KR20210116551A - 갑각류로부터의 근육 및 지방 세포들의 단리와 배양 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 종들과 세포주 자체들로부터 재생 가능한 근육 및/또는 지방 일차 세포주들, 무한증식 세포주들 및 줄기 세포주들의 형성 및 생산하기 위한 방법들뿐만 아니라 이들로부터 생산되는 인간 및 동물 소비 식육 제품들에 관한 것이다.
Description
[001] 본 발명은 쉬림프(shrimp), 프론(prawn), 크랩(crab), 크레이피쉬(crayfish) 및/또는 로브스터(lobster) 종으로부터의 재생 가능한 근육 및 지방 줄기 세포주들의 형성에 관한 것이다.
[002] 세계 인구는 계속적으로 증가하고 있는 반면에 도시의 확장과 기후 조건들의 변화로 인하여 경작할 수 있는 농지의 양은 감소하고 있다. 이는 상업적 어업과 해양 "양식"을 증가시켰으며, 세계의 해양과 대양에 영향을 미치고 있다. 그 결과, 쉬림프, 프론, 크랩 및 로브스터와 같이 특히 인기 있는 종들의 남획은 야생의 개체군들을 크게 감소시켜왔다.
[003] 환경에 대해 가지는 동물 식육 생산과 자연 어업의 부담을 감소시키기 위한 시도에서, 기술들이 조직 강화 식육 및 어육을 위해 개발되고 있다. 이러한 유형의 세포 농업은 동물들을 사육하고 희생시킬 필요 없이 식품의 생산을 가능하게 한다. 세포 농업에서 대부분의 연구는 미발달 근육 성장, 근육 줄기 세포, 근육 치유 및 근육 재생-특히 소고기, 돼지고기 및 닭고기의 연구들로부터 입수 가능한 풍부한 정보가 있는 동물들에 대해 집중되고 있다. 그러나 살아있는 동물들로부터 추출된 근육의 "동일한(like-for-like)" 복제인 식육 또는 어육 제품들의 생산에는 많은 어려움들이 존재한다.
[004] 그러나, 해산물 종들에 대해, 연구가 적게 수행되어 왔고, 성공적인 세포 농업 작업을 위해 극복되어야 하는 장애들이 복합되어 있다(Rubio 등의 "Front. Sustain. Food Syst." doi: 10.3389/fsufs.2019.00043, 2019). 리토페나에우스 반나메이(Litopenaeus vannamei)(이전의 페나에우스 반나메이(Penaeus vannamei); 화이트레그 쉬림프/퍼시픽 화이트 쉬림프/킹 프론으로도 알려짐)와 페나에우스 모노돈(Penaeus monodon)(자이언트 타이거 프론/아시안 타이거 프론으로도 알려짐)은 1.66 반나메이/2.6 모노돈 Gb 게놈 사이즈 및 44 의사 염색체들(반나메이)/88개의 염색체들을 가지는 것으로 예측된다(Zhang 등의 "Nature Communications"(10:356, 2019) 및 Yuan 등의 "J. Marine Genomics doi.org/10.1016/j.margen.2017.12.006"(2017)). 이들 큰 게놈 사이즈들과 상당한 숫자의 게놈 반복들은 프론/쉬림프 게놈들의 서열 결정(sequencing)과 조합을 어렵게 만든다(Yuan 등의 "J. Marine Genomics doi.org/10.1016/j.margen.2017.12.006"(2017) 및 Zhang 등의 "Nature Communications"(10:356, 2019)). 또한, 프론/쉬림프에 대해 이용 가능한 몇몇 게놈 라이브러리 연구 엔진들은 강하지 않거나 잘 설명되어 있지 않다(쉬림프 GPAT; 쉬림프 EST 프로젝트; NCBI 분류 체게 프로젝트). 더욱이, 쉬림프/프론에 대한 게놈 연구들은 게놈 진화(Yuan 등의 "Mar Biotechnol"(19(1): 76-88, 2017); Yuan 등의 "Mar Drugs"(15(7): 213, 2017)), 유전자 연관(Yang 등의 "Scientific Reports"(5: 15612, 2015)) 및 발달 유전자들(Brown 등의 "Genome Biol Evol"(10(1): 143-156, 2018))에 중점을 두어왔다. 이러한 상황은 주어진 종에 대한 "쉬림프" 및 "프론"의 일치하지 않거나 및/또는 상호 교환적인 이용에 의해 더 복잡하게 된다. 그렇더라도, 적어도 2,000종의 인지된 종들이 존재하며, 이들 속들 중에서 가장 중요한 것들은 페나에우스(Penaeus), 솔레노세라(Solenocera), 메타페나에우스(Metapenaeus), 파라페나에우스(Parapenaeus), 파라페나에옵시스(Parapenaeopsis), 메타페나에옵시스(Metapenaeopsis), 트라치페나에우스(Trachypenaeus), 프로트라치페네(Protrachypene), 지포페나에우스(Xiphopenaeus), 히메노페나에우스(Hymenopenaeus), 아티포페나에우스(Atypopenaeus), 유시시오니아(Eusicyonia), 시시오니아(Sicyonia) 및 리토페나에우스(Litopenaeus)이다.
[005] 일부 연구들은 개체 크기 및 무게에 의한 물리적인 동물 성장의 측면에서 쉬림프/프론 종들을 조사하였다. 쉬림프 성장은 외래의 틸라피아 성장 호르몬들을 쉬림프 배아들 내로 형질 도입하여 개선되었다(Arenal 등의 "Biotechnol Lett"(30(5): 845-51, 2008)). 억제 감쇠 교잡이 페나에우스 모노돈 종에서 체중과 연관된 몇몇 성장 유전자들에서 확인된다(Tangprasittipap 등의 "Aquaculture"(307(1-2): 150-156, 2010)). 근육 성장 유전자들은 페나에우스 모노돈 종에서는 확인되었지만, 다른 종들에서는 그렇지 않았다(Ngyuen 등의 "Aquaculture"(464: 545-553, 2016)). 그러나, 근육 세포들을 재프로그램하거나 불명화하기 위한 유전자들의 유전적 변형은 아직 시도되지 않았거나, 성공적이지 않았다.
[006] 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 종들에 대한 상황은 유사하다. 예를 들면, 마블 크레이피쉬(프로캄바루스 비르지날리스(Procambarus virginalis))(이전에는 프로캄바루스 팔락스 f. 비르지날리스(Procambarus fallax f. virginalis))는 276개의 염색체들을 갖는 인간들의 경우(즉, 3.5Gbp; Gutekunst 등의 "Nature Ecology & Evolution"(2: 567-573, 2018))보다 큰 것으로 추정되는 게놈 크기를 가지지만, 블루 크랩(칼리넥테스 사피두스(Callinectes sapidus)) 게놈은 알려지지 않은 숫자의 염색체들을 갖는 약 2Gbp의 크기이다(인터넷 상의 블루 크랩 웹사이트의 IMET 가디언즈; 2.35pg, 인터넷 상의 동물 데이터베이스; 및 게놈 크기(bp)＝(0.978 X 109) X DNA 함량(pg)으로 정의한 Dolezel 등("Cytometry"(Part A 51A: 127-128, 2003) 참조). 현재까지 로브스터 게놈은 완전히 서열 결정되지 않은 반면, 아메리칸 로브스터(호마루스 아메리카누스(Homarus americanus)) 게놈은 약 4.40pg/4.3Gbp 또는 그 이상인 것으로 추정된다(인터넷 상의 동물 게놈 크기 데이터베이스 웹사이트 및 글로스터 해양 유전체학 연구소(Gloucester Marine Genomics Institute) 웹사이트, 아메리칸 로브스터 게놈 참조).
[007] 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터에 관한 정보의 부족은 세포 배양에서의 어려움들로 인해 충분히 논의될 수 있다. 예를 들면, 쉬림프/프론 세포주들은 림프 기관 및 난소들로부터만 이루어져 있다(Tapay 등의 "Proc Soc Exp Biol Med"(209(1): 73-8, 1995); Hsu 등의 "Aquaculture"(136: 43-55, 1995); 미국 특허 제6,143,547호; George 및 Dhar의 "In Vitro Cell Dev Biol Anim"(46(9): 801-10, 2010); Ma 등의 "Reviews in Aquaculture"(9: 88-98, 2017)). 또한, 쉬림프/프론 일차 근육 배양들은 12일까지만 지속되었고(George 및 Dhar(2010)), 지방 세포들에 대해 기재된 알려진 일차 배양들이나 세포주들은 없었다.
