KR102626827B1 - 동물세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 동물세포의 배양방법 - Google Patents
동물세포 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 동물세포의 배양방법 Download PDFInfo
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Abstract
효모 추출물 또는 펩톤(Peptone)을 포함하는 동물세포 배양용 배지 조성물에 관한 것으로, 일 양상에 따른 효모 추출물 또는 펩톤(Peptone)을 포함하는 동물세포 배양용 배지 조성물에 의하면, 혈청을 포함하지 않는 배지에서도 동물세포의 성장과 증식이 가능하고, 동물세포의 성장 및 증식이 촉진되는 효과가 있다.
Description
본 발명은 동물세포 배양용 배지 조성물에 관한 것이다.
인구의 지속적인 증가와 함께 환경오염에 대한 문제점이 대두되고 있으며 특히, 해양 환경 오염에 대한 문제점이 심각한 수준으로 심화되고 있다. 1960년 대 이후로 환경 오염과 무분별한 어획으로 몇몇의 종은 지속 가능하지 않은 수준까지 도달하게 되었으며, 미세플라스틱과 같은 물질들에 의한 해양 환경 오염은 해양 생물들의 몸에 점진적으로 축적되어 그것을 먹는 인간에게까지 영향을 미친다.
해양 환경 오염에도 불구하고 인구 증가와 함께 수산물에 대한 수요는 기하급수적으로 증가하고 있으며 특히, 새우, 게 및 랍스터와 같은 갑각류에 대한 공급이 수요를 충족시키지 못하여 양식업이 증가하게 되었다. 하지만 양식업의 증가로 지구 온난화의 주요 물질인 탄소가스 배출이 더욱 심화되었으며 결국 수요를 채우기 위한 공급 방법이 새로운 환경 오염을 야기시키고 있다.
환경 오염을 억제하고 수요를 충족시키기 위한 방법으로 배양육이 해결책으로 제시되고 있다. 배양육은 하나의 개체에서 세포를 추출하고 증식시켜 여러 개의 개체를 만들어 낼 수 있으므로 탄소 가스의 배출량을 줄일 수 있고, 면적 대비 높은 생산량을 보인다. 또한, 배양육은 실험실의 배양기 내에서 세포를 증식시키므로, 바다에서 어획되는 수산물과는 다르게 중금속과 미세 플라스틱에 오염되지 않은 안전한 먹거리를 제공할 수 있는 장점이 있다.
배양육을 개발 및 생산하기 위해서는 세포 추출 기술과 세포 증식 기슬 그리고 세포 맞춤 배양액이 만드시 조합되어야만 하며, 상용화를 위해서는 배양액 가격 절감이 가장 큰 문제로 알려져 있다. 일반적으로 단백질, 아미노산, 호르몬 등이 포함되어 있는 우태아혈청 (FBS; Fetal bovine serum)을 5~20% 첨가하여 세포를 배양하며 우태아혈청을 세포배양에서 필수적으로 생각되고 있으며, 세포의 성장과 증식에 매우 효과적이지만 소 태아의 혈액에서 직접적으로 추출하므로 매우 비윤리적이고 상당히 고가라는 단점이 있다.
이에 본 연구자들은 혈청이 포함되지 않고도 세포의 성장 및 증식에 효과적인 배양액을 개발하고자 연구를 수행해온 바, 혈청이 없이도 갑각류의 세포에서 공통적으로 세포의 성장 및 증식이 활발히 진행되는 무혈청 배양액을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 효모 추출물 또는 펩톤(Peptone)을 포함하는 동물세포 배양용 배지 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 배지 조성물에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 동물세포의 배양 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 효모 추출물 또는 펩톤(Peptone)을 포함하는 동물세포 배양용 배지 조성물을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지 조성물은 상기 효모 추출물 또는 펩톤(Peptone)을 0.01 내지 20, 0.01 내지 10, 0.6 내지 10 또는 0.6 내지 2% (w/v)로 포함하는 것일 수 있다.
