CN113302282A - 从甲壳类动物中分离和培养肌肉细胞和脂肪细胞 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及用于从海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾物种形成和产生可再生的肌肉和/或脂肪原代细胞系、永生化的细胞系和干细胞系的方法和所述细胞系本身以及由其生产的人类和动物可食用肉制品。
Description
技术领域
本公开涉及从海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾物种形成可再生的肌肉和脂肪干细胞系。
背景技术
世界人口持续增加，而可耕农业用地的量由于城市扩张和气候条件不断变化而减少。这增加了商业性捕捞和海洋“养殖”，给世界海洋带来了压力。因此，对诸如海水虾、淡水虾、螃蟹和龙虾的特别受欢迎的物种的过度捕捞已经使那些野生种群显著减少。
为了减轻动物肉类生产和野生捕捞对环境造成的巨大压力，正在开发用于组织工程肉类和鱼类的技术。这种类型的细胞农业允许生产食物，而无需培育和宰杀动物。细胞农业方面的大部分研究集中于可从胚胎肌肉发育、肌肉干细胞、肌肉修复和肌肉再生的研究中获得大量信息的动物，特别是牛肉、猪肉和鸡肉。然而，在生产作为从活体动物中提取的肌肉的“同类”复制品的肉制品或鱼制品方面存在许多挑战。
然而，对于海鲜物种，几乎没有进行过研究，这增加了成功细胞农业工作必须要克服的障碍(Rubio等,(2019)Front.Sustain.Food Syst.doi:10.3389/fsufs.2019.00043)。预测南美白对虾(Litopenaeus vannamei)(原名为凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)；也被称为白脚虾/太平洋白虾/宽沟对虾)和斑节对虾(Penaeus monodon)(也被称为大虎虾/亚洲虎虾)具有1.66Gb(南美白对虾)/2.6Gb(斑节对虾)的基因组大小和44条假染色体(南美白对虾)/88条染色体(Zhang等(2019)Nature Communications 10:356；和Yuan等(2017)J.Marine Genomics doi.org/10.1016/j.margen.2017.12.006)。这些大的基因组大小和显著数量的基因组重复序列的存在使得对淡水虾/海水虾基因组的测序和组装变得困难(Yuan等(2017)J.Marine Genomics doi.org/10.1016/j.margen.2017.12.006；和Zhang等(2019)Nature Communications 10:356)。此外，少数可用于淡水虾/海水虾的基因组文库搜索引擎不稳固或注释不佳(虾类GPAT；虾类EST计划；NCBI分类计划)。此外，对海水虾/淡水虾的基因组研究已经集中在基因组进化(Yuan等(2017)Mar Biotechnol 19(1):76-88；Yuan等(2017)Mar Drugs 15(7):213)、遗传连锁(Yang等(2015)Scientific Reports 5:15612)和发育基因(Brown等(2018)Genome Biol Evol 10(1):143-156)。对于给定的物种，这种情况由于“海水虾(shrimp)”和“淡水虾(prawn)”的不一致和/或可互换使用而进一步复杂化。尽管如此，存在至少2,000种公认的物种，商业上最重要的是以下属中的那些：对虾属(Penaeus)、管鞭虾属(Solenocera)、新对虾属(Metapenaeus)、拟对虾属(Parapenaeus)、仿对虾属(Parapenaeopsis)、赤虾属(Metapenaeopsis)、糙对虾属(Trachypenaeus)、原糙对虾属(Protrachypene)、剑对虾属(Xiphopenaeus)、膜对虾属(Hymenopenaeus)、异对虾属(Atypopenaeus)、真单肢虾属(Eusicyonia)、单肢虾属(Sicyonia)和滨对虾属(Litopenaeus)。
一些研究已经通过体型和体重在动物身体生长方面研究了海水虾/淡水虾物种。通过将外源罗非鱼生长激素基因转导到海水虾胚胎中来改善海水虾的生长(Arenal等(2008)Biotechnol Lett 30(5):845-51)。抑制性消减杂交鉴定出斑节对虾中与体重相关的几个生长基因(Tangprasittipap等(2010)Aquaculture 307(1-2):150-156)。已经在斑节对虾中鉴定出肌肉生长基因，但是在其它物种中尚未鉴定出(Ngyuen等(2016)Aquaculture 464:545-553)。然而，对基因进行遗传修饰以将肌肉细胞永生化或重编程尚未被尝试或尚未成功。
螃蟹、小龙虾和/或龙虾物种的情况类似。例如，大理石纹小龙虾(处女螯虾(Procambarus virginalis)(原名为处女龙纹螯虾(Procambarus fallaxf.virginalis)))的基因组大小据估计大于人类的基因组大小，具有276条染色体(即3.5Gbp；Gutekunst等(2018)Nature Ecology&Evolution 2:567-573)，而蓝蟹(Callinectes sapidus)基因组的大小为约2Gbp，具有未知数量的染色体(参见互联网上的IMET蓝蟹守护者(IMET Guardians of the Blue Crab)网站；2.35pg，参见互联网上的动物基因组大小数据库(Animal Genome Size Database)；和Dolezel等(Cytometry(2003)A部分51A:127-128)，其定义了基因组大小(bp)＝(0.978×109)×DNA含量(pg)。虽然迄今为止尚未对龙虾基因组进行完全测序，但是估计美洲龙虾(美洲螯龙虾(Homarus americanus))基因组为约4.40pg/4.3Gbp或更大(参见互联网上的动物基因组大小数据库网站和格洛斯特海洋基因组学研究所(Gloucester Marine Genomics Institute)网站的美洲龙虾基因组)。
缺乏有关海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾的信息可以说主要是由于细胞培养方面的挑战。例如，仅已经从淋巴器官和卵巢建立了海水虾/淡水虾细胞系(Tapay等(1995)Proc Soc Exp Biol Med 209(1):73-8；Hsu等(1995)Aquaculture 136:43-55；美国专利号6143547；George和Dhar(2010)In Vitro Cell Dev Biol Anim 46(9):801-10；Ma等(2017)Reviews in Aquaculture 9:88-98)。此外，海水虾/淡水虾原代肌肉培养物仅持续最多12天(George和Dhar,2010)，并且没有关于脂肪细胞的已知原代培养物或细胞系的描述。