[008] 또한, 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터로부터 지방 세포들을 배양하기 위한 시도들은 기재되어 있지 않다.
[009] 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터로부터의 무한증식 세포주(immortalized cell line)들의 가용성은 세포 농업의 차후 단계들을 진행시키게 할 수 있다(Rubio 등의 "Front. Sustain. Food Syst. doi: 10.3389/fsufs.2019.00043"(2019)). 식품 규제 및 연구 그룹들은 일차 세포들을 단리하는 시간이 소요되는 과정보다는 식품 규제 및 조사 그룹들은 세포주들의 준비된 소스를 가질 수 있었다. 이는 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 바이러스 질병들의 이해, 이들 바이러스들의 존재에 대한 테스트, 그리고 치료의 발전을 가능하게 하였다(Ma 등의 "Reviews in Aquaculture"(9: 88-98, 2017)). 이에 따라, 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터로부터의 무한증식 근육 및 지방 세포주들에 대한 필요성이 남아 있다. 여기에 제시되는 본 발명은 이러한 요구를 해결한다.
[010] 본 발명은 조직 강화 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 식육 제품들 및 이러한 제품들을 생산하기 위한 방법들에 관한 것이다. 일 측면에서, 상기 식육 제품은 탈체(ex vivo) 및/또는 생체 외(in vitro)로 성장된 근육 세포들을 포함한다. 다른 측면에서, 상기 식육 제품은 탈체 및/또는 생체 외로 성장된 근육 및/또는 지방 세포들을 포함한다. 또 다른 측면에서, 상기 식육 제품은 탈체 및/또는 생체 외로 성장된 근육 세포들, 지방 세포들, 다른 세포들 및 이들의 결합들을 포함한다. 상기 식육 제품은 필수적으로 임의의 유해한 미생물 또는 기생충 오염이 없다.
[011] 이에 따라, 본 발명은 재생 가능한 근육 및/또는 지방 줄기 세포주들을 성장시켜 소비를 위한 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 식육 제품들을 생산하기 위한 방법들을 제공한다.
[012] 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 무한증식(immortalized) 근육 및/또는 지방 세포주를 생산하기 위한 한 가지 방법은 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 및/또는 지방 세포들을 단리하는 단계, 재조합 아데노바이러스 구성체(adenoviral construct) 또는 비통합성(non-integrative) 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)를 형성하기 위해 적어도 하나의 근육 특이적 및/또는 지방 특이적 성장 유전자를 아데노바이러스 벡터 또는 비통합성 렌티바이러스 벡터 내로 통합시키는 단계, 그리고 상기 단리된 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 세포들을 상기 재조합 아데노바이러스 구성체 또는 비통합성 렌티바이러스 벡터로 형질 도입하는 단계를 포함한다. 그렇지만, 상기 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 무한증식 근육 및/또는 지방 세포주를 생산하기 위한 방법은 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 및/또는 지방 세포들의 단리 후에 사이클로아스트라제놀(Cycloastragenol), 제니스테인(Genistein) 및/또는 레스베라트롤(Resveratrol)과 같은 화학적 활성제들에 의해 텔로머레이스(telomerase)의 활성을 유도하는 단계도 포함한다.
[013] 또한, 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 유도 다능성 줄기(induced pluripotent stem)(iPS) 세포들을 생산하기 위한 방법이 제시된다. 이러한 방법은 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터로부터 근육 및/또는 지방 세포들을 단리하는 단계, 상기 세포들을 표적화 인자(targeting factor)를 포함하는 에피소말 플라스미드(episomal plasmid)로 형질 주입하는 단계, 그리고 이후에 iPS 세포들을 생산하기 위해 상기 형질 주입된 세포들을 배양하는 단계를 포함한다.
[014] 또한, 본 발명은 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 및/또는 지방 세포들을 단리하는 단계, 상기 세포들을 재프로그래밍 mir302a-d, mir367, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc 및 Lin28과 같은 마이크로RNA들을 포함하는 마이크로RNA 및 mRNA들로 형질 주입하는 단계, 그리고 iPS 세포들을 생산하기 위해 상기 형질 주입된 세포들을 배양하는 단계를 통해 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 유도 다능성 줄기(iPS) 세포들을 생산하기 위한 방법을 제공한다.
[015] 본 발명은 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 세포들을 단리하는 단계, 다능성 유전자들을 발현시키기 위해 상기 단리된 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 세포들을 재프로그램하는 단계, 유도 다능성 줄기(iPS) 세포들을 단리하는 단계, 근섬유들 및/또는 지방을 생성하기 위해 상기 iPS 세포들을 유도하는 단계, 그리고 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 식육 제품을 생산하기 위해 상기 근섬유들 및/또는 지방을 성장시키는 단계에 의해 소비를 위해 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 식육 제품들을 생산하는 방법을 더 포함한다.
[016] 도 1은 절편 직후의 배양 배지 내의 쉬림프 외식편들을 나타낸다. A: T75 플라스크 내의 외식편들이고, B: 페트리 접시 내의 외식편들이다.
[017] 도 2는 7일째의 외식편 세포 성장을 나타낸다.
[018] 도 3은 80%-90%의 융합에 도달한 후에 1:3의 비율로 희석된 세포들의 Ti-2 니콘 현미경 상의 명시야 영상을 나타낸다. A: x20 배율이고, B: x20 배율이다.
[019] 도 4는 현탁 배양의 생성 후의 3일째에 형성되기 시작하는 근섬유들을 x40 배율로 나타낸다.
[020] 도 5는 7일의 성장 후에 수확을 위해 준비되는 근섬유들을 x40 배율로 나타낸다.
[021] 도 6은 근육 줄기 세포들이 단리되는 꼬리 분절들의 조직 구조를 나타낸다. A: 최종적인 몸체 분절이고, B: 상기 최종적인 몸체 분절의 증가된 배율의 도면이며, C: 상기 꼬리의 중간 날개이고, D: 상기 중간 날개의 증가된 배율의 도면이며, E: 상기 꼬리의 측부 날개이고, F: 상기 측부 날개의 증가된 배율의 도면이며, G: 중간의 어린 쉬림프의 조직 구조이고, 근육 부위들은 흑색으로 윤곽을 나타낸다.
[017] 도 2는 7일째의 외식편 세포 성장을 나타낸다.
[018] 도 3은 80%-90%의 융합에 도달한 후에 1:3의 비율로 희석된 세포들의 Ti-2 니콘 현미경 상의 명시야 영상을 나타낸다. A: x20 배율이고, B: x20 배율이다.
[019] 도 4는 현탁 배양의 생성 후의 3일째에 형성되기 시작하는 근섬유들을 x40 배율로 나타낸다.
[020] 도 5는 7일의 성장 후에 수확을 위해 준비되는 근섬유들을 x40 배율로 나타낸다.
[021] 도 6은 근육 줄기 세포들이 단리되는 꼬리 분절들의 조직 구조를 나타낸다. A: 최종적인 몸체 분절이고, B: 상기 최종적인 몸체 분절의 증가된 배율의 도면이며, C: 상기 꼬리의 중간 날개이고, D: 상기 중간 날개의 증가된 배율의 도면이며, E: 상기 꼬리의 측부 날개이고, F: 상기 측부 날개의 증가된 배율의 도면이며, G: 중간의 어린 쉬림프의 조직 구조이고, 근육 부위들은 흑색으로 윤곽을 나타낸다.
[022] 본문에 전체적으로 걸쳐, "일" 또는 "하나"의 실체라는 용어는 이러한 실체의 하나 또는 그 이상을 말한다. 예를 들면, "폴리뉴클레오티드"는 하나 또는 그 이상의 폴리뉴클레오티드들을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, "일"(또는 "하나"), "하나 또는 그 이상" 및 "적어도 하나"라는 용어들은 여기서 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
[023] 또한, "및/또는"은 여기서 사용되는 경우에 다른 것과 함께 또는 그렇지 않은 두 명시된 특징들이나 구성 요소들 각각의 특정된 개시로 여겨진다. 따라서 "A 및/또는 B"와 같은 표현에서 사용되는 바와 같은 "및/또는"이라는 용어는 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독), 그리고 "B"(단독)를 포함하도록 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 표현에서 사용되는 바와 같은 "및/또는"이라는 용어는 A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독; B(단독); 그리고 C(단독)의 측면들을 각기 포괄하도록 의도된다.
