CN115354014B - 一种用于对虾细胞长期培养和连续传代的培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于对虾细胞长期培养和连续传代的培养基，首先提供一种对虾细胞培养用的基础培养基，是用2～5×/倍浓度的对虾血清氨基酸混合物替换1.5×L‑15培养基中的氨基酸组分，并添加50～100×浓度的对虾血清糖类混合物，同时添加终浓度为70‑86g/L的明胶。本发明再一个方面还提供一种对虾细胞生长培养基，是在上述的基础培养基中添加对虾卵巢提取液和眼柄的水提取液；更进一步的，所述的对虾细胞生长培养基，还添加有15％FBS(v/v)、20μg/L表皮生长因子和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子以及抗生素溶液。本发明所提供的培养基在培养对虾细胞中产生了明显的有益效果。

Description

一种用于对虾细胞长期培养和连续传代的培养基
技术领域
本发明属于动物细胞培养技术领域，具体涉及一种用于对虾细胞长期培养和连续传代的培养基，可用于对虾细胞的体外长期培养及细胞系的建立。
背景技术
对虾作为一种重要的海水养殖经济物种，因味道鲜美和营养丰富而备受欢迎。然而，各种疾病的频繁爆发，特别是病毒性疾病，给对虾养殖业带来了沉重的损失。体外培养的对虾细胞，特别是连续培养的对虾细胞系，是开展对虾病毒及其致病机理研究所不可或缺的研究工具与手段。对虾细胞培养方面的研究报道最早开始于Chen等(1986)，至今已有近40年历史，尽管科学家们已在对虾细胞的体外培养方面进行了许多努力，但由于用于对虾细胞培养的培养基不合适，至今没有成功地建立起永生性对虾细胞系。
目前用于对虾细胞体外培养的培养基大多是在哺乳动物或昆虫细胞培养基的基础上加以改良而来。其中，Leibovitz's L-15(L-15)培养基是最常用的。之前实验表明2×L-15培养基中添加15％-20％胎牛血清(FBS)和10％-20％对虾肌肉提取液，以及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)等可以获得较好的培养效果。然而，之前的工作表明，2×L-15培养基在低温保存后容易过饱和，析出沉淀，且不能再次溶解。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于对虾细胞长期培养和连续传代的培养基，该培养基能够更好地维持对虾细胞在体外的长期存活和生长，使对虾细胞的传代工作更容易进行，从而解决了体外培养对虾细胞的连续传代问题，从而能够建立对虾细胞系。
本发明首先提供一种对虾细胞培养用的基础培养基，是用2～5×/倍浓度的对虾血清氨基酸混合物替换1.5×L-15培养基中的氨基酸组分，并添加50～100×浓度的对虾血清糖类混合物，同时添加终浓度为70-86g/L的明胶；
作为优选，所述的基础培养基，是用5×的对虾血清氨基酸混合物替换1.5×L-15培养基中的氨基酸组分；
作为优选，所述的基础培养基，是添加100×浓度的对虾血清糖类混合物；并添加86g/L的明胶。
作为实施例的一种具体记载，所述的对虾细胞培养用的基础培养基，其包含有如下终浓度的组分：
1)氨基酸：丝氨酸32-40mg/L、缬氨酸16-20mg/L、赖氨酸136-171mg/L、胱氨酸20-23mg/L、亮氨酸72-90mg/L、甘氨酸137-172mg/L、牛磺酸665-829mg/L、脯氨酸1213-1518mg/L、丙氨酸164-205mg/L、酪氨酸5-6mg/L、鸟氨酸15-18mg/L、精氨酸227-284mg/L、组氨酸25-28mg/L、苏氨酸12-15mg/L、蛋氨酸6-8mg/L、谷氨酸79-98mg/L、异亮氨酸45-57mg/L、β-丙氨酸4-5mg/L、天冬酰胺131-164mg/L、天冬氨酸43-54mg/L、苯丙氨酸35-43mg/L、羟脯氨酸50-63mg/L、γ-氨基丁酸3mg/L、谷氨酰胺300mg/L、色氨酸20mg/L和半胱氨酸120mg/L；
2)糖类：木糖4-6mg/L、岩藻糖7mg/L、核糖24-28mg/L、葡萄糖905-936mg/L、蔗糖63-69mg/L、乳糖11-18mg/L、果糖4-6mg/L、阿拉伯糖18-19mg/L、海藻糖224-234mg/L、龙胆二糖81-88mg/L和半乳糖900mg/L；
3)维生素：肌醇2mg/L、叶酸1mg/L、烟酰胺1mg/L、氯化胆碱1mg/L、D-泛酸钙1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、磷酸硫胺素1mg/L和核黄素-5-磷酸钠0.1mg/L；
4)无机盐：KCl 400mg/L、NaCl 8g/L、CaCl2 140mg/L、MgCl2 93.7mg/L、MgSO497.7mg/L、KH2PO4 60mg/L、Na2HPO4 190mg/L和NaHCO3 1g/L；
