM-α 배지+10% FBS,
Supplements : Control + 세포 배양 첨가물(L-glutamine 2 mM, 2-ME 100 μM, NEAA 0.1 mM 및 HEPES 10 mM),
bFGF : Control + 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF) 10 ng/ml,
EGF : Control + 표피 성장 인자(EGF) 20 ng/ml,
IGF-1 : Control + 유사인슐린 성장인자-1(IGF-1) 10 ng/ml,
3 Factors : Control + bFGF 10 ng/ml + EGF 20 ng/ml + IGF-1 10 ng/ml,
Supplements + 3F : Control + 세포 배양 첨가물(L-glutamine 2 mM, 2-ME 100 μM, NEAA 0.1 mM 및 HEPES 10 mM) + bFGF 10 ng/ml + EGF 20 ng/ml + IGF-1 10 ng/ml,
MSC : MSC 배지+10% FBS)

이하 본 발명을 실시예와 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 녹용 세포의 준비

배양을 위한 녹용 세포를 분리하기 위하여, 초기 녹용의 생장 2~3개월 후 사슴으로부터 외과적 수술을 통하여 멸균적으로 녹용을 채취하였다. 채취한 녹용으로부터 녹용 세포를 효과적으로 분리하기 위하여 콜라게나아제(Collagenase)를 농도별로 처리하였다. 콜라게나아제를 저농도(1~2 mg/ml)로 처리한 경우, 녹용 세포 분리에 4~5시간이 소요되었으며, 이에 따라 회수된 녹용 세포의 생존율이 80% 내외로 저하되는 것을 확인하였다. 따라서, 콜라게나아제의 처리 농도를 2.5mg/ml로 높여 녹용 조직에 처리하였으며, 이를 통해 녹용 세포의 분리 시간을 2시간 이내로 단축하였다. 또한 하이알루로니다아제(hyaluronidase)(1mg/ml)와 트립신(0.125%)의 순차적인 복합 처리를 통하여 세포회수율을 증진시켰으며, 녹용 세포의 생존율도 94%로 증진되는 것을 확인하였다.

이 후, 여러 농도의 퍼콜(Percoll) 용액을 이용한 원심분리를 수행하였으며, 최종적으로 30% 단일층을 사용하여, 녹용 조직으로부터 세포 분리 시 홉입되었던 세포찌꺼기(cell debris)와 적혈구 등의 혼입물을 깨끗이 제거하고 효율적으로 세포를 회수하였다. 얻어진 녹용 세포의 현미경 사진을 도 1에 나타내었다.

실시예 2. 녹용 세포의 배양 조건에 따른 증식 효과

2.1 배지 종류에 따른 녹용 세포 생존률 및 증식률

다양한 종류의 세포들에서 유용성이 있다고 알려진 배지를 1 차적으로 선별하여 녹용 세포의 체외증식에 미치는 효과를 비교하였다. 선별된 배지로는 DMEM-S, DMEM/F12, MEM-α, MSC, StemPro, mSFM, rSFM, BGJb, RPMI 및 IMDM을 구입하여 사용하였으며, 다양한 배지에서 녹용 세포를 배양하여 녹용 세포의 생존율과 세포 증식 정도를 비교하였다. 세포 배양은 각각의 배양액에 기본 첨가물로서 10% 우태아혈청(FBS)과 1% p/s (penicillin/streptomycin)을 첨가하고 37℃, 5% 이산화탄소, 20% 산소 조건 하에서 Forma Series II Water Jackted CO₂ incubator(Thermo Electron Corp.) 배양기 내에서 6-well plate(BD Science) (배지 2 ml)를 이용하여 수행되었다. 이하 모든 실시예에서 사용된 배양기, 반응기 및 배양 조건(37℃, 5% 이산화탄소, 20% 산소 조건), 그리고 배지를 제외한 배지에 첨가되는 기본 첨가물(10% 우태아혈청(FBS)과 1% p/s (penicillin/streptomycin)은 실시예 2.1과 동일하였다.