[024] 다르게 정의되지 않은 한, 여기에 사용되는 모든 기술적 및 과학적인 용어들은 본 발명이 속하는 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 가진다. 예를 들면, 생물 의학 및 분자 생물학 콘사이스 사전("The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology"(Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press)); 세포 및 분자 생물학 사전("The Dictionary of Cell and Molecular Biology"(3rd ed., 1999, Academic Press)); 생화학 및 분자 생물학 옥스퍼드 사전("The Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology"(Revised, 2000, Oxford University Press)); Takahashi 등의 "Cell"(131:861-872, 2007); 그리고 Yu 등의 "Science"(21; 318, 5858: 1917-20, 2007)가 해당 기술 분야에서 숙련자에게 본문에 사용되는 많은 용어들의 일반적 사전으로 제공된다.
[025] 단위들, 접두어들 및 기호들은 그 국제단위계(SI)에서 허용되는 방식으로 표시된다. 수치 범위들은 이러한 범위를 한정하는 수치들을 포함한다. 여기에 제공되는 표제가 본 발명의 다양한 측면들을 제한하는 것은 아니며, 전체적으로 본문에서 참조가 될 수 있다.
[026] 여기서의 값들의 범위의 언급은, 여기에 다르게 기재되지 않은 한, 단지 상기 범위 내에 해당되는 각각의 별도의 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로 기여하도록 의도되며, 각각의 별도의 값은 여기서 개별적으로 언급되는 바와 같이 본문에 포함된다. 특정한 값들의 범위가 제공되는 경우, 각각의 개재되는 값은 그 내에 포함되도록 의도되며, 모든 보다 작은 하위 범위들도 포함되는 점이 이해될 것이다.
[027] 식용 가능한 쉬림프(shrimp), 프론(prawn), 크랩(crab), 크레이피쉬(crayfish) 및/또는 로브스터(lobster) 제품들뿐만 아니라, 상기 식용 가능한 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 제품들에의 사용을 위해 세포 소스로부터 근육 및/또는 지방 조직을 생체 외로(in vitro) 생성하기 위한 새롭고 개선된 방법들이 여기에 제공된다. 이러한 방법들은 양식 또는 자연 어업에 크게 의존하지 않고 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 조직, 또는 "식육(meat)"의 생산을 위해 유용하다. 현재, 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터로부터의 식육은 통상적으로 꼬리, 다리 또는 집게발 근육들로부터만 취해진다. 상기 꼬리, 다리, 또는 집게발 식육은 일반적으로 외골격의 제거 후에 전체적으로 또는 큰 조각들로 판매되지만, 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 식육 제품(meat product)들도 "미트볼들"/"피쉬볼들"에 포함되기 위한 다진 식육과 같은 파생 상품들 및 훈제, 퓨레, 조미 및/또는 건조 식육을 함유하는 제품들을 포함한다.
[028] 또한, 여기에 제공되는 방법들 중의 임의의 것에 의해 만들어진 근육 및/또는 지방 조직과 같은 생체 외로 생산된 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 조직들이 개시된다. 이에 따라, 상기 세포 소스는 성체 줄기 세포, 유도 다능성 줄기(induced pluripotent stem)(iPS) 세포 및/또는 무한증식(immortalized) 세포주가 될 수 있다. 상기 쉬림프 및/또는 프론 세포 소스는 바람직하게는 페나에우스(Penaeus), 솔레노세라(Solenocera), 메타페나에우스(Metapenaeus), 파라페나에우스(Parapenaeus), 파라페나에옵시스(Parapenaeopsis), 메타페나에옵시스(Metapenaeopsis), 트라치페나에우스(Trachypenaeus), 프로트라치페네(Protrachypene), 지포페나에우스(Xiphopenaeus), 페페나에우스(Hymenopenaeus), 아티포페나에우스(Atypopenaeus), 유시시오니아(Eusicyonia), 시시오니아(Sicyonia) 및/또는 리토페나에우스(Litopenaeus) 속(genus)으로부터의 종으로부터 단리된다. 상기 크랩 세포 소스는 바람직하게는 치오노에세테스(Chionoecetes), 칼리넥테스(Callinectes), 차리브디스(Charybdis), 칸세르(Cancer), 스킬라(Scylla) 및/또는 메타카르시누스(Metacarcinus) 속으로부터의 종으로부터 단리된다. 상기 크레이피쉬 세포 소소는 바람직하게는 캄바루스(Cambarus), 자수스(Jasus), 테누스(Thenus), 캄바렐루스(Cambarellus), 캄바로이데스(Cambaroides), 아타코프시스(Atacopsis), 아우스트로포타모비우스(Austropotamobius), 아스타쿠스(Astacus), 프로캄바루스(Procambarus), 오르코넥테스(Orconectes), 팍소넬라(Faxonella) 및 파시파스타쿠스(Pacifastacus) 속으로부터 단리된다. 상기 로브스터 세포 소스는 바람직하게는 아칸타카리스(Acanthacaris), 유네프로프스(Eunephrops), 호미나리누스(Hominarinus), 호마루스(Homarus), 메타네프로프스(Metanephrops), 네프로피데스(Nephropides), 네프로프스(Nephrops), 네프로프시스(Nephropsis), 타우마스토첼레스(Thaumastocheles), 타우마스토첼로프시스(Thaumastochelopsis), 티모피데스(Thymopides), 티모프스(Thymops), 또는 티모프시스(Thymopsis) 속으로부터의 종으로부터 단리된다.
갑각류로부터의 일차 근육 및 지방 세포들의 단리
[029] 본 발명의 일 측면은 재생 가능한 근육 및/또는 지방 줄기 세포주들을 성장시켜 소비를 위한 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 식육 제품들을 생산하는 방법에 관한 것이다. 이는 다양한 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 종들로부터 근육 및/또는 지방 세포들을 단리시키고, 이들 생체 외로 배양하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 도 6은 줄기 세포들이 단리되는 쉬림프 꼬리 분절(segment)들의 조직 구조를 예시한다.
[030] 바람직하게는, 신선한 희생된 쉬림프들, 프론들, 크랩들, 크레이피쉬 및/또는 로브스터들로부터의 외식편(explant)들은 작은 조각들로 분리된다. 통상적으로, 상기 조각들은 적어도 0.1㎜의 크기이며, 0.25㎜, 0.5㎜, 0.75㎜, 1㎜, 1.25㎜, 1.5㎜, 1.75㎜, 2㎜, 2.25㎜, 2.5㎜, 2.75㎜, 3㎜, 3.25㎜, 3.5㎜, 3.75㎜, 4㎜, 4.25㎜, 4.55㎜, 4.75㎜, 5㎜ 또는 0.1㎜ 내지 5㎜ 사이의 임의의 수치가 될 수 있다. 외식편은 세포 배양을 위해 세포 배양 배지를 파종하는 데 이용될 수 있다.
[031] 사용될 때, 외식편들은 그레이스 곤충 배지(Grace's insect media), DMEM 하이 글루코오스(high glucose)(하이클론(HyClone) SH30022.01, 피셔 사이언티픽(Fischer Scientific), 월섬, 매사추세츠 주), 뉴트리스템(NUTRISTEM)® MSC XF 보강 혼합(바이올로지컬 인더스트리즈(Biological Industries), 크롬웰, 코네티컷 주), 뉴트리스템® MSC XF 기본 배지(바이올로지컬 인더스트리즈, 크롬웰, 코네티컷 주), 미오쿨트(MYOCULT)TM SF 체적 증대 인간(expansion human) 10x(스템셀 테크놀로지즈(Stemcell Technologies)TM, 케임브리지, 매사추세츠 주), 분화되지 않은 중간엽 줄기 세포들을 위한 하이클론(HyClone)TM 배지(SH30879.01, GE 라이프사이언스(Lifescience), 보스턴, 매사추세츠 주), 하이클론 줄기 세포 10x 보강(하이클론TM SH30878.02, 피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠 주), 레보비츠(Leibovitz's)-15(L-15) 배지(써모피셔(ThermoFisher), 월섬, 매사추세츠 주), M199 배지(써모피셔, 월섬, 매사추세츠 주), MPS 배지(써모피셔, 월섬, 매사추세츠 주), Pj-2 배지, NCTC 135 배지(써모피셔, 월섬, 매사추세츠 주), MM 곤충 배지(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)®, 세인트루이스, 몬타나 주), TC 100 배지(써모피셔, 월섬, 매사추세츠 주), 그리고 이들의 결합들과 같은 세포 배양 배지 내에서 배양된다. 상기 세포 배양 배지는 10%의 소태아 혈청(FBS) 및/또는 5%의 페니실린/스트렙토마이신(PS)을 추가적으로 포함할 수 있다. 신선한 배지가 주기적으로, 바람직하게는 2일-3일마다 첨가된다.