5)其他营养物质：明胶86g/L、NaHCO3 1g/L、丙酮酸钠550mg/L、青霉素钠100IU/mL、硫酸链霉素100IU/mL、两性霉素B 0.25mg/L和酚红10mg/L；
渗透压为620±20mOsm·kg-1，pH值为7.2±0.2。
本发明再一个方面还提供一种对虾细胞生长培养基，是在上述的基础培养基中添加对虾卵巢提取液和眼柄的水提取液；
作为优选，在基础培养基中添加20％卵巢提取液和4％眼柄提取液。
更进一步的，所述的对虾细胞生长培养基，还添加有15％FBS(v/v)、20μg/L表皮生长因子(EGF)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及抗生素溶液。
所述的抗生素，作为实施例的具体记载，是青霉素钠100IU/mL、硫酸链霉素100IU/mL和两性霉素B 0.25mg/L；
本发明还提供一种传代培养对虾细胞系的方法，是使用上述的对虾细胞最适生长培养基来培养对虾细胞；
作为优选，所述的对虾细胞，为对虾的前血细胞。
应用本发明所提供的对虾细胞基础培养基(SBM)和生长培养基(SGM)开展刀额新对虾(Metapenaeus ensis)血淋巴细胞(MeH)的体外培养，可获得以下培养结果：
1)MeH细胞可在接种后12小时内快速形成70％-80％汇合度的细胞单层，在对虾细胞最适生长培养基中可健康存活不少于270天；
2)显著提高了MeH细胞的增殖潜能，打破了体外培养MeH细胞的有丝分裂停滞问题
3)培养于SGM中的MeH细胞可被连续传代32次，成功建立了MeH有限细胞系，并且第20代的MeH细胞中仍然可以检测到10％左右的增殖率；
4)体外培养的MeH细胞可被对虾偷死野田村病毒(CMNV)感染，仍可保持对病毒的易感性。
附图说明
图1：含有不同含量的对虾血清氨基酸组分的对虾细胞基础培养基原代培养对虾血淋巴细胞(MeH)的培养效果图，其中图A1-A4是MeH细胞在SBM-4中培养0小时、12小时、40天和120天的生长状态图；B1-B2和C1-C2分别显示MeH细胞在SBM-3和SBM-4培养基中培养80天后的Calcein-AM染色结果图；D是MeH细胞在SBM-3和SBM-4中培养80天后的细胞存活率分析结果的柱状图。
图2：不同渗透压调节物质的四种对虾细胞基础培养基(SBM-5、SBM-6、SBM-7和SBM-8)原代培养对虾血淋巴细胞(MeH)的培养效果比较图，其中图A1-A4、B1-B4、C1-C4和D1-D4分别显示了MeH细胞在SBM-5、SBM-6、SBM-7和SBM-8中培养0小时、12小时、4天和16天的生长状态。
图3：含有100×含量的对虾血清糖类混合物的对虾细胞基础培养基(SBM-12)原代培养对虾血淋巴细胞(MeH)的培养效果图，其中图A1-A4显示了MeH细胞在SBM-12中培养0小时、12小时、60天和275天的生长状态；B1-B2和C1-C2分别显示在SBM-12中培养5天和30天的MeH细胞的Calcein-AM染色结果；D1-D4和E1-E4分别显示在SBM-12中培养10天和30天后的MeH细胞的EdU染色结果；F是MeH细胞在SBM-12中分别培养5天和30天后的细胞存活率分析结果的柱状图；G是MeH细胞在SBM-12中分别培养10天和30天后的细胞增殖率分析结果的柱状图。
图4：含有不同浓度对虾卵巢提取液的对虾细胞生长培养基原代培养对虾血淋巴细胞(MeH)的培养效果图，其中图A1-A4显示了MeH细胞在SGM-4中培养0小时、12小时、20天和100天的生长状态；B1-B2和C1-C2分别显示MeH细胞在SGM-4中培养5天和30天后的Calcein-AM染色结果；D是MeH细胞在SGM-1、SGM-2、SGM-3和SGM-4中分别培养5天和30天后的细胞存活率分析结果的柱状图。
图5：利用所设计的含有不同浓度对虾肌肉提取液的四种对虾细胞生长培养基(SGM-5、SGM-6、SGM-7和SGM-8)原代培养对虾血淋巴细胞(MeH)的培养效果的比较图，其中SGM-5、SGM-6、SGM-7和SGM-8是指在SGM-4培养基中分别添加了5％、10％、15％和20％对虾肌肉提取液的四种对虾细胞生长培养基；图A1-A3、B1-B3、C1-C3和D1-D3分别显示了MeH细胞在SGM-5、SGM-6、SGM-7和SGM-8中培养0小时、4小时和3天的生长状态。
图6：含有4％对虾眼柄提取液的对虾细胞生长培养基(SGM-10)原代培养对虾血淋巴细胞(MeH)的培养效果图，其中A1-A4显示了MeH细胞在SGM-10中培养0小时、12小时、30天和136天的生长状态；B1-B2和C1-C2分别显示MeH细胞在SGM-10中培养5天和30天后的Calcein-AM染色结果；D是MeH细胞在SGM-9、SGM-10、SGM-11和SGM-12中分别培养5天和30天后的细胞存活率分析结果的柱状图。