펩톤은 각종 단백질을 효소 분해하거나 가수 분해할 때 생성되는 생성물의 총칭으로 폴리펩티드, 아미노산, 미네랄 등의 성분이 혼합되어 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 펩톤은 동물성 펩톤, 박테리아 펩톤 또는 식물성 펩톤일 수 있으며, 바람직하게는 식물성 펩톤일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 동물성 펩톤은 미트(meat) 및/또는 카제인(casein)일 수 있다.
상기 박테리아 펩톤은 박토 펩톤(Bacto peptone) 일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 식물성 펩톤은 대두 펩톤(soy peptone), 밀 펩톤(wheat peptone), 잠두 펩톤(broadbean peptone), 감자 펩톤(potato peptone), 완두콩 펩톤(pea peptone), 파파익 대두 펩톤(Papaic soy peptone) 및 루핀 펩톤(lupin peptone)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으며, 바람직하게는 대두 펩톤일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 용어 "식물성 펩톤"은 식물로부터 얻은 단백질의 분해 산물을 의미한다. 예를 들어 대두 펩톤(soy peptone)은 대두(soy)로부터 얻은 총단백질을 분해하여 얻은 산물을 의미한다. 상기 식물성 단백질의 분해는 부분적 분해(partial digest)에 의해 행해질 수 있다. 상기 단백질의 분해는 산처리, 염기처리, 효소처리, 고압처리, 열처리 또는 물리적 처리에 의한 분해를 통해 행해질 수 있다. 상기 물리적 처리는 예컨대 그라인딩(grinding)이다.
본 발명에서 식물성 펩톤은 식물성 단백질의 부분적 분해 산물로서, 단분자인 아미노산뿐만 아니라, 수개 내지 수십개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드와 온전한 단백질 분자가 모두 포함되어 있는 혼합물 형태일 수 있다.
본 발명의 식물성 펩톤이 얻어지는 식물의 원천은 특별히 한정되지 않으며, 세포 증식을 촉진하는 능력을 갖는다면 어떠한 식물로부터 유래된 펩톤이라도 모두 포함된다.
본 발명의 배지 조성물은 미생물 추출물을 포함할 수 있으며, 미생물은 식용가능한 것일 수 있다.
상기 미생물은 박테리아, 고세균 또는 효모일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 있어서, 용어 "효모 추출물"은 효모를 배양한 후 NaCl, 에탄올 또는 효소처리 등에 의한 자가소화를 통해서 생산되므로 산분해 HVP(Hydrolyzed vegetable protein)와 같은 유해 물질 생성의 문제를 유발하지 않는 천연의 생물소재를 의미하며, 미생물 발효배지 또는 천연 조미료의 등에 사용되고 있다.
상기 효모 추출물은 식용 효모에 식용이 가능한 효소류을 첨가하여, 식용 효모의 폴리펩타이드를 가수분해하는 방법으로 만들어질 수 있으며, 식용으로 사용 가능한 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서 상기 효모 추출물은 식품에 사용가능한 것일 수 있다.
효모 추출물은 무기질, 비타민, 핵산, 펩타이드 및 아미노산 등을 포함하는 것으로 알려져 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 위커하모마이세스 속(Wicherhamomyces sp.), 피키아 속(Pichia sp.) 및 한세니아스포라 속(Hanseniaspora sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 식물성 펩톤과 상기 효모 추출물은 식물 또는 미생물 유래 성분으로 동물성 성분을 대체하는 성분일 수 있다. 상기 식물 또는 미생물 유래 성분은 바이오 의약품 및 식품 용도를 목적으로 사용하기에 매우 적합하다.
일 구체예에 있어서, 상기 동물세포는 근육줄기세포, 근육세포 및 이의 전구세포(progenitor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 근육줄기세포는 위성 세포(satellite cell) 또는 근아세포(myoblast), 예를 들어, 근아세포일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
본 명세서에서 용어, "근육줄기세포(Muscle stem cell)"는 형질전환 없는 증식, 무한증식, 자가 재생산 능력 및 근육으로의 분화할 수 있는 능력을 모두 포함하는 근육줄기세포의 특성을 갖는 세포를 의미하며, 자가 재생산능력 또는 무한증식 능력 및 근육분화 능력을 보이는 세포라면 제한 없이 포함될 수 있다. 상기 자가 재생산 능력 및 근육 분화능력은 마커로서 확인이 가능하다. 또한 상기 근육줄기세포는 예를 들면 자가 재생능과 함께, CD29, CD56, Oct4, Nanog 또는 Pax7의 발현을 보이는 세포일 수 있다. 상기 근육줄기세포는 분화능과 자기재생능을 갖는 것이라면, 그 종류 및 유래가 제한되지 아니한다. 상기 근육줄기세포는, 예를 들면, 포유동물, 인간, 원숭이, 돼지, 말, 소, 닭, 오리, 양, 개, 고양이, 마우스 또는 토끼 등으로부터 유래한 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 근육줄기세포는 소 또는 닭의 근육줄기세포일 수 있다.