[032] 선택적으로, 외식편들은 주기적으로 세척 프로세스 동안에 상기 외식편들로부터 이탈되는 어떠한 세포들의 추가적인 제거 없이 약 5%의 페니실린-스트렙토마이신 여과 인산 완충 생리식염수(PBS; 0.137M의 NaCl, 0.0027M의 KCl, 0.01M의 Na2HPO4, 0.0018M의 KH2HPO4, pH7.4)로 주기적으로 세척된다. 바람직하게는, 상기 세척 프로세스는 외식편들이 상기 배양 배지로부터 제거될 때까지 2일-3일마다 수행된다.
[033] 상기 외식편/세포 배양들은 이산화탄소 없이 28℃에서 배양된다. 배양이 시작된 후의 약 7일에, 외식편들은 원심 분리, 여과, 자성 비드(magnetic bead)들 및/또는 해당 기술 분야의 숙련자에게 알려진 다른 수단들로 제거되며, 단일 세포들의 큰 집단이 이후에 남겨진다. 상기 집단 내의 근육 줄기 세포들의 동일성은 형태론적 확인 및/또는 근육 유전자들의 PCR 증폭에 의해 결정된다. 세포들에서의 동일성도 형태론적 확인 및/또는 지방 특이적 유전자들의 PCR 증폭에 의해 결정된다. 배양들은 통상적으로 액체 배지/우무 배지 상의 집적적인 성장, 특이적 DNA 염색, PCR 증폭, ELISA, RNA 표지 및 효소 과정들(예를 들어, ADP에서 ATP로의 효소 변환 등), 플라스모테스트(PlasmoTest)TM(인비보젠(InvivoGen), 샌디에이고, 캘리포니아 주), BAM4/LST-MUG(fda.gov/food/laboratory-methods-foodwebsite, 4장 및 5장으로부터 입수 가능한 Feng 등의 (2002)), 그리고 이들의 결합들과 같은 표준 기술들을 이용하여 마이코플라스마(mycoplasma) 및/또는 다른 병원균들에 대해 테스트된다.
[034] 외식편들의 제거 후, 나머지 세포 집단은 나누어지고, 신선한 세포 배양 배지가 추가되며, 배양이 계속된다. 신선한 배지는 주기적으로, 바람직하게는 약 2일-3일마다 첨가된다. 상기 세포들이 거의 융합되는, 바람직하게는 약 70%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 사이의 임의의 값이거나, 상기 세포 집단이 10㎖의 배지 내에 약 8백만의 세포들일 때, 상기 세포들은 다시 나누어지고, 1:3의 비율로 희석된다. 상기 배양 프로세스는 페니실린-스트렙토마이신의 양을 5%에서 2%까지 및 이후에 상기 세포들의 저온 냉동 보존 이전에 9%까지 서서히 감소시키는 과정을 포함할 수 있다.
[035] 세포들은 계대(passage) 2후에 표준 저온 냉동 보존 조건들 및 표준 저온 냉동 보존 배지를 이용하여 저온 보존될 수 있다(예를 들면, 서모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific), 니폰 제네틱스(Nippon Genetics) 및 ATCC로부터 인터넷 상에서 입수 가능한 프로토콜들과 시약들 참조). 예를 들면, 세포들은 1000 x g에서 간단하게 원심분리(예를 들어, 약 5분)될 수 있고, 상청액(supernatant)이 제거될 수 있으며, -80℃에서 저장되기 이전에 동결 튜브들 내에서 1㎖의 밤방커(Bambanker) 동결 배지에 재현가될 수 있다.
근섬유들 내로의 분화
[036] 대략 2백만-3백만의 일차 근육 세포들, 무한증식 근육 줄기 세포들 및/또는 재프로그램된 세포들이 적절한 배양 배지에 첨가된다. 적절한 배양 배지는 DMEM 하이 글루코오스(하이클론TM, SH30022.01; 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 월섬, 매사추세츠 주), 그레이스 곤충 배지, DMEM 하이 글루코오스(하이클론TM SH30022.01, 피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠 주), 뉴트리스템® MSC XF 보충 혼합(바이올로지컬 인더스트리즈, 크롬웰, 코네티컷 주), 뉴트리스® MSC XF 기본 배지(바이올로지컬 인더스트리즈, 크롬웰, 코네티컷 주), 미오쿨트TM SF 체적 증대 인간 10x(스템셀 테크놀로지즈TM, 케임브리지, 매사추세츠 주), 분화되지 않은 중간엽 줄기 세포들을 위한 하이클론TM 배지(SH30879.01, GE 라이프사이언스, 보스턴, 매사추세츠 주), 하이클론TM 줄기 세포 10x 보충(하이클론TM SH30878.02, 피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠 주), 그리고 이들의 결합들을 포함한다. 상기 배양 배지는 불활성화된 소태아 혈청 및/또는 페니실린-스트렙토마이신으로의 촉진을 포함할 수 있다. 세포 배양들은 바람직하게는 28℃에서 교반되면서 배양된다. 통상적으로, 근섬유들은 현탁 배양의 개시 후의 3일째에 형성되기 시작한다. 배지는 상기 세포들을 원심 분리하고/근섬유들을 성장시켜 주기적으로(예를 들어, 3일마다) 변경되고, 상기 배지 상청액이 대체되며, 상기 세포들이 재현가되고/근섬유들이 성장된다. 근섬유들은 일반적으로 상기 현탁 배양이 개시된 후의 7일째에 수확된다.
단리된 일차 근육 및/또는 지방 세포들의 불멸화(immortalization)
[037] 서열 결정(sequencing)으로 식별되는 근육 및/또는 지방 세포들에 특이적인 성장 유전자들은 단리된 근육 및/또는 지방 세포들을 불멸화시키는 데 이용된다. RNA 서열 결정은 표준 기술들을 이용하여 수행되고 분석된다(예를 들면, Kukurba 및 Montgonery의 "Cold Spring Harb Protoc"(11: 951-969, 2015) 참조). 이들 유전자들은, 예를 들면, MyoD와 SMARCD3, Pax3, Pax7(Chal 및 Pourquie의 "Development"(144: 2104-2122, 20176)에서 검토됨), 미오신(myosin)-1, 인테그린(integrin) 알파-7, 카드헤린(cadherin)-15, 미오게닌(myogenin), 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor), 미오스타틴(myostatin)과 성장 분화 인자(growth differentiation factor), 갑각류 혈당상승 호르몬(hyperglycemic hormone), 그리고 미오신 중쇄(Jung 등의 "Reviews in Aquaculture"(5, 77-110, 213); Ngyuen 등의 "Aquaculture"(464: 545-553, 2016); Okita 등의 "Nat Methods"(8: 409-412, 2011)를 포함한다. 재조합 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector)(adm)들; 렌티플래쉬 파티클들(lentiflash particles)(벡탈리스(vectalys)), 유도 가능 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)들(Bar-Nur 등의 "Stem Cell Reports"(10: 1505-1521, 2018) 및 인테그레이즈 결핍(integrase-deficient) 렌티바이러스 벡터들(Chick 등의 "Human Gene Therapy"(23: 1247-1257, 2012)과 같은 비통합성(non-integrative) 렌티바이러스 벡터들; 및/또는 mini circles(Kim 등의 "Stem Cell Research"(23: 87-94, 2017))와 같은 비통합성 불멸화(immortalization) 방법들이 관심의 대상인 성장 유전자들을 통합시키고 과발현시키는 데 이용된다. 아데노바이러스 벡터들은 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus) LTR의 전사 조절 하에서 완전한 길이의 쥣과(murine) MyoD cDNA를 발현시키는 Ad5-유도, E1A-결손 아데노바이러스 벡터(Lattanzi 등의 "J Clin. Invest."(101(10): 2119-2128, 1998)); Ad-MyoD, Ad-m-MYOD1("Vector Biolabs", Cat. No 1492, ADV-265351); 인간 5형 아데노바이러스(Suehiro 등의 "FEBS Letters"(584: 3545-3549, 2010)), 그리고 흰 철갑상어 아데노바이러스(WSAdV-1)(Hendrick 등의 "Can J Fish Aquat Sci"(42: 1321-1325, 1985); Hendrick 등의 "Dis Aquat Org"(8: 39-44, 1990))를 포함한다. 비통합성 렌티바이러스 벡터들의 예는 상업적으로 입수 가능한 렌티플래쉬 파티클들(벡탈리스)이고, 이는 주문 제작 pRLP-MS2 플라스미드(벡탈리스, 툴루즈, 프랑스)를 포함하며, 여기서 앞서 언급한 바와 같은 근육 성장 유전자는 상기 벡터 내로 복제되고, pRLP-MCP 및 VSVG 플라스미드들과 함께 형질 도입된다. 선택적으로는, tetOP-MyoD 및 M2rtTA와 같은 유도 가능한 렌티바이러스 벡터들이 상기 단리된 근육 세포들 내에서 공동으로 발현된다(Bar-Nur 등(2018)). 유사하게, 적합한 인테그레이즈 결핍 렌티바이러스 플라스미드들이 Chick 등(2012)에 따라 구성될 수 있으며, pHR' SIN-cPPT-SFFV-eGFP-WPRE, pHR' SIN-cPPT-SFFV-NogoB-WPRE 및 pCMV 델타 R8.74 D64V 플라스미드들의 결합을 포함한다. 최종적으로, hPax7을 발현시키는 DNA 소형 고리들이 Kim 등(2017)에 따라 복제된다.