此外，没有关于从海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾中培养脂肪细胞的尝试的描述。
来自海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾的永生化细胞系的可用性将允许细胞农业公司进入细胞农业的接下来的步骤(Rubio等(2019)Front.Sustain.FoodSyst.doi:10.3389/fsufs.2019.00043)。食品监管和研究小组则将具有现成的细胞系来源，而不是耗时的分离原代细胞的过程。这将有助于了解海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾的病毒性疾病、测试那些病毒的存在以及开发治疗(Ma等(2017)Reviews inAquaculture 9:88-98)。因此，仍然需要来自海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾的永生化肌肉和脂肪细胞系。本文提供的公开内容解决了这种需要。
发明内容
本公开涉及组织工程海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肉制品和用于生产这样的产品的方法。在一个方面，所述肉制品包含离体和/或体外生长的肌肉细胞。在另一个方面，所述肉制品包含离体和/或体外生长的肌肉细胞和/或脂肪细胞。在又一个方面，所述肉制品包含离体和/或体外生长的肌肉细胞、脂肪细胞、其它细胞和其组合。所述肉制品基本上没有任何有害的微生物或寄生生物污染。
因此，本公开还提供了通过开发可再生的肌肉和/或脂肪干细胞系来生产用于食用的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肉制品的方法。
一种用于产生海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾永生化肌肉和/或脂肪细胞系的方法包括分离海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉和/或脂肪细胞；将至少一种肌肉特异性和/或脂肪特异性生长基因整合到腺病毒载体或非整合型慢病毒载体中以形成重组腺病毒构建体或非整合型慢病毒载体；以及使用所述重组腺病毒构建体或非整合型慢病毒载体转导所述分离的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉细胞。然而，所述用于产生海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾永生化肌肉和/或脂肪细胞系的方法还包括在分离海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉和/或脂肪细胞之后通过化学激活剂，如环黄芪醇、染料木素和/或白藜芦醇诱导端粒酶的活性。
还提供了一种用于产生海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾诱导性多能干(iPS)细胞的方法。该方法包括从海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾中分离肌肉和/或脂肪细胞；用包含靶向因子的游离型质粒转染所述细胞；然后培养所述转染的细胞以产生iPS细胞。
此外，本公开提供了一种用于产生海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾诱导性多能干(iPS)细胞的方法，所述方法是通过以下步骤实现的：分离海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉和/或脂肪细胞；用含有微RNA的重编程微RNA和mRNA，如mir302a-d、mir367、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc和Lin28转染所述细胞；以及培养所述转染的细胞以产生iPS细胞。
本公开还包括一种生产用于食用的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肉制品的方法，所述方法是通过以下步骤实现的：分离海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉细胞；将所述分离的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉细胞重编程以表达多能基因；分离诱导性多能干(iPS)细胞；诱导所述iPS细胞产生肌肉纤维和/或脂肪；以及使所述肌肉纤维和/或脂肪生长以生产海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肉制品。
附图说明
图1描绘了在切片后立即在培养基中的虾外植体。A：T75烧瓶中的外植体；B：皮氏培养皿中的外植体。
图2示出了第7天的外植体细胞生长。
图3示出了在达到80％-90％汇合度后以1:3的比例稀释的细胞在Ti-2Nikon显微镜上的明场成像。A：×20放大倍数；B：×20放大倍数。
图4示出了在产生悬浮培养物后3天开始形成的肌纤维，×40放大倍数。
图5示出了在7天生长后准备收获的肌纤维，×40放大倍数。
图6示出了从中分离出肌肉干细胞的尾节的组织学；A：最后的体节；B：最后的体节的增加放大倍数视图；C：尾节的中翼；D：中翼的增加放大倍数视图；E：尾节的侧翼；F：侧翼的增加放大倍数视图；G：中线幼虾的组织学；肌肉区域以黑色勾勒出。
具体实施方式
在整个本公开中，术语“a/an(一种/个)”实体指的是一种/个或多种/个这样的实体；例如，“a polynucleotide(一种/个多核苷酸)”应当被理解为表示一种/个或多种/个多核苷酸。因而，术语“a/an(一种/个)”、“一种/个或多种/个”和“至少一种/个”在本文中可互换使用。