상기 근육줄기세포는 근모세포(myoblast)로 유도되는 과정에서 Pax7 또는 MyoD의 발현을 보이는 세포일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "근모세포는 근육세포로 분화하는 과정 중의 전구세포(precursor cell)로 근원세포와 마찬가지로 증식을 하며 세포 간에 융합이 일어나서 근육세포(myogenic cell, myocyte)로 분화할 수 있는 세포를 의미한다. 상기 "근육세포"는 근모세포의 분화 과정을 통해, 근모세포로부터 생성된 근조직을 구성할 수 있는 세포를 의미한다.
상기 근육세포는 근세포(myocyte) 또는 근관세포(myotube), 예를 들어, 근세포일 수 있으나, 이에 한정되지 아 니한다.
상기 전구세포는 복수 계통으로 분화된 세포를 생성시킬 수 있는 세포, 예컨대, 근아세포, 섬유아세포, 지방세포, 간질 세포, 주피세포, 평활근 세포 및 내피 세포를 지칭한다. 전구세포는 이들이 전형적으로 광범위한 자기 복제 능력을 갖지 않는다는 점에서 줄기 세포와는 상이하다.
상기 동물세포는 지방 세포(fat cell 또는 adipocyte) 및/또는 이의 전구 세포, 간질 세포(결합조직) 및/또는 이의 전구 세포, 또는 내피 세포(혈관) 및/또는 이의 전구 세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
일 구체예에 있어서, 상기 동물은 소, 양, 돼지, 가금류, 갑각류 및 어류로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것 일수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
일 구체예에 있어서, 상기 동물세포는 동물의 조직으로부터 세포들을 단리시키고, 이를 생체 외에서 배양하여 만들어진 동물 유래 세포를 의미할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 동물세포는 갑각류 세포인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 동물세포는 새우, 게 또는 랍스터 유래 세포인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배지 (culture media)"는 인 비트로 (in vitro)에서 줄기세포를 비롯한 세포의 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 물질을 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium), Knockout DMEM, E8 (Essential 8 Medium), SF-DMEM (serum free-Dulbecco Modified Eagle Medium), L15 Medium 및 Grace's Insect Medium으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 아니한다.
상기 배지 이외에 당해 업계에서 이용되는 배지이면 충분하며, 상기 배지는 아미노산류, 비타민류, 무기염류 및 기타 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 비필수 아미노산 및 L-글루타민, 비타민류로는 비타민 B12, 무기염류로는 트레이스 성분(CuSO45H2O, Fe(NO3)39H2O, ZnSO4), 포스포에놀 피루베이트(Phosphoenol pyruvate), 모노에탄올아민(Momoethanolamine), 소듐 셀레니트(Sodium selenite) 및 소듐 바이카보네이트(Sodium bicarbonate), 기타 성분으로는 D-글루코스, 리놀레익산(Linoleic acid), 리포익산(Lipoic acid), 소듐 피루베이트(Sodium pyruvate), 하이폭산틴 나트륨(Hypoxantine Na), 퓨트레신 하이드로클로라이드(Putrescine HCl) 및 폴리아민 용액(Polyamine solution)을 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지는 무혈청 배지인 것일 수 있다.
무혈청 배지는 비윤리적, 비환경적, 고비용 문제점을 가진 혈청을 사용하지 않는 세포배양용 배지로 혈청의 사용을 불필요하게 한 세포배양용 배지를 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지는 혈청을 포함하는 배지인 것일 수 있다.