[038] 이와 다르게, 세포들의 화학적 불멸화는 사이클로아스트라제놀(Cycloastragenol)(시그마(Sigma), SMB00372-20MG; Fauce 등의 "J Immunol."(181(10): 7400-7406)(2008)), 글리신 맥스(Glycine Max)(대두)로부터의 제니스테인(Genistein)(시그마, G6776-5MG; Chau 등의 "Carcinogenesis"(28(11): 2282-2290, 2007)), 또는 레스베라트롤(Resveratrol)(시그마, R5010-100MG; Xia 등의 "British Journal of Pharmacology"(155: 387-394, 2008); Zhai 등의 "Oncology Letters"(11: 3015-3018, 2016))과 같은 텔로머레이스(telomerase) 활성화제들의 사용에 의해 자극된다.
[039] 약 70%의 융합에서의 단리된 일차 세포들은 형질 도입(transduction)을 위해 이용된다. 관심의 대상인 유전자를 가지는 아데노바이러스 벡터 구성체들과 함께 배양되는 세포들은 28℃에서나 그 부근에서 1시간 동안 배양되며, 48시간-72시간 이후에 PCR, 정량적 PCR 및/또는 FACS에 의해 형질 도입에 대해 평가된다. 렌티플래쉬 파티클들은 제거 이전에 일차 세포들과 함께 28℃에서나 그 부근에서 약 12시간 동안 배양된다. 선택적으로, 상기 형질도입 프로세스는 처음의 형질 도입 후의 대략 30시간에서 반복된다(Prel 등의 "Mol Ther Methods Clin Dev"(21(2): 15039)(2015)). 유도 가능한 렌티바이러스 벡터들은 제거 이전에 24시간 동안 28℃에서나 그 부근에서 일차 세포들과 함께 배양되며, 이후에 48시간 및 72시간에서 4㎍/㎖-8㎍/㎖의 폴리브렌(polybrene) 형질 주입(transfection) 시약(시그마-알드리치)으로 보충된다(Bar-Nur 등(2018)). 인테그레이즈 결핍 렌티바이러스 플라스미드들은 8㎍/㎖의 폴리브렌의 존재에서 28℃에서나 그 부근에서 18시간 동안 일차 세포들과 함께 배양된다(Chick 등의 "Human Gene Therapy"(23(12): 1247-1257)(2012)). 선택적으로는, 소형 고리들은 Kim 등("Stem Cell Research"(23: 87-94)(2017))에 의해 보고된 바와 같이 제네인(GENEIN)TM 형질 주입 키트(MTI-글로벌스템(GlobalStem), 게이더스버그, 메릴랜드 주)로 3일 동안 전체 3회 일차 세포들 내로 형질 도입된다.
[040] 화학적 불멸화에 의존할 때, 상기 세포들은 사이클로아스트라제놀(0.01-1mM, 시그마; Fauce 등의 "J Immunol."(181(10): 7400-7406)(2008)); 제니스테인(0.5-1mM, 시그마; Chau 등의 "Carcinogenesis"(28(11): 2282-2290)(2007)) 또는 레스베라트롤(10-50mM, 시그마; Xia 등의 "British Journal of Pharmacology"(155: 387-394)(2008); Zhai 등의 "Oncology Letters"(11: 3015-3018)(2016))로 전체 72시간 또는 144시간 동안 배양된다(72시간에서 보충됨).
[041] 일차 세포들의 불멸은 근육 줄기 세포 및/또는 성장 유전자들의 PCR 발현에 의하거나, 10회를 넘어서 계대되는 세포들의 능력에 의해 확인된다. 텔로머레이스 활성은 텔로머레이스 반복 증폭 ELISA에 의해 평가된다.
단리된 일차 근육 및 지방 세포들로부터 iPS 세포들의 생성
[042] 일차 근육 및/또는 지방 세포들 및/또는 무한증식 근육 및/또는 지방 세포들 에피소말 플라스미드(episomal plasmid)들로의 형질 주입에 의하거나(예를 들면, Chandrobose 등의 "Stem Cell Research & Therapy"(9: 68, 2018); Slamecka 등의 "Cell Cycle"(15(2): 234-249, 2016) 참조), 통합- 및 무이종(xeno-free) mRNA 형질 주입에 의해(Lee 등의 "Stem Cells International"(2016: 6853081, 2016)) 재프로그램된다.
[043] pCXLEhOct3/4-shp53-F, pCXLE-hSK, pCXLE-hUL 및 pCXLE-EGFP의 야마나카 칵테일(Yamanaka cocktail)(아드젠(Addgene), 워터타운, 매사추세츠 주)뿐만 아니라 Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc의 야마나카 칵테일(Takahashi 등의 "Cell"(131: 861-872, 2007); Okita 등의 "Nat Methods"(8: 409-412, 2011); Rosello 등의 "Elife"(2: e00036, 2013))로부터의 에피소말 플라스미드들이 이용된다.
[044] 형질 주입 직후에, 세포들은 배양 배지 내에 두어진다. 적절한 배양 배지는 10%의 FBS 및 2%의 PS로 보충된 그레이스 곤충 배지(Ma 등(2017); George 및 Dhar(2010)) 및/또는 중간엽 줄기 세포 배지를 포함한다. 배지는 변경되고, 7일째에, 세포들은 지지 세포 없는(feeder-free) 유도 다능성 줄기(iPS) 세포 유도를 위해 마트리게1(MATRIGEl)®(코닝(Corning), 턱스베리, 매사추세츠 주) 상으로 파종된다. 이후에, 상기 배지는 mTeSR1(스템셀 테크놀로지즈TM, 케임브리지, 매사추세츠 주)로 변경되고, 바람직하게는 낙산염 나트륨(sodium butyrate)으로 보충된다. 배지는 이후에 초기 클론들이 형성될 때까지 나중에 소분자 SMC4 칵테일(소분자들인 PD0325901, CHIR99021, 티아조비빈(Thiazovivin) 및 SB431542를 포함(포커스 바이오몰리큘즈(FOCUS Biomolecules), 플리머스 미팅, 펜실베이니아 주))로 보강된다.
[045] 선택적으로는, 재프로그래밍 마이크로RNA들을 포함하는 마이크로RNA 및 mRNA들(mir302a-d, mir367, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Lin28; 스템젠트사(Stemgent Inc.), 케임브리지, 매사추세츠 주)이 앞서 설명한 바와 같이(Lee 등(2016)) 형질 주입된다. 단리된 일차 근육 세포들은 형질 주입일 이전에 비트로넥틴(vitronectin) XF 도포 웰(well)들 내에 파종된다. mRNA 형질 주입은 기간 동안, 예를 들면 11일 동안 매일 반복되지만, 마이크로RNA 형질 주입은 파종 후에 1일 및 5일의 두 경우에만 반복된다.