图7：对培养于对虾细胞生长培养基(SGM-10)中的原代培养MeH细胞进行血细胞类型鉴定、细胞活性和增殖能力分析的结果图，其中图A显示新鲜分离的MeH细胞的Wright-Giemsa染色结果，表明新鲜分离的对虾血淋巴含有颗粒细胞(GC)、半颗粒细胞(SGC)、透明细胞(HC)和前血细胞(PHC)四种类型的血淋巴细胞；B1、B2和B3显示体外培养至30天的MeH细胞的Wright-Giemsa染色结果，B2和B3图中箭头所指为正在分裂的前血细胞；E表示新分离的血淋巴细胞和培养30天的血淋巴细胞中四种类型血细胞的占比变化；C1-C4和D1-D4显示MeH细胞在体外培养10至30天的增殖能力发生了变化；F表示CCK-8法检测体外培养30天内MeH细胞的活力变化结果；G是MeH细胞在生长培养基(SGM-10)中培养10天和30天的细胞增殖率分析结果的柱状图。
图8：所优化的对虾细胞最适生长培养基(SGM-10)可支持MeH细胞连续传代培养32次图，其中P0指示原代培养MeH细胞。P1-P32分别指示第1-32代的MeH细胞；图A1-A2和B1-B2分别显示MeH细胞在SGM-10中培养至第10代和第20代时的Calcein-AM染色结果；D是MeH细胞在SGM-10中培养至第10代和第20代时细胞存活率分析结果的柱状图。
图9：在SGM-10培养基中培养的MeH细胞对野田村偷死病毒(CMNV)的易感性分析结果图，其中图A1-A3、B1-B3和C1-C3分别显示了2×PBS、热灭活CMNV和野生型CMNV感染后的MeH细胞，箭头指示细胞病变效应；D为被CMNV感染后1天和3天的MeH细胞中依赖于RNA的CMNV病毒RNA聚合酶(RdRp)的半定量RT-PCR扩增结果；E为RdRp半定量RT-PCR扩增条带的灰度值统计结果。
具体实施方式
本发明研究了在培养基中添加远高于对虾血淋巴中营养成分水平后的培养效果，本发明还探究了提高培养基中的氨基酸和蛋白质的含量，降低氯化钠的添加量后的培养效果，进一步对对虾细胞培养基进行营养成分的优化，最终获得了一种可支持对虾细胞单层长期存活和连续传代的新的对虾细胞培养基。
本发明分别测定了对虾血清中的游离氨基酸、糖类和游离脂肪酸的组成及其含量，然后根据测定结果，优化和建立了对虾细胞的最适基础培养基。
首先，以1.5×L-15(Gibco,USA)培养基(配方见表1)为对照(SBM-0)，以1×、1.5×、2×和5×浓度倍比对虾血清氨基酸混合物分别替代1.5×L-15培养基中原有的氨基酸组分，配制了4种新的基础培养基，分别命名为SBM-1～SBM-4。然后向上述5种基础培养基中分别添加15％FBS(v/v)、20％对虾卵巢提取液(v/v)、20μg/L表皮生长因子(EGF)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及抗生素溶液(青霉素钠100IU/mL、硫酸链霉素100IU/mL和两性霉素B 0.25mg/L)。通过比较上述五种SBM培养基对刀额新对虾血淋巴细胞MeH细胞的附着、存活和生长的支持能力，筛选出最适的基础培养基。
表1：The 1×L-15和1.5×L-15培养基的组分及浓度含量表
上述5种基础培养基的培养结果表明，含5×浓度对虾血清氨基酸混合物的对虾细胞基础培养基(SBM-4)的培养效果最好，可支持对虾血淋巴细胞存活120d以上，其次是含2×对虾血清氨基酸混合物的对虾细胞基础培养基(SBM-3)，可支持对虾血淋巴细胞存活80d以上。Calcein-AM染色结果表明，在SBM-3和SBM-4中培养80d后的对虾细胞的存活率仍可分别达到37％和44％左右。而在其他基础培养基中的存活时间不超过15d，而1.5×L-15对照培养基仅能支持对虾MeH细胞存活3d左右。因此，SBM-4被选用于后续对虾细胞基础培养基的进一步优化。
其次，本发明又开展了对SBM-4基础培养基中渗透压调节物质的优化。选择了四种既具有渗透调节作用又具有营养功能的物质(磷酸盐、明胶、胶原蛋白和胰蛋白胨)分别代替NaCl调节培养基的渗透压。具体方法是在不含有氨基酸组分的1×L-15培养基中添加5×对虾血清氨基酸混合物后，再分别添加不同浓度的磷酸盐混合物、明胶、胶原蛋白和胰蛋白胨，制备四种新的基础培养基SBM-5～SBM-8，并比较这四种基础培养基的培养效果。结果发现在SBM-6中加入86g/L明胶后可以显著提高MeH细胞的生长和存活，在第16天未见细胞的融合和裂解，而MeH细胞在SBM-5、SBM-7和SBM-8培养基中的存活时间不超过4d。可见，明胶为一种良好的对虾细胞培养基渗透压调节物质。因此，含有86g/L明胶的SBM-6被选用于后续对虾细胞基础培养基的进一步优化。
本发明又开展了SBM-6基础培养基中糖类物质的组成与含量的优化。具体方法是将1×、5×、50×和100×含量的对虾血淋巴糖类混合物分别加入SBM-6中，制备了四种基础培养基：SBM-9～SBM-12，并比较这四种基础培养基的培养效果。结果发现，含100×浓度的对虾血清糖类混合物的对虾细胞基础培养基(SBM-12)的培养效果最好，可支持对虾血淋巴细胞存活275d以上；Calcein-AM染色结果表明，在SBM-12中培养5d和30d的对虾细胞的存活率分别为40％和64％左右；EdU染色结果表明，在SBM-12中培养10d和30d后的对虾细胞仍有部分细胞处于增殖状态，细胞分裂比率分别可达到20％和1.2％左右。而其他三种基础培养基(SBM-9、SBM-10和SBM-11)也可维持细胞体外存活200d以上。因此，SBM-12被选用于后续对虾细胞基础培养基的进一步优化。