상기 혈청은 동물 혈액일 수 있으나 이에 한정되지 아니하고, 바람직하게는 포유동물(예: 돼지, 말, 소, 염소, 양 및 개) 혈액으로부터 유래된 혈청이며, 더욱 바람직하게는 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 혈청은 소태아 혈청(Fetal bovine serum, FBS), 사람 혈소판 용해물(human platelet lysate, hPL), 사람 혈청 알부민(human serum albumin, HSA), 사람 혈청(human Serum, HS), 혈소판 혈장(Platelet-Rich Plasma, PRP), 혈소판 부족 혈장(platelet poor plasma, PPP) 송아지 혈청(Calf serum), 말 혈청(hourse serum), 돼지 혈청(porcine serum) 및 양 혈청(sheep serum)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 배양은 부유배양인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "세포 배양 (cell culture)"은 조절된 조건 하에서 인공적으로 체외에서 살아있는 세포를 키우는 과정을 의미한다. 또한, 개체 조직의 일부분을 무균적으로 떼어내 효소로 세포간 연결 물질을 분해하여 유리시킨 현탁액을 병이나 페트리 접시와 같은 배양 접시의 편평한 밑부분에 도말하여 세포를 성장 및 증식시키는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어"부유배양(suspension culture)"은 배양대상의 세포를 기질(substrate) 등에 고정시키지 않은 채로 배양액 내에서 부유(floating)하는 상태로 배양하는 것을 말한다.
상기 배양 과정에서 배양세포의 부유상태를 만들기 위해 배지에 SR(serum replacement)를 첨가하거나, 저부착 배양 접시 또는 바이오리액터를 사용하여 배양할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에서 사용되는 다양한 부유배양 방법을 사용할 수 있다.
상기 배양은 성장 및 증식인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "성장(growth) 및 증식(proliferation)"은, 세포 수의 증가를 의미한다. 상기 배양은 미분화 증식인 것일 수 있다. 상기 미분화 증식(undifferentiated proliferation)은 줄기세포가 특정 세포로 분화되지 않은 채 원래의 세포와 동일한 성질을 가지는 즉, 분화능(potency) 및 자기재생(self-renewal)능을 가지는 세포로 증식하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화되는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하 여 형태나 기능이 변해가는 것을 의미한다. 특정 세포 유형으로의 분화 정도를 측 정 또는 판단하는 것은 당해 분야에 익히 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 또 한, 상기 분화는, 유세포 분석 또는 면역세포화학과 같은 기법을 사용하여 세포 표 면 표지 (예를 들면, 조직-특이적 또는 세포-표지 특이적 항체로 세포를 염색함) 및 세포 형태의 변화 (예를 들면, 핵 비율/세포질 비율)를 측정하면서, 광학 현미경 또는 공초점 현미경을 사용하여 세포 형태를 조사함으로써, 또는 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction: PCR) 및 유전자-발현 프로파일과 같은 당해 분 야에 익히 공지된 기법을 사용하여 유전자 발현상의 변화를 측정함으로써 확인될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지 조성물은 아미노산 혼합물 또는 미량원소를 추가로 포함할 수 있다.
상기 아미노산 혼합물에 포함되는 아미노산의 종류에는 제한이 없으며 알라닌, 시스테인, 아스파르트산, 글루탐산, 페닐알라닌, 글라이신, 히스티딘, 아이소류신, 라이신, 류신, 메티오닌, 아스파라긴, 피롤라이신, 프롤린, 글루타민, 아루기닌, 세린, 트레오닌, 셀레노시스테인, 발린, 트립토판, 타이로신 중 하나 이상의 것일 수 있다.