此外，本文使用的“和/或”将被视为两个指定特征或元件中的每一个的具体公开，其中包括或不包括另一个。因此，诸如“A和/或B”的短语中所用的术语“和/或”意图包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，诸如“A、B和/或C”的短语中所用的术语“和/或”意图涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术术语和科学术语所具有的含义与本公开所涉及的本领域普通技术人员通常所理解的含义相同。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology(《生物医学与分子生物学简明词典》),Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC出版社；The Dictionary of Cell and Molecular Biology(《细胞与分子生物学词典》),第3版,1999,学术出版社(Academic Press)；The OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology(《牛津生物化学与分子生物学词典》),修订版,2000,牛津大学出版社(Oxford University Press)；Takahashi等(2007)Cell 131:861-872；和Yu等(2007)Science 21；318(5858):1917-20为技术人员提供了本公开中使用的许多术语的通用词典。
单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数值。本文提供的标题不是对本公开的各个方面的限制，其可以通过整体参考说明书而获得。
除非本文另外指明，否则在本文中对值的范围的叙述仅意图用作单独提及落入该范围内的每一个单独的值的简写方法，并且每一个单独的值被并入到说明书中，就如同它在本文中被单独叙述一般。在提供特定的值的范围的情况下，应当了解的是，每一个中间值都意图包括在其中，并且还包括所有更小的子范围。
本文公开了可食用的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾产品以及用于从细胞来源体外产生肌肉和/或脂肪组织以用于可食用的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾产品中的新的和改进的方法。这些方法可用于生产海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和龙虾肌肉组织或“肉”，而不依赖于粗放养殖或野生捕捞。目前，来自海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾的肉通常仅取自尾部、腿部或爪部肌肉。尾部、腿部或爪部的肉一般在去除外骨骼后整块或以大块形式出售；然而，海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肉制品还包括衍生物，如用于包括在“肉丸”/“鱼丸”中的碎肉和含有熏肉、肉泥、调味肉和/或干肉的产品。
还公开了通过本文提供的任何方法制成的体外产生的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾组织，如肌肉和/或脂肪组织。因此，所述细胞来源可以是成体干细胞、诱导性多能干(iPS)细胞和/或永生化细胞系。优选地从来自以下属的物种中分离所述海水虾和/或淡水虾细胞来源：对虾属、管鞭虾属、新对虾属、拟对虾属、仿对虾属、赤虾属、糙对虾属、原糙对虾属、剑对虾属、膜对虾属、异对虾属、真单肢虾属、单肢虾属和/或滨对虾属。优选地从来自以下属的物种中分离螃蟹细胞来源：雪蟹属(Chionoecetes)、美青蟹属(Callinectes)、蟳属(Charybdis)、黄道蟹属(Cancer)、青蟹属(Scylla)和/或后黄道蟹属(Metacarcinus)。优选地从以下属中分离小龙虾细胞来源：螯虾属(Cambarus)、岩龙虾属(Jasus)、扁虾属(Thenus)、侏儒螯虾属(Cambarellus)、拟螯虾属(Cambaroides)、巨螯虾属(Atacopsis)、白圆钳螯虾属(Austropotamobius)、河虾属(Astacus)、原螯虾属(Procambarus)、叉肢螯虾属(Orconectes)、粉红侏儒鳌虾属(Faxonella)和太平螯虾属(Pacifastacus)。优选地从来自以下属的物种中分离龙虾细胞来源：密刺螯虾属(Acanthacaris)、真海螯虾属(Eunephrops)、霍氏螯龙虾属(Hominarinus)、螯龙虾属(Homarus)、后海螯虾属(Metanephrops)、仿海螯虾属(Nephropides)、海螯虾属(Nephrops)、拟海螯虾属(Nephropsis)、仿锯指螯虾属(Thaumastocheles)、拟锯指螯虾属(Thaumastochelopsis)、仿百里螯虾属(Thymopides)、百里螯虾属(Thymops)或拟百里螯虾属(Thymopsis)。
从甲壳类动物中分离原代肌肉和脂肪细胞
本公开的一个方面涉及一种通过开发可再生的肌肉和/或脂肪干细胞系来生产用于食用的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肉制品的方法。这可以通过从各种海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾物种中分离肌肉和/或脂肪细胞并且在体外培养它们来实现。例如，图6示出了从中分离出干细胞的虾尾节的组织学。
优选地，将来自新鲜处死的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾的外植体分成小块。通常，这些块的尺寸是至少0.1mm并且可以是0.25mm、0.5mm、0.75mm、1mm、1.25mm、1.5mm、1.75mm、2mm、2.25mm、2.5mm、2.75mm、3mm、3.25mm、3.5mm、3.75mm、4mm、4.25mm、4.55mm、4.75mm、5mm或0.1mm与5mm之间的任何数。将外植体用于接种细胞培养基以进行细胞培养。
在使用时，将外植体在细胞培养基中孵育，如格雷斯昆虫培养基(Grace's insectmedia)、DMEM高糖培养基(HyClone SH30022.01，马萨诸塞州沃尔瑟姆的飞世尔科技公司(Fischer Scientific,Waltham MA))、
MSC XF补充剂混合物(康涅狄格州克伦威尔的生物工业公司(Biological Industries,Cromwell,CT))、