本发明又开展了SBM-12基础培养基中脂肪酸的组成与含量的优化。具体方法是根据对虾血清中四种必需脂肪酸(α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸和顺式-9，12-亚油酸)的分析结果，分别将1×、5×和10×含量的上述对虾血清必需脂肪酸混合物添加到SBM-12中，制备三种新的基础培养基：SBM-13～SBM-15，并比较这三种基础培养基的培养效果。结果发现，添加的上述脂肪酸混合物可以浓度依赖的方式诱导对虾细胞发生明显的黑化现象，导致对虾细胞仅能存活不到6天。可见，上述脂肪酸混合物对对虾细胞具有较高的细胞毒性。因此不建议将其添加到SBM中。
在上述研究的基础上，确定最佳对虾细胞基础培养基(OSBM)组成如下：用2～5×浓度对虾血清氨基酸混合物替换1.5×L-15培养基中的氨基酸组分，并添加50～100×浓度的对虾血清糖类混合物，并添加终浓度为70-86g/L的明胶。
为进一步提高对虾细胞的长期培养效果，本发明还通过进一步在确定的SBM-12培养基中添加对虾卵巢、肌肉和眼柄提取液，并最终获得对虾细胞最适生长培养基。
其中，对虾卵巢组织、肌肉和眼柄组织的水提取液的制备方法如下：无菌条件下取对虾组织，其中，卵巢组织和眼柄组织按照每克组织20mL的比例，肌肉组织按照每克组织3mL的比例，分别加入无菌水，匀浆，然后将组织匀浆于60℃水浴中孵育1小时，期间振摇混匀数次。之后，将组织匀浆冻融1次，4℃条件下，10000×g离心2小时，收集上清液，过滤除菌(0.22μm无菌滤膜)，分装保存于-80℃。
1)对虾卵巢提取液的最适添加量。具体方法是将制备的对虾卵巢提取液分别以5％(SGM-1)、10％(SGM-2)、15％(SGM-3)和20％(SGM-4)的浓度加入不含卵巢提取液的SBM-12培养基中，并比较上述培养基的细胞培养效果。结果显示，上述不同浓度卵巢提取液的上述四种生长培养基均能支持对虾细胞健康生长和存活100天以上。其中，以SGM-4中培养的对虾细胞的存活最好，即20％是卵巢提取液的最适添加量。因此，SGM-4被用于对虾细胞生长培养基的进一步优化。
(2)对虾肌肉提取液的最适添加量
将制备的对虾肌肉提取液分别以5％(SGM-5)、10％(SGM-6)、15％(SGM-7)和20％(SGM-8)的浓度添加到SGM-4培养基中，并比较上述培养基的细胞培养效果。结果显示，添加对虾肌肉提取液对对虾细胞的生长和存活有不利影响，细胞出现空泡后逐渐聚集，3d后明显死亡。并且细胞毒性作用与对虾肌肉提取液呈浓度依赖关系，肌肉提取液浓度越高，细胞毒性越强。因此，对虾肌肉提取液将不被添加到SGM中。
(3)对虾眼柄提取液的最适添加量
将对虾眼柄提取液分别以1％(SGM-9)、4％(SGM-10)、7％(SGM-11)和10％(SGM-12)的浓度加入SGM-4培养基中，并进行细胞培养效果的评估。结果表明，四种不同浓度的对虾眼柄提取液均能支持对虾细胞健康生长和存活136天以上。其中，SGM-10中培养的对虾细胞的存活最好，即4％是眼柄提取液的最适添加量。因此，SGM-10被用于对虾细胞生长培养基的进一步优化。
因此，确定最佳对虾细胞生长培养基(OSGM)是SGM-10，即在最适对虾基础培养基中分别添加20％卵巢提取液和4％眼柄提取液。
本发明进一步分析了使用最适生长培养基(SGM-10)长期培养之后的对虾血淋巴细胞中四种类型血细胞的占比变化。发现对虾血淋巴中含有四种不同类型的血细胞，按照细胞数量占比由小到大的顺序，分别为前血细胞、透明细胞、颗粒细胞和半颗粒细胞；在OSGM中培养了30d后，发现存活的细胞中主要是前血细胞，其次是半颗粒细胞，最后是颗粒细胞，几乎观察不到透明细胞。这表明透明细胞不能在体外长时间存活，在生长过程中逐渐分化成其他类型细胞或破裂死亡，而前血细胞则是对虾血细胞建系的重要细胞来源。
本发明还进一步测试了在OSGM中培养的对虾血淋巴细胞的病毒易感性，发现在OSGM中培养的MeH细胞可被对虾偷死野田村病毒(CMNV)感染，并且病毒可以在细胞中复制。
本发明又进一步建立和优化了对虾血淋巴细胞的传代方法，此传代方法可成功将对虾细胞单层传代32次，而且传至第10代和第20代的对虾细胞的活性可达16％和21％；且第20代的对虾细胞的增殖率仍可保持在10％左右。
下面以刀额新对虾(Metapenaeus ensis)血淋巴细胞的体外培养为例，结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1：对虾血清中游离氨基酸、糖类化合物和游离脂肪酸的种类和含量以及渗透压和pH值的测定