상기 아미노산 혼합물은 세린, 아스파르트산, 글루탐산, 알라닌, 글루타민, 프롤린, 타이로신, 발린 및 류신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지 조성물은 아미노산 혼합물을 100 내지 5000 mg/L, 100 내지 4500 mg/L, 100 내지 4000 mg/L, 100 내지 3500 mg/L, 500 내지 5000 mg/L, 1000 내지 5000 mg/L, 1500 내지 5000 mg/L, 2000 내지 5000 mg/L, 2500 내지 5000 mg/L, 500 내지 4500 mg/L, 1000 내지 4000 mg/L, 1500 내지 3500 mg/L 또는 2000 내지 3000 mg/L 농도로 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 아미노산의 일문자(삼문자)는 생화학 분야에서의 표준 약어 규정에 따라 다음의 아미노산을 의미한다: A(Ala): 알라닌; C(Cys): 시스테인; D(Asp): 아스파르트산; E(Glu): 글루탐산; F(Phe): 페닐알라닌; G(Gly): 글라이신; H(His): 히스티딘; I(IIe): 이소류신; K(Lys): 라이신; L(Leu): 류신; M(Met): 메티오닌; N(Asn): 아스파라진; O(Ply): 피롤라이신; P(Pro): 프롤린; Q(Gln): 글루타민; R(Arg): 아르지닌; S(Ser): 세린; T(Thr): 쓰레오닌; U(Sec): 셀레노시스테인, V(Val): 발린; W(Trp): 트립토판; Y(Tyr): 타이로신.
상기 미량원소는 생물이 성장하는 데 꼭 필요한 물질들 중 아주 작은 양만 필요한 물질들을 의미하며, 생물의 생장 발달 및 생리에 중요한 역할을 하는 필수 화학 원소이다.
일 구체예에 있어서, 상기 미량원소는 칼슘(Ca), 칼륨 (K), 나트륨 (Na), 철(Fe), 염소(Cl), 붕소(B), 망간(Mn), 아연(Zn), 구리(Cu) 및 몰리브덴(Mo)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지 조성물은 미량원소를 10 내지 500 mg/L, 10 내지 450 mg/L, 10 내지 400 mg/L, 10 내지 350 mg/L, 50 내지 500 mg/L, 100 내지 500 mg/L, 150 내지 500 mg/L, 200 내지 500 mg/L, 250 내지 500 mg/L, 50 내지 450 mg/L, 100 내지 400 mg/L, 150 내지 350 mg/L 또는 200 내지 300 mg/L 농도로 포함할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지 조성물은 상기 아미노산 혼합물 또는 미량원소를 100 내지 5000 mg/L, 100 내지 4500 mg/L, 100 내지 4000 mg/L, 100 내지 3500 mg/L, 500 내지 5000 mg/L, 1000 내지 5000 mg/L, 1500 내지 5000 mg/L, 2000 내지 5000 mg/L, 2500 내지 5000 mg/L, 500 내지 4500 mg/L, 1000 내지 4000 mg/L, 1500 내지 3500 mg/L 또는 2000 내지 3000 mg/L로 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 효모 추출물 또는 펩톤(Peptone)을 포함하는 동물세포 배양용 배지 조성물에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 동물세포의 배양 방법을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 동물세포는 갑각류 세포인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지는 무혈청 배지인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배양은 부유배양인 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 배지 조성물은 아미노산 혼합물 또는 미량원소를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
일 양상에 따른 효모 추출물 또는 펩톤(Peptone)을 포함하는 동물세포 배양용 배지 조성물에 의하면, 혈청을 포함하지 않는 배지에서도 동물세포의 성장과 증식이 가능하고, 동물세포의 성장 및 증식이 촉진되는 효과가 있다.
도 1은 동물세포 배양 시 배양 배지를 달리한 경우에 따른 세포 증식의 차이를 확인한 결과이다.
도 2a 내지 도 2c는 펩톤을 포함하는 배지에서 동물세포를 배양하여 우태아혈청을 첨가하거나 첨가하지 않은 배지와 비교하여 동물세포의 증식의 차이를 확인한 결과이다.
도 3a 내지 도 3c는 효모 추출물을 포함하는 배지에서 동물세포를 배양하여 우태아혈청을 첨가하거나 첨가하지 않은 배지와 비교하여 동물세포의 증식의 차이를 확인한 결과이다.
도 4는 효모 추출물을 포함하는 배지에서 동물세포를 배양하는 경우, 시간경과에 따른 아미노산의 소모량을 측정한 경과이다.
도 5a 내지 도 5f는 효모 추출물 또는 펩톤을 포함하는 배지에 아미노산 혼합물을 추가로 첨가하여 동물세포의 증식을 관찰한 결과이다.