[046] 상기 일차 근육 및/또는 지방 세포들이 유도된 다능성 세포들을 재프로그램하였는 지를 확인하기 위해, 알려진 다능성 유전자들이 정량적 PCR 및 FACSㄹ르 통해 분석되며, 결과들은 서열 결정에 의해 확인된다. 예시적인 다능성 유전자들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, PL10 패밀리 유전자들(Mochizuki 등의 "Dev Genes Evol"(211(6): 299-308, 2001); Lv-Vasa(Aflalo 등의 "Mol Repro Dev"(74: 172-177, 2007)), DEAD 패밀리 유전자들(Shukalyuk 등의 "Cell Biol Int"(31(2): 97-108, 2007)); Pou5f1, klf, sall4, hsp60(Robles 등의 "Zebrafish"(8(2): 57-63, 2011)); VVL, SoxN, dmyc, Luna 패밀리 유전자들(Rosello 등의 "Elife"(2: e00036, 2013)); 그리고 piwi(Alie 등의 "Dev Biol"(350(1): 183-97, 2011))를 포함한다. 기능 테스트들이 이후에 세포 역가를 확인하기 위해 수행된다. 적합한 테스트들의 예들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 생체 외의 분화 분석들, 기형종(teratoma) 형성, 핵형(karyotype) 분석 및 중아황산염 서열 결정을 포함한다.
다능성 배아 줄기 세포들로부터의 근육 및 지방 세포들의 발생
[047] 다른 실시예들에서, 상기 근육 및/또는 지방 세포들은 배반포 단계(blastocyst stage) 및 수정란들로부터의 세포들과 같은 다능성 배아 줄기 세포들로부터 유도된다.
[048] 다능성 배아 줄기 세포들은 기본적으로 상술한 바와 같이 초기에 배양된다. 근육 세포들은 Salani 등("J Cell Mol Med"(16(7): 1353-1364, 2012)) 및 Chai와 Pourquie("Development"(144: 2104-2122, 2017))에 기재되어 있는 바와 같이 배아 줄기 세포들 또는 유도 다능성 줄기 세포들로부터 분화된다. 지방 세포들은 Barberi 등("PLoS Med"(2(6): e161, 2005)), Mohsen-Kanson 등("Stem Cells"(32: 1459-1467, 2014)) 및 Hafner 등("Scientific Reports"(6: Article Number 32490, 2016))에 기재되어 있는 바와 같이 배아 줄기 세포들 및 유도 다능성 줄기 세포들로부터 분화된다.
실시예들
실시예 1-쉬림프/프론으로부터의 일차 근육 줄기 세포들의 단리
[049] 살아있는 화이트레그 쉬림프들 및 타이거 프론들(성체 또는 유생 후의 단계들을 포함)이 희생되기 이전에 10분 동안 얼음 위에 놓여진다. 전체 쉬림프들/프론들은 11%의 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 내에서 10초 동안 세척되며, 마지막 몸체 분절과 꼬리는 절제된다. 나머지 몸체 부분들은 얼음 위에 유지된다.
[050] 절제된 꼬리와 부착된 분절은 2%의 과망간산칼륨으로 이송되고, 10분 동안 살균된다. 상기 꼬리와 부착된 분절은 이후에 PBS 완충액(0.137M의 NaCl, 0.0027M의 KCl, 0.01M의 Na2HPO4, 0.0018M의 KH2HPO4, pH7.4) 내에서 한 번, 2%의 페니실린-스트렙토마이신 여과 PBS 내에서 한번 세척되며, 5분-10분 동안 5% 또는 10%의 페니실린-스트렙토마이신 여과 PBS 내에서 세척되기 이전에 70%의 에탄올 내에서 5분-10분 동안 유지된다.
[051] 깨끗해진 꼬리들과 부착된 분절은 세포 배양 배지를 포함하는 별도의 10㎝의 접시와 함께 얼음 위에서 유지된다. 다섯의 다른 배지들인 (1) 10%의 열처리 불활성화된 소 태아 혈청 및 5%의 페니실린-스트렙토마이신을 구비하는 그레이스 곤충 배지(하이클론TM SH30071.03, 피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠 주), (2) 10%의 열처리 불활성화된 소 혈청 및 5%의 페니실린-스트렙토마이신을 구비하는 DMEM 하이 글루코오스(하이클론TM SH30022.01, 피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠 주), (3) 뉴트리스템® MSC XF 보충 혼합(바이올로지컬 인더스트리즈, 크롬웰, 코네티컷 주): 5%의 페니실린-스트렙토마이신을 구비하는 뉴트리스템® MSC XF 기본 배지(바이올로지컬 인더스트리즈, 크롬웰, 코네티컷 주), (4) DMEM 하이 글루코오스(하이클론TM SH30022.01, 피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠 주): 미오쿨트TM SF 체적 증대 인간 10x(스템셀 테크놀로지즈TM, 케임브리지, 매사추세츠 주): 5%의 페니실린-스트렙토마이신, 그리고 (5) 분화되지 않은 중간엽 줄기 세포들을 위한 하이클론TM 배지(SH30879.01, GE 라이프사이언스, 보스턴, 매사추세츠 주): 하이클론TM 줄기 세포 10 x 보충(하이클론TM SH30878.02, 피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠 주): 5%의 페니실린-스트렙토마이신이 사용된다.
[052] 성체 근육 단리를 위해, 상기 꼬리는 제거되고, 보존되는 반면, 불투명한 근육은 상기 몸체 분절로부터 절제된다. 지방 및 표피 조직의 층은 제거된다.
[053] 유생 후의 근육 단리를 위해, 머리는 몸체로부터 분리된다. 다리들은 가능한 한 제거되며, 상기 몸체 분절들은 초기에 전기 민서(mincer) 또는 휴대용 분쇄기(blender)로 다져진다.
[054] 성체 또는 부분적으로 다져진 유생 후의 근육은 다짐의 두 번째 라운드가 수행되는 접시를 포함하는 준비된 10㎝의 배지로 이송되기 이전에 대략 1㎜의 조각들로 수동으로 갈린다. 상기 성체들에 대해, 근육은 이후에 상기 꼬리로부터 제거되고, 다져지며, 준비된 배지 접시로 이송되고, 다시 다져진다. 이러한 프로세스는 이후에 성체의 날개가 있는 단부들에 대해 반복된다. 절제의 완료에 따라, 상기 외식편들 및 배지들은 세포 배양 플라스크들 및/또는 접시들로 이송되며, CO2 없이 28℃에서 배양된다(도 1 참조).
[055] 배양들은 2일-3일마다 신선한 배지를 추가하여 유지된다. 단리 후의 3일 내지 7일 사이에, 외식편 조직들은 10초-30초 동안 중력 분리 또는 원심 분리에 의해 제거된다. 나머지 세포 집단은 세포 밀도에 따라 통상적으로 2 T75 플라스크들 내로 나누어지며, 배지가 각 플라스크 내에 10㎖-12㎖의 최종 부피까지 추가된다(도 2 참조). 28℃에서 배양이 계속되며, 신선한 배지가 2일-3일마다 추가된다. 약 10㎖의 배지 내에서 세포 숫자가 약 8백만이거나 및/또는 약 80-90%의 융합이 존재할 때, 상기 세포 집단은 1:3의 비율로 다시 희석되며, 계대 2까지 동일한 조건들 하에서 배양된다(도 3 참조). 이 때, 일부 세포들은 1000 x g에서 5분 동안 원심 분리되고, 상청액이 제거되며, 세포들은 -80℃에서의 저장 이전에 1㎖의 밤방커 동결 배지 내에서 저온 튜브들 내에 재현가된다. 다른 세포들은 적어도 계대 4까지 배지 내에서 더 배양된다. 이들 경우들에서, 상기 배양 배지 내에 존재하는 항생 물질은 계대 2 이후에 2%까지 감소되며, 계대 4 이후에 0%까지 더 감소된다.
[056] 근육 줄기 세포들의 동일성을 확인하기 위해, 근육 유전자들의 발현이 정량적 PCR을 거쳐 분석된다. 여기서, 미오스타틴 및 성장 분화 인자, 근육 림단백질, 알파 골격근, 미오신 중쇄, 미오신-1, Pax3, Pax7, 인테그린 알파-7, 카드헤린-15 및 미오게닌(Jung 등의 "Reviews in Aquaculture"(5, 77-110, 2013); Ngyuen 등의 "Aquaculture"(464: 545-553, 2016); Okita 등의 "Nat Methods"(8: 409-412, 2011))과 같은 근육 세포 유전자들이 표적으로 된다. 지방 세포들은 지방산-결합 단백질의 존재(Ngyuen 등의 "Aquaculture"(464, 2016)), 혈청 아밀로이드 A(SAA), 막관통 4L 식스 패밀리 멤버 1(TM4SF1)(Jernas 등의 "FASEB"(20(9): 1540-1542, 2006)), 또는 표면 항원들인 CD44, CD45 및 CD105의 결합(Wang 등의 "Exp Ther Med"(13(3): 1039-1043, 2017))에 의해 확인된다.