对虾血清的制备方法如下：用2.5-mL一次性注射器从对虾第一步足前面轻轻刺入血窦处，找准位置后匀速抽取对虾血淋巴；卸下注射器的针头，将对虾血淋巴转移至1.5mL离心管中，依次抽取20只；室温静置1小时直至血淋巴凝结分层，1000×g离心10分钟，将所有离心管中的上清液收集到一起，收集的血清经12000×g、4℃离心10分钟后进一步收集上清液，适量分装后得到对虾血清，于-80℃保存备用。
其中，利用冰点渗透压仪和pH计分别测定对虾血清的渗透压和pH值，发现对虾血清的渗透压为620±20mOsm/kg，pH值为7.2±0.2。
对虾血清中游离氨基酸的种类和含量的测定方法如下：
将800μL的对虾血清与200μL的10％磺基水杨酸混合，于冰上静置孵育1小时，然后在4℃条件下20000×g离心2次，每次15分钟，取20μL上清液注入A300-adv氨基酸分析仪(德国MembraPure)的注射瓶，用于游离氨基酸的组成和含量的分析，测定结果如表1所示。
对虾血清中糖类化合物的种类和含量的测定方法为：
100μL对虾血清与400μL预冷的甲醇(50％)在1.5mL的离心管中混匀1分钟，然后在冰浴中超声10分钟后，在-40℃下孵育1小时，4℃条件下12000×g离心10分钟。将收集的上清液在温和的氮气气流下干燥，然后加入100μL的ddH2O重悬。重悬后的样品通过滤膜过滤后，吸取100μL样品转移到HPIC-MS/MS分析仪器的注射瓶中，用于分析各种糖类的组成和含量，测定结果如表1所示。
对虾血清中游离脂肪酸的种类和含量的测定方法为：将50μL对虾血清与430μL提取液(异丙醇：正己烷体积比为2：3)和20μL内标(1mg/L正己烷)混合，在1.5mL的离心管中涡旋30秒，然后在冰浴中超声5分钟，4℃条件下12000×g离心15分钟。然后，将约400μL的上清液转移到新的离心管中，用氮气干燥，加入200μL甲醇和100μL重氮甲烷，涡旋10秒后室温静置15分钟，再次用氮气吹干样品。最后加入160μL正己烷重新溶解。在4℃、12000×g的条件下进一步离心5分钟后，将上清液转移到GC-MS分析仪器的注射瓶中，用于游离脂肪酸的组成和含量的分析，测定结果如表2所示。
表2：对虾血清中游离氨基酸、糖类化合物和游离脂肪酸的种类和含量以及渗透压和pH值的测定结果平均值表
注释：Na，未检测出；数据以平均值±标准误表示(n＝3)
实施例2：对虾血淋巴细胞的抽取与培养
取2.5mL一次性注射器，首先吸取抗凝剂0.5mL，然后从酒精和碘伏消毒处理后的对虾的第一步足上方位置快速刺入血窦处，找准位置后匀速抽取血淋巴细胞。抽取后立即上下晃动注射器，以确保抗凝剂和血淋巴混合均匀，防止血液凝固。充分混匀后卸下注射器的针头，将对虾血淋巴细胞转移至15mL离心管中，得到对虾血淋巴与抗凝剂的混合液，混匀后，于室温下，1000×g离心10min。弃去上清，加入30×双抗混合物离心洗涤1次，用2×PBS离心洗涤1次，加入对虾细胞生长培养基，重悬细胞，制成对虾血淋巴细胞悬液，接种到细胞培养板中，于28℃、5％CO2培养箱中培养。
其中，抗凝剂的配制方法为：在1L纯水中分别加入15g NaCl、0.2g KCl、0.2gKH2PO4、3g Na2HPO4·12H2O、9.8g柠檬酸三钠，2.48g EDTA·2Na和0.8g还原型谷胱甘肽(或0.6g半胱氨酸)，充分溶解后，过滤除菌，然后分装保存于4℃冰箱中。
实施例3：对虾细胞基础培养基中氨基酸种类与含量的优化
首先，以1.5×L-15培养基(见表1)为对照(SBM-0)，以1×、1.5×、2×和5×倍比含量的对虾血清氨基酸混合物(见表1)分别替代1.5×L-15培养基(表3)中原有的氨基酸组分，分别配制了4种新的基础培养基：SBM-1、SBM-2、SBM-3和SBM-4(表3)。然后向上述5种基础培养基中分别添加15％FBS(v/v)、20％对虾卵巢提取液(v/v)、20μg/L表皮生长因子(EGF)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)以及抗生素溶液(青霉素钠100IU/mL、硫酸链霉素100IU/mL和两性霉素B 0.25mg/L)，用于培养刀额新对虾血淋巴细胞(MeH)。
通过比较上述五种SBM培养基对MeH细胞的附着、存活和生长的支持能力，筛选出最适的基础培养基。如图1所示，含5×对虾血清氨基酸混合物的对虾细胞基础培养基(SBM-4)的培养效果最好，可支持对虾血淋巴细胞存活120d以上，其次是含2×对虾血清氨基酸混合物的对虾细胞基础培养基(SBM-3)，可支持对虾血淋巴细胞存活80d以上。Calcein-AM染色结果表明，在SBM-3和SBM-4中培养80d后的对虾细胞的存活率仍可分别达到37％和44％左右。而在其他基础培养基中的存活时间不超过15d，而1.5×L-15对照培养基仅能支持对虾MeH细胞存活3d左右。因此，SBM-4被选用于后续对虾细胞基础培养基的进一步优化。
实施例4：对虾细胞基础培养基中渗透压调节物质的优化