도 6a 내지 도 6f는 효모 추출물 또는 펩톤을 포함하는 배지에 미량원소를 추가로 첨가하여 동물세포의 증식을 관찰한 결과이다.
도 2a 내지 도 2c는 펩톤을 포함하는 배지에서 동물세포를 배양하여 우태아혈청을 첨가하거나 첨가하지 않은 배지와 비교하여 동물세포의 증식의 차이를 확인한 결과이다.
도 3a 내지 도 3c는 효모 추출물을 포함하는 배지에서 동물세포를 배양하여 우태아혈청을 첨가하거나 첨가하지 않은 배지와 비교하여 동물세포의 증식의 차이를 확인한 결과이다.
도 4는 효모 추출물을 포함하는 배지에서 동물세포를 배양하는 경우, 시간경과에 따른 아미노산의 소모량을 측정한 경과이다.
도 5a 내지 도 5f는 효모 추출물 또는 펩톤을 포함하는 배지에 아미노산 혼합물을 추가로 첨가하여 동물세포의 증식을 관찰한 결과이다.
도 6a 내지 도 6f는 효모 추출물 또는 펩톤을 포함하는 배지에 미량원소를 추가로 첨가하여 동물세포의 증식을 관찰한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 명세서 및 청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정 해석되지 아니하며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함" 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 명세서 전체에 있어서, "A 및/또는 B"는, A 또는 B, 또는 A 및 B를 의미한다.
실시예 1. 배지 별 세포 증식 확인
세포 배양 시 배양 배지를 달리한 경우에 세포 증식에 차이가 나타나는지 알아보기 위하여 새우에서 분리한 갑각류 유래 세포를 일반적으로 사용되는 기본 배지(DMEM-F12, L15 또는 Grace's insect media)에 0, 5 또는 10% (v/v) 우태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS)을 첨가한 배지를 사용하여 배양하고 세포 증식 정도를 확인하였다.
구체적으로, 28 내지 32℃, 300rpm 조건에서 최초 1.5 x 105 cells/ml로 갑각류 세포를 접종하고 48시간 동안 부유배양(Suspension Culture)하였으며, 3가지 기본 배지에서 세포의 증식을 비교하였다. 대략적인 세포의 증식 경향을 확인하기 위하여 OD600에서 흡광도를 측정하였으며, 배양된 정확한 세포 수를 hemocytometer를 통해 확인하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 흡광도 측정 결과 및 hemocytometer를 통한 세포 수 확인 결과, Grace's insect media에서 가장 높은 세포 증식을 확인하였다. 또한, 우태아혈청을 첨가하지 않은 배양 배지보다 우태아혈청을 첨가한 배지에서 높은 세포 증식을 보였다. 상기 결과로부터 동일하게 우태아혈청을 포함하더라도 기본 배지의 종류에 따라 갑각류 세포의 증식률은 확연히 달라진다는 것을 확인할 수 있었으며, Grace's insect media가 갑각류 세포의 증식에 적합하지만 다른 기본 배양 배지에 우태아혈청을 첨가하더라도 세포의 증식은 발생한다는 것을 알 수 있었다.
실시예 2. Peptone 포함 배지에서의 세포 증식
동물세포의 배양에 있어서 세포 증식 효과가 있는 우태아혈청을 대체할 수 있는 성분으로 펩톤(Peptone)이 사용될 수 있는 지 여부를 확인하기 위해, 일반적인 동물세포 배양에 사용하지 않는 펩톤에 의한 세포 증식 효과를 확인하였다. 펩톤은 각종 단백질을 효소 분해하거나 가수 분해할 때 생성되는 생성물의 총칭으로 폴리펩티드, 아미노산, 미네랄 등의 성분이 혼합되어 있다. 구체적으로, 기본 배지 3종류(DMEM-F12, L15 또는 Grace's insect media)에 0.01, 0.6, 1 또는 10% (w/v)의 농도가 되도록 펩톤을 첨가하여 배양액을 제조하고, 우태아혈청을 첨가하거나 첨가하지 않은 배양액과 비교하여 새우, 게 또는 랍스터에서 분리한 갑각류 유래 세포의 증식을 실시예 1과 같은 방법으로 확인하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, DMEM-F12, L15 또는 Grace's insect media에 우태아혈청과 펩톤을 첨가하지 않았을 경우 매우 미미한 세포의 증식을 확인하였다. 하지만, 3종류의 기본 배지에 펩톤을 첨가하여 세포를 배양한 경우 10% (v/v)의 우태아혈청을 포함하는 경우보다 높은 세포 증식률을 보였으며, 그 중에서도 Grace's insect media에 펩톤을 첨가한 경우 가장 높은 세포 증식을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 모든 기본 배지에 펩톤을 첨가하여 배양하였을 경우 10% (v/v) 우태아혈청을 첨가한 배양 배지보다 세포 증식률이 증가하므로 펩톤이 우태아혈청보다 세포 증식에 효과적인 것을 확인하였다.