최초 접종후, 3.5일 경과 후 한번 계대 배양하여 처리에 따른 녹용세포의 증식 양상을 검증하였으며, 총 1주간 배양 후 각각의 처리군에서 세포 생존율과 최초 배양을 시작했던 세포 수 대비 증식된 세포의 비율을 산정하여 처리군간 세포증식 효율을 비교하였다. 이하, 본 발명에서의 모든 세포 증식률은 하기 수식에 따라 동일하게 산출하였다.

세포 증식률은 하기 수식에 의하여 계산하였다.

[세포증식률 (fold change) =

배양 종료 시점에서의 증식된 세포수 / 배양 시작 시점에서의 세포수]

그 결과, 각 배지 종류에 따른 녹용 세포의 생존율은 DMEM-S 99.5±0.2%, DMEM/F12 99.2±0.3%, MEM-α 92.3±4.0%, MSC 99.7±0.0%, StemPro 94.9±3.0%, mSFM 98.8±0.1%, rSFM 99.0±0.4%, BGJb 97.0±2.5%, RPMI 98.6±1.3%, IMDM 94.0±3.2% (평균±표준오차, n=3)로 나타나 모두 92.3~99.7%의 생존율을 보여 처리군간 큰 차이를 보이지 않았다(도 2 참조).

그러나 1주간의 배양 동안 배지 종류에 따른 녹용 세포의 증식 정도는 각각의 처리에서 DMEM-S 4.3±0.3배, DMEM/F12 3.4±0.0배, MEM-α 5.8±0.3배, MSC 10.1±0.3배, StemPro 2.7±0.3배, mSMF 4.3±0.3배, rSFM 4.7±0.2배, BGJb 2.5±0.2배, RPMI 3.3±0.1배, IMDM 3.5±0.3배(평균±표준오차, n=3)의 세포 증식률을 나타내어 배지 종류에 따라 큰 차이를 나타내었다(도 3 참조). 이러한 결과로부터, 높은(5배 이상)의 세포 증식률을 나타낸 MEM-α와 MSC 배지가 녹용 세포의 증식 촉진에 가장 효과적인 배지임을 확인하였다.

2.2 배양 조건에 따른 녹용 세포 증식 효과

상기 실시예 2.1의 결과를 토대로 녹용 세포의 증식률이 높았던 MEM-α와 MSC 배지 중에서 최소 필수 배양 배지인 MEM-α를 기본 배양배지로 하여 기본배양조건을 선정하기 위하여 추가적으로 우태아 혈청(FBS: Fetal Bovine Serum) 또는 사슴 혈청(DS:Deer Serum)을 사용하여, 혈청의 종류 및 농도, 배양기 온도 및 산소 농도 등의 배양조건을 검증하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 혈청 종류 및 농도에 따른 녹용 세포의 증식 정도는 각각의 처리에서 무혈청(FBS/DS 0%) 1.1±0.1배, FBS 5% 2.2±0.2배, FBS 10% 6.5±0.7배, FBS 20% 7.5±0.5배, DS 5% 2.0±0.4배, DS 10% 2.9±0.3배, DS 20% 5.3±0.4배(평균±표준오차, n=3)의 세포 증식률을 나타내어 혈청의 농도가 증가할수록 세포 증식률 또한 증가하였으며, 사슴 혈청(Deer serum)보다 우태아혈청(FBS:Fetal Bovine Serum)이 더 효과적인 혈청임을 확인하였다.

또한, 도 5 내지 도 6에 나타난 바와 같이, 상기 배양기 내 온도 및 산소 농도에 따른 녹용 세포의 증식 정도는 배양기내 온도 35℃에서 1.8±0.2배, 37℃에서 5.9±0.8배, 39℃에서 3.4±1.1배(평균±표준오차, n=3)의 세포 증식률을 나타내었으며, 배양기내 산소 농도 5%에서 1.2±0.2배, 10%에서 2.5±0.4배, 20%에서 6.1±0.3배의 세포 증식률을 나타내어 온도 37℃, 산소 20%의 배양 조건에서 녹용 세포의 증식이 매우 효과적임을 확인하였다.