从磷酸盐、明胶、胶原蛋白和胰蛋白胨中筛选出可以在SBM中替代氯化钠的渗透压调节物质。
具体方法如下：在不含有氨基酸组分的1×L-15培养基中添加5×对虾血清氨基酸混合物后，再分别添加36g/L Na2HPO4和24g/L KH2PO4的磷酸盐混合物、86g/L的明胶、156g/L的胶原蛋白以及66g/L的胰蛋白胨，得到4种不同的SBM：SBM-5，SBM-6，SBM-7和SBM-8(表2)。最后，分别向以上4种基础培养基中补充15％FBS，20％对虾卵巢提取液、20μg/L bFGF、20μg/L EGF、100mg/L的青霉素钠、100mg/L的链霉素和0.25mg/L的两性霉素B，然后用于培养对虾血淋巴细胞，并比较这四种基础培养基的培养效果。结果如图2所示，在SBM-6中加入86g/L明胶后可以显著提高MeH细胞的生长和存活，在第16天未见细胞的融合和裂解，而MeH细胞在SBM-5、SBM-7和SBM-8培养基中的存活时间不超过4d。可见，明胶为一种良好的对虾细胞培养基渗透压调节物质，可用于替代氯化钠，以避免过高浓度氯化钠的细胞毒性。因此，含有86g/L明胶的SBM-6被选用于后续对虾细胞基础培养基的进一步优化。
实施例5：对虾细胞基础培养基中糖类化合物及脂肪酸的种类与含量的优化
糖类化合物的优化是在SBM-6的基础上进行的。将1×、5×、50×和100×对虾血清游离糖类混合物(HS)(见表1)分别加入SBM-6，分别制备SBM-9、SBM-10、SBM-11和SBM-12四种基础培养基(表2)。最后，分别向以上4种基础培养基中补充15％FBS，20％对虾卵巢提取液、20μg/L bFGF、20μg/L EGF、100mg/L的青霉素钠、100mg/L的链霉素和0.25mg/L的两性霉素B，然后用于培养对虾血淋巴细胞，并根据对虾细胞的培养效果来选择最适糖类化合物含量的SBM，用作对虾细胞基础培养基的进一步优化。
结果如图3所示，添加HS混合物可明显促进MeH细胞的生长和存活，且呈浓度依赖关系，也就是说，HS混合物浓度越高，细胞培养效果越好。在SBM-9、SBM-10、SBM-11和SBM-12四种基础培养基中，含有100倍HS混合物的SBM-12对MeH细胞的培养效果最好，细胞在SBM-12中可连续培养275d以上。其他三种含HS混合物的SBM也可以支持MeH细胞存活200d以上。MeH细胞在SBM-12中培养5d和30d的存活率分别可达40％和64％左右。EDU染色分析表明，在SBM-12中培养10d和30d的MeH细胞可检测到明显的增殖能力，在细胞中成功捕获到了绿色荧光信号。在SBM-12中培养的MeH细胞在第10d的增殖率可达20％左右，在第30d却显著下降到1.2％左右。因此，SBM-12被选用于后续对虾细胞基础培养基的进一步优化。
此外，在此基础上进行的游离脂肪酸种类与含量的优化结果表明，四种必需脂肪酸(α-亚麻酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸和顺式-9，12-亚油酸)混合物的添加会对MeH细胞的生长和存活有不利影响。添加的上述脂肪酸混合物可以浓度依赖的方式诱导对虾细胞发生明显的黑化现象，导致对虾细胞仅能存活不到6天。可见，上述脂肪酸混合物对对虾细胞具有较高的细胞毒性。因此，不考虑将其添加到SBM中。
综上所述，SBM-12为最佳对虾细胞基础培养基(OSBM)。
实施例6：对虾细胞生长培养基(SGM)中卵巢和眼柄提取液最适添加量的优化
为进一步提高对虾细胞的长期培养效果，本发明还通过进一步优化SBM-12培养基中对虾卵巢、肌肉和眼柄提取液的最适添加量，以筛选出对虾细胞最适生长培养基。具体优化方法和结果如下：
1)对虾卵巢提取液的最适添加量。具体方法：将制备的对虾卵巢提取液分别以5％(SGM-1)、10％(SGM-2)、15％(SGM-3)和20％(SGM-4)的浓度加入不含卵巢提取液的SBM-12培养基中，并比较上述培养基的细胞培养效果。结果如图4显示，含不同浓度卵巢提取液的上述四种生长培养基均能支持对虾细胞健康生长和存活100天以上。对虾细胞在SGM-1、SGM-2、SGM-3和SGM-4中培养至第5d的的存活率分别可达为27％、30％、40％和37％左右，第30d分别为41％、50％、48％和69％。可见，SGM-4中培养的对虾细胞的存活最好，即20％是卵巢提取液的最适添加量。因此，SGM-4被用于对虾细胞生长培养基的进一步优化。
其中，对虾卵巢提取液的制备方法如下：将对虾的卵巢组织按照每克组织20mL的比例在无菌水中进行充分匀浆后，在60℃水浴锅中间歇摇晃孵育1小时。然后将所得组织混合物冻融一次，4℃条件下，10000×g离心2小时。收集上清液，过滤除菌(0.22μm无菌滤膜)，适当分装后置于-80℃保存备用。