실시예 3. 효모 추출물 포함 배지에서의 세포 증식
동물세포의 배양에 있어서 세포 증식 효과가 있는 우태아혈청을 대체할 수 있는 성분으로 효모 추출물(Yeast extract)이 사용될 수 있는 지 여부를 확인하기 위해, 효모 추출물을 첨가하였을 경우 어떠한 세포 증식의 변화를 보이는지 확인하였다. 펩톤 대신에 효모 추출물을 사용한 것을 제외하고는 실시예 2와 동일한 방법을 통해 확인하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, Grace's insect media를 기본 배지로 사용하고 효모 추출물을 첨가한 경우 가장 높은 세포 증식률을 보였다. 상기 결과로부터 배지에 효모 추출물을 첨가할 경우 우태아혈청을 첨가한 배지 보다 세포 증식에 효과적이라는 것을 확인하였다.
실시예 4. 세포 배양 시 아미노산 소모량의 측정 및 아미노산 혼합물 첨가 배지에서의 세포 증식
4.1. 아미노산 소모량의 측정
Grace's insect media에 효모 추출물을 첨가한 배양액이 세포 증식에 효과적인 것을 확인하고, 세포 증식 속도를 더욱 증가시킬 수 있는 방법을 알아보기 위해 세포의 배양 과정에서 아미노산의 소모량을 ultra performance liquid chromatography (UPCL)를 통해 측정하였다. 구체적으로, Grace's insect media에 0.6% (w/v) 효모 추출물을 첨가한 배양 배지에 새우 세포를 배양한 뒤, 세포 배양 후 3, 6, 10, 12, 24 및 48시간의 배양액을 채취하여 아미노산 소모량을 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, Serine, Aspartic acid, glutamic acid, alanine, glutamine, proline, tyrosine, valine, leucine, 총 9종의 아미노산이 12시간 이내에 50% 이상 소모되는 것을 확인하였다.
4.2. 아미노산 혼합물 첨가 배지에서의 세포 증식
12시간 이내에 50% 이상 소모되는 아미노산이 세포 증식 초기에 사용되어 세포 증식 속도에 밀접한 영향을 갖고 있을 것이라 가정하고, 효모 추출물 또는 펩톤을 첨가한 Grace's insect media에 먼저 소모되는 9종의 아미노산 혼합물을 추가로 첨가하여 아미노산 혼합물 첨가에 의한 세포 증식을 관찰하였다. 구체적으로, Alanine 225mg/L, Aspartic Acid 350mg/L, Glutamic Acid 600mg/L, Glutamine 600mg/L, Leucine 75mg/L, Proline 350mg/L, Serin 1100mg/L, Tyrosine*2Na 75mg/L, Valine 100mg/L의 농도가 되도록 아미노산 혼합물을 첨가하고 세포 증식을 관찰하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 세포 배양 시작 24시간 이후에서 9종의 아미노산을 첨가하지 않은 것 보다 9종의 아미노산을 첨가한 배양 배지에서 현저히 빠른 세포 증식을 관찰할 수 있었고, 세포 배양 시작 48시간에서도 9종 아미노산을 첨가하지 않은 세포 배양 배지보다 아미노산 혼합물을 첨가한 배양 배지에서 보다 많은 양의 세포가 증식된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터 세포 배양 시 초기 소모량이 많은 아미노산의 첨가는 세포 증식 속도 및 증식량을 증가시킨다는 것을 알 수 있었다.