MSCXF基础培养基(康涅狄格州克伦威尔的生物工业公司)、MyocultTM SF扩增人类10×(Stemcell TechnologiesTM，马萨诸塞州的坎布里奇(Cambridge,MA))、HyCloneTM未分化间充质干细胞培养基(SH30879.01，马萨诸塞州波士顿的通用电气生命科学公司(GELifescience,Boston,MA))、Hyclone干细胞10×补充剂(HyCloneTM SH30878.02，马萨诸塞州沃尔瑟姆的飞世尔科技公司)、Leibovitz's-15(L-15)培养基(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher,Waltham,MA))、M199培养基(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)、MPS培养基(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)、Pj-2培养基、NCTC 135培养基(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)、MM昆虫培养基(
密苏里州的圣路易斯(St.Louis,MO))或TC 100培养基(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司)和其组合。细胞培养基可以另外包含10％胎牛血清(FBS)和/或5％青霉素/链霉素(PS)。定期添加新鲜培养基，优选地每2天-3天添加一次。
任选地，定期用约5％青霉素-链霉素过滤的磷酸盐缓冲盐水(PBS；0.137M NaCl、0.0027M KCl、0.01M Na2HPO4、0.0018M KH2HPO4，pH 7.4)冲洗外植体，而在冲洗过程中不进一步去除从外植体脱落的任何细胞。优选地，冲洗每2天-3天进行一次，直到从培养基中去除外植体为止。
将外植体/细胞培养物在28℃在没有二氧化碳的情况下孵育。在开始培养后约7天，通过离心、过滤、磁珠和/或本领域技术人员已知的其它手段去除外植体，留下大的单细胞群体。通过形态鉴定和/或肌肉基因的PCR扩增来确定该群体中肌肉干细胞的身份。还通过形态鉴定和/或脂肪特异性基因的PCR扩增来确定脂肪细胞的身份。使用标准技术对培养物进行支原体和/或其它病原体的常规测试，如在肉汤/琼脂上直接生长、特异性DNA染色、PCR扩增、ELISA、RNA标记和酶促程序(例如ADP酶促转化为ATP等)、PlasmoTestTM(加利福尼亚州圣地亚哥的InvivoGen公司(InvivoGen,San Diego,CA))、BAM 4/LST-MUG(Feng等(2002)，可从fda.gov/food/laboratory-methods-food网站获得，第4章和第5章)和其组合。
在去除外植体后，将剩余的细胞群体分开，添加新鲜的细胞培养基并且继续孵育。定期添加新鲜培养基，优选地约每2天-3天添加一次。当细胞接近优选地约70％、80％、90％、95％、99％或其间的任何值的汇合度或细胞群体为10ml培养基中约800万个细胞时，将细胞再次分开并且以1:3比例稀释。培养过程可以包括在将细胞冷冻保存之前，将青霉素-链霉素的量从5％缓慢减少到2％，然后减少到0％。
可以在第2代后使用标准冷冻保存条件和标准冷冻保存培养基将细胞冷冻保存(参见例如可在互联网上从赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)、日本遗传学株式会社(Nippon Genetics)和ATCC获得的方案和试剂)。例如，可以将细胞以1000×g短暂离心(例如约5分钟)，去除上清液，并且将细胞在冷冻管中重悬在1ml的Bambanker冷冻培养基中，之后储存在-80℃。
分化为肌纤维
将约200万-300万个原代肌肉细胞、永生化肌肉干细胞和/或重编程的细胞添加到适当的培养基中。适当的培养基包括DMEM高糖培养基(HYCLONETM，SH30022.01；马萨诸塞州沃尔瑟姆的飞世尔科技公司)、格雷斯昆虫培养基、DMEM高糖培养基(HYCLONETMSH30022.01，马萨诸塞州沃尔瑟姆的飞世尔科技公司)、
MSC XF补充剂混合物(康涅狄格州克伦威尔的生物工业公司)、
MSC XF基础培养基(康涅狄格州克伦威尔的生物工业公司)、MYOCULTTM SF扩增人类10×(STEMCELL TECHNOLOGIESTM，马萨诸塞州的坎布里奇)、HYCLONETM未分化间充质干细胞培养基(SH30879.01，马萨诸塞州波士顿的通用电气生命科学公司)、HYCLONETM干细胞10×补充剂(HYCLONETM SH30878.02，马萨诸塞州沃尔瑟姆的飞世尔科技公司)和其组合。所述培养基可以包括用灭活的胎牛血清和/或青霉素-链霉素进行补充。优选地将细胞培养物在28℃在搅拌下孵育。通常，在开始悬浮培养后3天，肌纤维开始形成。通过将细胞/发育中的肌纤维离心，更换培养基上清液并且将细胞/发育中的肌纤维重悬来定期更换培养基(例如每3天)。一般在开始悬浮培养后7天收获肌纤维。
分离的原代肌肉和/或脂肪细胞的永生化
使用通过测序鉴定的肌肉和/或脂肪细胞特异性生长基因来使分离的肌肉和/或脂肪细胞永生化。使用标准技术进行RNA测序并且进行分析(参见例如Kukurba和Montgonery(2015)Cold Spring Harb Protoc 2015(11):951-969)。这些基因包括例如MyoD和SMARCD3、Pax3、Pax7(在Chal和Pourquié(2017)Development 144:2104-2122中进行综述)、肌球蛋白-1、整合素α-7、钙粘蛋白-15、肌细胞生成素、生长激素和胰岛素样生长因子、肌肉生长抑制素和生长分化因子、甲壳类动物高血糖激素和肌球蛋白重链(Jung等(2013)Reviews in Aquaculture 5,77-110；Ngyuen等(2016)Aquaculture 464:545-553；Okita等(2011)Nat Methods 8:409-412)。使用非整合永生化方法，如重组腺病毒载体(adm)；非整合型慢病毒载体，如lentiflash粒子(vectalys公司)、诱导型慢病毒载体(Bar-Nur等(2018)Stem Cell Reports 10:1505-1521)和整合酶缺陷型慢病毒载体(Chick等(2012)Human Gene Therapy 23:1247-1257)；和/或微环(Kim等(2017)Stem CellResearch 23:87-94)来整合和过表达所关注的生长基因。腺病毒载体包括在劳斯肉瘤病毒LTR的转录控制下表达全长鼠类MyoD cDNA的Ad5衍生的E1A缺失型腺病毒载体(Lattanzi等(1998)J Clin.Invest.101(10):2119-2128)；Ad-MyoD、Ad-m-MYOD1(Vector Biolabs公司，目录号1492，ADV-265351)；人类5型腺病毒(Suehiro等(2010)FEBS Letters 584:3545-3549)和白鲟腺病毒(WSAdV-1(Hendrick等(1985)Can J Fish Aquat Sci 42:1321-1325；Hendrick等(1990)Dis Aquat Org 8:39-44))。非整合型慢病毒载体的实例是市售的lentiflash粒子(Vectalys公司)；这包括可定制的pRLP-MS2质粒(法国图卢兹的Vectalys公司(Vectalys,Toulouse,France))，其中将如上所述的肌肉生长基因克隆到载体中并且与pRLP-MCP和VSVG质粒一起转导。可选地，使诱导型慢病毒载体，如tetOP-MyoD和M2rtTA在分离的肌肉细胞中共表达(Bar-Nur等(2018))。类似地，可以根据Chick等(2012)构建合适的整合酶缺陷型慢病毒质粒，包括pHR'SIN-cPPT-SFFV-eGFP-WPRE、pHR'SIN-cPPT-SFFV-NogoB-WPRE和pCMVδR8.74 D64V质粒的组合。最终，根据Kim等(2017)克隆表达hPax7的DNA微环。