2)对虾眼柄提取液的最适添加量。对虾眼柄提取液的制备方法与卵巢提取液的制备方法相同。将对虾眼柄提取液分别以1％(SGM-9)、4％(SGM-10)、7％(SGM-11)和10％(SGM-12)的浓度加入SGM-4培养基中，并进行细胞培养效果的评估。结果如图6所示，四种不同浓度的对虾眼柄提取液均能支持对虾细胞健康生长和存活136天以上。对虾细胞在SGM-9、SGM-10、SGM-11和SGM-12中培养至第5d的的存活率分别可达31％,、34％、32％和32％左右，第30d分别为36％、48％、39％和41％左右。可见，SGM-10中培养的对虾细胞的存活最好，即4％是眼柄提取液的最适添加量。因此，SGM-10即为对虾细胞最适生长培养基(OSGM)。
表3：16种对虾细胞基本培养基(SBM)和12种对虾细胞生长培养基(SGM)的配方表
注释：所列28种培养基均添加2g/L葡萄糖、1g/L NaHCO3、15％胎牛血清(FBS)、20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20μg/L表皮生长因子(EGF)、100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素、0.25mg/L两性霉素B和20％的对虾卵巢提取液(未添加到SGM-1、SGM-2、SGM-3和SGM-4中)，将渗透压调节为620±20mOsm/kg，pH值为7.2±0.2，然后用于对虾血淋巴细胞MeH培养；b、c、d表示的HAA、HS和HFA分别代表氨基酸混合物(HAA)、糖类混合物(HS)和四种必需脂肪酸混合物(HFA)，其组成和含量分别与对虾血清中检测到的成分和含量相同，如表1所列。
实施例9：优化后的对虾细胞最适基础培养基和最适生长培养基配方
综上实施例，本发明提供的对虾细胞基础培养基(SBM)，其制备是以无菌超纯水为溶剂，并添加如下终浓度的组分：
(1)氨基酸：丝氨酸32-40mg/L、缬氨酸16-20mg/L、赖氨酸136-171mg/L、胱氨酸20-23mg/L、亮氨酸72-90mg/L、甘氨酸137-172mg/L、牛磺酸665-829mg/L、脯氨酸1213-1518mg/L、丙氨酸164-205mg/L、酪氨酸5-6mg/L、鸟氨酸15-18mg/L、精氨酸227-284mg/L、组氨酸25-28mg/L、苏氨酸12-15mg/L、蛋氨酸6-8mg/L、谷氨酸79-98mg/L、异亮氨酸45-57mg/L、β-丙氨酸4-5mg/L、天冬酰胺131-164mg/L、天冬氨酸43-54mg/L、苯丙氨酸35-43mg/L、羟脯氨酸50-63mg/L、γ-氨基丁酸3mg/L、谷氨酰胺300mg/L、色氨酸20mg/L和半胱氨酸120mg/L；
(2)糖类：木糖4-6mg/L、岩藻糖7mg/L、核糖24-28mg/L、葡萄糖905-936mg/L、蔗糖63-69mg/L、乳糖11-18mg/L、果糖4-6mg/L、阿拉伯糖18-19mg/L、海藻糖224-234mg/L、龙胆二糖81-88mg/L和半乳糖900mg/L；
(3)维生素：肌醇2mg/L、叶酸1mg/L、烟酰胺1mg/L、氯化胆碱1mg/L、D-泛酸钙1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、磷酸硫胺素1mg/L和核黄素-5-磷酸钠0.1mg/L；
(4)无机盐：KCl 400mg/L、NaCl 8g/L、CaCl2 140mg/L、MgCl2 93.7mg/L、MgSO497.7mg/L、KH2PO4 60mg/L、Na2HPO4 190mg/L和NaHCO3 1g/L；
(4)其他营养物质：明胶86g/L、NaHCO3 1g/L、丙酮酸钠550mg/L、青霉素钠100IU/mL、硫酸链霉素100IU/mL、两性霉素B 0.25mg/L和酚红10mg/L。最后，用NaCl将OSBM培养基的渗透压调整为620±20mOsm·kg-1，用HCl和NaOH将培养基的pH值调整为7.2±0.2。
其次，本发明还提供一种对虾细胞生长培养基，其制备是以对虾最适基础培养基为基础，进一步添加如下终浓度的组分：15％FBS(v/v)、20％对虾卵巢提取液(v/v)、4％对虾眼柄提取液(v/v)、20μg/L表皮生长因子(EGF)和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。最后，用NaCl将上述培养基的渗透压调整为620±20mOsm·kg-1，用HCl和NaOH将上述培养基的pH值调整为7.2±0.2。
实施例10：在对虾细胞最适生长培养基(OSGM)中培养的对虾血淋巴细胞(MeH)的细胞类型鉴定、细胞活性和增殖能力分析
为了检测那种MeH细胞在OSGM中长期培养后仍能存活，用Wright-Giemsa染色对新鲜分离和体外培养30d的MeH细胞进行了鉴定。结果如图7显示，对对虾血淋巴中的血细胞类型进行鉴定的结果表明，对虾血淋巴中含有四种不同类型的血细胞，按照细胞数量比例由小到大分别为前血细胞(10.1％)、透明细胞(11.5％)、颗粒细胞(28.6％)和半颗粒细胞(52.9％)；而在对虾细胞最适生长培养基OSGM中培养了30d的对虾血淋巴细胞，发现存活的细胞中主要是前血细胞(47.2％)，其次是半颗粒细胞(41.0％)，最后是颗粒细胞(12.6％)，几乎没有透明细胞。这表明透明细胞不能在体外长时间存活，在生长过程中逐渐破裂死亡。