실시예 3. 첨가물( supplements ) 및 성장인자에 따른 녹용 세포 증식 효과

상기의 실시예 2.1 내지 실시예 2.2의 결과를 토대로 녹용 세포의 증식률이 높았던 MEM-α 배지를 기본 배지로 선별하여 기본배양조건(MEM-α 배지+10% FBS, 37℃, 20% 산소)을 설정한 후, 세포 배양 첨가물 및 성장 인자 첨가에 따른 녹용 세포의 증식 효과를 확인하였다. 증식 효과의 비교는 기본배양조건에서 증식된 녹용 세포 수와 처리군에서의 녹용 세포 수를 비교하여 상기 실시예 2.1의 수식과 동일한 수식을 통해 수행하였다. 성장인자들은 기본 섬유아세포 성장인자(bFGF) 10 ng/ml, 표피 성장 인자(EGF) 20 ng/ml, 유사인슐린 성장인자-1(IGF-1) 10 ng/ml의 양으로 각 배지에 첨가되었으며, 세포 배양 첨가물은 L-glutamine 2 mM, 2-ME 100μM, NEAA 0.1 mM 및 HEPES 10 mM을 포함하였다.

그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 기본배양조건(control), 세포 배양 첨가물을 포함하는 경우(Supplements), 기본 섬유아세포 성장인자만을 포함하는 경우(bFGF), 표피 성장 인자만을 포함하는 경우(EGF), 유사인슐린 성장인자-1만을 포함하는 경우(IGF-1), bFGF, EGF 및 IGF-1의 3가지 성장인자를 모두 포함하는 경우(3 Factors) 및 세포 배양 첨가물과 3가지 성장인자를 모두 포함하는 경우(Supplements + 3F)의 세포 증식률을 1주간 녹용 세포를 배양 후 비교하여 보면,

녹용 세포의 증식 정도가 상기 순서에 따라 각각 6.7±0.5배, 9.4±0.2배, 9.8±1.5배, 20.6±0.9배, 9.1±1.3배, 26.1±1.0배, 31.0±1.3배(평균±표준오차, n=3)로 증가된 것을 확인하였다. 또한, MEM-α 대신에 세포배양 첨가물이나 성장인자를 첨가하지 않은 MSC 배지를 사용한 경우의 세포증식률은 13.7±1.8배로 나타났다.

이러한 결과로부터 녹용 세포의 배양 및 증식에 가장 효과적인 성장인자는 bFGF임을 확인하였으며, bFGF에 기타 성장인자 및 세포배양 첨가물을 추가할 경우, 녹용 세포의 증식이 보다 효율적으로 촉진될 수 있음을 확인하였다.

Claims

DMEM-S, DMEM/F12, MEM-α, MSC, StemPro, mSFM, rSRM, BGJb, RPMI 및 IMDM로 이루어진 군으로부터 선택되는 기본배지에, 10% FBS, L-글루타민(L-glutamine) 0.5~5mM, 2-ME(2-mercaptoethanol) 10~300μM, NEAA(non-essential amino acid) 0.01~0.3mM, HEPES((4-(2-hydroxyethyl)-1-peperazineethanesulfonic acid)) 3~30mM, 기본 섬유아세포 성장인자(basic fibroblast growth factor; bFGF) 5~20ng/ml, 유사인슐린 성장인자-1(insulin-like growth factor-1;IGF-1) 5~20ng/ml 및 표피성장인자(epidermal growth factor; EGF) 10-30ng/ml를 추가로 포함하는 배지에서 녹용세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 녹용세포의 배양방법.
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제1항에 있어서,
상기 녹용 세포의 배양은 30~40 ℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 녹용 세포의 배양 방법.
제1항에 있어서,
상기 녹용 세포의 배양은 배양기 내 산소 농도가 10~35%인 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 녹용 세포의 배양 방법.
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