[057] 세포주들의 무균은 마이코플라스마의 부존재에 의해 결정된다. 이는 세포 배양 오염지수 키트, 마이코플루오르(MycoFluor)TM 마이코플라스마 검출 키트, 마이코세큐(MycoSEQ)TM 마이코플라스마 검출 키트(써모피셔 사이언티픽), 마이코알럴트 플러스(MycoAlert PLUS) 검출 키트, 파이로젠(PyroGene) TM 재조합 인자 C 엔드 포인트 형광 검사(론자(Lonza)) 및/또는 PCR계 마이코플라스마 검출 서비스를 위한 FTA 샘플 수집 키트(ATCC)와 같은 상업적으로 입수 가능한 키트들을 이용하여 테스트된다.
실시예 2-근섬유들 내로의 분화
[058] 근섬유 분화는 대략 2백만-3백만의 일차 또는 무한증식 성체 근육 줄기 세포들을 10%의 열처리 불활성화 소 혈청 및 5%의 페니실린-스트렙토마이신과 함께 DMEM 하이 글루코오스(하이클론TM SH30022.01, 피셔 사이언티픽, 월섬, 매사추세츠 주) 배지에 첨가하여 이루어진다. 세포들은 속도 3에서 자기 교반기 세트(IKA RCT 베이직) 상에서 교반되면서 28℃에서 배양된다. 배지는 1000 x g에서 5분 동안 섬유들을 원심 분리하여 3일마다 변경되고, 사용된 배지는 제거되며, 신선한 배지로 대체된다. 근섬유들은 현탁 배양의 개시 이후에 약 3일째에 형성되며(도 4 참조), 7일 후에 수확을 위해 준비된다(도 5 참조).
실시예 3-단리된 일차 근육 및 지방 세포들의 불멸화
[059] 비통합성 불멸화 방법들은 관심의 대상인 성장 유전자들을 통합시키고 과발현시키는 데 이용될 수 있다. 이들 유전자들은, 예를 들면, MyoD와 SMARCD3, Pax3, Pax7(Chal 및 Pourquie의 "Development"(144: 2104-2122)(2017)에서 검토됨), 미오신-1, 미오게닌, 인테그린 알파-7, 카드헤린-15, 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자, 미오스타틴 및 성장 분화 인자, 갑각류 혈당상승 호르몬, 그리고 미오신 중쇄(Jung 등의 "doi.org/10.1111/raq.12005"(2013); Ngyuen 등의 "Aquaculture"(9464: 545-553, 2016); Okita 등의 "Nat Methods"(8: 409-412, 2011))를 포함한다. 그러나, 화학적 불멸화는 또한 텔로머레이스 활성을 증가시키기 위해 사이클로아스트라제놀(Fauce 등의 "J Immunol."(181(10): 7400-7406, 2011)), 글리신 맥스(대두)로부터의 제니스테인(Chau 등의 "Carcinogenesis"(28(11): 2282-2290, 2007), 또는 레스베라트롤(Xia 등의 "British Journal of Pharmacology"(155: 387-394, 2008); Zhai 등의 "Oncology Letters"(11: 3015-3018, 2016))과 같은 활성제들을 사용하여 이루어질 수 있다.
[060] 일차 세포들의 불멸은 근육 줄기 세포 및/또는 성장 유전자들의 PCR 발현에 의하거나, 10회를 넘어서 계대되는 세포들의 능력에 의해 확인된다. 화학적 불멸화가 이용될 때, 상기 텔로머레이스 반복 증폭 ELISA 분석이 텔로머레이스의 활성 및 길이의 증가를 평가하는 데 이용된다.
실시예 4-단리된 일차 근육 및 지방 세포들로부터의 iPS 세포들의 발생
[061] 일차 근육 및 지방 세포들은 Chandrabose 등(2018)에 설명되어 있는 바와 같이 본질적으로 에피소말 플라스미드들에 의하거나, Lee 등(2016)에 기재되어 있는 바와 같이 통합- 및 무이종 mRNA 형질 주입에 의해 재프로그램된다.
[062] 상기 쉬림프에 대한 서열 결정 결과들로부터의 에피소말 플라스미드들(애드젠(Addgene)) 표적화 인자들이 이용된다. 또한, Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc의 야마나카 칵테일도 사용된다. 10%의 FBS 및 2%의 PS로 보충된 그레이스 곤충 배지(Ma 등 2017; George 및 Dhar(2010)) 또는 중간엽 줄기 세포 배지가 형질 주집 직후에 사용된다. 배지는 매일 변경된다. 7일째에, 세포들은 지지 세포 없는 iPS 유도를 위해 마트리겔(코닝) 상으로 파종된다. 다음날에, 상기 배지는 mTeSR1(스템 셀 테크놀로지즈(Stem Cell Technologies))로 변경되며, 낙산염 나트륨으로 보충된다. 12일째에, 낙산염 나트륨은 더 이상 첨가되지 않으며, 대신에 초기 클론들이 형성될 때까지 소분자 SMC4 칵테일(소분자들인 PD0325901, CHIR99021, 티아조비빈 및 SB431542(포커스 바이오몰리큘즈)을 포함)로 대체된다.
[063] 선택적으로는, 재프로그래밍 마이크로RNA들을 포함하는 마이크로RNA 및 mRNA들(mir302a-d, mir367, Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc, Lin28; 스템젠트사, 매사추세츠 주)이 앞서 설명한 바와 같이(Lee 등(2015)) 형질 주입된다. 단리된 일차 근육 세포들은 형질 주입일 이전에 비트로넥틴 XF 도포 웰 내에 파종된다. mRNA 형질 주입은 2일로부터 11일 동안 반복되지만, 마이크로RNA 형질 주입은 파종 후에 1일 및 5일에 반복된다.
[064] 상기 일차 근육 및 지방 세포들이 유도된 다능성 세포들을 재프로그램하였는 지를 확인하기 위해, 서열 결정에 의해 확인되는 알려진 다능성 유전자들이 정량적 PCR 및 FACS를 통해 분석된다. 예시적인 다능성 유전자들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, PL10 패밀리 유전자들(Mochizuki 등의 "Dev Genes Evol"(211(6): 299-308, 2001); Lv-Vasa(Aflalo 등의 "Mol Repro Dev"(74: 172-177, 2007)), DEAD 패밀리 유전자들(Shukalyuk 등의 "Cell Biol Int"(31(2): 97-108, 2007)); Pou5f1, klf, sall4, hsp60(Robles 등의 "Zebrafish"(8(2): 57-63, 2011)); VVL, SoxN, dmyc, Luna 패밀리 유전자들(Rosello 등의 "Elife"(2: e00036, 2013)); 그리고 piwi(Alie 등의 "Dev Biol"(350(1): 183-97, 2011))를 포함한다. 생체 외의 분화 분석들, 기형종 형성, 핵형 분석 및 중아황산염 서열 결정과 같은 기능 테스트들이 상기 세포들의 역가를 확인하기 위해 수행된다.
[065] iPS 세포들의 존재의 확인에 따라, 이들 세포들은 80%의 융합에서 동결될 수 있다.
실시예 5-쉬림프, 크랩, 크레이피쉬 및 로브스터로부터의 지방 줄기 세포들의 단리 및 체적 증대
[066] 앞서의 단락 [045], 단락 [046] 및/또는 단락 [049]에서 설명한 바와 같이 쉬림프들/프론들, 크랩, 크레이피쉬, 또는 로브스터의 희생과 세척에 후속하여, 상기 쉬림프/프론, 크랩, 크레이피쉬, 또는 로브스터의 머리는 상기 몸체 및 꼬리 분절들로부터 분리된다. 그 다리들도 상기 쉬림프/프론, 크랩, 크레이피쉬, 또는 로브스터의 몸체로부터 분리된다. 껍질은 상기 분절들로부터 제거되며, 상기 지방 및 표피 조직은 일회용의 메스와 겸자들로 상기 꼬리 및 몸체 분절들에서 벗겨진다. 상기 지장 및 표피 조직들은 5%의 페니실린/스트렙토마이신을 포함하는 PBS 내에서 널리 세척된다. 상기 조직은 이후에 Bunnell 등("Methods"(45(2): 115-120, 2008))애 기재되어 있는 바와 같이 I형 콜라게나아제(Collagenase) 내에서 소화되고, 메스로 다져진다. 표피 또는 기질 세포들로부터 분리되는 지방 줄기 세포들은 Bunnell 등에 의해 설명되어 있다("Methods"(45(2): 115-120, 2008)).