另外，通过使用端粒酶激活剂来刺激细胞的化学永生化，如环黄芪醇(西格玛公司(Sigma)，SMB00372-20MG；Fauce等(2008)J Immunol.181(10):7400-7406)、来自大豆的染料木黄酮(西格玛公司，G6776-5MG；Chau等(2007)Carcinogenesis 28(11):2282-2290)或白藜芦醇(西格玛公司，R5010-100MG；Xia等(2008)British Journal of Pharmacology155:387-394；Zhai等(2016)Oncology Letters 11:3015-3018)。
使用约70％汇合度的分离的原代细胞进行转导。在28℃或约28℃将细胞与含有所目标基因的腺病毒载体构建体一起孵育1小时并且在48小时-72小时后通过PCR、定量PCR和/或FACS评价转导。在28℃或约28℃将lentiflash粒子与原代细胞一起孵育约12小时，之后去除。任选地，在第一次转导后约30小时重复转导过程(Prel等(2015)Mol Ther MethodsClin Dev 21(2):15039)。在28℃或约28℃将诱导型慢病毒载体与原代细胞一起孵育24小时，之后去除，然后在48小时和72小时补充以4μg/ml-8μg/ml聚凝胺转染试剂(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))(Bar-Nur等(2018))。在28℃或约28℃在8μg/ml聚凝胺存在下将整合酶缺陷型慢病毒质粒与原代细胞一起孵育18小时(Chick等(2012)Human GeneTherapy 23(12):1247-1257)。可选地，使用GENEINTM转染试剂盒(马里兰州盖瑟斯堡的MTI-Global Stem公司(MTI-Global Stem,Gaithersburg,Maryland))将微环转导到原代细胞中，总共3次，每3天一次，如Kim等(Stem Cell Research(2017)23:87-94)所报道。
当依赖化学永生化时，将细胞与环黄芪醇(0.01μM-1μM，西格玛公司；Fauce等(2008)J Immunol.181(10):7400-7406)；染料木黄酮(0.5μM-1μM，西格玛公司；Chau等(2007)Carcinogenesis 28(11):2282-2290)或白藜芦醇(10μM-50μM，西格玛公司；Xia等(2008)British Journal of Pharmacology 155:387-394；Zhai等(2016)OncologyLetters 11:3015-3018)一起孵育总共72小时或144小时(在72小时进行补充)。
通过肌肉干细胞和/或生长基因的PCR表达或通过细胞传代超过10次的能力来验证原代细胞的永生性。通过端粒酶重复扩增ELISA来评估端粒酶活性。
从分离的原代肌肉和脂肪细胞产生iPS细胞
通过用游离型质粒转染(参见例如Chandrobose等(2018)Stem Cell Research&Therapy 9:68；Slamecka等(2016)Cell Cycle 15(2):234-249)或通过无整合和无异种mRNA转染(Lee等(2016)Stem Cells International 2016:6853081)将原代肌肉和/或脂肪细胞和/或永生化的肌肉和/或脂肪细胞重编程。
使用来自山中混合物(Yamanaka cocktail)的游离型质粒：pCXLEhOct3/4-shp53-F、pCXLE-hSK、pCXLE-hUL和pCXLE-EGFP(马萨诸塞州沃特敦的Addgene公司(Addgene,Watertown,MA))以及Oct4、Sox2、Klf4和Myc的山中混合物(Takahashi等(2007)Cell 131:861-872；Okita等(2011)Nat Methods 8:409-412；Rosello等(2013)Elife 2:e00036)。
在转染后立即将细胞放置在培养基中。适当的培养基包括补充有10％FBS和2％PS的格雷斯昆虫培养基(Ma等,2017；George和Dhar,2010)和/或间充质干细胞培养基。每天更换培养基并且在第7天，将细胞接种到
(马萨诸塞州图克斯伯里的康宁公司(Corning,Tewksbury,MA))上以进行无饲养细胞诱导性多能干(iPS)细胞衍生。随后，将培养基更换为mTeSR1(STEMCELL TECHNOLOGIESTM，马萨诸塞州的坎布里奇)，优选地补充有丁酸钠。然后优选地日后将培养基补充以小分子SMC4混合物(含有小分子：PD0325901、CHIR99021、噻唑维恩(Thiazovivin)和SB431542(宾夕法尼亚州普利茅斯会议的FOCUSBiomolecules公司(FOCUS Biomolecules,Plymouth meeting,PA)))直到形成初始集落为止。
可选地，如先前所述(Lee等,2016)转染含有微RNA的重编程微RNA和mRNA(mir302a-d、mir367、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28；马萨诸塞州坎布里奇的Stemgent公司(Stemgent Inc.,Cambridge,MA))。在转染前一天将分离的原代肌肉细胞接种在玻连蛋白XF包被的孔中。在接种后，每天重复mRNA转染，持续一段时间，例如持续11天，而将微RNA转染重复两次，如在第1天和第5天。