CCK-8结果表明，MeH细胞在OSGM中培养，一直到第15d，都可检测到细胞增殖。此后，MeH细胞的活跃增殖能力降低，但细胞活力可稳定维持到30d以上。
EdU染色结果表明，在SGM-10中培养10d和30d的MeH细胞检测到了增殖信号，MeH细胞在第10d的潜在增殖率可达32.5％。
实施例11：MeH细胞在SGM-10中的传代培养及有限细胞系的建立
在含有明胶的SGM-10培养基中培养的MeH细胞贴壁不紧，因此，通过物理吹吸的方式可以很容易地进行传代培养。每隔3～4天更换一半培养基，用培养液吹洗细胞后将细胞悬液重新接种，并在28℃含3％CO2的培养箱中孵育。结果如图8所示，此传代方法可成功将对虾细胞单层传代32次，Calcein-AM染色结果表明，传至第10代和第20代的对虾细胞的活性分别为14.99±0.98％和20±1.13％；EdU染色结果表明，第20代的对虾细胞增殖率为9.7±0.88％。
实施例12：在SGM-10中培养的MeH细胞对对虾偷死野田村病毒(CMNV)的敏感性
具体方法：将MeH细胞接种于12孔培养板中，培养至80％单层形成，然后用含有100μL CMNV原液的2mL无血清、无抗生素和无明胶的OSGM培养液更换旧培养基，孵育2小时。然后吸出含病毒的培养基，换成新鲜的无明胶OSGM培养基，每天观察细胞病变效应(CPE)。以热灭活的CMNV悬液(95℃，5分钟)和2×PBS接种细胞为阴性对照，用半定量RT-PCR法分析CMNV在MeH细胞中的感染和复制情况。结果如图9所示，在OSGM中培养的MeH细胞能成功地被对虾偷死野田村病毒(CMNV)感染，在CMNV接种后第3天可看到明显的细胞病变效应(CPE)，半定量RT-PCR也检测到了病毒的复制。对虾血淋巴细胞对CMNV病毒敏感性的成功维持，也证实了本发明的OSGM培养基的适用性。

Claims (3)

1.一种对虾细胞生长培养基，其特征在于，所述的培养基是用5×浓度的对虾血清氨基酸混合物来替换1.5×L-15培养基中的氨基酸组分，并添加100×浓度的对虾血清糖类混合物，同时添加86g/L的明胶；
其中，所述的培养基包含有如下终浓度的组分：
氨基酸：丝氨酸35.5 mg/L、缬氨酸90.4 mg/L、赖氨酸153.6 mg/L、胱氨酸21.65 mg/L、亮氨酸81.05 mg/L、甘氨酸154.85 mg/L、牛磺酸747.2 mg/L、脯氨酸1365.55 mg/L、丙氨酸184.85 mg/L、酪氨酸5.6 mg/L、鸟氨酸16.55 mg/L、精氨酸255.6 mg/L、组氨酸26.4 mg/L、苏氨酸13.05 mg/L、蛋氨酸7.05 mg/L、谷氨酸88.6 mg/L、异亮氨酸50.9 mg/L、β-丙氨酸4.35 mg/L、天冬酰胺147mg/L、天冬氨酸48.5 mg/L、苯丙氨酸39.1 mg/L、羟脯氨酸56.3mg/L、γ-氨基丁酸3 mg/L、谷氨酰胺300 mg/L、色氨酸20 mg/L和半胱氨酸120 mg/L；
糖类：木糖5mg/L、岩藻糖7mg/L、核糖26mg/L、葡萄糖920mg/L、蔗糖66mg/L、乳糖14mg/L、果糖5mg/L、阿拉伯糖19mg/L、海藻糖229mg/L、龙胆二糖 84mg/L和半乳糖900mg/L；
维生素：肌醇2mg/L、叶酸1mg/L、烟酰胺1mg/L、氯化胆碱1mg/L、D-泛酸钙1mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、磷酸硫胺素1mg/L和核黄素-5-磷酸钠0.1mg/L；
无机盐：KCl 400mg/L、NaCl 8g/L、CaCl2 140mg/L、MgCl2 93.7mg/L、MgSO4 97.7mg/L、KH2PO4 60mg/L、Na2HPO4 190mg/L和NaHCO3 1g/L；
其他营养物质：NaHCO3 1g/L、丙酮酸钠550mg/L、青霉素钠100IU/mL、硫酸链霉素100IU/mL、两性霉素B 0.25mg/L和酚红10mg/L；
其中，所述的培养基的渗透压为620±20mOsm·kg-1，pH值为7.2±0.2；所述的对虾细胞生长培养基中还添加有20％对虾卵巢提取液、4％对虾眼柄提取液、15％FBS、20μg/L表皮生长因子和20μg/L碱性成纤维细胞生长因子。
2.一种传代培养对虾细胞系的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的对虾细胞生长培养基来培养对虾细胞。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的对虾细胞，为对虾的前血细胞。
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