[067] 상기 단리된 세포들은 20%의 FBS, 1%의 L-글루타민(미디어테크) 및 1%의 페니실린/스트렙토마이신으로 보강된 알파-MEM(미디어테크(Mediatech), 헌든, 버지니아 주) 내에 재현가된다. 상기 세포 서스펜션은 Bunnell 등("Methods"(45(2): 115-120, 2008))에 기재되어 있는 바와 같이 70㎛의 셀 스트레이너(cell strainer)를 통해 여과된다. 상기 세포들은 리신이 도포된 배양 평판에서 배양되며(Bunnell 등의 "Methods"(45(2): 115-120, 2008)), 28℃에서 배양된다(George 및 Dhar의 "In Vitro Cell Dev. Biol.-Animal"(46: 801-810, 2010)).
[068] 배양 배지가 교환되고, 세포들은 Bunnell 등("Methods"(45(2): 115-120, 2008))에 기재되어 있는 바와 같이 평판 배양 후 72시간에서 세척되었다. 이후에 세포들을 유지하기 위해, 배양 배지는 세포들이 80%-90%의 융합에 도달할 때까지 두 번째 날마다 변경된다. 상기 세포들은 Bunnell 등("Methods"(45(2): 115-120, 2008))에 기재되어 있는 바와 같이 80%-90%의 융합에 도달하면 수확되거나 분화될 수 있다.
실시예 6-크랩, 크레이피쉬 및 로브스터로부터의 일차 근육 줄기 세포들의 단리
[069] 앞서의 단락 [045] 및 단락 [046]에서 설명한 바와 같이 크랩들 또는 로브스터의 얼음 상에의 희생과 세척에 후속하여, 크랩 집게발들, 다리들 및 몸체의 근육은 앞서의 단락 [045]-단락 [047]에 설명되어 있는 바와 같이 분리되고 처리된다. 상기 크랩 근육 줄기 세포들은 Sashikumar 및 Desai("Cytotechnology"(56: 161-169, 2008)에 기재되어 있는 바와 같이 20℃-24℃에서 배양된다.
[070] 크레이피쉬 및 로브스터들에 대하여, 상기 집게발들, 다리들 및 꼬리로부터의 근육이 앞서의 단락 [045] 내지 단락 [047]에서 설명한 바와 같이 분리되고, 처리되며, 배양된다. 크레이피쉬 근육 줄기 세포들은 Neumann 등("In Vivo"(14(5): 691-8, 2000)에 기재되어 있는 바와 같이 27℃에서 배양된다. 로브스터 근육 줄기 세포들은 Stepanyan 등("Chemical Senses"(29(3): 179-187, 2004)에 기재되어 있는 바와 같이 5℃에서 포화 습도에서 배양되거나, 로브스터들이 생존하였던 온도에서 배양된다.
Claims (21)
- 생체 외로 성장된 쉬림프(shrimp), 프론(prawn), 크랩(crab), 크레이피쉬(crayfish) 및/또는 로브스터(lobster) 근육 세포들을 포함하는 식육 제품.
- 제1항에 있어서, 생체 외로 성장된 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 지방 세포들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식육 제품.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 생체 외로 성장된 다른 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 세포들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 식육 제품.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식육 제품은 임의의 유해한 미생물 및/또는 기생충 오염이 필수적으로 없는 것을 특징으로 하는 식육 제품.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 쉬림프 및/또는 프론 근육 세포들은 페나에우스(Penaeus), 솔레노세라(Solenocera), 메타페나에우스(Metapenaeus), 파라페나에우스(Parapenaeus), 파라페나에옵시스(Parapenaeopsis), 메타페나에옵시스(Metapenaeopsis), 트라치페나에우스(Trachypenaeus), 프로트라치페네(Protrachypene), 지포페나에우스(Xiphopenaeus), 히메노페나에우스(Hymenopenaeus), 아티포페나에우스(Atypopenaeus), 유시시오니아(Eusicyonia), 시시오니아(Sicyonia) 또는 리토페나에우스(Litopenaeus) 속(genus)으로부터의 종으로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 식육 제품.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 쉬림프 및/또는 프론 근육 세포들은 페나에우스 모노돈(Penaeus monodon) 및/또는 리토페나에우스 반나메이(Litopenaeus vannamei)로부터 유래되는 것을 특징으로 하는 식육 제품.
- 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 무한증식(immortalized) 근육 및/또는 지방 세포주를 생산하기 위한 방법에 있어서,
(a) 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 및/또는 지방 세포들을 단리하는 단계;
(b) 재조합 아데노바이러스 구성체(adenoviral construct) 또는 렌티플래쉬 파티클(lentiflash particle)을 형성하기 위해 적어도 하나의 근육 특이적 및/또는 지방 특이적 성장 유전자를 아데노바이러스 벡터 또는 렌티플래쉬 파티클 내로 통합시키는 단계;
(c) 상기 단리된 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 세포들을 상기 단계 (b)의 재조합 아데노바이러스 구성체 또는 렌티플래쉬 파티클로 형질 도입하는 단계; 및
(d) 무한증식 근육 및/또는 지방 세포주를 생산하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 유도 다능성 줄기(iPS) 세포들을 생산하기 위한 방법에 있어서,
(a) 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 세포들로부터 근육 및/또는 지방 세포들을 단리하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 세포들을 표적화 인자(targeting factor)를 포함하는 에피소말 플라스미드(episomal plasmid)로 형질 주입하는 단계; 및
(c) iPS 세포들을 생산하기 위해 상기 단계 (b)의 형질 주입된 세포들을 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 소비를 위해 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 세포 식육 제품들을 생산하기 위한 방법에 있어서,
(a) 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 세포들을 단리시키는 단계;
(b) 다능성 유전자들을 발현시키기 위해 상기 단리된 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 세포들을 재프로그램하는 단계;
(c) 유도 다능성 줄기(iPS) 세포들을 단리하는 단계;
(d) 근섬유들 및/또는 지방을 생산하기 위해 상기 iPS 세포들을 유도하는 단계; 및
(e) 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 세포 식육 제품을 생산하기 위해 상기 근섬유들 및/또는 지방을 성장시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 안정하게 형질 도입된 무한증식 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 세포에 있어서, 상기 무한증식 근육 세포는 적어도 외인성의 MyoD, SMARCD3, Pax3, Pax7, 미오신(myosin)-1, 인테그린(integrin) 알파-7, 카드헤린(cadherin)-15, 미오게닌(myogenin), 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor), 미오스타틴(myostatin) 및 성장 분화 인자(growth differentiation factor), 갑각류 혈당상승 호르몬(hyperglycemic hormone) 및/또는 미오신 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 무한증식 근육 세포.
- 안정한 무한증식 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 세포에 있어서, 상기 무한증식 근육 세포는 증가된 텔로머레이스(telomerase) 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 무한증식 근육 세포.
- 제10항의 무한증식 근육 세포를 포함하는 세포 배양.
- 제11항의 무한증식 근육 세포를 포함하는 세포 배양.
- 안정하게 형질 도입된 무한증식 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 지방 세포에 있어서, 상기 무한증식 지방 세포는 적어도 외인성의 MyoD, SMARCD3, Pax3, Pax7, 미오신-1, 인테그린 알파-7, 카드헤린-15, 미오게닌, 성장 호르몬 및 인슐린 유사 성장 인자, 미오스타틴 및 성장 분화 인자, 갑각류 혈당상승 호르몬 및/또는 미오신 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 무한증식 지방 세포.
- 안정한 무한증식 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 지방 세포에 있어서, 상기 무한증식 지방 세포는 증가된 텔로머레이스 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 무한증식 지방 세포.
- 제14항의 무한증식 지방 세포를 포함하는 세포 배양.
- 제15항의 무한증식 지방 세포를 포함하는 세포 배양.
- 안정하게 형질 주입된 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 유도 다능성 세포에 있어서, 상기 유도 다능성 세포는 일차 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 및/또는 지방 세포 및/또는 무한증식 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 근육 및/또는 지방 세포로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 유도 다능성 세포.
- 안정하게 형질 주입된 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 유도 다능성 세포에 있어서, 상기 유도 다능성 세포는 배반포 단계(blastocyst stage) 세포 및/또는 수정란 세포와 같은 다능성 쉬림프, 프론, 크랩, 크레이피쉬 및/또는 로브스터 배아 줄기 세포로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 유도 다능성 세포.
- 제18항의 유도 다능성 세포를 포함하는 세포 배양.
- 제19항의 유도 다능성 세포를 포함하는 세포 배양.
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