为了确认原代肌肉和/或脂肪细胞已经被重编程为诱导性多能细胞，通过定量PCR和FACS分析已知的多能基因并且通过测序验证结果。示例性多能基因包括但不限于PL10家族基因(Mochizuki等(2001)Dev Genes Evol 211(6):299-308)；Lv-Vasa(Aflalo等(2007)Mol Repro Dev 74:172-177)、DEAD家族基因(Shukalyuk等(2007)Cell Biol Int 31(2):97-108)；Pou5f1、klf、sall4、hsp60(Robles等(2011)Zebrafish 8(2):57-63)；VVL、SoxN、dmyc、Luna家族基因(Rosello等(2013)Elife 2:e00036)；和piwi(Alie等(2011)Dev Biol350(1):183-97)。然后进行功能测试以验证细胞效能。合适的测试的实例包括但不限于体外分化测定、畸胎瘤形成、核型分析和亚硫酸氢盐测序。
从多能胚胎干细胞产生肌肉和脂肪细胞
在其它实施方案中，肌肉和/或脂肪细胞源自于多能胚胎干细胞，如来自胚泡阶段的细胞和受精卵。
最初基本上如上文所述培养多能胚胎干细胞。如Salani等(J Cell Mol Med(2012)16(7):1353-1364)以及Chai和Pourquié(Development(2017)144:2104-2122)中所述，从胚胎干细胞或诱导性多能干细胞分化出肌肉细胞。如Barberi等(PLoS Med(2005)2(6):e161)；Mohsen-Kanson等(Stem Cells(2014)32:1459-1467)；和Hafner等(ScientificReports(2016)6:文章编号32490)中所述，从胚胎干细胞和诱导性多能干细胞分化出脂肪细胞。
实施例
实施例1：从海水虾/淡水虾中分离原代肌肉干细胞
在处死前将活的白脚虾和虎虾(包括成体阶段或幼体后期阶段)在冰上保持10分钟。将整个海水虾/淡水虾在11％次氯酸钠中冲洗10秒并且解剖最后一个体节和尾节。将剩余的身体部分保持在冰上。
将解剖的尾节和附接的体节转移到2％高锰酸钾中并且灭菌10分钟。然后将尾节和附接的体节在PBS缓冲液(0.137M NaCl、0.0027M KCl、0.01M Na2HPO4、0.0018M KH2HPO4，pH 7.4)中冲洗一次，在2％青霉素-链霉素过滤的PBS中冲洗一次，并且在70％乙醇中保持5分钟-10分钟，之后在5％或10％青霉素-链霉素过滤的PBS中洗涤5分钟-10分钟。
将清洁的尾节和附接的体节与容纳细胞培养基的单独的10cm培养皿一起保持在冰上。使用五种不同的培养基：(1)含有10％热灭活的胎牛血清(HYCLONETM SH30071.03，马萨诸塞州沃尔瑟姆的飞世尔科技公司)和5％青霉素-链霉素的格雷斯昆虫培养基；(2)含有10％热灭活的牛血清和5％青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基(HYCLONETM SH30022.01，马萨诸塞州沃尔瑟姆的飞世尔科技公司)；(3)
MSC XF补充剂混合物(康涅狄格州克伦威尔的生物工业公司):
MSC XF基础培养基(康涅狄格州克伦威尔的生物工业公司)，含有5％青霉素-链霉素；(4)DMEM高糖培养基(HYCLONETM SH30022.01，马萨诸塞州沃尔瑟姆的飞世尔科技公司):MYOCULTTM SF扩增人类10×(StemcellTechnologiesTM，马萨诸塞州的坎布里奇):5％青霉素-链霉素；和(5)HYCLONETM未分化间充质干细胞培养基(SH30879.01，马萨诸塞州波士顿的通用电气生命科学公司):HYCLONETM干细胞10×补充剂(HYCLONETM SH30878.02，马萨诸塞州沃尔瑟姆的飞世尔科技公司):5％青霉素-链霉素。
对于成体肌肉分离，将尾节去除并且保留，同时从体节解剖不透明的肌肉。去除脂肪层和表皮组织。
对于幼体后肌肉分离，将头部与身体分离。尽可能多地去除腿部并且最初使用电动绞肉机或手持共混机将体节切碎。
将成体或部分切碎的幼体后肌肉手动切碎成约1mm的块，之后转移到准备好的10cm含培养基的培养皿中，其中进行第二轮切碎。对于成体，然后从尾节去除肌肉，切碎，转移到准备好的培养基培养皿中并且再次切碎。然后对成体有翼端部重复该过程。在解剖完成后，将外植体和培养基转移到细胞培养瓶和/或培养皿中并且在28℃在没有CO2的情况下孵育(参见图1)。
通过每2天-3天添加一次新鲜培养基来维持培养物。在分离后的3天至7天，通过重力分离或离心10秒-30秒去除外植体组织。根据细胞密度将剩余的细胞群体分瓶，通常分到2个T75培养瓶中，并且在每一个培养瓶中添加培养基至10ml-12ml的最终体积(参见图2)。继续在28℃孵育并且每2天-3天添加一次新鲜培养基。当在约10ml培养基中细胞数为约800万个和/或细胞约80％-90％汇合时，将细胞群体以1:3比例再次稀释并且继续在相同的条件下孵育直到第2代为止(参见图3)。此时，将一些细胞以1000×g离心5分钟，去除上清液并且将细胞在冷冻管中重悬在1ml Bambanker冷冻培养基中，之后储存在-80℃。将其它细胞在培养基中进一步培养直到至少第4代为止。在这些情况下，将培养基中存在的抗生素在第2代后减少到2％，并且在第4代后进一步减少到0％。
为了确认肌肉干细胞的身份，通过定量PCR分析肌肉基因的表达。在此，靶向肌肉细胞基因，如肌肉生长抑制素和生长分化因子、肌肉LIM蛋白、α骨骼肌、肌球蛋白重链、肌球蛋白-1、Pax3、Pax7、整合素α-7、钙粘蛋白-15和肌细胞生成素(Jung等(2013)Reviews inAquaculture 5,77-110；Ngyuen等(2016)Aquaculture 464:545-553；Okita等(2011)NatMethods 8:409-412)。通过脂肪酸结合蛋白(Ngyuen等(2016)Aquaculture 464)、血清淀粉样蛋白A(SAA)、四次跨膜L6家族成员1(TM4SF1)(Jernas等(2006)FASEB 20(9):1540-1542)或表面抗原CD44、CD45和CD105的组合(Wang等(2017)Exp Ther Med 13(3):1039-1043)的存在来鉴定脂肪细胞。
通过不存在支原体来确定细胞系的无菌性。这使用市售的试剂盒来测试，如细胞培养污染试剂盒、MycoFluorTM支原体检测试剂盒、MycoSEQTM支原体检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司)、MycoAlert PLUS检测试剂盒、PyroGeneTM重组因子C终点荧光测定(龙沙公司(Lonza))和/或用于基于PCR的支原体检测服务的FTA样品采集试剂盒(ATCC)。
实施例2：分化为肌纤维
通过将约200万-300万个原代或永生化的成体肌肉干细胞添加到含有10％热灭活的牛血清和5％青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基(HYCLONETM SH30022.01，马萨诸塞州沃尔瑟姆的飞世尔科技公司)中来实现肌纤维分化。将细胞在设置为速度3的磁力搅拌器(IKARCT基本型)上在28℃在搅拌下孵育。通过将纤维以1000×g离心5分钟，去除用过的培养基并且将其更换为新鲜培养基，每3天更换一次培养基。在开始悬浮培养后约3天开始形成肌纤维(参见图4)并且在7天后即可收获(参见图5)。