실시예 5. 미량원소 첨가 배지에서의 세포 증식
효모 추출물은 주로 아미노산, 비타민 그리고 미량원소(Trace element) 로 구성되어 있다. 미량원소는 생물이 성장하는 데 꼭 필요한 물질들 중 아주 작은 양만 필요한 물질들을 의미하며, 생물의 생장 발달 및 생리에 중요한 역할을 하는 필수 화학 원소이다. 수은, 카드뮴, 요오드 등 대부분의 중금속 등이 이에 속한다.
9종 아미노산 이외에 세포의 증식을 촉진시킬 수 있는 물질을 확인해보고자 효모 추출물에 포함되어 있는 미량원소의 양을 분석하여 효모 추출물 또는 펩톤을 포함하는 배양 배지에 미량원소를 추가로 첨가(Grace's insect media + yeast extract + 미량원소 또는 Grace's insect media + peptone + 미량원소)하고 세포 증식에 어떠한 영향을 미치는지 확인해보고자 세포 증식 실험을 수행하였다. 구체적으로, Calcium 5.28mg/L, Magnesium 16.2mg/L, Potassium 258mg/L, Sodium 50.4mg/L, Zinc 0.084mg/L, Copper 0.0414mg/L, Manganese 0.021mg/L의 농도로 미량원소를 첨가하고 세포증식을 관찰하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 새우 세포 배양 배지에 미량원소를 첨가한 경우 미량원소를 첨가하지 않은 대조군보다 세포 증식 속도 및 최종 증식량이 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 새우 세포와 동일하게 게, 랍스터 세포 배양 배지에 미량원소를 첨가한 경우에도 미량 원소를 첨가하지 않은 대조군보다 세포 증식 속도 및 최종 증식량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과로부터, 갑각류 세포 배양 배지에 미량원소를 첨가하면 세포 증식 속도 및 최종 증식량의 증가에 도움을 준다는 것을 확인할 수 있었다.
Claims (19)
- 효모 추출물을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지 조성물로서,
상기 동물세포는 새우, 게 또는 랍스터 유래 세포인 것인, 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 효모 추출물을 0.01 내지 10% (w/v)로 포함하는 배지 조성물. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 효모는 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp.), 위커하모마이세스 속(Wicherhamomyces sp.), 피키아 속(Pichia sp.) 및 한세니아스포라 속(Hanseniaspora sp.)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 배지 조성물. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 배지는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, DMEM/F-10 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-10), DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium: Nutrient Mixture F-12), α-MEM (α-Minimal essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Isocove's Modified Dulbecco's Medium), Knockout DMEM, E8 (Essential 8 Medium), SF-DMEM (serum free-Dulbecco Modified Eagle Medium), L15 Medium 및 Grace's Insect Medium으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 배양은 부유배양인 것인 배지 조성물. - 제1항에 있어서,
아미노산 혼합물 또는 미량원소를 추가로 포함하는 배지 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 아미노산 혼합물은 세린, 아스파르트산, 글루탐산, 알라닌, 글루타민, 프롤린, 타이로신, 발린 및 류신으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 것인 배지 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 미량원소는 칼슘(Ca), 칼륨(K), 나트륨(Na), 철(Fe), 염소(Cl), 붕소(B), 망간(Mn), 아연(Zn), 구리(Cu) 및 몰리브덴(Mo)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 것인 배지 조성물. - 제11항에 있어서,
상기 아미노산 혼합물 또는 미량원소를 100 내지 5000 mg/L로 포함하는 배지 조성물. - 효모 추출물을 포함하는 동물세포 배양용 무혈청 배지 조성물에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 동물세포의 배양 방법으로서,
상기 동물세포는 상기 동물세포는 새우, 게 또는 랍스터 유래 세포인 것인, 배양 방법. - 삭제
- 삭제
- 제15항에 있어서,
상기 배양은 부유배양인 것인 배양 방법. - 제15항에 있어서,
상기 배지 조성물은 아미노산 혼합물 또는 미량원소를 추가로 포함하는 것인 배양 방법.
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