实施例3：分离的原代肌肉和脂肪细胞的永生化
可以使用非整合永生化方法来整合和过表达目标生长基因。这些基因包括例如MyoD和SMARCD3、Pax3、Pax7(在Chal和Pourquié(2017)Development 144:2104-2122中进行综述)、肌球蛋白-1、肌细胞生成素、整合素α-7、钙粘蛋白-15、生长激素和胰岛素样生长因子、肌肉生长抑制素和生长分化因子、甲壳类动物高血糖激素和肌球蛋白重链(Jung等(2013)doi.org/10.1111/raq.12005；Ngyuen等(2016)Aquaculture 464:545-553；Okita等(2011)Nat Methods 8:409-412)。然而，也可以使用激活剂增加端粒酶活性来实现化学永生化，如环黄芪醇(Fauce等(2008)J Immunol.181(10):7400-7406)、来自大豆的染料木黄酮(Chau等(2007)Carcinogenesis 28(11):2282-2290)或白藜芦醇(Xia等(2008)BritishJournal of Pharmacology 155:387-394；Zhai等(2016)Oncology Letters 11:3015-3018)。
通过肌肉干细胞和/或生长基因的PCR表达或细胞传代超过10次的能力来验证原代细胞的永生性。当使用化学永生化时，使用端粒酶重复扩增ELISA测定来评估端粒酶的活性和长度的增加。
实施例4：从分离的原代肌肉和脂肪细胞产生iPS细胞
基本上如Chandrabose等,2018所述通过游离型质粒或如Lee等,2016所述通过无整合和无异种mRNA转染来将原代肌肉和脂肪细胞重编程。
使用靶向来自虾类的测序结果的因子的游离型质粒(Addgene公司)。此外，还使用Oct4、Sox2、Klf4和Myc的山中混合物。在转染后立即使用补充有10％FBS和2％PS的格雷斯昆虫培养基(Ma等,2017；George和Dhar,2010)或间充质干细胞培养基。每天更换培养基。在第7天，将细胞接种到基质胶(康宁公司)上进行无饲养细胞iPS衍生。第二天，将培养基更换为mTeSR1(Stem Cell Technologies公司)，补充有丁酸钠。在第12天，不再添加丁酸钠，而是替换为小分子SMC4混合物(含有小分子：PD0325901、CHIR99021、噻唑维恩和SB431542(FOCUS Biomolecules公司))直到形成初始集落为止。
可选地，如先前所述(Lee等,2015)转染含有微RNA的重编程微RNA和mRNA(mir302a-d、mir367、Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28；马萨诸塞州的Stemgent公司)。在转染前一天将分离的原代肌肉细胞接种在玻连蛋白XF包被的孔中。在接种后，将mRNA转染从第2天起重复11天，而在第1天和第5天重复微RNA转染。
为了确认原代肌肉和脂肪细胞被重编程为诱导性多能细胞，通过经定量PCR和FACS分析由测序验证的已知多能基因。示例性多能基因包括但不限于PL10家族基因(Mochizuki等(2001)Dev Genes Evol 211(6):299-308)；Lv-Vasa(Aflalo等(2007)MolRepro Dev 74:172-177)、DEAD家族基因(Shukalyuk等(2007)Cell Biol Int 31(2):97-108)；Pou5f1、klf、sall4、hsp60(Robles等(2011)Zebrafish 8(2):57-63)；VVL、SoxN、dmyc、Luna家族基因(Rosello等(2013)Elife 2:e00036)；和piwi(Alie等(2011)Dev Biol350(1):183-97)。进行功能测试，如体外分化测定、畸胎瘤形成、核型分析和亚硫酸氢盐测序以验证细胞的效能。
在确认iPS细胞的存在后，可以在80％汇合度时将这些细胞冷冻。
实施例5：从虾、螃蟹、小龙虾和龙虾中分离和扩增脂肪干细胞
在如上文在第[045]、[046]和/或[049]段中所述处死和清洁海水虾/淡水虾、螃蟹、小龙虾或龙虾后，将海水虾/淡水虾、螃蟹、小龙虾或龙虾的头部与体节和尾节分离。还将腿部与海水虾/淡水虾、螃蟹、小龙虾或龙虾的身体分离。从体节去除甲壳；并且使用一次性手术刀和镊子从尾节和体节剥离脂肪和表皮组织。将脂肪和表皮组织在含有5％青霉素/链霉素的PBS中充分洗涤。然后如Bunnell等(Methods 2008；45(2):115-120)所述，将组织在I型胶原酶中消化并且使用手术刀切碎。如Bunnell等(Methods 2008；45(2):115-120)所述，将脂肪干细胞与表皮或基质细胞分离。
将分离的细胞重悬在补充有20％FBS、1％L-谷氨酰胺(Mediatech公司)和1％青霉素/链霉素的α-MEM(弗吉尼亚州赫恩登的Mediatech公司(Mediatech,Herndon,VA))中。如Bunnell等(Methods 2008；45(2):115-120)所述，通过70μm细胞过滤器过滤细胞悬浮液。将细胞在赖氨酸包被的培养板中培养(Bunnell等,Methods 2008；45(2):115-120)并且在28℃孵育(George和Dhar(2010)In Vitro Cell Dev.Biol.-Animal 46:801-810)。
如Bunnell等(Methods 2008；45(2):115-120)所述，在平板接种后72小时更换培养基并且洗涤细胞。之后为了维持细胞，每隔一天更换一次培养基直到细胞达到80％-90％汇合度为止。一旦它们达到80％-90％汇合度，就可以收获或分化细胞，如Bunnell等(Methods 2008；45(2):115-120)所述。
实施例6：从螃蟹、小龙虾和龙虾中分离原代肌肉干细胞
在如[045]和[046]中所述在冰上处死和清洁螃蟹或龙虾之后，如[045]-[047]中所述分离和处理蟹爪、腿和主体的肌肉。如Sashikumar和Desai(Cytotechnology(2008)56:161-169)所述，将螃蟹肌肉干细胞在20℃-24℃培养。
对于小龙虾和龙虾，如[045]-[047]中所述分离、处理和培养来自爪部、腿部和尾部的肌肉。如Neumann等(In Vivo(2000)14(5):691-8)所述，将小龙虾肌肉干细胞在27℃培养。如Stepanyan等(Chemical Senses(2004)29(3):179-187)所述将龙虾肌肉干细胞在饱和湿度下在5℃培养或在龙虾存活时保持的温度下培养。
Claims (21)
1.一种肉制品，其包含在体外生长的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉细胞。
2.根据权利要求1所述的肉制品，其还包含在体外生长的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾脂肪细胞。
3.根据权利要求1或2所述的肉制品，其还包含在体外生长的其它海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾细胞。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的肉制品，其中它基本上没有任何有害的微生物和/或寄生生物污染。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的肉制品，其中所述海水虾和/或淡水虾肌肉细胞来自属于以下属的物种：对虾属(Penaeus)、管鞭虾属(Solenocera)、新对虾属(Metapenaeus)、拟对虾属(Parapenaeus)、仿对虾属(Parapenaeopsis)、赤虾属(Metapenaeopsis)、糙对虾属(Trachypenaeus)、原糙对虾属(Protrachypene)、剑对虾属(Xiphopenaeus)、膜对虾属(Hymenopenaeus)、异对虾属(Atypopenaeus)、真单肢虾属(Eusicyonia)、单肢虾属(Sicyonia)或滨对虾属(Litopenaeus)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的肉制品，其中所述海水虾和/或淡水虾肌肉细胞来自斑节对虾(Penaeus monodon)和/或南美白对虾(Litopenaeus vannamei)。
7.一种用于产生海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾永生化肌肉和/或脂肪细胞系的方法，其包括
(a)分离海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉细胞和/或脂肪细胞；
(b)将至少一种肌肉特异性和/或脂肪特异性生长基因整合到腺病毒载体或lentiflash粒子中以形成重组腺病毒构建体或lentiflash粒子；
(c)用(b)的所述重组腺病毒构建体或lentiflash粒子转导所分离的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉细胞；和
(d)产生永生化的肌肉和/或脂肪细胞系。
8.一种用于产生海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾诱导性多能干(iPS)细胞的方法，其包括
(a)从海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾中分离肌肉和/或脂肪细胞；
(b)用包含靶向因子的游离型质粒转染步骤(a)的所述细胞；和
(c)培养步骤(b)的所转染的细胞以产生iPS细胞。
9.一种生产用于食用的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾细胞肉制品的方法，其包括
(a)分离海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉细胞；
(b)将所分离的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉细胞重编程以表达多能基因；
(c)分离诱导性多能干(iPS)细胞；
(d)诱导所述iPS细胞以产生肌肉纤维和/或脂肪；和
(e)使所述肌肉纤维和/或脂肪生长以生产海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾细胞肉制品。
10.一种稳定转导的永生化的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉细胞，其中所述永生化的肌肉细胞至少包含外源性MyoD、SMARCD3、Pax3、Pax7、肌球蛋白-1、整合素α-7、钙粘蛋白-15、肌细胞生成素、生长激素和胰岛素样生长因子、肌肉生长抑制素和生长分化因子、甲壳类动物高血糖激素和/或肌球蛋白重链。
11.一种稳定永生化的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉细胞，其中所述永生化的肌肉细胞表现出增加的端粒酶活性。
12.一种细胞培养物，其包含根据权利要求10所述的永生化的肌肉细胞。
13.一种细胞培养物，其包含根据权利要求11所述的永生化的肌肉细胞。
14.一种稳定转导的永生化的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾脂肪细胞，其中所述永生化的脂肪细胞至少包含外源性MyoD、SMARCD3、Pax3、Pax7、肌球蛋白-1、整合素α-7、钙粘蛋白-15、肌细胞生成素、生长激素和胰岛素样生长因子、肌肉生长抑制素和生长分化因子、甲壳类动物高血糖激素和/或肌球蛋白重链。
15.一种稳定永生化的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾脂肪细胞，其中所述永生化的脂肪细胞表现出增加的端粒酶活性。
16.一种细胞培养物，其包含根据权利要求14所述的永生化的脂肪细胞。
17.一种细胞培养物，其包含根据权利要求15所述的永生化的脂肪细胞。
18.一种稳定转染的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾诱导性多能细胞，其中所述诱导性多能细胞来源于原代海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉和/或脂肪细胞和/或永生化的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾肌肉和/或脂肪细胞。
19.一种稳定转染的海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾诱导性多能细胞，其中所述诱导性多能细胞来源于海水虾、淡水虾、螃蟹、小龙虾和/或龙虾多能胚胎干细胞，如胚泡期细胞和/或受精卵细胞。
20.一种细胞培养物，其包含根据权利要求18所述的诱导性多能细胞。
21.一种细胞培养物，其包含根据权利要求19所述的诱导性多能细胞。
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